ESTUDIO DEL SISTEMA INMUNE DE SALMO SALAR

Tesis entregada para optar al grado de Doctor en Biotecnología

Leidy Ximena Lagos Rojas

Co-Director de Tesis: Mario Rosemblatt Co-Directora de Tesis: Vivian Wilhelm

Santiago-Chile Octubre 2011

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AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a mi familia, mi padre, madre y hermana, por el apoyo que me han brindado durante toda mi vida y han hecho posible todos mis logros y éxitos, especialmente éste: la conclusión de mi doctorado y el inicio de una vida profesional llena de triunfos. Gracias también a toda mi familia y amigos, especialmente a mis hermanas del alma, Vero, Yenny, Lore, Maca, Shio, Made, Paxi, por compartir conmigo los buenos momentos y por ofrecerme su apoyo cuando se han presentado momentos difíciles en mi camino. Mil gracias a la familia salmones, ya que más que compañeros de trabajos, somos una familia, cada uno con su sello característico que nos permite ser tan diversos y tolerantes entre nosotros mismos, gracias por enseñarme a tolerar, compartir y quererlos y más que nada, gracias por conocerme y tolerarme. Un agradecimiento muy especial a mis directores de tesis, por su tiempo, ayuda, paciencia y atención, esta investigación no hubiera sido posible sin ellos. Muchas gracias a Dra. Jorunn Jorgensen y todo los integrantes de su laboratorio, Dimi, Merdhad, Hanna, Astrid e Ingrid, por su acogida, enseñanzas y la gran experiencia que significó conocer una nueva cultura tan diferente a la nuestra, como es la cultura Nórdica, gracias a ellos me llevo la mejor impresión del mundo de esta gente maravillosa. Un especial agradecimiento a marido, Sigmund, sin él el término del presente trabajo y la sobrevida al crudo invierno noruego hubiese sido imposible. Muchas gracias por su comprensión, paciencia, soporte y sobre todo, por su amor. Finalmente y no menos importante, muchas gracias a todas las personas que han formado parte importante de este largo camino, ya que cada uno de ustedes han contribuido enormemente a mi desarrollo, tanto profesional, como personal, en resumen, todos ustedes han contribuido a construir la profesional y ser humano que soy. Me los llevo a todos ustedes en el corazón!

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PREFACIO

Desde 1980 ha la fecha, tanto la demanda como la producción de salmón

se ha incrementado significativamente. En el año 2006 Chile tuvo exportaciones del orden de las 380 mil toneladas, con retornos económicos de US $ 2 mil 200 millones, convirtiendo a la salmonicultura es uno de los pilares de nuestra economía. De ahí la importancia en el estudio del sistema inmune de salmón (Salmo salar), de modo de mejorar las condiciones de productividad y sustentabilidad de la industria acuícola.

El presente proyecto de tesis se divide en dos partes. La primera parte hace referencia a los efectos de diferentes dietas e inmunoestimulantes disponibles en el mercado, estudiando las vías y mecanismos por los cuales los inmunoestimulantes, tanto sintéticos como naturales, ejercen su efecto sobre el sistema inmune de Salmo salar. Con el fin de mejorar el diseño de vacunas e inmunoestimulantes. Por otra parte, para poder dilucidar los diferentes componentes del sistema inmune de Salmo salar, hemos realizado la caracterización de las diferentes subpoblaciones celulares presentes en riñón cefálico, el cual es sabido correspondería al órgano progenitor de células inmunes.

Luego de presentado el primer avance de dicho proyecto de tesis y dado lo contingente del tema, decidimos entablar un colaboración con uno de los países líderes en investigación acuícola, como lo es Noruega. Dicha colaboración se realizó al alero de Dra. Jorunn Jorgensen perteneciente a la Universidad de Tromso, Noruega, cuyo principal objetivo fue dilucidar si Salmo salar poseería componentes inmunes y responden frente a inmunoestimulantes y mediante mecanismos similares a los presentes en mamíferos. Dado lo interesante de los resultados hemos decidido incluir dicha investigación en la segunda parte del presente trabajo, en el cual se exponen los resultados obtenidos en la pasantía de año y medio realizada en el extranjero. Una de las principales conclusiones obtenidas en la segunda parte del proyecto de tesis es que Salmo salar posee células con carácterísticas de células presentadoras de antígeno y presentarían vías coestimulatorias similares a las observadas en mamíferos.

El presente trabajo, en conjunto aporta al conocimiento sobre el sistema inmune de una especie tan importante a nivel comercial como lo es Salmo salar, lo que permitiría mejorar técnicas de inmunización, vacunación y en consecuencia mejorar la productividad y disminuir el impacto ambiental de la industria acuícola.

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TABLA DE CONTENIDOS

Página

AGRADECIMIENTOS ii PREFACIO iii TABLA DE CONTENIDOS iv-v ABREVIATURAS x-xi RESUMEN 1 ABSTRACT 3 INTRODUCCION 4 HIPOTESIS Y OBJETIVOS 14 MATERIALES Y METODOS Animales de experimentación y vacunación 15 Aislamiento de leucocitos de salmón 15 Inmunoestimulantes 16 Estallido respiratorio 16 Peroxidasa lisosomal 17 Fosfatasa lisosomal 17 Ensayo de fagocitosis 17 Citometría de flujo y cell sorter 17 Aislamiento de ARN, síntesis de cADN y análisis mediante PCR 18 Análisis por PCR en tiempo real 19

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Análisis de secuencias 20 Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y de 22 inmunofluorescencia Modulación de la expresión de CD40/CD40L en HKLs 22 Clonamiento y expresión de CD40L 22 Análisis mediante Western blot 23 Co-cultivo de leucocitos de Salmo salar y CHSE-214 23 que sobreexpresan CD40L-Análisis mediante citometría de flujo ELISA de captura 24 Análisis estadístico 24 LISTA DE TABLAS Tabla I. Componentes de inmunidad innata en teleósteos 6 y su modo de acción Tabla II. Receptores tipo Toll (TLRs), propiedades y agonistas 9 Tabla III. Secuencias de partidores utilizados para análisis 19 de PCR convencional Tabla IV. Secuencias de partidores utilizados en el análisis 20 de PCR en tiempo real Tabla V. Número de acceso de las secuencias utilizadas 21 para el análisis filogenético de CD40L y CD40 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema de la organización estructural de CD40 y CD40L 11 Figura 2. Efecto de CD40L en las diferentes etapas de maduración 11 de linfocitos B

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Figura 3. Citoquinas presentes en la interacción CD40-CD40L 13 en DCs y linfocitos T Figura 4. Evaluación de parámetros de inmunidad innata en peces 26 alimentados con diferentes dietas comerciales Figura 5. Evaluación de parámetros de inmunidad innata en peces 28 tratados con diferentes inmunoestimulantes vía i.p. Figura 6. Citometría de flujo y cell sorter de HKLs cultivados in vitro 30 por 24h Figura 7. PCR en tiempo real de poblaciones de HKLs separadas 32 mediante cell sorter Figura 8. Análisis de población fagocítica provenientes de HKLs 35 de Salmo salar Figura 9. Incorporación de CCH por linfocitos B de Salmo salar 37 Figura 10. Alineamiento múltiple de secuencias de proteínas 43 CD40L y CD40 Figura 11. Estructura tridimensional de proteína CD40L 44 Figura 12. Análisis filogenético que muestra la relación de 45-46 CD40L y CD40 de salmón con otras especies y otros miembros de la familia TNRF y TNF, respectivamente Figura 13. Expresión transcripcional de CD40L y CD40 47 en órganos de salmón Figura 14. Modulación de la expresión transcripcional de CD40L 49 y CD40 en leucocitos derivados de riñón cefálico (HKLs) Figura 15. Modulación de la expresión transcripcional de CD40L 51 y CD40 en HKLs y bazo de salmones vacunados Figura 16. PCR para identificar la presencia de CD40L 53 Figura 17. PCR de colonias transformadas 53

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Figura 18. Análisis de orientación de los genes insertos 54 en clones recombinantes por su patrón de productos derivados de la acción de enzimas de restricción Figura 19. Análisis de la expresión de CD40L en células CHSE-214 55 por microscopía de fluorescencia Figura 20. Verificación de expresión del plasmidio CD40L-GFP 56 transfectado en células CHSE-214 Figura 21. Microscopía de fluorescencia de co-cultivo de células que 59 sobreexpresan CD40L-GFP y leucocitos de salmón Figura 22. Cuantificación de la expresión relativa por PCR en tiempo 60 real de genes de importancia inmune para medir el efecto del tag GFP en el reconocimiento de CD40L Figura 23. Análisis comparativo del perfil transcripcional de HKLs 61 co-cultivados con las líneas celulares CHSE-214 o TO transfectadas con CD40L Figura 24. CD40L modula la expresión de varios marcadores celulares 63 e induce expresión transcripcional de diversas citoquinas e IFNs en HKLs Figura 25. CD40L y CpG clase B inducen un aumento en la 65 expresión de MHCIIβ en HKLs Figura 26. CD40L y CpG clase B inducen un aumento en la 67-68 expresión de MHCIIβ en la fracción de células adherentes derivadas de HKLs Figura 27. Capacidad de capturar antígeno en HKLs estimuladas 70 in vitro 3 y 7 días Figura 28. Efecto de CD40L y CpG clase B en la expresión de IgM 73 Figura 29. Análisis mediante Western blot del efecto de CpG clase B 74 y CD40L en la secreción de IgM en leucocitos de Salmo salar Figura 30. Detección de IgM mediante ELISA de captura 75

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RESULTADOS Primera Parte: 25-37 Efecto de inmunoestimulantes y caracterización de subpoblaciones linfocitarias en el Sistema Inmune de Salmo salar Efecto de diferentes regímenes de alimentación en parámetros 25 de inmunidad innata de Salmo salar Evaluación de parámetros de inmunidad innata en Salmo salar 27 inyectados i.p. con diferentes inmunoestimulantes Caracterización de poblaciones linfocitarias en HKLs de Salmo salar 29 Perfil transcripcional de diferentes subpoblaciones linfocitarias 31 de Salmo salar separadas mediante cell sorter Caracterización de población fagocítica en HKLs de Salmo salar 33 Capacidad fagocítica de linfocitos B en Salmo salar 34 Segunda Parte: 41-75 La interacción CD40/CD40L es una importante vía coestimulatoria en la maduración de APCs en teleósteos Conservación estructural y funcional de CD40L y CD40 en Salmo salar Caracterización de CD40L y CD40 de Salmo salar 41 Distribución de CD40L y CD40 de Salmo salar 47 Modulación de la expresión de CD40L y CD40 en HKLs 48 Efecto de la vacunación contra el virus de la enfermedad del páncreas 50 en la expresión de CD40L y CD40 en HKLs y esplenocitos Clonamiento y expresión de CD40L de Salmo salar 50 Sobreexpresión de CD40L en células CHSE-214 52 Co-cultivo de células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L 57 y leucocitos de Salmo salar

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Efecto de CD40L en HKLs 62 La estimulación con CD40L induce expresión de MHCIIβ en HKLs 64 de Salmo salar Estimulación de células adherentes provenientes de riñón cefálico 66 con CD40L induce expresión de MHCIIβ, moléculas coestimulatorias y citoquinas La estimulación con CD40L reduce la capacidad de incorporar 69 antígeno en HKLs Efecto de CD40L y CpG en linfocitos B de Salmo salar 71 DISCUSION PRIMERA PARTE 38 DISCUSION SEGUNDA PARTE 76 CONCLUSIONES Y PROYECCIONES 83 BIBLIOGRAFIA 85

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ABREVIATURAS

aa: aminoácido

Ac: anticuerpo

Ag: antígeno

APCs: células presentadoras de antígeno

BCR: receptor de células B

CCH: Concholepas concholepas hemocianina

CHSE-214: Chinook salmon embryo

ConA: concavalina A

DCs: células dendríticas

Fas: receptor de muerte celular

Fwd: sentido

HBSS: solución salina balanceada de Hanks

HKLs: linfocitos de riñón cefálico

Ig: Inmunoglobulina

i.p.: intraperitoneal

L-15: Leibovitz

LPS: lipopolisacárido

MET: Microscopía Electróncia de Transmisión

MHCII: complejo mayor de histocompatibilidad clase II

MIF: intensidad de fluorescencia media

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mIgM: IgM de membrana

NBT: azul de nitrotetrazolium

NK: natural killer

ORF: marco de lectura abierto

OVA: ovoalbúmina

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

PHA: fitohemaglutinina

PAMPs: patrones moleculares asociados a patógenos

PBL: linfocitos de sangre periférica

PD: enfermedad pancréatica

PI: yoduro de propidio

PMA: acetato de forbol meristato

Poli I:C: ácido Polyinosinic-polycitidílico

PRRs: receptors de reconocimiento de patrones moleculares

Rev: antisentido

RT-PCR: PCR en tiempo real

SEM: error estándar de la media

SFB: suero fetal bovino

sIgM: IgM soluble

TCR: receptor de células

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RESUMEN

La salmonicultura es uno de los pilares de nuestra economía, de ahí la importancia en optimizar los niveles de sanidad y producción en dicha industria. En el presente estudio hemos demostrado el efecto de diferentes dietas comerciales en parámetros de inmunidad innata de salmón, tales como fosfatasa lisosomal, peroxidada lisosomal y estallido respiratorio. Nuestros resultados muestran la importancia de la adición de inmunoestimulantes en la alimentación para definir el estado inmunológico en peces. Por otro lado, se hace necesario la caracterización del sistema inmune, ya que de esta manera se puede optimizar y entender el mecanismo por el cual tanto enfermedades como inmunoestimulantes estarían ejerciendo su acción. Nuestros datos soportan la hipótesis que el sistema inmune de Salmo salar cuenta con poblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos, tales como linfocitos B (IgM+/MHCII+); putativas APCs (MHCII++) y putativos linfocitos T (MHCII-). Dentro de estas células existen dos subpoblaciones capaces de incorporar antígeno, un tipo celular de gran tamaño y MHCII++, que podría corresponder a APCs y la otra corresponde a una característica particular de Salmo salar, que es la capacidad de linfoctios B de incorporar antígeno. Dado la escasez de anticuerpos para identificar las subpoblaciones mencionadas anteriormente, hemos desarrollado un sistema para detectar la presencia de APCs, haciendo uso de una de las vías coestimulatorias más comunes en vertebrados superiores, como lo es la interacción entre CD40L y CD40. En vertebrados superiores, la interacción CD40L-CD40 representa una importante vía coestimualtoria, crucial para la maduración de DCs, induciendo cambios fenotípicos y funcionales que transforman éstas células en células presentadoras de antígeno (APCs) más efectivas. Sin embargo, no existe evidencia de su conservación funcional en vertebrados inferiores, como salmón. Primeramente, hemos realizado la caracterización funcional de CD40L y CD40 de Salmo salar. CD40L de salmón es una proteína de transmembrana tipo II con un dominio funcional homólogo a TNF en el extremo extracelular que contiene el C-terminal, mientras que CD40 corresponde a una proteína de membrana tipo I con patrones de cuatro residuos de cisteína repetidos en su extremo N-extracelular. CD40L y CD40 se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes órganos de Salmo salar, particularmente en órganos relacionados con la función immune. Así, CD40L se encuentra expresado en una fracción celular identificada con linfocitos y su expresión es inducida por la acción de mitógenos tales como PHA y Con A. Por otro lado, CD40 es expresado en células con características de APCs y su expresión es inducida en presencia de CpG. Para determinar el efecto que tiene la unión de CD40L a su receptor CD40 en células de salmón, hemos co-cultivado células CHSE-214 que sobreexpresan ectópicamente CD40L con leucocitos derivados de riñón cefálico y hemos demostrado que CD40L induce una rápida y duradera (6-72h)

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inducción en la expresión de transcritos codificantes para importantes moléculas coestimulatorias tales como CD40, CD83 y B7-H1, además de citoquinas características de respuesta tipo helper (IFNs, IL-12p40, IL-10 y IL-1β). Interesantemente, la unión de CD40L en HKLs induce la expresión de MHCIIβ en la superficie de los leucocitos al tiempo que causa una disminución en su capacidad de capturar antígeno. Nuestros resultados proveen la primera evidencia de la existencia funcional de la vía coestimualtoria CD40L-CD40 en peces y demuestran que su interacción es clave en la maduración de APCs en Salmo salar. En conjunto nuestros datos permiten el enriquecimiento en el conocimiento de la inmunidad en vertebrados inferiores, crucial para el mejoramiento en estrategias de inmunoestimulación y además permitiría dilucidar el mecanismo evolutivo del sistema inmune en vertebrados superiores.

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ABSTRACT

Salmon farming is one of the pillars of the chilean economy, hence the importance in optimizing the levels of production and health regulation. In this study we demostrate the effect of different commercial diets on several parameters of innate immunity in salmon, such as lysosomal phosphatase, lysosomal peroxidase and respiratory burst. We also show that the addition of immunostimulant in the diet is very important for the establishment of the immune status in fish. Moreover, our data stress the importance of fully characterizing the components of the immune system since it will help in our understanding of the mechanisms of action of disease and immunostimulant. Our data support the hypothesis that the immune system in Salmo salar has the same cellular components found in mammals, such as B lymphocytes (IgM+/MHCII+); putative APCs (MHCII++) and putative T cells (MHCII-). Salmo salar presents two different cell populations capable to uptake antigens, one is large cells MHCII++ that may correspond to APCs. And the other cell subpopulation correspond to a particular feature of salmon, since they present a set of B lymphocytes capable of uptake antigen. Due the lack of Ac for indentify the different immune populations we developed a system to characterize APCs in teleost, using an important costimulatory pathway, CD40L/CD40. In mammals, CD40L-CD40 mediated costimulatory pathway that represents a critical step in the final maturation of DCs inducing changes that makes them more effective antigen presenting cells (APCs). However, little is known about its existence and conservation in lower vertebrates. To shed light into the evolution of CD40L and CD40, we report the identification and functional characterization of CD40L and CD40 from the Atlantic salmon (Salmo salar). Salmon CD40L is a type II membrane-bound protein with a TNF homology domain in its extracellular C-terminal region, while CD40 is a type I membrane-bound protein with a sequence pattern of four cysteine-rich domains in its extracellular N-terminal region. Atlantic salmon CD40L and CD40 are widely distributed, particularly in immune tissues, and are induced by T cell stimulant (PHA, ConA) or CpG, respectively. To gain further insight into the function of CD40L we overexpresses the Atlantic salmon CD40L in CHSE-214 cell line and co-cultured CHSE-cells ectopically expressing the CD40L and head kidney leukocytes (HKLs) and have shown that CD40L induces a rapid and long-lasting (6-72h) increase of expression of important costimulatory molecules such as CD40, CD83, B7-H1; and by the increased expression of several cytokines, including IFNs, IL-12p40, IL-10 and IL-1β, which are signature cytokines for Th response. Most importantly, CD40L ligation induces an increase on MHCIIβ surface expression and a decreased on the capacity of antigen uptake in HK APCs. Our results provide the first evidence for the existence of a functional CD40L-CD40-mediated costimulatory pathway on maturation of APCs from Atlantic salmon. Our data enrich our knowledge of immunity in lower vertebrates and also allow us to understand the mechanism of evolution of the immune system.

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INTRODUCCION

Históricamente la acuicultura ha impactado al sector productivo nacional, convirtiéndose en uno de los pilares fundamentales de nuestra economía, posicionando nuestro país en uno de los líderes mundiales de dicho rubro (1). Sin embargo, la producción a gran escala expone a los animales a condiciones de gran estrés, problemas de salud y deterioro de las condiciones medio ambientales, lo que se traduce en severas pérdidas económicas (2). Las enfermedades infecciosas son uno de los principales problemas en acuicultura, las cuales son tratadas con quimioterapia, vacunación y otras medidas profilácticas. Como ejemplo, el uso de agentes quimoterapeúticos (antibióticos) causan resistencia a drogas en los organismos y el uso de vacunas apuntan a la producción de anticuerpos específicos para un patógeno en particular y es por lo general más costosa. De ahí, que unos de los métodos más promisorios para el control de enfermedades en acuicultura es el fortalecimiento de los mecanismos de defensa del pez (sistema inmune) a través de la administración anticipada de inmunoestimulantes. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual dichas moléculas ejercerían su efecto no es del todo claro (3). Aunque diversos estudios han apostado por un efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad innata, no existe suficiente evidencia que soporte dicha conclusión. De ahí la importancia de identificar los mecanismos por los cuales inmunoestimulantes ejercerían su efecto, ya que con dicha información se podría generar nuevas formulaciones más eficaces.

Es por esto que en su primera parte el presente proyecto propone

estudiar las vías y mecanismos por los cuales los inmunoestimulantes, tanto sintéticos como naturales, ejercen su efecto sobre el sistema inmune de Salmo salar.

Componentes del Sistema Inmune

La morfología del sistema inmune en peces es muy diferente a la de mamíferos. La diferencia más evidente es el hecho que los peces no poseen médula ósea, en lugar de esto; timo, bazo y riñón cefálico son los principales órganos linfoides. Debido a esto, los componentes de inmunidad innata son muy diversos e importantes, dado que son la primera barrera en contacto con patógenos. El detalle de los componentes de inmunidad innata en teleósteos son expuestos en la Tabla I. La respuesta inmune adaptativa de peces en general está bien desarrollada e integrada y en teleósteos es donde se encuentran muchas similitudes funcionales con la respuesta observada en vertebrados superiores. Incluso, hay evidencias que sugieren que su sistema inmunitario estaría compuesto de subpoblaciones leucocitarias tales como linfocitos B y T, granulocitos, trombocitos, macrófagos y células citotóxicas

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inespecíficas (4-6). La identificación de linfocitos B ha sido posible dado que linfocitos B presentan Igs en su superficie, pero aún no ha sido posible dilucidar el resto de las subpoblaciones linfocitarias, debido a la carencia de reactivos, anticuerpos específicos (7-8). En teleósteos la existencia de linfocitos T ha sido estudiada mediante ensayos indirectos como proliferación inducida por mitógenos como fitohemaglutinina A (PHA), concavalina A (ConA) y lipopolisacárido (LPS), respuesta en reacciones de cultivo mixto y función como células colaboradoras en la producción de Acs contra antígenos (Ags) (9-11). Por otra parte, Lovy y col. (12) han caracterizado ultraestructuralmente células de agallas provenientes de Chinook salmon y Salmo salar que presentan grandes similitudes a células dendríticas (DCs).

Adicionalmente, CD83, el cual es un marcador característico de DCs

activadas o diferenciadas, es expresado en varios tejidos de salmón y su expresión es inducida durante infecciones virales (13). Recientes estudios describen que linfocitos B de Onchorhyncus mykiss son capaces de fagocitar esferas de látex y bacterias y poseen capacidad citotóxica (14). La inmunidad humoral está representada por los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Igs). En peces el repertorio de isotipos de cadena pesada de Ig ha mostrado ser más limitada que en vertebrados superiores. Sólo dos isotipos de cadena pesada han sido identificados en peces teleósteos: IgM e IgD. Donde IgM, en teleósteos, presenta forma de tetrámero en el cual los monómeros están formados por dos cadenas livianas y dos pesadas con un peso molecular aproximado de 700kDa y un coeficiente de sedimentación de 17S, aunque también existirían en formas monoméricas en el suero (15).

Receptores tipo Toll, agonistas TLR e Inmunoestimulantes

Las células del sistema inmune actúan reconociendo los llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), que son moléculas altamente conservadas presentes en la superficie de la mayoría de los patógenos. Estos motivos son reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Dentro de esta última clase de moléculas están los receptores tipo Toll o TLR. Estos receptores son expresados en una variedad de células inmunes, tales como macrófagos, DCs, linfocitos B y T y en algunas células no inmunes tales como fibroblastos y células epiteliales (16). Los diferentes tipos de TLRs y sus ligandos se especifican con más detalle en la Tabla II.

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Tabla I. Componentes de inmunidad innata en teleósteos y su modo de acción.

Componentes físicos Modo de acción Referencia

Escamas Barrera física

Mucosas Barrera física y química (36), (28)

Componentes celulares

Neutrófilos Fagocitosis

Monocitos/Macrófagos Fagocitosis. Producción de citoquinas. Secreción de factores de crecimiento y enzimas para remodelar tejido dañado. Estimulación de linfocitos T

Natural killer (NK) Induce apoptosis de células infectadas. Síntesis y secreción de IFNγ

(37)

Componentes humorales

Sistema del complemento

Promueve unión de microbios. Promueve inflamación. Causa lisis osmótica o muerte apoptótica

(38)

Interferon/proteína Mx Inhibe replicación viral (36), (38)

Transferrina Unión a hierro. Actúa como inhibidor de crecimiento en bacterias. Activa macrófagos

(39)

Enzimas líticas Cambia la carga de superficie de microbios para facilitar fagocitosis.

(40)

Antiproteasa Restringe la capacidad de invadir y crecer in vivo de bacterias

(38)

Lectinas Induce reacciones de precipitación y aglutinación. Activa complemento

(36)

Proteína C- reactiva (CRP)

Activa complemento. Induce liberación de citoquinas

(4)

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Un análisis filogenético conducido por Purcell y col. (17) evidencia que los peces son capaces de responder a muchos de los agonistas TLRs de mamíferos produciendo una variedad de citoquinas en respuesta al estímulo. Es interesante mencionar que los TLRs pueden responder a patógenos vivos o PAMPs aislados actuando así como inmunoestimulante, activando células del sistema inmune. Los inmunoestimulantes son una serie de agentes, naturales y artificiales que son utilizados para estimular el sistema inmune y así ayudar en el control de enfermedades. Actúan directamente sobre las células del sistema inmune estimulando su acción efectora. Entre estos se encuentran agentes químicos sintéticos como el levamisol; sustancias biológicas como derivados bacterianos: LPS, β-glucano, polisacáridos, quitina y oligosacáridos; extractos provenientes de animales o plantas; factores nutricionales como vitamina C y E; hormonas, como prolactina y hormona de crecimiento y citoquinas como IFNs e IL-2 (18-20). Fundamentalmente los inmunoestimulantes actúan facilitando la función de células fagocíticas, aumentando su actividad bactericida, estimulando la actividad de células natural killer (NK), del sistema del complemento, la lisozima y la respuesta mediada por anticuerpos. La activación de estas funciones inmunológicas está asociada con un aumento de la protección contra enfermedades infecciosas. Estos agentes son sólo efectivos en algunas enfermedades y además su acción varía dependiendo al periodo de administración, dosis, métodos de administración y condición fisiológica del pez (21-22). El tratamiento de Salmo salar con β-glucanos ha sido previamente demostrado que aumenta la resistencia a diferentes patógenos (23). También la inyección intraperitoneal de β-glucano en combinación con LPS induce protección en pez carpa contra patógenos como Aeromona hydrophila y aumenta la protección debido al efecto adyuvante de β-glucanos con LPS (24). Se ha sugerido que β-glucanos puede unirse al heterodímero TLR2/TLR6, pero la unión de β-glucanos a dectina-1 parece ser más importante en el reconocimiento de β-glucanos (25).

Los lipopolosacárido (LPS) son un componente de la membrana externa de bacterias Gram-negativas. Este es generalmente considerado el inmunoestimulante más potente entre los componentes de la pared celular y consiste en polisacáridos extendidos hacia el exterior de la superficie celular con una porción lipídica embebida en la membrana. Esta porción es conocida como lípido A y es responsable de inducir respuestas inmunoestimuladoras tales como producción de citoquinas inflamatorias y sustancias efectoras inflamatorias como óxido nítrico (26). Mientras que la estimulación de TLR4 por LPS puede causar shock séptico en mamíferos, se sabe que peces y otros vertebrados menores son resistentes a este efecto tóxico (27). Estudios con LPS inyectado intraperitonealmente (i.p.) ha demostrado una tendencia hacia la distribución de éste en órganos tales como riñón cefálico y bazo en peces teleósteos (28). Estimulación de macrófagos por LPS permite la producción de citoquinas como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-10 (16).

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Por otro lado, el ADN plasmidial contiene motivos CpG que son comunes en ADN bacteriano, pero no están presente en el ADN de vertebrados (29). Estos motivos estimulan la proliferación de células B y también activan macrófagos y DCs (30). Como otros componentes inmunoestimuladores, los motivos CpG del ADN activan moléculas de señalización intra-citoplasmática. Sin embargo, a diferencia del LPS que activa TLR4 en la superficie celular, es necesario que los motivos CpG sean incorporados a la célula y logren una maduración endosomal para que ejerzan su acción inmunoestimulatoria. Strandskog y col. (31) han demostrado que leucocitos de salmón responden a las diferentes clases de motivos CpG de igual manera que mamíferos.

Sobre la base de los datos discutidos anteriormente, postulamos que los componentes del sistema inmune innato del salmón responden a los inmunoestimulantes y dietas comerciales a través de mecanismos similares a los descritos en vertebrados superiores. Bajo esta hipótesis y dado los antecedentes mencionados anteriormente, el primer objetivo de este estudio fue determinar y comparar la acción inmunoestimulatoria de diferentes dietas comerciales, como también diferentes sustancias conocidas por su acción inmunomoduladora. Nuestros datos señalan que para entender el mecanismo de acción de inmunoestimulante es necesario conocer los componentes del sistema inmune en teleósteos.

En el presente estudio presentamos datos sobre diferentes subpoblaciones celulares del sistema inmune, sugiriendo que la inmunidad adaptativa en peces tendría componentes, marcadores y posiblemente una función fisiológica similar a la de los mamíferos.

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Tabla II. Receptores tipo Toll (TLRs), propiedades y agonistas.

Propiedades TLR

Agonistas

TLR 2

TLR2 es dependiente de la formación de dímeros Reconoce una gran variedad de ligandos.

β-glucan (Laminara), LPS

TLR 3

Induce síntesis de Interferon tipo I (IFNα y IFNβ)

ARN doble hebra, poly I:C

TLR 4

TLR4 requiere MD-2 y LPS para iniciar la señalización

LPS

TLR 5

TLR5 reconoce flagelina bacterial. Activa la expresión de genes proinflamatorios

Flagelina

TLR 7/8

TLR7 y 8 reconoce PAMPs en compartimentos endosomal/lisosomal

RNA hebra simple Compuestos imidazoquinolina -Imiquimod -Resiquimod

TLR 9

Señalización mediada por MyD88 CpG viral y bacteriano (ADN plasmidial)

Poblaciones celulares del Sistema Inmune

En la actualidad se sabe que la inmunidad adaptativa en teleósteos fue establecida hace aproximadamente 470 millones de años, basado en el origen de Igs y la presencia de moléculas claves tales como MHC, TCRs y co-receptores como CD3, CD4, CD8 como también la identificación de linfocitos B y T, células imprescindibles para la inmunidad adaptativa en vertebrados superiores. En mamíferos, las DCs desempeñan un rol clave en la activación de linfocitos T. Estas células son células presentadoras de antígenos (APCs) superiores debido a la alta expresión de moléculas MHCII en su superficie y debido a que proporcionan importantes moléculas de adhesión y coestimulatorias para la interacción con linfocitos T (59). En Salmo salar se han descrito células que presentan morfología similar a DCs de mamíferos y son positivas para marcadores específicos como MHCII (60). Sin embargo, no existen estudios funcionales que demuestren que dichas células presentarían funciones similares a su contraparte en mamíferos, tales como la capacidad de presentar antígenos, sobreexpresar moléculas coestimulatorias y secretar citoquinas claves para la activación y polarización de la respuesta inmune.

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Actualmente, el mecanismo que explica cómo las APCs instruirían a linfociots T para iniciar una respuesta adaptativa y vice versa, como la expresión de moléculas coestimulatorias en linfocitos T produciría una activación recíproca en APCs, es completamente desconocido en teleósteos. Considerando los antecedentes mencionados anteriormente, en el presente estudio hemos logrado desarrollar un sistema mediante el uso de una importante vía coestimulatoria en mamíferos, como lo es la interacción CD40L/CD40, para caracterizar funcionalmente la existencia de APCs en Salmo salar. Para llevar a cabo nuestro objetivo hemos caracterizado exitósamente los homólogos de CD40L y CD40 en Salmo salar y en conjunto con esto hemos estudiado cuidadosamente el rol que estas moléculas estarían cumpliendo en la inmunidad adaptativa del salmón. Nuestros resultados evidencian que la interacción entre CD40 y CD40L afecta directamente la función de las células del sistema inmune del salmón.

CD40 es una glicoproteína de transmembrana de 50-kDa, miembro de la superfamilia de receptores para factor de necrosis tumoral (TNFR) (41). En la membrana se encuentra en forma de monómeros y su trimerización es crucial para su activación. CD40 es ampliamente expresado en varios linajes celulares, particularmente en células presentadoras de antígeno (APCs), tales como linfocitos B (42, 43), células dendríticas (DCs) (44, 45) y monocitos/macrófagos (46) y su efecto tiene relación directa con el tipo de célula diana. El ligando de CD40, CD40L, también denominado CD154, es una proteína integral de membrana tipo II de 34-39 kDa, con un extremo C-terminal perteneciente a la familia TNF (47). La Fig. 1 muestra un esquema representativo de las características estructurales de ambas moléculas.

Los primeros estudios relacionados con la expresión del gen codificante

para CD40L indican que dicha proteína se encontraría expresada principalmente en linfocitos T CD4+ activados, lo cual sugiere que su principal función sería intensificar la respuesta en células presentadoras de antígeno (DCs, linfocitos B). En verterbados superiores la unión de CD40L a CD40 en linfocitos B activa la proliferación, diferenciación y producción de Ig en estas células actuando en diferentes etapas de su diferenciación (Fig. 2). La importancia de dicha interacción es claramente graficada en ratones knock-out para CD40 y CD40L, los cuales son incapaces de formar centros germinales, generar linfocitos B de memoria y generar switch de isotipo (47, 48).

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FIGURA 1. Esquema de la organización estructural de CD40 y CD40L.

FIGURA 2. Efecto de CD40L en las diferentes etapas de maduración de linfocitos B.

-proliferación -proliferación -proliferación

-expresión de CD23 -diferenciación -diferenciación

-precusor de GC -switch de isotipo

-expresión de Fas -memoria

-expresión de CD80/CD86

-producción de Ig

-expresión de IL-6

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La expresión de CD40 en células profesionales presentadoras de antígenos (APCs) ha sido ampliamente estudiada en mamíferos. Varios grupos han reporteado que CD40 se expresa constitutivamente en DCs generadas a partir de progenitores hematopoyéticos in vitro así como también de células Langerham (49-53). Esto sugiere que la interacción CD40/CD40L juega un rol principal en el cross-talk funcional entre linfocitos T y DCs. En DCs, la unión de CD40 con CD40L representa un paso crítico en la maduración de estas células, induciendo cambios que la transforman en potentes APCs.

En mamíferos, la expresión de CD40 es utilizada como marcador de activación en DCs, ya que su expresión es inducida en presencia de productos microbiales (ligandos para receptor tipo Toll), patógenos (virus) e incorporación de cuerpos apoptóticos. La maduración y/o activación de DCs es caracterizada por el incremento en la expresión de complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII) y moléculas coestimulatorias tales como CD54 (ICAM-1), CD58/LFA-3, CD83/B7-1, CD86/B7-2 (54-56). En monocitos y DCs, la unión de CD40 a CD40L induce un aumento de viabilidad en estas células además de la secreción de citoquinas como IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNFα, como también enzimas de la matriz tales como metaloproteasas (MMP), además de inducir un aumento en la capacidad tumoricida de estas células.

Muy importante es la secreción de IL-12, la cual induce la polarización de

la respuesta tipo helper hacia Th1 (57). En ratones se ha demostrado la existencia de dos subconjuntos de DCs mieloides capaces de responder en forma diferenciada a los estímulos presentados por linfocitos T (58). Estos subconjuntos no han sido demostrados en teleósteos, pero dado que teleósteos representan antecesores de APCs desde el punto de vista evolutivo, es posible que las características de ambos subconjuntos de DCs sea representado por un sólo grupo de APCs primitivas en teleósteos. La Fig. 3 grafica la red de citoquinas que participan en la interacción entre ambos subconjuntos de DCs y linfocitos T.

Con los antecedentes mencionados anteriormente, la hipótesis que guía

la segunda parte de nuestro trabajo es que Salmo salar presentaría vías coestimulatorias similares a las de mamíferos, representada por la interación entre CD40L y CD40 y que las APCs del salmón responderían a los mismos estímulos y mediante los mismos mecanismos que vertebrados superiores. Dado la importancia a nivel funcional de CD40L en la activación de APCs es que la caracterización inicial de la interacción CD40L-CD40 expuesta en el presente estudio permitirá enriquecer nuestro conocimiento del sistema inmune en peces contribuyendo a la mejor comprensión de los procesos evolutivos en el desarrollo de APCs a través del tiempo.

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DC inmadura DC activada (DC1) linfocitos T CD4+

activación

Patógeno

CD40 CD40L

IL-12

IFNγ

IL-2

TNF

DC inmadura DC activada (DC2) linfocitos T CD4+

activación

Patógeno

CD40 CD40L

IL-4

IL-10

IL-4

IL-5

IL-6

IL-9

IL-10

IL-13

TGF-β

Th1

Th2

DC inmadura DC activada (DC1) linfocitos T CD4+

activación

Patógeno

CD40 CD40L

IL-12

IFNγ

IL-2

TNF

DC inmadura DC activada (DC2) linfocitos T CD4+

activación

Patógeno

CD40 CD40L

IL-4

IL-10

IL-4

IL-5

IL-6

IL-9

IL-10

IL-13

TGF-β

Th1

Th2

Sobre la base de los antecedentes expuestos respecto del efecto de inmunoestimulantes sobre el sistema inmune innato y de estimulación del sistema inmune adquirido por la interacción CD40L-CD40, hemos propuesto una hipótesis única para todo el proyecto de tesis. A

B

FIGURA 3. Citoquinas presentes en la interacción CD40-CD40L, en DCs y linfocitos T, respectivamente. En modelos murinos se ha demostrado la existencia de dos subconjunto de DCs mieloides (A, B) capaces de responder en forma diferenciada a la interacción con linfocitos T.

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HIPOTESIS

El Sistema Inmume Innato y el Sistema Inmune Adquirido de Salmo salar responden a inmunoestimulantes y agonistas de receptores inmunes mediante

mecanismos similares a los descritos en vertebrados superiores.

OBJTIVO GENERAL

Estudiar el comportamiento del Sistema Inmune Innato y del Sistema Inmune Adquirido de Salmo salar frente a inmunoestimulantes y agonistas de

receptores inmunes y en particular estudiar la existencia de putativas APCs mediante el estudio de sus agonistas moleculares y sus efectos en las

diferentes subpoblaciones leucocitarias de Salmo salar.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estudiar el efecto de diversos inmunoestimulantes y sus vías de administración, tanto a nivel in vitro como in vivo, sobre el Sistema Inmune Innato de Salmo salar.

Caracterizar las diferentes subpoblaciones linfocitarias pertenecientes al Sistema Inmune Adquirido de Salmo salar.

Caracterizar la existencia de putativas APCs de Salmo salar.

Caracterizar molecular y funcionalmente la vía coestimulatoria: CD40L/CD40 y sus efectos sobre diferentes subpoblaciones linfoides de Salmo salar.

Estudiar el efecto de CD40L sobre la maduración de APCs de Salmo salar.

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MATERIALES Y METODOS

Animales de experimentación y vacunación Salmo salar no vacunados de aproximadamente 20g fueron obtenidos de Sea Fishing INVERTEC Chiloé SA, Chile y certificados por Chang, Integral Biosecurity. Los animales fueron aclimatados en tanques con capacidad de 115 litros que son parte de una red recirculante de agua a una temperatura de 14 +/- 2°C. Los peces fueron alimentados con dieta comercial (Omega, EWOS, Chile) 5-6 veces al día. No se observaron signos de infección o mortalidad durante el período de realización de los experimentos. Para los estudios in vitro de la segunda parte de la tesis, las células se aislaron de salmón, Salmo salar, Aquagen standard (Aquagen, Kyrksæterøra, Norway) de aproximadamente 500g fueron obtenidos de Tromsø Aquaculture Research Station (Tromsø, Norway). Los peces se mantuvieron en condiciones similares a las mencionadas anteriormente. Los peces vacunados contra la enfermedad del páncreas (pancreatic disease: PD) fueron obtenidos de un experimento de desafío descrito en trabajos anteriores (61). Brevemente, se utilizaron alevines presmolt, Aquagen standard de aproximadamente 70g. Antes del desafío, los peces se anestesiaron usando 0.04g/l benzocaína (Sigma, St. Louis, USA) e inyectaron intraperitonealmente (i.p.) con un volumen total de 100μl de diferentes formulaciones: vacuna PD conteniendo el antígeno solo (salmonid alphavirus inactivado) o combinado con CpG (50μg) y poly I:C (50μg). Los peces controles se inyectaron con el medio de inoculación solo (PBS). No se observó mortalidad debido a la inyección. Se recolectó el riñón cefálico y bazo de los peces tratados, 8 peces por grupo 5 días post-inyección. Aislamiento de leucocitos de salmón Los animales de experimentación se sangraron por la vena caudalis y se sacrificaron por dislocación cervical. Leucocitos provenientes de riñón cefálico (HKLs) y bazo fueron aislados siguiendo el protocolo descrito por Pedersen y col. (62). Brevemente, los órganos (HK y bazo), se disgregaron utilizando 100-μm pore size cell strainers (Falcon) en medio L-15 completo conteniendo penicilina (10U/ml), estreptomicina (10μg/ml), 2% suero fetal bovino (SFB) y heparina (20U/ml). La suspensión resultante se cargó en gradientes discontinuos de Percoll 25/54 % y se centrifugó a 400 x g por 40min a 4°C. Las células de la interfase se recolectaron y se lavaron dos veces en medio L-15. Los leucocitos se ajustaron a una densidad de 2 x 106 cel/ml y se cultivaron en placas de 24 pocillos en medio L-15 completo 5% SFB.

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Para la obtención de las células adherentes (monocitos/macrófagos), los HKLs se ajustaron a una densidad de 7 x 106 cel/ml y se cultivaron en medio L-15 completo 0,1% SFB durante 24h, luego se lavaron dos veces en PBS para finalmente ser cultivados en L-15 completo 5%SFB. Los linfocitos obtenidos presentaron una viabilidad del 95% medida por azul de tripán. Inmunoestimulantes Las diferentes dietas utilizadas para alimentar los animales de experimentación se obtuvieron del mercado, Dieta control (EWOS OMEGA, EWOS, Chile); Nutra Defense (Skretting, Chile) y Prohetox (Veterquímica, Santiago, Chile). Los diferentes inmunoestimulantes utilizados tanto in vitro como in vivo se describen a continuación: polyinoscinic:polycytidylic acid (poly I:C), PMA, CpG clase B (5`-TCGTGCTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3`; 2μM). Poly I:C y PMA fueron provistos por Sigma-Aldrich y CpG clase B (Thermo fisher Scientific GmbH). Laminaria hyperborea fue proporcionado gentilmente por Dr. Roy Dalmo (Universidad de Tromsø, Tromsø, Noruega), ADN genómico proveniente de Vibrio anguillarum y LPS/Manto proveniente de Vibrio ordalli fueron proporcionados por Dr. Alvaro Miquel (GrupoBios, Santiago, Chile). Estallido respiratorio El estallido respiratorio se cuantifica midiendo la producción de anión superóxido usando el procedimiento de reducción de nitroblue tetrazolium (NBT) a diformazan mediante un método de quimioluminiscencia. HKLs (100μl; 1 x 106 cel) se cultivan en placas de 96 pocillos de fondo plano, se incubaron en medio completo (RPMI, 2%FSB) o adicionado de diferentes inmunoestimulantes por 40 horas a 17ºC. Luego se remueve el medio y las células adherentes se lavan suavemente dos veces con 100μl de solución de sal balanceada Hanks (HBSS) (Sigma-Aldrich). Se agregó 100μl de HBSS/NBT a los pocillos y se incubaron por 2h a 17ºC. Luego se remplaza el medio por 100μl de metanol 100% y las células se fijan por 3 min. Luego se lavan los pocillos 3 veces con 100 μl de metanol 70% y se secan al aire. Se arega KOH 5M (120 μl) y DMSO (140 μl) a cada pocillo, el formazan se solubiliza pipeteando y la reacción colorimétrica se lee a 650nm en espectrofotómetro. Se analizó la cinética de la reacción y se calculó la pendiente máxima de cada curva.

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Peroxidasa lisosomal El contenido de peroxidasa en leucocitos y del medio (debido a la desgranulación) se usó como indicador de activación de leucocitos mediante un método colorimétrico. Alícuotas de linfocitos y medio se pone en placas de 96 pocillos que contiene 10mM de 3,3,5,5 tetramethylbenzidine hydrochloride y 5mM de H2O2. La reacción de cambio de color se detiene después de 2 min adicionando 50μl de ácido sulfúrico 2M, la densidad óptica se lee a 450nm. Fosfatasa lisosomal La actividad de fosfatasa ácida lisosomal se midió usando placas de cultivo de 96 pocillos. Las células se lavan dos veces con PBS y se lisan con Triton X-100 (0.1% 10μl). Luego se agregan 20μl de buffer acetato (0.2M; pH 5.0) y 10μl de paranitrofenolfosfato (24mM) y se incuban 30min a 12ºC. Posteriormente se agregaron 200μl de buffer borato (0.2M; pH 9.8) y la densidad óptica se midió a 405nm. Ensayo de fagocitosis Los ensayos de fagocitosis se realizaron utilizando microesferas de látex fluorescentes (Fluoresbrite, microesferas carboxiladas de 1.75μm de diámetro, Polyscience Inc.) o CCH marcada fluorescentemente con Alexa fluor 647, siguiendo el protocolo descrito por Li y col. (14). Brevemente, se co-cultivaron leucocitos y microesferas fluorescentes en una relación de 1:10 (leucocitos/microesferas) o 50μg/ml de CCH marcada por 24h a 16ºC. Posteriormente, HKLs se tripsinizaron (Sigma, USA), se lavaron 3 veces con PBS 3% SFB y 4.5% D-glucosa (Sigma) y se centrifugaron a 100 x g por 10min a 4 ° C con el objetivo de remover las microesferas no fagocitadas. Finalmente, los HKLs se resuspendieron en PBS 2% SFB para su posterior marcaje y análisis mediante citometría de flujo. Citometría de flujo y cell sorter HKLs se marcaron siguiendo el protocolo descrito por Iliev y col. (32). Brevemente, los HKLs se lavaron con PBS 2% SFB e incubaron con antisuero anti-MHCIIβ (1:1000) o Ac anti-IgM (1:400) por 20min en PBS 2% SFB en hielo. El Ac anti-MHCIIβ corresponde a un antisuero policlonal preparado en conejo dirigido contra péptidos sintéticos pertenecientes a la molécula de MHCIIβ de Salmo salar (Universidad de Tromso, Tromso, Noruega). Por otro lado, el Ac anti-IgM corresponde a un Ac monoclonal preparado en ratón dirigido contra

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IgM de trucha (GrupoBios, Santiago, Chile). Las células control se incubaron con la misma dilución de suero preinmune. El Ac secundario cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 546 (Sigma) o Ac secundario anti-ratón conjugado con FITC, se diluyeron a una concentración de 1mg/ml en PBS 2% SFB y las células se incubarn 20min en hielo. Luego de lavar las células dos veces con PBS 2% SFB, se aregó Ioduro de propidio (PI) a cada muestra (2µg/ml) para descartar células no viables. Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSAria (Becton Dickinson). Se grabaron 10.000 eventos en cada muestra. El análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando los programas FacsDiva software (BD Biosciences) y Cyflogic software (CyFlo Ltd.). Para los experimentos de cell-sorter, los HKLs se marcaron con anti-MHCII e anti-IgM siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células aisladas se recibieron en 500μl de SFB solo; se recolectaron 2 x 106 células por cada población aislada. Aislamiento de ARN, síntesis de cADN y análisis mediante PCR El ARN total de leucocitos aislados, tejidos o HKLs cultivados in vitro 24h sin estimulación o estimulados, como se indica respectivamente, proveniente de salmón fue aislado siguiendo el protocolo que se describe a continución. En el caso de los experimentos de cell-sorter las poblaciones fueron aisladas para luego analizar el perfl transcripcional de las diferentes poblaciones obtenidas. El aislamiento de ARN se realizó siguiendo las instrucciones del proveedor utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). La digestión del ADN genómico se realizó utilizando RNase-Free DNase set (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. La concentración y pureza del ARN obtenido se evaluó mediante Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer (Nanodrop Tec., Wilmington, DA, USA) y su integridad fue evaluada mediante gel de agarosa al 1%. Todas las muestras presentaron una relación OD260/280 entre 1.9 y 2.1. Todos los reactivos fueron provistos por Applied Biosystems, USA. Para la síntesis de cADN se utilizaron 500ng de ARN en todas las muestras. La síntesis de cADN se realizó con una mezcla de hexámeros al azar en un volumen de reacción de 10μl, utilizando TaqMan Reverse Transcription Reagents kit, siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). El cADN obtenido se diluyó con 90μl de agua libre de DNase y fue usado como templado para los análisis de PCR o PCR en tiempo real. Los análisis de PCR convencional se realizaron utilizando Go Taq DNA polymerase Master Mix (Promega, USA). Esta es una solución que contiene Go Taq ADN polymerasa, dNTPs y MgCl2. La reacción de PCR contiene 10μl of Go Taq Master Mix, 1μl de cada partidor sentido y antisentido (10μM) descritos en la Tabla III, 3μl de cADN diluido en un volumen final de reacción de 20μl. El análisis de PCR se realizó para los siguientes genes: TCR, CD4, CD3, CD8, CD11c, CD83, MHCII, IgM y EF1aB se usó como referencia (housekeeping).

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Las condiciones de amplificación fueron las siguientes; 96ºC por 5min seguido por 35 ciclos de 96ºC por 30s, 58ºC por 30s, 72ºC por 30 y una etapa final de 72ºC por 10 min. Tabla III. Secuencias de partidores utilizados para análisis de PCR convencional.

Gen Sentido (5'-3') Antisentido (5'-3')

EF1A CTCAAAGAACGGGCAGACTC AGATGGGCACAAAGGCGACT

IgM TAGTGGCTTGGCTTATTGATG AGGTTCTGTCAATGGTTCTCA

CD8 ATAACGGCAGAGGACGCAG CACAGCCTTTTGGGGTTTGAT

CD4 GGAGATGTGCTTGTGTATGG GATTTGAAGTCCTCCAGTCT

CD3 TGGAATACAAGGATGAGAACT GGCTGTGAGGCGATACTGT

CD11c GGGACTTACACGGCAGCAG CGAATAATGTTTTTGGCGTCAG

CD83 TCTGATAAGGAGTCTGGTCT TCATCAGCCAAAAGTTCCAC

MHC-II CTTCTTCCCCAAACCAATCA CTTATTCCTCTCAGCCTCAG

CXCL10 AGGAGTGTGCAGTAAATCTGTGAAC CTCATGGTGCTCTCTGTTCCA

IFN B CTCTCAGATATGGGTGGACTCTTTC AAGATCCTCTGGAAACATTTGTTCGA

IFN C TGGGCAGTGTGGATACAAGTG CTGCAATGTTCCCAAAGTACGTATT

IFN γ AAGGGCTGTGATGTGTTTCTG TGTACTGAGCGGCATTACTCC

IL-1 GCTGGAGAGTGCTGTGGAAGA TGCTTCCCTCCTGCTCGTAG

IL-10 ACTCCGCACATCCTTCTCCACCA TCATGGCGGTGGGCAACACC

CD40 ATGCCATGCCAAGAGGGTGAAT ATTTGCATGGGCTGAGGCTTGT

B7-H1 ACATGTGTCCAGGCTGAGGATCAA ATTGTGGCAAGAGGATAGCCCTCA

Análisis por PCR en tiempo real (RT-PCR) Los análisis de RT-PCR se realizaron para determinar la abundancia de diferentes transcritos codificantes para diferentes genes en tejidos o leucocitos aislados. Las reacciones de RT-PCR se realizaron en duplicado, donde cada reacción contiene 2.5 μl del cADN templado (equivalente a 3.5ng de ARN), 22.5μl de Fast SYBR Green Master Mix (2x; Applied Biosystem) y 150nM de los partidores sentido y antisentido listados en Tabla II, en un volumen de 25μl. El perfil de amplificación consistió en una etapa inicial de desnaturación a 95°C por 20s, seguido por 40 ciclos a 95°C por 3s y 60°C por 60s; curva de disociación de 60°C a 95°C en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). La especificidad de la amplificación se analizó usando la curva de disociación, y los valores de expresión relativa se normalizaron con los valores obtenidos para el gen de EF1Ab y calculados utilizando el método descrito Pfaffl (64).

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Tabla IV. Secuencia de partidores utilizados en el análisis de PCR en tiempo real.

CD40L Fwd: CACCAGGACCGGGCCACAAC Rev: TGGGCACACCCCCAGTGAGT

CD40 Fwd: ATGCCATGCCAAGAGGGTGAAT Rev: ATTTGCATGGGCTGAGGCTTGT

B7-H1 Fwd: ACATGTGTCCAGGCTGAGGATCAA Rev: ATTGTGGCAAGAGGATAGCCCTCA

CD83 Fwd: GTGGCGGCATTGCTGATATT Rev: CTTGTGGATACTTCTTACTCCTTTGCA

IL-1β Fwd: CCCATCACCATGCGTCAC Rev: CTCCAACTCCAACACTATATG

IL-10 Fwd: ACTCCGCACATCCTTCTCCACCA Rev: TCATGGCGGTGGGCAACACC

IL-12b Fw: ATCAAGCAGCCAGTATGGGACAGA Rv: TCCTGCAAGCTCACTGTCCTTCAT

IFN B Fwd: CTCTCAGATATGGGTGGACTCTTTC Rev: AAGATCCTCTGGAAACATTTGTTCGA

IFN C Fwd: TGGGCAGTGTGGATACAAGTG Rev: CTGCAATGTTCCCAAAGTACGTATT

IFN γ Fwd: AAGGGCTGTGATGTGTTTCTG Rev: TGTACTGAGCGGCATTACTCC

MHCIIβ Fwd: AGAAGCCTGGAACAAAGGTCCTGA Rev: AACTGTCTTGTCCAGTATGGCGCT

IL-15 Fwd: CACCATGACAGGTTTTTTGAC Rev: TCAACTGACAGTTGTCCCTAT

CCL-4 Fwd: CACCATGTTCACCCCTCGTCT Rev: TTACAGGAGTGGTGTCTGCTC

IL-2 Fwd: CACCATGGACCGTCTTTACAG Rev: TTATCCACGCTTTACAGCATG

EF1aB Fwd: TGCCCCTCCAGGATGTCTAC Rev: CACGGCCCACAGGTACTG

Análisis de secuencias Péptido señal, regiones transmembrana hidrofóbicas, sitios de N-glicosilación, masa molecular, motivos funcionales y estructura terciaria se identificaron utilizando la base de datos y servidores previamente descritos (63). Los diferentes alineamientos de secuencias de proteínas se generaron usando el programa Cluster W y el porcentaje de similitud entre las secuencias se calculó utilizando MatGAT 4. Los análisis filogenéticos se realizaron usando MEGA 5.0 con el método neighbour-joining. Los números de acceso de las secuencias utilizadas en el análisis filogenético se listan en Tabla V.

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Tabla V. Número de acceso de las secuencias utilizadas para el análisis filogenético de CD40L y CD40.

Análisis filogenético CD40L Análisis filogenético CD40

CD40L CD40

Human NP_000065.1 Monkey ABA29632.1

Monkey NP_001028011.1 Human EAW75763.1 Cow NP_777049.1 Dog AAP86653.1 Cat NP_001009298.1 Cow AAC48710.1 Dog AAD04375.1 Mouse AAH29254.1

Mouse NP_035746.2 Rat AAF43717.2 Rat NP_445805.1 Chicken ABV03588.1 Chicken NP_990064.1 Zebrafish NP_001138718.1 Zebrafish NP_001138281.1 Salmon NP_001134708.1 Trout NP_001118138.1 J. flounder BAC87848.1 Salmon NP_001140007.1 CD27

TNFα Rat AAH95844.1

Human BAG70306.1 Mouse NP_001028298.1 Monkey ABF67511.1 Human AAH12160.1 Dog AAL26919.1 OX40

Mouse CAA68530.1 Mouse CAA79772.1 Zebrafish NP_001019618.1 Rat NP_037181.1

FasL Human AAB33944.1 Zebrafish NP_001036166.1 NGFR

Mouse AAH52866.1 Human NP_002498.1 Rat NP_037040.1 Rat NP_036742.2 Human NP_000630.1 Mouse AAH38365.1 Monkey NP_001028010.1 Fas Mouse ABI24113.1 Human CAI13871.1 Zebrafish ABG91567.1 TNFR2 Rat NP_569110.1 Mouse NP_035740.2 Human NP_001057.1 TNFR1 Zebrafish NP_998355.1 Human AAA61201.1 Rat NP_037223.1 Mouse NP_035739.2

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Microscopía electrónica de Transmisión (MET) y de fluorescencia HKLs previamente incubados con microesferas fluorescentes se lavaron 3 veces con PBS 3% SFB y 4.5% D-glucosa (Sigma), para luego centrifugarlos a 100g x 10min a 4°C para remover las microesferas no fagocitadas. Finalmente, los HKLs se resuspendieron en 1ml de PBS y se cargaron en portaobjetos tratados previamente con poly-lysina para el análisis de microscopía de fluorescente (OLYMPUSYX70). Para el análisis mediante MET, los HKLs previamente co-cultivados con microesferas fluorescentes se fijaron en una solución de 2.5% glutaraldehído 0.1M buffer cocadilato de sodio, el tratamiento y análisis de las muestras fue conducido en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. Modulación de la expresión de CD40/ CD40L en HKLs Leucocitos aislados de riñón cefálico (HKLs) se cultivaron en medio completo en ausencia o presencia de diferentes estímulos: LPS de E. coli (0111:B4; 50μg/ml), polyinoscinic:polycytidylic acid (poly I:C; 50μg/ml), PMA (100ng/ml), PHA (de red kidney bean Phaseolus vulgaris; 10μg/ml), Concavalina A (Con A; 25μg/ml) o CpG de clase B (5`-TCGTGCTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3`; 2μM) por 4, 12 y 24h. Todos los reactivos fueron proporcionados por Sigma-Aldrich, a excepción de CpG clase B (Thermo fisher Scientific GmbH). Los diferentes estímulos se diluyeron en medio completo antes de su adición a los cultivos celulares. Clonamiento y expresión de CD40L Las secuencia codificante para CD40L de Salmo salar se clonó en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen) como describe Pedersen y col. (65). Brevemente, el ARN de leucocitos cultivados 12h en ausencia o en presencia de los diferentes estímulos se aisló disolviendo las células en Trizol Reagent (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los RT-PCR fueron realizados como se describió con anterioridad utilizando los partidores mostrados en la Tabla II. El producto de PCR se purificó utilizando Qiagen gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany). La correcta dirección del inserto y clonamiento de la secuencia se corroboró mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación. Los fragmentos resultantes se transfirieron al vector de expresión Gateway compatible para sistemas eucarióticos, que cuenta con un promotor CMV y tag GFP. Se utilizó un vector que cuenta con un promotor CMV, pero sin tag GFP, denominado 12.2. Los siguientes constructos: CD40L/pDEST-GFP y CD40L/12.2 se utilizaron para transfectar células de las líneas celulares de salmónidos CHSE-214 y TO.

23

Para la transfección, las células CHSE-214 o TO se cultivaron en placa de 24 pocillos a una densidad de 5x104 cel/pocillo y se dejaron crecer hasta obtener un 80-90% de confluencia. El reactivo de transfección FuGENE HD (Roche Applied Science) se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Un total de 0.3μg del plasmidio se mezcló con 1.5μl de FuGENE HD en 50μl EMEM, se incubó durante 15 min antes de ser agregado a las células. Luego de 48h de cultivo, las células transfectadas se lavaron dos veces en medio sin suero, se fijaron con 1% paraformaldehído (Sigma) por 20min y luego se lavaron 3 veces con PBS, quedando en condiciones óptimas para el co-cultivo con leucocitos de Salmo salar. Análisis mediante Western blot Células CHSE-214 sobreexpresando CD40L o transfectadas con el vector vacío, se lavaron en PBS y se recolectaron en buffer SDS (160nM Tris-HCl, pH 6.8, 10% β-mercaptoetanol, 2% SDS, 20% glicerol y 0.1% azul de bromofenol). Los sobrenadantes de HKLs o de esplenocitos estimulados, ya sea con CD40L o CpG se diluyeron a la mitad en buffer SDS. La expresión de CD40L o secreción de IgM se estudió como se describe a continuación. Células CHSE lisadas o los sobrenadantes mencionados anteriormente se hirvieron por 10min y se sometió a análisis mediante Western blot utilizando el sistema NuPage (Invitrogen). La transferencia e incubación con los respectivos anticuerpos (Ac) (anti-GFP; anti-CD40L, anti-Actina, anti-IgM dilución1/1000) se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticuerpo secundario utilizado corresponde a anti-conejo o anti-ratón marcado con peróxidasa de rábano (Santa cruz Biotecnology) diluidos 1/10000. La detección se realizó utilizando el sustrato quimioluminicente SuperSignal West Pico y el sistema de imagen molecular Carestream Health, Inc., Rochester, NY, USA. Co-cultivo de leucocitos de Salmo salar y CHSE-214 que sobreexpresan CD40L y análisis mediante citometría de flujo HKLs o esplenocitos fueron co-cultivados con células CHSE-214 fijadas y que sobreexpresan CD40L o con CHSE-214 transfectadas con el vector vacío como control de transfección por 1, 3, 7 y 12 días. Posterior al tratamiento, las células se tripsinizaron y transfirieron a tubos de microcentrífuga en hielo. Los leucoctios se marcaron siguiendo el protocolo descrito por Iliev y col. (20). Brevemente, las células se lavaron en PBS frío y se incubaron con antisuero anti-MHCIIβ (dilución 1/1000) o ascítico anti-IgM (1/400) por 20min en PBS 2% SFB en hielo. Las células control se incubaron con el suero pre-inmune o con un Ac monoclonal no relacionado a las mismas diluciones por 20min.

24

Luego se agregó el Ac secundario anti-conejo Alexa546 o anti-ratón Alexa546 diluido a una concentración de 1mg/ml en PBS 2% SFB y las células se incubaron por 20min adicionales en hielo. Para los experimentos de captura de antígeno, se utilizó ovoalbúmina conjugada con Alexa flúor 647. Los HKLs estimulados, ya sea con CD40L o CpG se incubaron por 4h con 15μg/ml ovoalbúmina marcada, luego los leucocitos se lavaron dos veces con PBS 2% SFB y se marcaron con los Ac respectivos siguiendo el protocolo mencionado anteriormente. Las células marcadas se analizaron mediante citometría flujo en un equipo FACSAria (Becton Dickinson). Se grabaron 10.000 eventos para cada una de las muestras y el análisis de los datos se realizó usando el software FacsDiva software (BD Biosciences) y Cyflogic software (CyFlo Ltd.). ELISA de captura Los sobrenadantes de HKLs o esplenocitos estimulados con CD40L o CpG a diferentes tiempos se evaluaron mediante ELISA de captura para determinar la secreción de IgM. Brevemente, 100μl del Ac de captura (anti-IgM monoclonal) diluido 1/1000 en Coating buffer (0.1M Carbonato pH 9.5) se agregó a cada pocillo en placa de 96 pocillos y se incubaron toda la noche a 4°C. Posteriormente los pocillos se lavaron 3 veces con 400μl de solución de lavado (PBS 0.05% Tween 20), se bloqueó agregando 400μl a cada pocillo de tampón PBS 10% SFB (solución de bloqueo) por 1h a t° ambiente. Luego se lavó los pocillos nuevamente y se agregó 100μl de los sobrenadantes diluidos en solución de bloqueo y se incubaron por 2h a t° ambiente. Se lavó los pocillos 5 veces y se agregó 100μl de la solución que contiene Ac anti-IgM policlonal + Avidin-HRP y se incubó por 1h t° ambiente. Los pocillos se lavaron 7 veces y se agregó 100μl de solución con sustrato (tetramethylbenzidine + H2O2) incubándose 20min en oscuridad, la reacción se detuvo agregando 50μl de solución de detención (H3PO4 1M) y la absorbancia se midió a 450nm. Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos obtenidos se realizó utilizando GraphPad Prism Statistics package. La expresión relativa se obtuvo normalizando los datos con los valores obtenidos para el gen de referencia (housekeping) EF1aB y el control que presentó el nivel de expresión más bajo fue definido como 1. Los datos se compararon utilizando análisis de dos variables (two-way ANOVA) seguido por la hipótesis de comparación múltiple de Bonferroni, donde P < 0,05.

25

RESULTADOS

Primera Parte

Efecto de inmunoestimulantes y caracterización de subpoblaciones linfocitarias en el Sistema Inmune de Salmo salar

Efecto de diferentes regímenes de alimentación en parámetros de inmunidad innata en Salmo salar

Como se mencionó anteriormente, la inmunidad innata en vertebrados inferiores, como en teleósteos, es muy variada e importante para la defensa contra patógenos, de ahí que parámetros que midan activación de macrófagos, tales como estallido respiratorio, fosfatasa lisosomal y peroxidasa lisosomal son cruciales para el estudio del estado inmunológico de peces. Con este objetivo diferentes grupos de alevines de Salmo salar se alimentaron con distintos inmunoestimulantes comerciales durante el periodo indicado por el fabricante, equivalente a tres meses. Las dietas utilizadas fueron las siguientes: Dieta control (Omega, EWOS), Nutra Defense (Skreting) y Prohetox (Veterquímica). Luego de tres meses de tratamientos, se aislaron los leucocitos de riñón cefálico (HKLs) de los diferentes grupos y se evaluaron diversos parámetros de inmunidad innata: estallido respiratorio, actividad de fosfatasa lisosomal y desgranulación de peroxisomas. La evaluación de especies reactivas de oxígeno presenta una relación directa con la activación de componentes de inmunidad innata, principalmente en macrófagos. La Figura 4 muestra esta respuesta en HKLs aislados de salmones alimentados con los diferentes regímenes de alimentación y co-cultivados durante 24h con diferentes inmunoestimulates tales como: poly I:C, ADN genómico derivado de V. anguillarum (DNAg), PMA y β-glucanos proveniente de Laminaria hyperborea (Laminaria). Nutra Defense, alimento calificado como rico en β-glucanos, induce la activación de todos los parámetros de inmunidad innata estudiados, principalmente fosfatasa lisosomal (Fig. 4A) y estallidos respiratorio (Fig. 4C). Por otra parte, Prohetox no induce diferencias significativas en los parámetros estudiados, comparado con la respuesta observada en el grupo control. Con respecto a los inmunoestimulantes aplicados in vitro, poly I:C presenta una respuesta levemente mayor que los grupos control. El ensayo de peroxidasa lisosomal (Fig 4B) no presenta inducción, lo que puede deberse al alto background obtenido en el ensayo.

26

Peroxidasa lisosomal

med

io s

olo

contr

ol

poli I:C

DNA g

PM

A

Lamin

aria

0

200

400

600

800

1000

1200Dieta Control

Nutra Defense

Prohetox

Ab

(x1000)

Respiratory Burst

medio

solo

control

poli I:C

DNA gPMA

Lamin

aria0

250

500

750

1000

1250Dieta Control

Nutra Defense

Prohetox

Ab

(x10

00)

Fosfatasa lisosomal

medio

solo

control

poli I:C

DNA gPM

A

Lamin

aria0

500

1000

1500

2000

2500Dieta Control

Nutra Defense

Prohetox

Ab

(x10

00)

A

B

C

FIGURA 4. Evaluación de parámetros de inmunidad innata en peces alimentados con diferentes

dietas comerciales. Tres diferentes grupos de peces se alimentaron durante 3 meses con dietas comerciales: dieta control (EWOS), Nutra Defense y Prohetox. HKLs fueron aislados y estimulados in vitro durante 24h con diferentes estímulos: medio de cultivo sin HKLs (medio), HKLs no estimulados (control), HKLs estimulados con poly I:C 10μg/ml (poli I:C), ADN genómico proveniente de V. anguillarum 50μg/ml (DNAg), PMA 7μg/ml (PMA) y Laminaria hiperborea con alto contenido de β-glucanos 100μg/ml (Laminaria). Luego de 24h de estimulación se evaluaron diferentes parámetros de inmunidad innata, tales como fosfatasa lisosomal (A), peroxidasa lisosomal (B) y estallido respiratorio (C). Los gráficos representan el promedio de tres experimentos independientes.

Estallido respiratorio

medio control poli I:C ADNg PMA β-glucanos

medio control poli I:C ADNg PMA β-glucanos

medio control poli I:C ADNg PMA β-glucanos

27

Evaluación de parámetros de inmunidad innata en Salmo salar inyectados intraperitonealmente (i.p.) con diferentes inmunoestimulantes

Dado los datos obtenidos anteriormente que muestran que la ingesta de alimentos ricos en β glucanos (Nutra Defense) induce la activación de parámetros de inmunidad innata en Salmo salar, quisimos estudiar si la vía de administración de los inmunoestimulantes afecta la acción inmunoestimuladora de estos. Con el fin de dilucidar su potencial uso como inmunoestimulantes acoplados en vacunas. Para esto, alevines de Salmo salar se inyectaron vía i.p. con diferentes inmunoestimulantes y lugo se aislaron los HKLs a diferentes tiempos para la evaluación de parámetros de inmunidad innata.

La Figura 5A muestra la activación de fosfatasa lisosomal, donde la

mayor inducción es obtenida en peces inyectados con LPS proveniente de V. ordalli a las 24h post-inyección seguido por el grupo tratado con Laminaria. Contrariamente, poly I:C y ADN genómico proveniente de V. anguillarum presentan un efecto muy modesto comparado con los grupos controles. Todos los inmunoestimulantes estudiados presentan la mayor inducción a las 24h, a excepción de Laminaria, cuya respuesta es un poco más sostenida en el tiempo (42h). Los resultados de estallido respiratorio (Figura 5B) se correlacionan claramente con los datos obtenidos en el ensayo de fosfatasa lisosomal, nuevamente LPS proveniente de V. ordalli y β-glucanos provenientes de Laminaria presentan los valores más altos de activación, además de Manto, proveniente de V. ordalli (incluido sólo en este grupo) que muestra niveles de activación similares a los valores obtenidos con los dos inmunoestimulantes mencionados anteriormente. Sin embargo, ADN genómico proveniente de V. anguillarum, rico en motivos CpG, induce una respuesta muy modesta comparada con los controles. Los datos sugieren que los inmunoestimulantes administrados vía i.p. son capaces de inducir una rápida activación de componentes de inmunidad innata, la cual declina luego de 24h post-tratamiento.

28

Fosfatasa lisosomal

0

1000

2000

3000

4000

5000

Cont

rol

Cont

rol P

BS

poli I:C

V. o

rdalli

Laminaria

V. a

nguilla

rum

Ab

(/1

000) 10 horas

14 horas

24 horas

42 horas

Respiratory burst

0200400600800

100012001400

Cont

rol

Cont

rol P

BS

V. o

rdalli

Laminaria

Man

to

V. a

nguilla

rum

Ab

(/1

000) 10 horas

14 horas

24 horas

42 horas

A

B

FIGURA 5. Evaluación de parámetros de inmunidad innata en peces tratados con diferentes inmunoestimulantes vía inyección i.p. HKLs se aislaron de los diferentes grupos de peces inyectados con diferentes inmunoestimulantes: no-inyectados (control), inyectados con control salino 100μl (control PBS), LPS proveniente de V. ordalli 1mg/Kg (V. ordalli), Laminaria hyperborea rica en β-glucanos 1mg/Kg (Laminaria), manto proveniente de V. ordalli 1mg/Kg (Manto) y ADN genómico proveniente de V. anguillarum 1mg/Kg (V. anguillarum). Se analizaron parámetros de inmunidad innata, tales como fosfatasa lisosomal (A) y estallido respiratorio (B). Los gráficos representan el promedio de tres experimentos independientes.

Estallido respiratorio

control PBS poli I:C LPS β-glucanos ADNg

control PBS LPS β-glucanos Manto ADNg

29

Caracterización de poblaciones linfocitarias en HKLs de Salmo salar

Estudios realizados por Iliev y col (32) demuestran que CpG clase B induce la diferenciación de progenitores proveniente de HKLs hacia células con características de APCs. Con esto en mente y en conjunto con los datos mostrados anteriormente iniciamos estudios con el fin de dilucidar si Salmo salar presenta subpoblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos. Con este propósito HKLs no estimulados y estimulados con CpG clase B por 24h se marcaron con los únicos dos anticuerpos disponibles para salmón, MHCII e IgM, y las diferentes subpoblaciones obtenidas se separaron mediante cell-sorter. El análisis mediante citometría de flujo muestra que tanto HKLs no estimulados (Fig. 6A) como los estimulados con CpG clase B (Fig. 6B) presentan claramente tres poblaciones celulares, 1: que corresponde a células positivas para IgM y MHCII, posiblemente linfocitos B (IgM+/MHCII+); 2: que representa células que expresan alta intensidad de MHCII, posibles APCs (MHCII++) y 3: que representa células negativas tanto para IgM como para MHCII, posiblemente linfocitos T (MHCII-). Pese a que HKLs tratados con CpG presentan las mismas tres subpoblaciones que HKLs no estimulados, el número de células presente en cada subpoblación varía. Haciendo relación con datos mostrados previamente (32), se observa que CpG induce un aumento en el número de células MHCII++, de un 22,23% en HKLs no estimuladas a un 38,2% en HKLs tratados con CpG. El porcentaje de células MHCII-, posiblemente correspondiente a linfocitos T, también presenta un leve aumento en presencia de CpG, de un 31,8% en HKLs no estimulados a un 35,59% en HKLs tratados con CpG, esto sugiere que CpG estaría influyendo no sólo la expresión de MHCII, sino también afectando a la población de HKLs que no expresan MHCII, posiblemente linfocitos T, ya sea directamente o indirectamente por medio de una red de señales coestimualotorias y citoquinas.

30

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

A B

FIGURA 6. Citometría de flujo y cell sorter de HKLs cultivados in vitro por 24h y marcados con

antisuero anti-MHCIIβ (conejo) y Ac anti-IgM (ratón) como Acs primarios y Ac anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 546 o Ac anti-ratón conjugado con FITC como Acs secundarios. Los gráfico dot-plot muestran la MIF de IgM v/s MIF de MHCIIβ (A) HKLs no estimulados cultivados in vitro 24h. (B) HKLs estimulados in vitro durante 24h con CpG clase B. Experimento representativo de tres experimentos independientes.

MHCIIβ

IgM

IgM

MHCIIβ

1A: 4,81%

3A: 31,8%

2A: 23,23% 2B: 38,2%

1B: 6,37%

3B: 35,59%

31

Perfil transcripcional de diferentes subpoblaciones linfocitarias de Salmo salar separadas mediante cell –sorter

Dado las tres poblaciones observadas en los datos anteriores y considerando que CpG induce un aumento en la expresión superficial de MHCII, cada una de las diferentes poblaciones fue separada mediante cell-sorter para luego analizar, mediante PCR en tiempo real, el perfil transcripcional de cada subpoblación. Los resultados de sorting dieron una pureza por sobre el 95% para las diferentes subpoblacione separadas (1A, 2A, 3A, 1B, 2B y 2C de Figura 3). Se analizaron diferentes genes perteneciente a los diferentes linajes celulares tales como IFNs y genes inducibles por IFN: IFNγ, CXCL10, IFN C, IFN B (Fig. 7A-D); mediadores proinflamatorios: OPG, DCR3, IL-1β, IL-10 (Fig. 7E-H), marcadores de poblaciones celulares: CD40, CD83, B7-H1, CD8 (Fig. 7I-L); y genes relacionados con linfocitos B: mIgM, PAX5, sIgM (Fig. 7M-O). Al igual que en mamíferos, se puede observar que CpG induce la expresión de diversos IFNs (IFNγ, IFN B e IFN C) en las tres diferentes poblaciones aisladas, pero particularmente IFNγ y CXCL10 (Fig. 7A-B), citoquinas característicamente secretadas por linfocitos T, son principalmente inducidos en la población MHCII-, esto sustenta la idea que la población de células MHCII- podría corresponder a linfocitos T en salmón. Por otro lado, CpG induce la expresión de citoquinas proinflamatorias, como IL-1β, IL-10 y DCR3 seguidos por OPG (Fig. 7E-H) en la población MHCII++, posibles APCs. Con respecto a marcadores de subpoblaciones celulares, se puede observar que CD40, (Fig. 7I) pese a estar presente principalmente en APCs, también es expresado en un amplio espectro de células, eso explicaría la elevada inducción observada en las tres poblaciones debido a CpG. Sin embargo, CD83 y B7-H1 (Fig. 7J-K), marcadores celulares presentes exclusivamente en APCs, son sobreregulados por CpG en células MHCII++. CD8, marcador exclusivo de linfocitos T citotóxicos, se expresa en la población MHCII- y al parecer CpG no ejercería un efecto directo en este grupo celular, ya que el tratamiento con CpG no induce una expresión significativa del transcrito para CD8.

La hipótesis que la población aislada IgM+/MHCII+ correspondería a linfocitos B, se ve respaldada por los datos obtenidos mediante PCR en tiempo real, en el cual la expresión del transcrito para IgM de membrana (mIgM), IgM soluble (sIgM) y PAX5 (Fig. 7 M-O) son altamente expresados en dicha población, en comparación con las otras dos poblaciones (MHCII- y MHCII++). CpG induce un efecto muy modesto en la expresión de mIgM y sIgM. Sin embargo, el tratamiento con CpG induce una disminución en la expresión de PAX5, esto podría deberse a que CpG induce la diferenciación de linfocitos B poco diferenciados o progenitores de linfocitos B hacia células con características de células plasmáticas, que se sabe que en mamíferos y peces expresan bajos niveles de PAX5, bajos niveles de Ig de superficies y secretan altas cantidades de Ig al medio (34).

32

IFNg

0

20

40

60

80

100

120

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

CXCL10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGIFNc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGIFNb

0

100

200

300

400

500

600

700

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

OPG

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGDCR3

0

20

40

60

80

100

120

140

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGIL-1b

0

100

200

300

400

500

600

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGIL-10

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

CD40

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGCD83

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

B7

0

2

4

6

8

10

12

14

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpGCD8

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

mIgM

0

0.5

1

1.5

2

2.5

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

PAX5

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

sIgM

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

MHCII- MHCII+/Ig+ MHCII++

NS

CpG

A B C D

E F G H

I J K L

M N O

FIGURA 7. PCR en tiempo real de poblaciones de HKLs separadas mediante cell sorter. Las diferentes poblaciones MHCII

-, MHCII

+/Ig

+ y MHCII

++ de HKLs cultivados in vitro 24h no

estimulados (NS) o estimulados con CpG clase B (CpG) fueron separadas mediante cell sorter y el perfil transcripcional se analizó mediante PCR en tiempo real. Se analizaron varios genes, tales como IFNs y genes inducibles por IFN (A-D); mediadores proinflamatorios (E-H); marcadores de subpoblaciones celulares (I-L) y genes relacionados con linfocitos B (M-O).

Experimento representativo de dos experimentos independientes.

Exp

resi

ón

rel

ati

va

33

Caracterización de población fagocítica en HKLs de Salmo salar

Los datos de PCR en tiempo real mostrados anteriormente sugieren que Salmo salar poseería subpoblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos. Sin embargo, una de las características principales de APCs es su capacidad de fagocitar antígenos, degradarlos y presentarlo a linfocitos T. Para determinar si la población MHCII++ obsevada en Salmo salar corresponde a APCs propiamente tal, hemos evaluado la capacidad fagocítica de HKLs. Con este fin, células totales de riñón cefálico (HKLs) se aislaron e incubaron 24h con microesferas fluorescentes para evaluar su capacidad fagocítica. La Fig. 8A muestra dot-plot de SSC (granularidad) v/s MIF de microesferas fluorescentes donde HKLs presenta dos poblaciones claramente definidas. En analogía a lo observado en mamíferos, una población de menor granularidad correspondería a linfocitos (gate color negro) y la otra, que son células que presentan mayor granularidad correspondería a granulocitos/macrófagos (gate color rojo). Se puede observar que las células capaces de fagocitar microesferas pertenecen a la población de células que presentan mayor granularidad y que estas células fagocitan una o más microesferas, denotado por la intensidad de fluorescencia de las microesferas.

Con el objetivo de caracterizar la población capaz de fagocitar las microesferas, HKLs co-cultivados con microesferas se marcaron con Ac anti-MHCII y anti-IgM. En Fig. 8B se observa que el 24,4% de la población capaz de fagocitar microesferas es MHCII+, sugiriendo que dicha población podría corresponder a posibles APCs en Salmo salar. Microscopía de fluorescencia muestra que las microesferas utilizadas para el ensayo de fluorescencia emiten en color azul y se observan asociadas a células de gran tamaño (Fig. 8C). Para determinar si éstas células efectivamente son capaces de fagocitar microesferas y descartar que dichas microesferas están asociadas en la superficie celular se realizó microscopía electrónica de transmisión (Fig. 8D) donde se puede observar los espacios vacíos dejados por las microesferas después de la tinción. La fig. 8E muestra una imagen amplificada de células que habrían contenido microesferas en su interior.

Con el fin de caracterizar con más detalle la subpoblación de HKLs capaz

de fagocitar microesferas, procedimos a realizar cell-sorting para obtener una población homogénea, fagocítica y altamente purificada. La Fig. 8F muestra granularidad v/s la intensidad de fluorescencia de microesferas, donde el 19,5% de HKLs son fagocíticas. Dicha población fue separada y se estudió su perfil transcripcional.

34

En la Fig. 8G se puede observar que la población no fagocítica (células microesferas (-)) y de menor tamaño, presenta marcadores característicos de linfocitos, tales como CD4, CD8 y CD3, en cambio la población de células fagocítias (células microesferas (+)) y de mayor tamaño es negativa para los marcadores mencionados anteriormente pero positiva para marcadores característicos de células presentadoras de antígeno (APCs), tales como CD11c, MHCII y CD83. Esto sugiere que Salmo salar presentaría componentes celulares similares a lo observado en mamíferos, es decir, linfocitos y APCs, y que estos presentarían un patrón transcripcional similar a lo observado en vertebrados superiores.Luego de determinar que existe una población de células MHCII++ capaz de fagocitar partículas, decidimos investigar la posibilidad que éstas células fagocitaran moléculas solubles como una manera de identificar aquellas células que pudieran presentar antígenos presentes en vacunas o en inmunoestimulantes. Capacidad fagocítica de linfcitos B en Salmo salar Con el objetivo descrito anteriormente y para estudiar el efecto de inmunoestimulante, relacionando fagocitosis e inmunoestimulación, hemos realizado un ensayo de endocitosis utilizado CCH (Concholepas concholepas hemocyanin) la cual corresponde a una proteína de aproximadamente 8MDa, ampliamente conocida por su efecto inmunoestimulante y utilizada como carrier para vacunas (35), sin embargo, los mecanismos exactos por los cuales estaría ejerciendo su efecto inmunoestimulante no son del todo claro. En los datos anteriores hemos demostrado que HKLs de Salmo salar responden a diferentes inmunoestimulantes y que poseerían diferentes subpoblaciones linfocitarias que presentan un perfil transcripcional similar a lo observado en mamíferos. Debido a esto, hemos evaluado el efecto de CCH en HKLs de Salmo salar. Con este fin, HKLs aislados se incubaron 24h in vitro con CCH conjugada a Alexa flúor 647. Posteriormente las células se analizaron mediante citometría de flujo. La Fig. 9A muestra el dot-plot del MIF de CCH v/s MIF de IgM, donde se pueden observar tres diferentes subpoblaciones: CCH-

/IgM- correspondiente a células IgM- y que no incorporan CCH (cuadrante inferior izquierdo: 60,3%); CCH+/IgM-, son células capaces de incorporar CCH, pero son negativas para IgM+ (cuadrante superior izquierdo: 15,3%). Finalmente y muy interesante es la población CCH+/IgM+, que representa el 16,3% del total de HKLs, pero que equivale al total de células positivas para IgM. Esta población correspondería a linfocitos B capaces de fagocitar CCH (cuadrante superior derecho). Por otro lado, al observar la Fig. 9B que muestra MIF de CCH v/s MIF de MHCII, se observa que el 26,3% de HKLs incorporan CCH y además son positivas para MHCII (cuadrante superior derecho).

35

Microesferas Blue bright

Células de riñón Salmo salar

Cultivadas 24h con microesferas

Microesferas Blue bright

Células de riñón Salmo salar

Cultivadas 24h con microesferas

80%

19,4%

Microesferas Blue bright

Células de riñón Salmo salar

Cultivadas 24hr con microesferas

gra

nu

lari

dad

80%

19,4%

Microesferas Blue bright

Células de riñón Salmo salar

Cultivadas 24hr con microesferas

gra

nu

lari

dad

6,6%31,3%

24,4%37,7%

6,6%31,3%

24,4%37,7%

A B

C D E

F G

FIGURA 8. Análisis de la población fagocíticas de células provenientes de HKLs de Salmo

salar. HKLs se aislaron e incubaron durante 24h con microesferas fluorescentes. El análisis mediante citometría de flujo muestra en (A) Gráfico dot-plot granularidad v/s MIF de microesferas blue-bright de HKLs totales. (B) dot-plot de intensidad de fluorescencia de MHCII v/s MIF de microesferas en HKLs. (C) Microscopía de fluorescencia de HKLs cultivados 24h con microesferas blue bright. (D) Microscopía electrónica de transmisión (MET) de HKLs cultivados 24h con micoesferas, flechas señalan células que incorporaron microesferas. (E) MET de HKLs cultivados 24h con microesferas fluorescentes amplificada 5700x. (F) Citometría de flujo-dot-plot muestra granularidad v/s MIF de microesferas blue bright de HKLs cultivados 24h con microesferas fluorescentes, las poblaciones separadas mediante cell sorter son las siguientes: P5: células microesferas (-) y P4: células microesferas (+). (G) Análisis por PCR convencional

de poblaciones separadas mediante cell sorter; se analizaron diferentes genes relacionados con subpoblaciones linfocitarias, tales como marcadores de linfocitos T (CD4, CD8 y CD3), marcadores de APCs (CD11c, MHCII y CD83) e IFNγ característico de respuesta tipo Th1. Experimento representativo de dos experimentos independientes.

CD4 CD8 CD3 CD11c St CD4 CD8 CD3 CD11c IFNγ MHCII CD83

Células microesferas (-) Células microesferas (+)

300 264 212 174 174 273 380 361

CD4 CD8 CD3 CD11c St CD4 CD8 CD3 CD11c IFNγ MHCII CD83

Células microesferas (-) Células microesferas (+)

300 264 212 174 174 273 380 361

Microesferas Blue bright

HKLs cultivadas 24h con microesferas

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El porcentaje levemente superior de células capaces de incorporar CCH en células marcadas con MHCII (26,3%) comparado con lo observado en células marcadas para IgM (16,3%), sugiere que el total de linfocitos B fagocitan la proteína CCH, pero que existe otra población MHCII+ que también incorpora CCH. Para dilucidar el origen de esta otra población que estaría incorporando CCH, realizamos cell-sorting de las tres poblaciones mencionadas anteriormente, las cuales son: CCH-/IgM- (60,3%), CCH+/IgM- (15,3%) y CCH

+/IgM

+ (15,3%) para luego analizar su perfil transcripcional. La Fig. 9C

muestra que la población CCH-/IgM- presenta transcritos para TCR, CD3 y CD8, marcadores celulares característicos de linfocitos T. Por otro lado, la población CCH+/IgM- es negativa para los transcritos mencionados anteriormente, pero positiva para marcadores de APCs tales como CD11c, CD83 y MHCII. Este es el mismo patrón transcripcional presente en células CCH+/IgM+, pero muy sorprendente es el hecho que la población CCH+/IgM+ presenta altos niveles del transcrito para IgM, esto confirmaría que los datos obtenidos por el perfil transcripcional se correlacionan con los datos de expresión de proteína, ya que esta población presenta IgM en su superficie (medido mediante citometría de flujo). Eso sugiere fuertemente que los linfocitos B, también positivos para MHCII, son capaces de incorporar antígeno y posiblemente actuar como APCs en Salmo salar. Es interesante notar que esta población IgM+ MHCII+ incorporan CCH, una proteína soluble y no fagocita las partículas sólidas como serían las microesferas de látex.

37

15,3%

60,3% 8,1%

16,3%

Células de riñón cultivadas 24h

con CCH-Alexafluor 647

15,3%

60,3% 8,1%

16,3%15,3%

60,3% 8,1%

16,3%

Células de riñón cultivadas 24h

con CCH-Alexafluor 647

21,5% 42,8%

26,3%9,4%

Células de riñón cultivadas 24h

con CCH-Alexafluor647

21,5% 42,8%

26,3%9,4%

21,5% 42,8%

26,3%9,4%

Células de riñón cultivadas 24h

con CCH-Alexafluor647

A B

C

FIGURA 9. Incorporación de CCH por linfocitos B de Salmo salar. (A) Dot-plot MIF de CCH-

Alexa647 v/s MIF de IgM en HKLs co-cultivados in vitro con 50μg/ml CCH por 24h. (B) Dot-plot MIF de CCH-Alexa647 v/s MIF de MHCII en HKLs co-cultivados in vitro con CCH por 24h. (C) Se realizó cell-sorting de las diferentes poblaciones indicadas en dot-plot: CCH

-/IgM

- (cuadrante

inferior izquierdo); CCH+/IgM

- (cuadrante superior izquierdo) y CCH

+/IgM

+ (cuadrante superior

derecho), se aisló el ARN y se analizó el perfil transcripcional de cada población. Se analizaron genes característicos de linfocitos T, tales como TCR, CD4, CD3 y CD8; genes presentes en APCs, CD11c, CD83 y MHCII; genes de linfocitos B, IgM y EF1 como referencia (housekeeping). Experimento representativo de dos experimentos independientes.

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM – cuadrante superior izquierdo

TCR CD4 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM + cuadrante superior derecho

CCH - CCH+/ IgM + IgM

15,3%

60,3% 8,1%

16,3%

C é lulas de ri ñó n cultivadas 24h con CCH - Alexafluor 647

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH - / IgM - cuadrante inferior izquierdo

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM – cuadrante superior izquierdo

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM – cuadrante superior izquierdo

TCR CD4 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM + cuadrante superior derecho

TCR CD4 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH + / IgM + cuadrante superior derecho

CCH - CCH+/ IgM + IgM

- IgM +

15,3%

60,3% 8,1%

16,3%

C é lulas de ri ñó n cultivadas 24h con CCH - Alexafluor 647

15,3%

60,3% 8,1%

16,3% 15,3%

60,3% 8,1%

16,3%

C é lulas de ri ñó n cultivadas 24h con CCH - Alexafluor 647

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH - / IgM - cuadrante inferior izquierdo

TCR CD4 CD3 CD8 CD11c CD83 MHCII EF1

CCH - / IgM - cuadrante inferior izquierdo

CCH- CCH+ CCH+

IgM- IgM- IgM+

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DISCUSIÓN PRIMERA PARTE

Efecto de inmunoestimulantes y caracterización de subpoblaciones linfocitarias en el Sistema Inmune de Salmo salar

La salmonicultura es uno de los pilares de la economía chilena, de ahí la importancia en optimizar los niveles de sanidad y producción en dicha industria. En el presente estudio hemos analizado el efecto de diferentes dietas comerciales en varios parámetros de inmunidad innata, demostrando que el tipo de alimentación es clave en definir el estado inmunológico de los peces. Por otro lado, y muy importante es la caracterización del sistema inmune de Salmo salar, ya que de esta manera se puede optimizar y entender el mecanismo por el cual tanto enfermedades como inmunoestimulantes y vacunas estarían ejerciendo su acción. Nuestros datos soportan la hipótesis que el sistema inmune en Salmo salar cuenta con poblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos, con una especial característica: los linfocitos B presentan la capacidad de incorporar antígenos. Estos estudios permitirían por un lado dilucidar la organización del sistema inmune en salmón y por el otro entender el mecanismo evolutivo de sistema inmune en vertebrados superiores.

En la actualidad el mercado ofrece diversos tipos de alimentos e

inmunoestimulantes que se administran vía oral para el cultivo de Salmo salar, pero son escasos los estudios que evidencian su real efecto sobre el estado inmune en Salmo salar. Nutra Defense es una dieta comercializada por Skretting que presenta altos niveles de β-glucanos, la cual muestra tener un efecto beneficioso en parámetros de inmunidad innata, al evaluar fosfatasa lisosomal, peroxidasa lisosomal y estallido respiratorio. En la Fig. 4 se observa que los peces alimentados con Nutra Defense presentan activación de los macrófagos, observado por los altos niveles de estallido respiratorio, niveles que son levemente inducidos en presencia de poly I:C in vitro. Sin embargo, los animales alimentados con Prohetox no presentan activación de los parámetros mencionados anteriormente comparado con la dieta control. Esto sugiere que los peces responden a inmunoestimulantes administrados oralmente, pero el tipo de inmunoestimulante es clave para obtener una respuesta inmune beneficiosa en peces.

Dado la importancia en la vía de administración del inmunoestimulante

para obtener una respuesta por parte de Salmo salar, hemos estudiado la incorporación de diferentes inmunoestimulantes por la vía intraperitoneal.

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Los datos muestran que LPS y un polisacárido complejo extra celular (manto) derivado del patógeno V. ordalli induce la activación de macrófagos (estallidos respiratorio y fosfatasa lisosomal), seguido por el efecto inducido por Laminaria (Fig. 5). Esto abre nuevas posibilidades, donde LPS podría ejercen un papel crucial como inmunoestimulante induciendo activación de inmunidad innata.

Para entender el mecanismo por el cual los inmunoestimulantes ejercen

su efecto, la dilucidación de la estructura del sistema inmune juega un papel clave. Nuestros datos muestran que Salmo salar cuenta con subpoblaciones celulares similares a las observadas en mamíferos (Fig. 6), presentando una población IgM+/MHCII+ correspondiente a linfocitos B; una población MHCII++ que correspondería a APCs y una población MHCII- que correspondería a linfocitos T. Los perfiles transcripcionales hacen relación con los datos observados mediante citometría de flujo (Fig. 7), donde las células IgM+/MHCII+ presentan los transcritos mIgM, PAX5 y sIgM, confirmando la existencia de linfocitos B en progenitores derivados de HKLs. Por otro lado, la población MHCII++ es positiva para citoquinas proinflamatorias como IL-1 e IL-10 y marcadores característicos de APCs como CD83 y B7-H1 marcadores que además son inducidos en presencia de análogos del ligando para TLR9 (CpG), cualidad clave de células presentadoras de antígeno maduras o diferenciadas. La población MHCII- presenta un perfil transcripcional positivo para CD8, IFNs y CXCL10, particularmente CpG induce la expresión de IFNs, en esta población sugiriendo que este grupo correspondería a células con características de linfocitos T. Una vez definidas estas tres subpoblaciones, hemos demostrado que HKLs son capaces de fagocitar microesferas y que esta población fagocítica es MHCII+ presentando transcritos característicos de APCs como CD11c, MHCII y CD83 mientras que no presenta transcrito para CD4, CD8 y CD3 (Fig. 8). Esto fundamenta la idea que HKLs contiene precursores capaces de diferenciar hacia diferentes subpoblaciones linfocitarias, tales como células presentadoras de antígeno y linfocitos del linaje T y B.

Una característica presente sólo en teleósteos es la capacidad que

presentan los linfocitos B de incorporar antígenos (14). En Salmo salar linfocitos B expresan IgM y MHCII en su superficie y en el presente estudio hemos demostrado que son capaces de incorporar proteínas, como es el caso de CCH (pero no partículas) (Fig. 9) lo cual las identificaría como células presentadoras de antígeno. Nuestros resultados difieren levemente a los datos obtenidos por Li et al. (14), donde se muestra la capacidad de linfocitos B obtenido de sangre periférica de fagocitar microesferas. Nosotros hemos realizados nuestros experimentos con linfocitos B aislados de riñón cefálico, los cuales no son capaces de fagocitar microesferas, pero si incorporan proteínas.

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Esto explicaría las diferencias observadas y paralelamente reafirmaría la hipótesis que las células presentes en riñón cefálico se encontrarían en un estado de diferenciación menor a las presentes en bazo o sangre, quizás en estado de células precursoras, lo que se respalda con los datos obtenidos mediante PCR en tiempo real y el estudio de la secreción de IgM.

Hemos realizado varios intentos para demostrar la capacidad de las

distintas poblaciones de presentar y activar los linfocitos T. Sin embargo, pese a que no hemos sido capaces de concretar estos estudios de presentación antigénica, debido a la carencia de Ac necesarios para la purificación de las diferentes poblaciones, nuestros datos respaldan la hipótesis que los teleósteos presentarían componentes celulares similares a lo observado en vertebrados superiores, donde el riñón cefálico aparentemente cumpliría una función similar a médula ósea en mamíferos, conteniendo progenitores capaces de diferenciarse hacia las diferentes subpoblaciones mencionadas anteriormente. En vista de las dificultades existentes en el estudio de la respuesta inmune de los teleósteos como consecuencia de la falta de reactivos para aislar las diferentes subpoblaciones inmunes, iniciamos estudios, que aunque indirectamente, permitirían estudiar la funcionalidad del sistema inmune de los peces. Estos experimentos se describen en la segunda parte del presente proyecto de tesis.

41

Segunda Parte

La interacción CD40/CD40L es una importante vía coestimulatoria en la maduración de APCs en teleósteos

Conservación estructural y funcional de CD40L y CD40 en Salmo salar Caracterización de CD40L y CD40 de salmón

Para la caracterización de CD40L de Salmo salar se utilizó la secuencia del gen de salmón disponible en la base de datos genebank (EMBL número de acceso BT057331.1). El cADN para CD40L de Salmo salar consiste de una secuencia de 1164-bp conteniendo un ORF de 795-bp. La proteína CD40L, sería una proteína de 219-aminoácidos que posee características de proteínas de membrana tipo II y consiste de una región extracelular de 219 aa que contiene el C-terminal además de cuatro residuos de cisteína; un dominio transmembrana de 20 aa y una región citoplasmática de 21 aa conteniendo el extremo N-terminal.

El péptido maduro corresponde a 264 aa, con una masa molecular teórica de 29,67 kDa; con un punto isoeléctrico de 8.69 y un potencial sitio de N-glicosilación (N219). El alineamiento de la secuencia de CD40L de Salmo salar muestra alta identidad con las secuencias de CD40L de trucha (95,8%) y algo menor con pez cebra (39,1%), mientras que la identidad con las secuencias de CD40L de otros vertebrados, incluyendo humano corresponde solo a un 25% (Fig. 10A). Como se observa en la Fig. 10A dos residuos de cisteína presentes en la posición 83 y 93 están conservados entre todas las moléculas de CD40L alineadas, incluyendo mamíferos, plumíferos y teleósteos. Sin embargo, dos residuos de cisteína presentes en las posiciones 178 y 218 en la molécula de CD40L en humano, que han sido identificados como residuos claves para la formación de un puente disulfuro y del sitio proteolítico que permite la existencia de CD40L en forma soluble, no están conservados en la molécula de Salmo salar. En reemplazo, la molécula de salmón presenta dos residuos de cisteína en las posiciones 213 y 224 que son conservados sólo en especies de teleósteos. Los potenciales motivos funcionales de la molécula fueron analizados utilizando la base de datos PFAM y revela la presencia de un dominio con homología a TNF en la región C-terminal (residuos 151-264).

42

Usando la estructura de CD40L de humano, recientemente cristalizada, como modelo (PDB: 3QD6) hemos modelado la estructura terciaria de CD40L de Salmo salar (Fig. 11A). Los resultados muestran que CD40L de Salmo salar presenta una estructura de sándwich conteniendo 2 sábanas beta plegadas, cada una formada por 5 cadenas β anti-paralelas que adoptan la clásica topología “jelly roll” característico de los miembros de la familia TNF. Los residuos claves para la interacción CD40L-CD40 son levemente diferentes en Salmo salar comparados con lo observado en humanos, dos tirosinas y una lisina son reemplazados por una histidina y una serina en salmón. En salmón el puente disulfuro se genera en una posición diferente a lo observado en humanos, estabilizando diferentes partes de la molécula. Otra diferencia observada es en la glutamina (Gln220) que corresponde a un aa polar en humanos, al parecer es reemplazado por una valina (Val223) que es hidrofóbica en salmón y la arginina (Arg203) en humanos es reemplazada por una lisina (Lys206) en salmón. El análisis filogenético revela que CD40L forma un grupo exclusivo independiente del grupo formado por los vertebrados superiores (Fig. 12A). Por otro lado, la secuencia cADN de CD40 para salmón (EMBL número de acceso NM_001141236.1) consiste de 1533 bp conteniendo un ORF de 1065-bp. De esta secuencia podemos deducir que CD40 de salmón correspondería a una proteína de membrana de 354 aa con una región citoplasmática de 139 aa; un dominio transmembrana de 19 aa y una región extracelular de 196 aa rica en residuos de cisteína (21 residuos). La proteína de CD40 de salmón muestra una identidad de ~ 23% con la secuencia de otros mamíferos y ~ 30% con otras especies de teleósteos (Fig. 10B).

El péptido maduro posee una masa molecular teórica de 38,6 kDa y un punto isoeléctrico de 5,7 y presenta dos potenciales sitios de N-glicosilación (N97 y N179). Como otros vertebrados, CD40 posee patrones de secuencias repetitivas ricas en cisteína en el segmento extracelular, formados por 4 cisteína los cuales son importantes en la estabilización de la proteína. El análisis filogenético, muestra que CD40 forma un grupo independiente, donde CD40 de teleósteos forma un grupo exclusivo opuesto al de vertebrados (Fig.12B).

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10 20 30 40 50 60 70 80 90 100. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Salmon M I N M Y Q T N L P P P P I P P R L G S V K S A P G P G H N K P L L G F L I G M I V L Q M L L L L G G F A Y L Y H K E N K Y D K D F E H K Y L D D M I V L R R L G E C E K - - D S Q S - V L D C E K L V 97Trout M I N M Y Q T N L P P P P I P P R L G S V K S A P G A G H N K P L L G F L I G M I V L Q M L L L L G G F T Y L Y H K E N K H D E D F E H K Y L D D M I V L R R L G E C E K - - D S Q S - V L D C E K L V 97Zebrafis M I N T F H S S Y N P P P V P P R A G Y K K A Q P S G - - N T P L V K F L S V M L L L L M T L T F G G F L Y L F Q K V N - - - G E L QW V Y Q E D T A T L K K L Q Q C A N - - G N R - - A Q E C Q I L I 91Chicken M N E A Y S P - - - A A P R P M G S T S P S T - - - - - - M K M F M C F L S V F M V V Q T I G T V L F C L Y L H M K M D K M E E V L S - - L N E D Y I F L R K V Q K C Q T G E D Q K S T L L D C E K V L 89Cow M I E T Y S Q - - - P S P R S V A T G P P V S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N - - L H E D F V F M K T I Q R C N K G E G S L S - L L N C E E I R 88Cat M I E T Y S Q - - - T A P R S V A P G P P V S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N - - L Y E D F V F M K T L Q K C N K G E G A L S - L L N C E E I K 88Dog M I E T Y S Q - - - T A P R S V A T G P P V S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N - - L Y E D F V F M K T L Q K C N K G E G S L S - L L N C E E I K 88Monkey M I E T Y N Q - - - P S P R S A A T G L P V R - - - - - - M K I F M Y L L T I F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N - - L H E D F V F M K T I Q R C N T G E R S L S - L L N C E E I K 88Human M I E T Y N Q - - - T S P R S A A T G L P I S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N - - L H E D F V F M K T I Q R C N T G E R S L S - L L N C E E I K 88Mouse M I E T Y S Q - - - P S P R S V A T G L P A S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S V L F A V Y L H R R L D K V E E E V N - - L H E D F V F I K K L K R C N K G E G S L S - L L N C E E M R 88Rat M I E T Y S Q - - - P S P R S V A T G L P A S - - - - - - M K I F M Y L L T V F L I T Q M I G S V P F A V Y L H R R L D K V E E E A S - - L H E D F V F V K K L K R C N K G E G S L S - L L N C E E M R 88

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Salmon E K Y K N I M E K V S Q V E G K A V K L T G G V P T Y G A M A R M I - - - - - - - - - - - - - - - - V K Q P V V G A L P S S - - - - - N Y L E W N I G - - H S V L R N V Q Y - F K S S W L K V L Q P G D 173Trout E K Y K N I M E K V S Q V E G K A V K R T G G V P S Y G A M A R M I - - - - - - - - - - - - - - - - V K Q P V V G A L P S S - - - - - K Y L E W N I G - - H S V L R N V Q Y - F K S S W L K V L Q P G D 173Zebrafis E K V N T V M G K V S L E N G T F S K F T G G P S R N G P A A H M V - - - - - - - - - - - - - - - - F L S E H N E K Y K E S E A L R S N S L L W D K E - - R S L L Q G V Q I T V K R D R L T I Q T P G V 173Chicken K G F Q D L Q C K D R T A S E E L P K - - - - F E M H R G H E H P H L K S R N E T S V A E E K R Q P I A T H L A G V K S N T T - - - V R V L K W M T T S Y A P T S S - L I S Y H E G K - L K V E K A G L 180Cow S R F E D L - V K D I M Q N K E V K K K E K N F E M H K G D Q E P Q - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V I S E A S S K T - - - T S V L QW A P K G Y Y T L S N N L V T L E N G K Q L A V K R Q G F 168Cat S R F E A F - L K E I M L N K E T K K - E K N V A M Q K G D Q D P R - - - - - - - - - - - - - - - - V A A H V I S E A S S S T - - - A S V L QW A P K G Y Y T I S S N L V T L E N G K Q L A V K R Q G L 167Dog S Q F E A F - L K E I M L N N E M K K - E E N I A M Q K G D Q D P R - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V I S E A S S N P - - - A S V L RW A P K G Y Y T I S S N L V S L E N G K Q L A V K R Q G L 167Monkey S Q F E G F - V K D I M L N K E E K K K E N S F E M Q K G D Q N P Q - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V I S E A S S K T - - - T S V L QW A E K G Y Y T M S N N L V T L E N G K Q L T V K R Q G L 168Human S Q F E G F - V K D I M L N K E E T K K E N S F E M Q K G D Q N P Q - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V I S E A S S K T - - - T S V L QW A E K G Y Y T M S N N L V T L E N G K Q L T V K R Q G L 168Mouse R Q F E D L - V K D I T L N K E E K K - E N S F E M Q R G D E D P Q - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V V S E A N S N A - - - A S V L QW A K K G Y Y T M K S N L V M L E N G K Q L T V K R E G L 167Rat R Q F E D L - V K D I S L N K E E K K - E K S F E M Q R G D E D P Q - - - - - - - - - - - - - - - - I A A H V V S E A N S N A - - - A S V L QW A K K G Y Y T M K S N L V V L E N G R Q L T V K R E G L 167

210 220 230 240 250 260 270 280 290. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . .

Salmon Y D I Y S Q V A F S - - - K W H P K A P L A S R V K L R K G E T G E E K N L M T A Y C S L G D Q N R T D V C T A F Q G G V F S L E P K D Q I S V W V T D P S L V N Y E E G T T T F G L Y K L 264Trout Y D I Y S Q V A F S - - - K W H P K T P L A S R V K L R K G E T G K E K N L M T A Y C S L G D Q N R T D V C T A F Q G G V F S L E P E D Q I S V W V T D P S L V N Y E E G T T T F G L F K L 264Zebrafis Y F I Y S Q V T F S - - - R R A T K N P L K Q T I N - R S G P K N E N K E L L K S F C T L - H E N T E E M C T A S S A G V F R L E K D Q Q V Y V T V T D R S L V N - - K K Y C W F G L F K L 260Chicken Y Y I Y S Q V S F C T K A A A S - - A P F T L Y I Y L Y L P M E E D R L L M K G L D T H S T S T A L C E L Q S I R E G G V F E L R Q G D M V F V N V T D S T A V N V N P G N T Y F G M F K L 272Cow Y Y I Y T Q V T F C S N R E T L S Q A P F I A S L C L K S P S G S E R I L L R A A N T H S - S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L Q S G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L 261Cat Y Y I Y A Q V T F C S N R E A S S Q A P F I A S L C L H S P S G S E R V L L R A A N A R S - S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L H P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L 260Dog Y Y V Y A Q V T F C S N R A A S S Q A P F V A S L C L H S P S G T E R V L L R A A S S R G - S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L H P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L 260Monkey Y Y I Y A Q V T F C S N R E A S S Q A P F I A S L C L K S P G R F E R I L L R A A N T H S - S A K P C G Q Q S I H L G G V F E L Q P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L 261Human Y Y I Y A Q V T F C S N R E A S S Q A P F I A S L C L K S P G R F E R I L L R A A N T H S - S A K P C G Q Q S I H L G G V F E L Q P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L 261Mouse Y Y V Y T Q V T F C S N R E P S S Q R P F I V G L W L K P S S G S E R I L L K A A N T H S - S S Q L C E Q Q S V H L G G V F E L Q A G A S V F V N V T E A S Q V I H R V G F S S F G L L K L 260Rat Y Y V Y T Q V T F C S N R E P L S Q R P F I V S L W L K P S S G S E R I L L R A A N T H S - S S K L C E Q Q S I H L G G V F E L Q A G A S V F V N V T E A S Q V I H G I G F S S I G L L K L 260

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Salmon M L G C F K T K R I E M V T L L F M L A V F P - - V V Y S C D P E T Q Y E N - H G E C C N K C G P G T R M S S D H S G C F D P H C M P C Q E D E Y Q E A F T E K I I C K V Q P Y C D Q N K N F E G S T N 97Japanese - - - - - - M L L F M V V V M L C T E V T V K T W A Q S L C D P L T Q Y E E - A G Q C S K M C G P G T R R M S Q S T - C T D P Q C A E C G N R E Y Q D R Y T R E A Q C K R Q P Y C D P N K N L R V T K P 92Zebrafis - - - - - - M T V I L R V C L L V T L I C L - - - - V S C C E K E T H Y T N S Q G K C C K M C G P G T R M M K D D N - C D D P R C K E C E V G E Y Q S G Y T K E T I C E R Q P S C D T N L N F L P Q M N 89Chicken - - - - - - M G R L G L L G L L C A L L L G C G Q P G D A V N C S D K Q Y E H K G R C C N R C Q P G K K L A S E C N D T E D S V C T P C E N G Q Y Q Q S W T K E R H C T P H E I C E D N A G L I V K R H 94Cow - - - - - - M V R L P L Q C L F W G F F L T A V H S E P A T A C G E K Q Y P V N S L C C D L C P P G Q K L V N D C T E V S K T E C Q S C G K G E F L S T W N R E K Y C H E H R Y C N P N L G L R I Q S E 94Dog - - - - - - M V L L P L R C L F W G S L L T T V Y P E P R T A C R E K Q Y L V D S Q C C N M C P P G E K L V N D C L H T I D T E C T R C Q T G E F L D T W N A E R H C H Q H K Y C D P N L G L H V E K E 94Monkey - - - - - - M F R L P L Q C V L W G C L L S S V H P E P P T A C R E K Q Y L I N S Q C C S L C Q P GW K L V N D C T E V T E T E C L P C G K G E F L D T W N R E T H C H Q H K Y C D P N L G L R V Q Q E 94Human - - - - - - M V R L P L Q C V L W G C L L T A V H P E P P T A C R E K Q Y L I N S Q C C S L C Q P G Q K L V S D C T E F T E T E C L P C G E S E F L D T W N R E T H C H Q H K Y C D P N L G L R V Q Q K 94Mouse - - - - - - M V S L P R L C A L W G C L L T A V H L G Q C L T C S D K Q Y L H D G Q C C D L C Q P G S R L T S H C T A L E K T Q C H P C D S G E F S A QW N R E I R C H Q H R H C E P N Q G L R V K K E 94Rat - - - - - - M L P L P Q L C A L W G C L L T A V H L G Q C V T C S D K Q Y L Q G G E C C D L C Q P G N R L V S H C T A L E K T Q C Q P C D S G E F S A HW N R E I R C H Q H R H C E L N Q G L Q V K K E 94

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Salmon R S K T S L S Q C I C K A G H H C S S K E - C L T C V P H T K C G P G Q E - I L S T G D H I R D T V C Q A C P A N T F S S D S S A E S K C K QW T V C - D K G S K A E A N G T S T S D I V C V S V P T F 194Japanese E S K T K Q S P C I C L L G F H C S S G T - C V T C V P H A T C K P G QW - A K I K G N L T H D T V C E S C P E G S F S T S H S W S S V C T K W T E C - E S G Y H I Q E S G T N E S D N I C V E P P R H 189Zebrafis S N K T S R N E C Q C K P G Y Y C D L D H G C E V C R K H T V C E P G Q R - V A V K G S P I R D N V C E E C S D G T F S T N H S A D T - C K E W T K C - E Y G - E V D T P G S S T S D Q T C V G T R D R 185Chicken G N A T H N T V C Q C R A G M H C S D A S - C Q T C V E N E P C K Q G F G F V A A M A E A R M T S P C E P C A E G T F S N V S S K T E P C H F W T S C E E K G L V V K V K G T N T S D V I C E S S R R S 193Cow G T L N T D T I C V C V E G Q H C T S H T - C E S C T P H S L C L P G F G - V K Q I A T G L L D T V C E P C P L G F F S N V S S A F E K C H RW T S C E R K G L V E Q H V G T N K T D V V C G F Q S R M 192Dog G T S E T D T T C T C D E G L H C T N A A - C E S C T M H S L C P P G L G - V K Q I A T G I S D T I C D P C P I G F F S N V S S A L E K C H P W T S C E T K G L V K V Q A G T N K T D V I C G P Q P R L 192Monkey G T S V T D N I C V C K E G R H C T S K A - C E S C V L Y H S C S P G F G - V K Q I A T G V S D T I C E P C P V G F F S N V S S A F E K C R P W T R C E T K G L A E Q Q A G T D K T D A V C G P Q N R L 192Human G T S E T D T I C T C E E GW H C T S E A - C E S C V L H R S C S P G F G - V K Q I A T G V S D T I C E P C P V G F F S N V S S A F E K C H P W T S C E T K D L V V Q Q A G T N K T D V V C G P Q D R L 192Mouse G T A E S D T V C A C K E G Q H C T S K D - C E A C A Q H T P C I P G F G - V M E M A T E T T D T V C H P C P V G F F S N Q S S L F E K C Y P W T S C E D K N L E V L Q K G T S Q T N V I C G L K S R M 192Rat G T A V S D T V C T C K E G Q H C A S K E - C E T C A Q H R P C G P G F G - V V Q M A T E T T D T V C Q P C P V G F F S N G S S L F E K C H P W T S C E D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 169

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Salmon S G R I A G Y S F V V V A L V T G - V V G I I L W K Y K G K H G E S Y K K G K E P C V E C L G C E R R P T E D R N N E G R N S E G P E E E R E Q L K P L I Q N G K P L S P P S P I S Q P S P G T Q T P V 293Japanese H G - - - G L I A C V V A V G S L A V V G L M V C L C K G E T K Q R A K D Y L E S C H G D K - - - - - E N L Q R E P S L V L F T T L D E T E N - - - - - - - - - H E L L P - - - - - - - - - - - - - - - 257Zebrafis T A V I V V V C V L L I L I A A A A L V G C L F F K - K G K S - P L F K L Q K Q T F M E I R - - - - - P D D D V T I A V Q Q Q - - P E E E D E - - - - - - - - N A P V S P - - T L S N - - - - - - - - - 257Chicken S L S V L I P I T A A V V T C L V G I C I Y C L V H T D L R R R G P K Q A E A E A P R E L - - - - - - - - - - V T Q Q P E E V D F P V Q E T R - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 254Cow R T L V V I P V T M G V L F A V L - L V S A C I R N I T K K R Q L R P C T L W L K G R I P - - - - - - - - - - - W R R L I R R I F P A P T R L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 251Dog R A L V V V P I I M G I L L V V L - L V S A C I R K V V K K P E N K V M Y - - Q D P V E D - - - - - - - - L E E F P M P P H S I A P V Q E T L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 252Monkey R L L V V I P I M L G I L F A I L - L V L V F I K K V D R K P Q D K A P C T K Q I P Q E I - - - - - - - - - D D L P G P - N P T P P V Q E T L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 252Human R A L V V I P I I F G I L F A I L - L V L V F I K K V A K K P T N K A P H P K Q E P Q E I N - - - - - - F P D D L P G S - N T A A P V Q E T L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 255Mouse R A L L V I P V V M G I L I T I F - G V F L Y I K K V V K K P K D N E I L P P A A R R Q D P - - - - - - Q E M E D Y P G H N T A A P V Q E T L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 256Rat - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 169

310 320 330 340 350 360. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .

Salmon E N D V N D S Q A E S S A K A E E M T E N G H V V A Q E Q G K Q H D T S Q M V S H N H S A S P S A E H N I Q L S G C V L P 354Japanese - - - - - - - - - - - - - - - - - F T E E E E M K I P E K T T R T K G R S S WW M L F S V T M D S V - - - - - - - - - - - 290Zebrafis - - - - - - - - - - - - - - - - - M T E N G N F V V Q E H G K - - - - D A I I P C H E S T S N T Y Q - - - - - - - - - - - 286Chicken - - - - - - - - - - - - - - - - - - - L G G Q P V A Q E D G K E S R I A E Q E Q L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 276Cow - - - - - - - - - - - - - - - - - - - S G A R D L M L V S A G R P - - - - G G R Q - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 269Dog - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H G C Q P V T Q E D G K E S R I S V Q E R V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 274Monkey - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H G C Q P V A Q E D G K E S R I S V Q E R Q - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 274Human - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H G C Q P V T Q E D G K E S R I S V Q E R Q - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277Mouse - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H G C Q P V T Q E D G K E S R I S V Q E R Q V T D S I A L R P L V - - - - - - - - - 289Rat - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 169

FIGURA 10. Alineamiento múltiple de proteínas CD40L (A) y CD40 (B). Residuos idénticos completamente conservados en todas las especies se muestran sombreados, residuos sombreados en gris corresponden a los residuos similares. Asteriscos indican los residuos de cisteína completamente conservadas en todas las especies alineadas. Flechas indican residuos de cisteína conservadas sólo en teleósteos. Espacios indican gaps introducidos para obtener un máximo alineamiento. Posibles sitios de N-glicosilación son mostrados en recuadros. El porcentaje de identidad de CD40L y CD40 con respecto a otras especies se muestran al final de cada secuencia.

* *

Identity 100 %

95.8 %

39.1 %

27.3 % 26.6 %

26.5 %

27.3 %

26.4 %

26.3 %

25.6 %

25.5 %

A

B

* * * * * *

Identity 100 %

30,5 %

32,5 % 27 %

22,1 %

23,7 %

24,4 %

24,3 %

25,3 %

16,9 %

* * * * * * * * * *

** * * * * * *

44

FIGURA 11. Estructura tridimensional de proteína CD40L. El diagrama muestra la estructura terciaria de la proteína CD40L de humano (derecha) y salmón CD40L (izquierda) obtenida por modelamiento de homología. Los residuos claves para la interacción CD40L-CD40 y las cisteínas son designados en la figura.

45

A

Figura 12. Leyenda a continuación.

46

B

FIGURA 12. Análisis Filogenético que muestra la relación de CD40L (A) y CD40 (B) de salmón con otras especies y otros miembros de la familia TNFR y TNF, respectivamente. El análisis filogenético fue construido con el método neighbor-joining y alineado en el programa MEGA 5. El número de acceso de las diferentes secuencias se muestra en Tabla V.

47

CD40

riñón

cef

álic

obaz

o

cora

zón

agal

las

inte

stin

o

0

1

2

3

4

5

ex

presi

ón

rela

tiv

a

CD40L

riñón

cef

álic

obaz

o

cora

zón

agal

las

inte

stin

o

0

1

2

3

4

5

ex

presi

ón

rela

tiv

aDistribución de CD40L y CD40 de Salmo salar

La distribución de los transcritos codificantes para CD40 y CD40L fueron analizados en diferentes órganos de Salmo salar por PCR en tiempo real (Fig. 13). Los resultados muestran que los transcritos para CD40L y CD40 son detectables en órganos inmunes, incluyendo riñón cefálico y bazo. El nivel de expresión de CD40L (Fig. 13A) fue mayor en bazo, seguido por riñón cefálico. Dentro de los órganos no inmunes, CD40L presentó alta expresión en agallas mientras que la menor expresión fue observada en intestino y corazón. La expresión del transcrito para CD40 (Fig. 13B) se correlacionan con lo observado para CD40L, donde la mayor expresión es detectada en órganos linfoides, especialmente en bazo, seguido por agallas y riñón cefálico. Estos datos sugieren que ambas moléculas estarían jugando un rol importante en respuesta inmune.

A B

FIGURA 13. Expresión transcripcional de CD40L y CD40 en órganos de salmón. La expresión

relativa de CD40L (A) y CD40 (B) se determinó en diferentes tejidos frescos extraídos de Salmo salar. Los datos fueron normalizados con el nivel de expresión de EF1aB y luego comparados con el nivel de expresión promedio obtenido en intestino, el cual presentó la expresión más baja designada con el valor de 1. Los resultados representan el promedio ± SEM de cuatro

diferentes individuos.

48

Modulación de la expresión de CD40L y CD40 en HKLs

Dada la distribución de CD40L y CD40 en órganos inmunes mostrado anteriormente y considerando el rol primordial de estas moléculas en el sistema inmune de mamíferos (66), en el presente estudio hemos investigado el efecto de varios inmunoestimulantes en la modulación de expresión de CD40L y CD40 en leucocitos derivados de riñón cefálico (HKLs), el cual es el principal órgano inmune en salmón. La Fig. 14 muestra el cambio en la expresión de los transcritos de CD40L y CD40 en HKLs a diferentes tiempos en presencia de diferentes estímulos tales como: ConA, PMA, PHA, CpG y LPS, las cuales son moléculas conocidas por su efecto estimulatorio en leucocitos de peces (67, 88). El mitógeno PHA induce un rápido incremento en la expresión de CD40L (Fig. 14A) mostrando la mayor expresión a 4h post-estimulación la cual disminuye a las 12 y 24h. Un patrón de expresión similar se obtiene con ConA. En contraste, la estimulación con análogos de productos microbiales tales como LPS y CpG no afecta la expresión de CD40L en HKLs, mientras que poly I:C y PMA induce la expresión de CD40L de forma leve a las 12h post-estimulación.

Interesantemente y contrario a los resultados obtenidos para CD40L, la expresión de CD40 es altamente inducida en presencia de CpG clase B, mostrando la máxima expresión a las 24h (Fig. 14B), estos datos concuerdan con estudios realizados previamente que muestran que CpG induce la maduración de APCs en salmón (60). Una modesta inducción en la expresión de CD40 es observada a las 12h post-estimulación con LPS y poly I:C. Los mitógenos PMA, PHA y ConA inducen un patrón de activación similar, observándose la máxima estimulación a las 12h de activación que ocurre un poco después al peak observado en la expresión de CD40L (a las 4h), con los mismos estímulos, lo que sugiere que la expresión de CD40L sería importante para inducir expresión de CD40.

49

****

**** ****

****

****

****

****

**** *** *** **

* *

****

****

****

****

**** ****

**** **** **

CD40L

Control CpG LPS PolyIC PMA PHA ConA0

5

10 4 h

12 h

24 h

ex

presi

ón

rela

tiv

a

CD40

Control CpG LPS PolyIC PMA PHA ConA0

5

10

exp

resi

ón

rel

ati

va

A

B

FIGURA 14. Modulación de la expresión transcripcional de CD40L y CD40 en leucocitos derivados de riñón cefálico (HKLs). HKLs se cultivaron con medio en ausencia de estímulos o estimulados con CpG clase B (2μM), LPS (50μg/ml), poly I:C (50μg/ml), PMA (100ng/ml), PHA (10μg/ml) y ConA (25μg/ml) por 4, 12 y 24h. Los diferentes tratamientos fueron terminados disolviendo las células en TRIzol. El nivel de expresión transcripcional de CD40L (A) y CD40 (B) se normalizó utilizando EF1aB como referencia y se expresan como expresión relativa dividiendo el valor de expresión de los grupos estimulados por el valor obtenido en los grupos controles en cada tiempo. Los datos representan el promedio ± SEM de cuatro individuos. Las diferencias son estadísticamente significativas (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001).

50

Efecto de la vacunación contra el virus de la enfermedad de Páncreas (PD) en la expresión de CD40L y CD40 en HKLs y esplenocitos de Salmo salar

PD es una enfermedad importante en el sector acuícola del hemisferio norte, causada por un alfavirus salmónido (SAV) que afecta principalmente a Salmo salar (69). Para dilucidar si CD40L y CD40 ejercen un rol funcional en la respuesta inmune del salmón contra dicho patógeno, hemos investigado la expresión de ambas moléculas en riñón y bazo de salmones vacunados con dos diferentes formulaciones, antígeno SAV inactivado, ya sea solo (PDhigh) o en combinación con CpG y poly I:C como adyuvantes (PD high/poly I:C/CpG), datos provenientes de experimentos previos (61). Como se observa en la Fig. 15A existe un leve incremento en la expresión del transcrito para CD40L en el grupo vacunado con la formulación que incluye poly I:C y CpG comparado con el grupo control (inyectado con PBS). Por el contrario, en el grupo de peces vacunados con el antígeno sin adyuvante se observa una significativa inducción en la expresión de CD40L en HKLs 5 días post-vacunación (Fig 15A). Por otro lado y como se observa en Fig. 15B la expresión de CD40L en esplenocitos no es afectada en forma significativa por ninguna de las dos formulaciones. La expresión de CD40 es incrementada levemente en riñón cefálico de peces vacunados con la formulación que incluye CpG y poly I:C (Fig 15A), pero especilamente en bazo (Fig. 15B), es donde se observa un incremento estadísticamente significativo, en el grupo de peces vacunados con el antígeno en conjunto con los adyuvantes. Esto sugiere que la adición de análogos de TLR podría inducir maduración de ACPs y por ende actuar como un potente inmunoestimulante.

Clonamiento y expresión de CD40L de Salmo salar

Sobre la base de los datos mostrados anteriormente que sugieren que la interacción CD40L/CD40 podría jugar un rol importante en la respuesta inmune en teleósteos, decidimos clonar y sobreexpresar CD40L, de modo de poder estudiar los efectos directos inducidos por dicha molécula. Como se observa en la Fig. 16, se detectó la expresión del gen codificante para CD40L en esplenocitos cultivados por 12h. Una vez obtenido el fragmento codificante para CD40L, se procedió a purificar el amplicón y se realizó la reacción de clonación en E. coli. Para determinar la presencia del inserto en las colonias transformadas, se realizó PCR de colonia. La Fig. 17 muestra las colonias que contenían los insertos codificantes para la proteína CD40L. Posteriormente, los plasmidios de las colonias positivas se purificaron y se realizó un análisis de restricción para determinar la correcta inserción de los fragmentos.

51

** *

Riñón cefálico

0

2

4

PBS

PD high

PD high/polyI:C/CpG

CD40 CD40L

exp

resió

n r

ela

tiva

Bazo

CD40 CD40L0

1

2

3

exp

resió

n r

ela

tiva

A B

FIGURA 15. Modulación de la expresión transcripcional de CD40L y CD40 en leucocitos derivados de riñón cefálico (A) y bazo (B) de salmones vacunados. Expresión de CD40L y CD40 frente a dos diferentes formulaciones; PD high: vacuna conteniendo antígeno SAV inactivado sin adyuvante o PD high/poly I:C/CpG que contieen antígeno SAV en combinación con CpG y poly I:C como adyudante. Los tejidos riñón cefálico y bazo se recolectaron 5 días post-vacunación. El nivel de expresión de CD40L y CD40 se normalizaron primeramente con los valores obtenidos por el gen EF1Ab usado como referencia y luego se expresaron como expresión relativa dividiendo el valor obtenido por los grupos vacunados por el valor obtenidos por los grupos control (PBS). El resultado representa el promedio ± SEM de cinco experimentos independientes. Las diferencias son estadísticamente significativas con respecto al grupo control (*P < 0,05; ** P < 0,01).

52

Una vez confirmada la correcta orientación de los genes, los amplicones fueron secuenciados, las secuencias obtenidas correspondieron exactamente con la molécula de CD40L analizadas de Salmo salar. Posteriormente se procedió a clonar los insertos en vectores compatibles para células eucarióticas, para lo cual se utilizaron dos diferentes vectores, un vector pDEST (Invitrogen) sin tag, llamado de ahora en adelante 12.2, otro es el vector pDEST (Invitrogen) conteniendo el tag GFP, de forma de poder determinar la eficiencia de la transfección. El análisis de restricción de los vectores mencionados anteriormente se muestran en la Fig. 18. Los vectores CD40L-GFP y CD40L-12.2 se utilizaron en los ensayos de sobreexpresión de la proteína CD40L de salmón.

Sobreexpresión de CD40L en células CHSE-214

Se transfectaron células de la línea celular CHSE-214, ya sea con el vector vacío conteniendo el tag GFP, como control de transfección o con el vector conteniendo el gen codificante para la proteína CD40L. La Fig. 19A muestra un ensayo de microscopía de fluorescencia de células CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP por 48h, observándose un buen nivel de transfección que se mantiene durante el tiempo, hasta 12 días post-transfección. Nuestro laboratorio cuenta con Ac policlonal anti-CD40L de salmón que reconoce la proteína CD40L de salmón desnaturada, la Fig. 19B muestra la microscopía de fluorescencia de células CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP y marcadas con el Ac anti-CD40L y como Ac secundario el Ac anti-conejo Alexa546. CD40L es una proteína de membrana, como se puede observar en las microscopías, donde el color verde corresponde a la fluorescencia del tag GFP acoplado a la proteína CD40L de salmón. Como se mencionó anteriormente, nuestro Ac anti-CD40L reconoce la proteína desnaturada, no nativa, de ahí que se observen gránulos intracelulares de color rojo que corresponden a la fluorescenia del Ac anti-CD40L, los cuales se colocalizan perfectamente con las células positivas para CD40L acopladas al tag GFP (merge). Dichos granulos conteniendo la proteína CD40L no se observan en las células transfectadas con el vector vacío (Fig. 19C) confirmando la especificidad de nuestro Ac y la óptima expresión de CD40L en células CHSE-214. La expresión de CD40L en células CHSE-214 fue confirmada mediante diferentes técnicas, PCR en tiempo real (Fig. 20A); PCR convencional (Fig. 20B) y western blot (Fig. 20C), confirmando que células CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP presentan CD40L tanto a nivel de transcrito como también a nivel protéico.

53

St PCR

St PCR

de colonia

1000

FIGURA 16. PCR para identificar la presencia del gen para CD40L. La fgura muestra el producto de PCR correspondiente a CD40L con un tamaño aproximado de 650bp proveniente de esplenocitos cultivados durante 12h. Experimento representativo de tres experimentos independientes.

FIGURA 17. PCR de colonias transformadas con CD40L. La figura muestra el PCR de colonia correspondiente a las colonias tranformadas con el plasmidio codificante para CD40L (1300bp). Se utilizó el partidor antisentido específico para CD40L y el partidor sentido del vector.

850 650

CD40L 650kDa

850 650

CD40L 650bp

St

54

A B

FIGURA 18. Análisis de orientación de los genes insertos en clones recombinantes por su patrón de productos derivdos de la acción de enzimas de restricción. (A) Electroforesis que muestra el análisis de restricción del plasmidio CD40L-GFP con enzimas HindIII y PvuII, fragmentos esperados: 1942, 797, 363 bp. (B) Análisis de restricción del plasmidio CD40L-12.2 con enzimas HindIII y RvuII, fragmentos esperados: 3677, 2101, 565 bp. Los recuadros muestran los plasmidios que presentan la correcta orientación de los insertos.

2000

850

650

2000

650

Bp St

2101bp

565bp

3677bp 5000

CD40L-GFP

55

A

B

C

FIGURA 19. Análisis de la expresión de CD40L en células CHSE-214 por microscopía de

fluorescencia. (A) Células CHSE-214 transfectadas con el plasmidio CD40L-GFP por 48h. (B) Células CHSE-214 transfectadas con el plasmidio CD40L-GFP por 48h y marcadas con el anticuerpo policlonal anti-CD40L de salmón (Alexa fluor546). (C) Células CHSE-214 transfectadas con el plasmidio vacío GFP por 48h como control de transfección y marcadas con anticuerpo policlonal anti-CD40L de salmón (Alexa fluor546). Los experimentos se realizaron al menos 5 veces obteniendo resultados reproducibles.

GFP Alexa-fluor546 Merge

GFP Alexa-fluor546 Merge

GFP

56

98

GFP CD40L ACTINA

kDa 1 2 3 4 5 6

198

62

49

38

28

17

98

GFP CD40L ACTINA

kDa 1 2 3 4 5 6

198

62

49

38

28

17

98

GFP CD40L ACTINA

kDa 1 2 3 4 5 6

198

62

49

38

28

17

CD40L

vect

or vac

ío

CD40

L

0

50000

100000

150000

200000

exp

resió

n r

ela

tiva

A B

C

FIGURA 20. Verificación de expresión del plasmidio CD40L-GFP transfectado en células CHSE-214. (A) PCR en tiempo real de células CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP (CD40L) o con el vector gfp vacío (vector vacío). Valores normalizados con la expresión de EF1aB, la expresión es relativa con respecto a valores obtenidos en CHSE-214 no transfectadas. Los resultados representan el promedio + SEM de cinco experimentos independientes. (B) Electroforesis de los productos de PCR convencional para CD40L y el control de expresión EF1Ab; 1: CHSE-214 no transfectadas, 2: CHSE-214 transfectadas con el vector vacío, 3: CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP. (C) Análisis por Western blot. Células CHSE-214 transfectadas con el vector vacío (GFP 27kDa: 1, 3 y 5) y CHSE transfectadas con CD40L-GFP (CD40L-GFP 56kDa: 2, 4 y 6) fueron reveladas con Ac anti-GFP (1, 2), anti-CD40L de salmón (3, 4) y Ac anti-actina, como control de carga (5, 6). Experimento representativo de un total de 3 experimentos independientes.

1 2 3

CD40L

EF1aB

1 2 3

CD40L

EF1aB

57

Co-cultivo de células que sobreexpresan CD40L y leucocitos de Salmo salar

Para estudiar el efecto directo de CD40L en leucocitos de salmón, hemos transfectados con el plasmidio codificante para CD40L dos diferentes líneas celulares derivadas de teleósteos: TO y CHSE-214. Posteriormente, éstas células que sobrexpresan ectópicamnete CD40L, se co-cultivaron con leucocitos derivados de diferentes órganos de salmón (riñón cefálico, bazo y células adherentes derivadas de riñón cefálico) por diferentes tiempos. Como se observa en la Fig. 21A, al co-cultivar HKLs con células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L, los HKLs interaccionan con las células CHSE-214 transfectadas (CD40L-GFP: tag GFP fluoresce en verde), denotada por los agregados celulares presentes alrededor de las células CD40L+. Esta interacción no se observa en células CHSE transfectadas con el vector vacío (Fig. 21B). Al realizar el mismo experimento, pero en este caso utilizando células TO que sobreexpresan CD40L co-cultivadas con HKLs, se observan los mismos agregados celulares, sugiriendo que la interacción observada se debe a CD40L y no depende de la línea celular utilizada (Fig. 21C). Contrariamente, en leucocitos derivados de bazo co-cultivados con células TO que sobreexpresan CD40L no se observan agregados celulares y ningún indicio de interacción entre leucocitos y CD40L (Fig. 21D). Por otro lado, células adherentes derivadas de riñón cefálico (putativas APCs) co-cultivadas con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L muestran el mismo patrón de interacción que HKLs y esta interacción se observa a partir de las 24h de co-cultivo (Fig. 21E) y se mantiene después de 3 días de co-cultivo (Fig. 21F).

En peces, riñón cefálico es comúnmente utilizado como fuente de leucocitos para experimentos in vitro. Las células de este órgano (HKLs) incluyen diversos tipos celulares, tanto progenitores hematopoyéticos como también células diferenciadas (70, 71). Debido a esto y a los datos mostrados anteriormente, hemos decidido trabajar con leucocitos derivados de riñón cefálico y células adherentes derivadas del mismo órgano. Los resultados mostrados previamente se realizaron con células transfectas con CD40L en el vector pEST conteniedo el tag GFP, unido a la proteína CD40L en el extremo N-terminal, que en el caso de CD40L está presente en la región citoplasmática, por lo que no se espera que GFP interfiera en el reconocimiento de CD40L por parte de CD40. Para corroborar lo anterior, hemos transfectado células TO con ambos vectores, con el vector vacío sin tag GFP (TO-12.2), vector conteniendo CD40L sin tag (TO-12.2-CD40L), con el vector vacío con tag GFP (TO-GFP) y con CD40L en el vector con tag GFP (TO-GFP-CD40L), posteriormente dichas células transfectadas se co-cultivaron con HKLs durante 24h para luego analizar el perfil transcripcional.

58

Como se observa en la Fig. 22, las células transfectadas con el vector que contiene CD40L sin tag GFP, como también las células transfectadas con el vector que contiene CD40L y el tag GFP, inducen la expresión de genes de importancia inmune, tales como B7-H1 (APCs activadas), IL-2 e IL-10, comparado con células transfectadas con los respectivos vectores vacíos. Por lo tanto podemos concluir que el tag GFP no interfiere en el reconocimiento de CD40L por parte de leucocitos de salmón.

Por otro lado, para confirmar que la interacción observada entre leucocitos y células que sobreexpresan CD40L se debe exclusivamente a la proteína y no depende de la línea celular, hemos analizado el perfil transcripcional de HKLs co-cultivados con CHSE-214 transfectadas con CD40L (CHSE-CD40L) o TO transfectadas con CD40L (TO-CD40L) y sus respectivos controles, CHSE transfectadas con el vector vacío (CHSE-GFP) y TO transfectadas con vector vacío (TO-GFP). La Fig. 23 muestra el análisis de microscopía de fluorescencia donde se observa que tanto CHSE-214 (Fig. 23A) como TO (Fig. 23B) muestran un alto nivel de transfección (denotado por el número de células que expresan el tag GFP). Al analizar el perfil transcripcional de HKLs co-cutivados con ambas líneas celulares (Fig. 23), se observa que CD40L induce la expresión de genes de importancia inmunológica tales como marcadores celulares de APCs: CD40, CD83, B7-H1 además de importantes citoquinas, tanto porinflamatorias (IL-12, IL-1) como anti-inflamatorias (IL-10). Sin embargo, los co-cultivos con CHSE-214 transfectadas con el vector vacío ofrecen una menor expresión de los genes inmunes analizados comparado con células TO transfectadas con el mismo vector vacío. La diferencia entre ambas líneas celulares radica en su origen, ya que mientras TO es una línea celular derivada de leucocitos de riñón cefálico, las células CHSE-214 son derivadas de linajes embrionarios provenientes de salmón chinook (CHSE: chinook salmon embryo). Dado que se obtiene un menor efecto inductor inespecífico de expresión de genes inmunes causado por células CHSE-214 que con TO, hemos decidido trabajar con células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L, pero previamente fijadas en paraformaldehído de manera de evitar activación de las células CHSE-214 y poder observar así el efecto debido sólo a CD40L en HKLs de salmón.

59

FIGURA 21. Microscopía de Fluorescencia de co-cultivo de células que sobreexpresan CD40L-GFP y leucocitos de salmón. (A) Co-cultivo 24h de células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L-GFP y HKLs. (B) Co-cultivo 24h de células CHSE-214 que sobreexpresan el vector de transfección vacío (GFP) y HKLs. (C) Co-cultivo de células TO que sobreexpresan CD40L-GFP y HKLs. (D) Co-cultivo 24h de células TO que sobreexpresan CD40L-GFP y linfocitos derivados de bazo. (E ) Co-cultivo de células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L y células adherentes derivadas de riñón cefálico por 24h (E) y 3 días (F). Experimentos representativos de cinco experimentos independientes.

A B C D

E F

60

0

5

10

15

20

25

30

35

OPG B7-H1 IL-2 IL-10

HK cocultured with TO-CD40L

TO-12.2/HK

TO-CD40L/HK

TO-GFP/HK

TO-CD40L-GFP/HK

FIGURA 22. Cuantificación de la expresión relativa por PCR en tiempo real de genes de importancia inmune para medir el efecto del tag GFP en el reconocimiento de CD40L. Co-cultivo 24h de HKLs con células TO transfectadas con diferentes constructos: células TO que sobreexpresan el vector vacío 12.2 sin tag GFP (TO-12.2/HK); células TO que sobreexpresan CD40L sin tag GFP (TO-12.2-CD40L/HK); células TO que sobreexpresan el vector vacío con tag GFP (TO-GFP/HK) y células TO que sobreexpresan CD40L con tag GFP (TO-GFP-

CD40L/HK). Experimento representativo de un total de 3 experimentos independientes.

Ex

presi

ón

rel

ati

va

HKLs co-cutivados 24h con células TO

TO-12.2/HK

TO-12.2-CD40L/HK

TO-GFP/HK

TO-GFP-CD40L/HK

61

0

10

20

30

40

50

60

CD40 CD83 B7-H1 IL-12 IL-10 IL-1

HK cocultured 24 hr with

TO-CD40L or CHSE-CD40L

TO-GFP/HK

TO-CD40L/HK

CHSE-GFP/HK

CHSE-CD40L/HK

A B

C

FIGURA 23. Análisis comparativo del perfil transcripcional de HKLs co-cultivados con las líneas celulares CHSE-214 o TO transfectadas con CD40L. (A) Células CHSE-214 transfectadas con CD40L-GFP por 48h. (B) Células TO transfectadas con CD40L-GFP por 48h. (C) Análisis por RT-PCR del perfil transcripcional de genes inmunes en HKLs co-cultivados con: células TO que sobreexpresan el vector de transfección vacío (TO-GFP/HK); células TO que sobreexpresan CD40L-GFP (TO-CD40L/HK); células CHSE-214 que sobreexpresan el vector vacío (CHSE-GFP/HK) y células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L-GFP (CHSE-CD40L/HK). Experimento representativo de un total de tres experimentos independientes.

HKLs co-cultivados 24h con TO-CD40L o CHSE-CD40L

Ex

presi

ón

rel

ati

va

62

Efecto de CD40L en HKLs

El efecto de CD40L en HKLs fue evaluado mediante el estudio del perfil de expresión de diversos genes relacionados con la función inmune. Células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L se co-cultivaron con HKLs por diferentes tiempos, células CHSE-214 transfectadas con el vector vacío se utilizaron como control. Los datos fueron normalizados con los valores obtenidos por HKLs sin estimulación. Las muestras se co-cultivaron por 6, 24 y 72h, luego se extrajo ARN y se realizó el análisis de expresión transcripcional por PCR en tiempo real.

Se determinó que la expresión de la mayoría de los genes estudiados era inducida al comparar con HKLs no estimuladas (Fig. 24). Interesantemente, los mARN codificantes para moléculas coestimulatorias características de APCs, tales como CD83, B7-H1 y CD40 (Fig. 24A-C) muestran un aumento en su expresión. Particularmente CD40 que muestra una significativa induccción en presencia de CHSE-214 que sobreexpresan CD40L (CD40L) comparado con los valores obtenidos por HKLs co-cultivados con CHSE-214 transfectadas con el vector vacío, confirmando que el efecto observado se debe a la unión de CD40L. Esto sugiere que la interacción de CD40 con CD40L induciría la activación/maduración de APCs en salmón.

La expresión de genes codificantes para citoquinas IL-1β, IL-10, TNFα y IL-12p40, (Fig. 24D-G) aumenta significativamente a las 6h post co-cultivo, obteniéndose la mayor inducción transcripcional a las 24h. Luego de 72h de co-cultivo se observa una disminución del nivel de los transcritos. En mamíferos las citoquinas mencionadas anteriormente, especialmente IL-12 son secretadas por APCs activadas con CD40L (72). Un dato interesante es la inducción en la expresión de transcritos para diferentes interferones (IFNs). Nuestros datos muestran un significativo aumento en la expresión de mARN para IFN B, IFN C e IFNγ (Fig. 24H-J) después de 24h de co-cultivo, IFN C e IFNγ muestran una disminución en la expresión en tiempos posteriores (72h).

63

B7-H1

6 24 720

10

20

30

CD83

6 24 720

10

20

30

IL-1

6 24 720

10

20

30

40

IL-10

6 24 720

10

20

30

IL-12p40

6 24 720

5

10

IFN B

6 24 720

200

400

600

800

1000

IFN C

6 24 720

1000

2000

3000

IFN

6 24 720

200

400

600

800

TNF

6 24 720

200

400

600

800

**

**

*** *

***

**** ****

****

*

CD40

6 24 720.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5vector vacío

CD40L

FIGURE 24. CD40L modula la expressión de varios marcadores celulares e induce la expresión

transcripcional de diversas citoquinas e IFNs en HKLs. HKLs no estimulados, co-cultivados con células CHSE-214 que sobreexpresan el vector vacío o CHSE-214 que sobreexpresan CD40L (CD40L) fueron estimulados por 6, 24 y 72h. Se determinó la expresión relativa de CD40 (A), B7-H1 (B), CD83 (C), IL-1β (D), IL-10 (E), TNFα (F), IL-12p40 (G), IFN B (H), IFN C (I) e IFNγ (J). El nivel de expresión de cada gen se normalizó por el nivel de expresión de EF1aB y se expresó como expresión relativa dividiendo la expresión promedio de las muestras co-cultivadas con CD40L o con el vector vacío por el valor de HKLs no estimulados para cada tiempo.Se muestra el promedio + SEM de tres individuos de tres experimentos independientes. Las diferencias observadas son estadísticamente significativas con respecto al control (HKLs no estimulados) (*P < 0,05; ** P < 0,01,*** P < 0,001, **** P < 0,0001).

Tiempo (horas)

Exp

resi

ón

rel

ati

va

A B C D E F G

H I J

64

La estimulación con CD40L induce la expresión de MHCIIβ en HKLs de Salmo salar

El rol funcional de CD40 en APCs, incluyendo DCs, ha sido vastamente estudiado en mamíferos, en experimentos in vitro como también in vivo. Estos experimentos demuestran que la unión de CD40L a CD40 altera considerablemente el fenotipo de las APCs (49). En estudios previos de nuestro laboratorio hemos demostrado que HKLs de salmón posee un número significativo de células que expresan en su superficie MHCIIβ y que dicha expresión es inducida en presencia de CpG clase B, indicando que estas células corresponderían a APCs maduras (60). Para caracterizar el efecto de la unión de CD40 en HKLs, hemos analizado la expresión de MHCIIβ en HKLs co-cultivados con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L mediante citometría de flujo. En congruencia con datos previos (60), HKLs presentan tres diferentes poblaciones basadas en el nivel de expresión de superficies de MHCIIβ (Fig. 25), donde tanto CpG clase B como también CD40L inducen la expresión de

MHCIIβ en la superficie después de 24h de estimulación, con un porcentaje de MHCIIβ high en HKLs no estimuladas de un 29,54% comparado con el 39,89% de células MHCIIβ high obtenidas en HKLs estimuladas con CD40L (Fig. 25A).

Esta población que expresa altos niveles MHCIIβ, denominada en este estudio “MHCIIβ high”está claramente graficada en los histogramas que muestran MIF de MHCIIβ contra el número de células (Fig. 25D). El efecto de CpG y CD40L

en HKLs se mantiene durante varios días. Después de 3 días de estimulación (Fig. 25B), 7 días de estimulación (Fig. 25C) y después de 12 días de co-cultivo (Fig. 25E). Particularmente, después de 7 días de estimulación, 6,65% de HKLs no estimulados corresponden a células MHCIIβ high, mientras que el porcentaje obtenido con la estimulación con CpG y CD40L fueron 50,9% y 54,11%, respectivamente.

El porcentaje de la población MHCIIβ high es afectada modestamente en

HKLs co-cultivados con células CHSE-214 que sobreexpresan el vector de transfección vacío, descartando la posibilidad que las células CHSE-214 o el constructo en sí mismo induzcan algún efecto en HKLs, ya que se puede apreciar que el efecto en HKLs producido por el co-cultivo con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L induce una expresión de MHCIIβ estadísticamente significativa, especialmente a los 7 días de estimulación, comparado con HKLs no estimulados. Los resultados muestran que CpG, al igual que CD40L inducen la expresión de MHCIIβ en la superficie y prolonga la viabilidad celular.

65

* *

** ** **** ****

1 día 3 días 5 días 7 días 12 días0

10

20

30

40

50

No estimulados CpG vector vacío CD40L

% c

élu

las M

HC

II

hig

h

A D B C E

FIGURE 25. CD40L y CpG clase B inducen un aumento en la expresión de MHCIIβ en HKLs. Los gráficos dot-plot muestran SSC v/s MHCIIβ de HKLs estimulados 24h in vitro con CD40L o CpG clase B, donde ambos estímulos inducen un aumento en la expresión superficial de MHCIIβ. (A) Esta población que expresa altos niveles de MHCIIβ es claramente definida después de 3 días de estimulación (B) y es más pronunciada después de 7 días de co-cultivo (C). (D) Los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de MHCIIβ. Los contornos grises representan MIF de MHCIIβ de HKLs no estimulados; contorno rojo indica MIF de MHCIIβ en HKLs estimulados con CpG clase B y el contorno azul representa MIF de MHCIIβ en HKLs estimulados con CD40L. Los gráficos representan los resultados obtenidos en uno de tres experimentos independientes. (E) El gráfico resume los porcentajes de células que expresan alta intensidad de MHCIIβ a diferentes tiempos de estimulación. Los valores son el promedio de tres experimentos independientes; la barra de error muestra SEM. Las diferencias observadas son estadísticamente significativa con respecto a HKLs no estimulados (*P < 0,05).

16,37% 53,58% 36,18% 58,63%

6,65% 50,9% 26,3% 54,11%

MHCII β

No estimulados CpG CD40L

1 day

3 days

7 days

Non - stimulated CpG empty vector CD40L 29,54% 36,42% 30,71% 39,89%

# of

cells

16,37% 53,58% 36,18% 58,63%

6,65% 50,9% 26,3% 54,11%

MHCII

CpG CD40L

1 día

3 días

7 días

No estimulados CpG vector vacío CD40L 29,54% 36,42% 30,71% 39,89%

#

de c

élu

las

SS

C-A

66

Estimulación de células adherentes proveniente de riñón cefálico con CD40L induce la expresión de MHCII, moléculas co-estimulatorias y citoquinas

De acuerdo a los datos mostrados anteriormente, CD40L induce la expresión de moléculas coestimulatorias y varias citoquinas en HKLs, como también induce un aumento en la expresión de superficie de MHCIIβ. Dado la heterogeneidad de las células presentes en HKLs y con el objetivo de identificar la población que estaría respondiendo al estímulo con CD40L hemos aislado la fracción de células adherentes, putativas APCs, provenientes de HKLs las que se co-cultivaron con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L. Posteriormente se analizó la expresión de MHCIIβ mediante citometría de flujo. La Fig. 26

muestra que aproximadamente la totalidad de las células adherentes son positivas para MHCIIβ. Adicionalmente, tanto CpG como CD40L inducen la expresión de MHCIIβ, aumentando desde un 10% MHCIIβ high en células controles hasta un 16,87% en células tratadas con CD40L por 3 días (Fig. 26A).

Este efecto fue observado después de 24h de estimulación y se mantiene en el tiempo, incluso después de 7 días de estimulación donde sólo un 11,75% de las células corresponden a células MHCIIβ high en células no estimuladas comparado con el 44,45% MHCIIβ high en células estimuladas con CD40L (Fig. 26B).

Paralelamente, estudiamos en la fracción adherente la expresión de

transcritos codificantes para diversas moléculas coestimulatorias características de APCs tales como CD40, CD83, B7-H1 y MHCIIβ así como también para diferentes citoquinas: IL-10, IL-1β, IL-12p40, TNFα, IFNγ, INF B y IFN C (Fig. 26D). Después de 6, 24 y 72h de co-cultivo de las células adherentes con

CHSE-214 que sobreexpresan CD40L, se detectó un aumento en la expresión de la totalidad de los genes estudiados. Interesantemente, la expresión de MHCIIβ en la superficie se correlaciona con los niveles de transcrito estudiado mediante PCR en tiempo real, siendo la máxima inducción observada a las 72h post-cocultivo, lo que sugiere que los niveles de este transcrito refleja también lo que sucede a nivel proteico.

Por otro lado, la máxima inducción de transcritos codificantes para

citoquinas es observado a las 24h post-cocultivo comparado con los controles. La inducción de IL-12p40 muestra un patrón similar a lo observado en HKLs, que contiene células tanto adherentes como no-adherentes (Fig. 24G). Para IL-1β e IL-10 los niveles de inducción muestran ser superiores en HKLs comparado con los niveles observados en células adherentes.

67

** ***

***

CD83

6 24 720

1

2

3

B7-H1

6 24 720

1

2

3

4

MHC II

6 24 720

1

2

3

4

IL-10

6 24 720

5

10

15

IL-1

6 24 720

5

10

15

IL-12p40

6 24 720

2

4

6

8

10

IFN

6 24 720

20

40

60

80

TNF

6 24 720

20

40

60

IFN B

6 24 720

200

400

600

IFN C

6 24 720

100

200

300

400

500

MHCIIβ

10% 16,65% 13,51% 16,87%

SS

C-A

10% 16,65% 13,51% 16,87%

11,75% 30,26% 23,39% 44,45%

MHCIIβ

10% 16,65% 13,51% 16,87%

SS

C-A

10% 16,65% 13,51% 16,87%

11,75% 30,26% 23,39% 44,45%

CD40

6 24 720

1

2

3

4

vector vacío

CD40L

1 día 3 días 7 días 0

20

40

60no-estimulados

CpG

vector vacío

CD40L

% c

élu

las M

HC

II

hig

h

A C

B

D

Leyenda de Figura 26 en la página siguiente.

Tiempo (horas)

Expre

sión r

elat

iva

** ***

*

**

**** *

HKLs no estimulados CpG vector vacío CD40L

68

FIGURE 26. CD40L y CpG clase B inducen un aumento en la expresión de MHCIIβ en la fracción de células adherentes derivadas HKLs. Los gráficos dot-plot SSC vs. MHCIIβ muestran MIF de MHCIIβ en células adherentes estimuladas in vitro con CD40L o CpG por 3 días (A) y 7 días (B). (C) Porcentaje de células adherentes que expresan alta intensidad de MHCIIβ a diferentes tiempos de estimulación. Los valores son el promedio de 3 experimentos independiente. (D) Células adherentes derivadas de HKLs se co-cultivaron con células CHSE-214 que sobrexpresan CD40L por 6, 24 y 72h y se examinó la expresión de moléculas co-estimulatorias: CD40, CD83, B7-H1, MHCIIβ y varias citoquinas como IL-10, IL-1β, IL-12p40, TNFα, IFNγ, IFN B y IFN C. El nivel de expresión de cada gen se normalizó con la expresión de EF1aB como gen de referencia y se expresó como expresión relativa dividiendo el nivel de expresión promedio de las muestras estimuladas con los valores obtenidos por las muestras no estimuladas en cada tiempo. Se muestra el promedio + SEM de tres individuos de experimentos independientes. Las diferencias son estadticamente significativas con respecto a los controles (*P < 0,05; ** P < 0,01,*** P < 0,001, **** P < 0,0001).

69

La estimulación con CD40L reduce la capacidad de incorporar antígeno en HKLs

La capacidad de las APCs inmaduras de incorporar antígeno es notablemente menor en APCs activadas y esta capacidad es ampliamente utilizada para evaluar el estado de maduración de APCs en vertebrados superiores. Basado en esta observación, procedimos a evaluar el efecto de CD40L en la maduración de APCs presentes en HKLs, evaluando su capacidad de capturar antígeno. Para llevar a cabo este objetivo, analizamos la internalización por HKLs de ovoalbúmina conjugada con Alexa fluor 647 (OVA). Leucocitos derivados de riñón cefálico se co-cultivaron con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L por 24h, 3 o 7 días, para luego evaluar la capacidad de incorporar antígenos, incubando los HKLs con OVA fluorescente por 4h, seguido de marcaje con antisuero anti-MHCIIβ y análisis mediante citometría de flujo.

Como se muestra en la Fig. 27 (A, C) la población que presenta bajos

niveles de MHCIIβ presenta alta capacidad de incorporar OVA, mientras que esta capacidad es notoriamente reducida en HKLs estimulados con CpG o CD40L. Esto sugiere que la interación de CD40 con CD40L induce la maduración de APCs, aumentado la expresión de MHCIIβ y disminuyendo la capacidada de incorporar antígenos. La capacidad de incorporar OVA se observó desde las 24h hasta 7 días post-estimulación (Fig. 27E). Pese a que

tanto CpG como CD40L inducen una disminución en la capacidad de incorporar OVA, el mecanismo de activación parece ser diferente. Mientras que CpG muestra una menor intensidad de fluorescencia de OVA, indicando que los HKLs estimulados con CpG incorporan menos OVA, los HKLs estimulados con CD40L muestran la misma intensidad de fluorescencia, pero un menor número de células capaces de fagocitar OVA (Fig. 27B, D). Experimentos adicionales

demuestran que la fracción de células adherentes estimuladas con CpG o CD40L también presentan una capacidad de incorporar OVA disminuida, aunque menos pronunciada comparado a lo observado en HKLs totales, que incluye tanto células adherentes como no-adherentes.

70

36,77% 50,06% 46,53 47,01% 56,48% 30,51%

24,81% 68,25% 31,83 62,72% 50,94% 42,17%

OVA-Alexa fluor 647

MH

CII

β-A

lexa

54

6

# o

fce

lls

Control CpG CD40L

36,77% 50,06% 46,53 47,01% 56,48% 30,51%

24,81% 68,25% 31,83 62,72% 50,94% 42,17%

OVA-Alexa fluor 647

MH

CII

β-A

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54

6

# o

fce

lls

Control CpG CD40L

Capacidad de incorporar antígenos

1 día 3 días 7 días 0

25

50

75 control

CD40L

% c

élu

las O

VA

++

A B

E

FIGURA 27. Capacidad de capturar antígeno en HKLs estimulados in vitro 3 y 7 días. HKLs estimulados se incubaron con ovoalbúmina fluorescente por 4h y luego se marcaron con antisuero anti-MHCIIβ. Los Dot-plots muestran MIF de MHCIIβ vs. MIF de OVA-Alexa flúor 647 en HKLs estimuladas por 3 días (A) y 7 días (C). (B, D) Los histogramas muestran la intensidad de OVA-Alexa fluor 647 en HKLs estimulados por 3 y 7 días. Contorno gris representa HKLs no estimulados; contorno rojo indica HKLs estimulados con CpG y el contorno azul representa HKLs co-cultivados con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L. Los gráficos muestran un experimento representativo de un total de 3 experimentos independientes. (E) El gráfico muestra el porcentaje de células capaces de incorporar ovoalbúmina (cuadrante a la derecha arriba en paneles A y C). Los valores representan el promedio de 3 experiemntos independientes, la barra de error muestra SEM. Las diferencias son estadísticamente significativas con respecto a los controles (P < 0,05).

No-estimuladas CpG CD40L

*

C D

71

Efecto de CD40L y CpG en linfocitos B de Salmo salar

Diversos estudios en vertebrados superiores han demostrado que la unión de CD40 a CD40L en linfocitos B induce un aumento del tamaño celular y la expresión de moléculas coestimulatorias, además linfocitos B activados por CD40 secretan un panel de citoquinas las cuales actúan de forma autocrina y paracrina, induciendo la secreción y el cambio de Ig (90). La interacción entre los receptores BCR, CD40 y Fas generan una compleja red de señales activadoras e inhibitorias, en la que la respuesta de linfocitos B finalmente es determinada por su estado de diferenciación (89). Para determinar el efecto de CD40L sobre linfocitos B de salmón, hemos co-cultivado HKLs o esplenocitos con células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L. La expresión de IgM se analizó mediante citometría de flujo y la capacidad de estas células de secretar IgM al medio fue evaluada mediante Western blot y ELISA de captura.

Los resultados muestran que el efecto de CpG sobre linfocitos B depende del estado de maduración de dichas células, ya que CpG clase B induce un aumento en el porcentaje de células IgM+/MHCII+ (linfocitos B) en esplenocitos, desde un 18,81% en esplenocitos no estimualdos a un 34,19% en esplenocitos estimualdos con CpG (Fig. 28A). Sin embargo, la situación en HKLs es diferente, ya que CpG induce una leve disminución en el número de células IgM+/MHCII+, de un 5,13% observado en HKLs no estimulados a un 3,96% en HKLs estimulados con CpG durante 3 días (Fig. 28B). CD40L no ejerce efecto alguno en el número de células IgM+/MHCII+ en esplenocitos y HKLs. El efecto de CpG en HKLs no sólo afecta el porcentaje de células IgM+/MHCII+, sino que también afecta la intensidad de fluorescencia de IgM en la superficie de estas células, mientras que en esplenocitos se observa un aumento del porcentaje de células, pero la intensidad de fluorescencia se mantiene . En HKLs se observa una disminución en el procentaje de células IgM+/MHCII+, pero además disminuye notablemente la intensidad con la que estas células expresan IgM (Fig. 28C).

Esto resultados sugieren que CpG en teleósteos, al igual que en

mamíferos, induciría diferenciación de linfocitos B hacia células con características de células plasmáticas, las cuales secretan Ig y disminuyen el nivel de expresión de Ig en su superficie (90). Para verificar dicha hipótesis, hemos cultivado ya sea esplenocitos o HKLs in vitro sin estímular o estimuladas con CpG clase B con CHSE-214 transfectadas con el vector vacío o co-cultivadas con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L. Los sobrenadantes se recolectaron a diferentes tiempos de estimulación y se evaluó la secreción de IgM mediante Western blot y ELISA de captura. La Fig. 29A muestra los análisis de Western blot que demuestran que esplenocitos cultivados in vitro por 3 días son capaces de secretar IgM, la cual es detectada en todos los sobrenadantes evaluados independiente del estímulo.

72

Sin embargo, a los 7 y 12 días de cultivo in vitro, CpG induce una mayor secreción de IgM. En el caso de HKLs (Fig. 29B) hay un aumento en la secreción de IgM en el tiempo, pero al igual que con los esplenocitos, CpG induce una notoria secreción de IgM después de 3, 7 y 12 días post-estimulación, mientras que CD40L no induce secreción de IgM. Estos datos se correlacionan con lo observado mediante citometría de flujo, donde CD40L no ejerce un efecto en la población IgM+/MHCII+.

Los mismos sobrenadantes fueron evaluados mediante ELISA de captura

(Fig. 30) donde se observa que CpG induce la secreción de IgM tanto en HKLs (Fig. 30A), como también en esplenoctios (Fig. 30B). Nuevamente, CD40L no afecta la secreción de IgM en ninguno de estos órganos.

73

18,81% 34,19 % 19,5% 16,8%

MHCIIβ

IgM

5,13% 3,96% 2,88% 2,04%

18,81% 34,19 % 19,5% 16,8%

MHCIIβ

IgM

5,13% 3,96% 2,88% 2,04%

* **

* * *

1 día 3 días 7 días0

2

4

6

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élu

las Ig

M+

MH

CII

+

1 día 3 días 7 días0

10

20

30

40no estimulados CpG vector vacío CD40L

% c

élu

las Ig

M+

MH

CII

+

FIGURA 28. Efecto de CD40L y CpG en la expresión de IgM. Gráficos dot-plot muestran MIF de IgM v/s MIF de MHCIIβ en esplenocitos (A) o HKLs (B) estimulados durante 3 días. Histogramas muestran MIF de IgM en esplenocitos (C) o HKLs (D) estimulados in vitro con CpG durante 3 días. Contorno gris corresponde a leucocitos no estimulados y contorno rojo corresponde a leucocitos estimulados con CpG. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de células MHCII

+/IgM

+ en leucocitos derivados de bazo (E) o HKLs (F) no estimulados;

estimulados con CpG; co-cultivados con CHSE-214 transfectadas con el vector vacío o con CHSE-214 que sobreexpresan CD40L. Datos muestran el promedio + SEM de tres experimentos independientes. Las diferencias son estadísticamente significativas con respecto a las muestras no estimuladas (*P < 0,05; ** P < 0,01).

A no estimulados CpG control de transfección CD40L

B C D

E Bazo F head kidney

Esplenocitos

HKLs

HKLs

HKLs

IgM

HKLs no estimulados CpG Bazo Riñón cefálico

no estimulados CpG

# d

e c

élu

las

74

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1628

17

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1628

17

17

28

62

St 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

17

28

62

St 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A

B

FIGURA 29. Análisis mediante Western blot del efecto de CpG clase B y CD40L en la secreción de IgM en leucocitos de Salmo salar-. (A) Western blot de sobrenadantes de leucocitos

derivados de bazo estimulados in vitro durante diferentes tiempos, los diferentes estímulos se señalan a continuación: no estimulados (NS); CpG clase B (CpG); co-cutlivo con células CHSE-214 transfectadas con el vector vacío (GFP); co-cultivo con células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L (CD40L). (B) Western blot de sobrenadantes de leucocitos derivados de riñón cefálico estimulados in vitro por diferentes tiempos y con los mismos estímulos señalados anteriormente. Experimento representativo de tres experimentos independientes.

24h 3 días 7 días 12 días

24h 3 días 7 días 12 días

NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L

NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L NS CpG GFP CD40L

75

ELISA de captura: IgM

Ab

460n

m

bla

nc

o

me

dio

su

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su

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Cp

G

GF

P

CD

40

L

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L

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Cp

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GF

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L

NS

Cp

G

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P

CD

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L

0.0

0.5

1.0

1.5

ELISA de captura: IgM

Ab

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G

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40

L

NS

Cp

G

GF

P

CD

40

L

0

1

2

3

4

5

A

B

FIGURA 30. Detección de IgM mediante ELISA de captura. (A) Detección de IgM presente en

sobrenadante de HKLs cultivados in vitro con diferentes estímulos: no estímulados (NS), CpG clase B (CpG), co-cultivados con células CHSE-214 transfectadas con el vector vacío (GFP) o co-cultivados con células CHSE-214 que sobreexpresan CD40L (CD40L). (B) esplenocitos cultivados en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Experimento representativo de dos experimentos independientes.

12 días

3 días 7 días

24h

3 días 12 días

7 días

24h

ELISA de captura: IgM

Sobrenadante de HKLs estimulados

ELISA de captura: IgM Sobrenadante

de esplenocitos estimulados

76

DISCUSIÓN SEGUNDA PARTE

La interacción CD40/CD40L es una importante vía coestimulatoria en la maduración de APCs en teleósteos

Conservación estructural y funcional de CD40L y CD40 en Salmo salar

Las funciones inmunoregulatorias mediadas por la interacción entre

CD40 presente en APCs y su ligando, CD40L, presente principalmente en linfocitos T activados ha sido extensamente estudiada en mamíferos, dada su importancia en la presentación antigénica y el cambio hacia respuesta tipo Th1. Sin embargo, no existe información alguna sobre el rol de esta interacción en la maduración de APCs en vertebrados inferiores. Gong y col. (73) ha demostrado la importancia de la interacción CD40L-CD40 en la producción de anticuerpos en pez zebra, sin embargo su participación en la maduración de las APCs no ha sido estudiada en teleósteos.

Debido a esto en el presente estudio hemos caracterizado

funcionalmente CD40L y CD40 en una especie de importancia económica como lo es Salmo salar. Hemos demostrado que leucocitos derivados de riñón cefálico de salmón responden a la estimulación con CD40L sobreregulando importantes moléculas coestimualtorias tales como CD40, CD83, B7-H1; aumentando la expresión de varias citoquinas incluyendo IFNs tipo I, IL-10, IL-1β, IL-12p40 y TNFα. Especial atención merece la observación que la estimulación con CD40L induce un aumento en la expresión de MHCIIβ en la superficie de leucocitos y disminuye su capacidad de capturar antígenos. Todas estas son características de APCs maduras o activadas, sugiriendo fuertemente que los teleósteos poseerían componentes similares a APCs capaces de responder a los mismos estímulos y a través de los mismos mecanismos descritos para vertebrados superiores.

Dado que CD40L y CD40 no han sido caracterizados en salmón,

inicialmente hemos aislado el cADN codificante para ambas proteínas y sus secuencias aminoacídicas fueron deducidas y comparadas con las secuencias correspondientes a la familia de receptores para TNFR y TNF, respectivamente, disponibles en la base de datos genebank para varias especies de vertebrados y dos especies de teleósteos. Las secuencias de CD40L y CD40 de salmón presentan un número de estructuras conservadas, similares a las presentes en las respectivas familias. Dichas similitudes se reflejan en homología de dominios funcionales tales como THD, conservación de residuos de cisteína y sitios de N-glicosilación para CD40L y residuos conservados de cisteína en CD40.

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Paralelamente hemos modelado la estructura tridimensional de CD40L, datos que nos permiten sugerir que CD40L y CD40 de salmón son ortólogos de la familia CD40L y CD40, respectivamente, y podrían estar ejerciendo las mismas funciones que su contraparte en vertebrados superiores.

Estructuralmente CD40L de salmón posee grandes similitudes a la

estructura de CD40L de humanos, pese a que la secuencia de CD40L en salmón presenta algunas variaciones en importantes aminoácidos para la interacción con CD40. Sin embargo las cargas electroestáticas y configuración de aminoácidos permiten sugerir que CD40L y CD40 de salmón podrían interaccionar de una manera similar a lo descrito en mamífero (Fig. 11). Pese a que el ORFs codificante para CD40L de salmón comparte aproximadamente un 25% de identidad con las secuencias pertenecientes a otros vertebrados (Fig. 10A), la similitud en estructura secundaria, tridimensional y el análisis filogenético (Fig. 12A) reafirman la idea que en peces estas moléculas son parte del sistema inmune y realizarían una función similar a la de los mamíferos. Paralelamente se encontraron transcritos de CD40L y CD40 en todos los tejidos analizados de salmón, sin embargo, la máxima expresión se encontró en tejidos relacionados con la función inmune (riñón cefálico, bazo y agallas) (Fig. 13). En mamíferos, CD40L se expresa principalmente en linfocitos T activados y su expresión es rápidamente sobreregulada en presencia de diferentes mitógenos tales como PHA y ConA. Por otro lado, CD40 se expresa constitutivamente en APCs y es rápidamente sobreregulado en presencia de estímulos como por ejemplo CpG.

En el presente trabajo se presentan datos relativos a la expresión de

CD40L y CD40 en HKLs en presencia de diferentes mitógenos (PHA, PMA y ConA) como también estímulos microbianos (LPS, poly I:C y CpG) (Fig. 14). La expresión de CD40L en HKLs no fue afectada por la presencia de LPS y CpG, mientras que poly I:C y PMA inducen un efecto muy modesto luego de 12h de estimulación. Sin embargo, la estimulación con PHA y ConA a concentraciones que en estudios anteriores en trucha han demostrado que inducen la sobreregulación de citoquinas características de la respuesta tipo Th (IL-21, IL-2 y IL-6) (67, 68) inducen en salmón una significativa expresión de CD40L. Esta inducción se observa a las 4h post-estimulación y es aún detectable después de 24h. Esta situación es similar a lo observado en mamíferos, donde CD40L es sobreregulado en linfocitos T 6h post-crosslinking con CD40 o 2h después de activación con mitógenos (74, 75). En contraste, la expresión de CD40 aumenta significativamente en presencia de estímulos virales y bacterianos como CpG, LPS y poly I:C, particularmente CpG induce el mayor efecto sobre el transcrito de CD40 a las 24h de estimulación.

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Estos datos se correlacionan con los estudios realizados en APCs de mamíferos, en los que CD40 se expresa constitutivamente a niveles muy bajos en DCs inmaduras, pero es rápidamente sobreexpresado en presencia de productos microbianos (análogos de ligandos para TLR) y otros patógenos (virus) (54-56). Estos datos apoyan la idea que CD40 modularía la respuesta inmune dirigida contra infecciones bacterianas y virales en salmón.

Los diferentes mitógenos (PMA, PHA y ConA) inducen expresión del

transcrito de CD40 12h post-estimulación, 8h después del incremento observado para el transcrito de CD40L en presencia de los mismo mitógenos, sugiriendo que la expresión de CD40L estaría induciendo la activación de CD40 (Fig. 14).

Para estudiar el rol que ejercerían CD40L y CD40 in vivo hemos

estudiado la expresión de ambas moléculas en peces vacunados con dos diferentes formulaciones contra el virus de la enfermedd del pancreas (pancreatic disease: PD). La Fig. 15 muestra que el transcrito para CD40L es sobreexpresado en HKLs de peces vacunados con la formulación que contiene el antígeno sin adyuvante a los 5 días post-vacunación, pero su expresión no es afectada en células derivadas de bazo, sugiriendo que el riñón cefálico contendría la mayor proporción de células capaces de expresar CD40L que podría corresponder a precursores de linfocitos T capaces de ser estimulados por las vacunas. Por otro lado, el patrón de inducción de CD40 es similar en riñón cefálicos y bazo, donde la mayor inducción es observada en peces vacunados con la formulación que contienen el antígeno en conjunto de CpG y poly I:C como adyuvante. Estos datos sugieren que la combinación de ligandos para TLR (CpG) en formulaciones para vacunas podría afectar la función de HKLs, modulando la expresión diferencial de CD40L y CD40.

Desde un punto de vista evolutivo, el estudio de las vías de señalización coestimulatorias en peces representa un importante avance, ya que se postula que en la escala evolutiva serían los peces los primeros organismos en desarrollar inmunidad adaptativa. Los eventos moleculares y celulares de la inmunidad adaptativa en peces todavía no son del todo claro, ya que la caracterización de las subpoblaciones inmunes tales como linfocitos T y células presentadoras de antígeno, no ha sido posible debido a la carencia de anticuerpos específícos para identificar estas subpoblaciones. Considerando esto, la identificación de la interacción CD40L-CD40 proporciona la primera evidencia que sugiere la existencia de linfocitos T y mecanismos regulatorios relacionados en teleósteos.

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Debido a la carencia de anticuerpos específicos y otras herramientas inmunes necesarias para separar y purificar las diferentes subpoblaciones celulares en peces, hemos utilizado una población celular heterogénea directamente aislada de riñón cefálico para evaluar el efecto de CD40L. Pese a que la hetereogeneidad de dicha población hace la interpretación de los datos más difícil, esto tiene la ventaja de que los datos obtenidos tienen más relevancia a nivel in vivo donde están presentes todos los componentes celulares y citoquinas necesarias para desarrollar una respuesta inmune.

Para estudiar el efecto de CD40L en células de riñón cefálico logramos

clonar y expresar ectópicamente CD40L de salmón en dos diferentes líneas celulares, CHSE-214 y TO (Fig. 16-20), confirmando que el tag GFP presente en los vectores utilizados para la transfección no interfiere en la interacción observada entre CD40L expresado ectópicamente y HKLs (Fig. 21-22).

Aunque es sabido que en mamíferos la unión de CD40L a CD40 induce

la expresión de varias moléculas coestimulatorias, la simultánea sobreregulación de CD40, CD83 y B7-H1 en HKLs debido a la interacción con CD40L es sorprendente y considerablemente significativa comparada con HKLs no estimulados (Fig. 24A-C). Interesantemente, la unión de CD40L a CD40 en progenitores hematopoiéticos CD34+ en mamíferos, induce la proliferación y diferenciación hacia células con atributos de DCs (76). Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en el presente estudio, que muestran que la estimulación con CD40L de progenitores derivados de riñón cefálico induce la sobrregulación de CD40, posiblemente induciendo diferenciación de células progenitoras hacia células con características de APCs. En conjunto con la sobreregulación de moléculas coestimualtorias mencionadas anteriormente, CD40L induce la expresión de citoquinas importantes para la respuesta inmune adaptativa, tales como IL-1β, IL-10, TNFα, IL-12p40, IFN B, IFN C y IFNγ (Fig. 24D-J). La mayor inducción del transcrito para IFNγ se observó a las 24h post-estimulación disminuyendo a las 72h de co-cultivo. Esto podría reflejar el hecho que los linfocitos T de salmón (putativa principal fuente de IFNγ) sufrirían apoptosis in vitro en ausencia de factores de crecimiento.

La observación que la unión de CD40L induce altos niveles de IFNs tipo I

en HKLs puede deberse a que estas moléculas son una familia de citoquinas secretadas en respuesta a infecciones virales que interfieren en la replicación y proliferación viral in vitro (77). En mamíferos, incluyendo humanos y roedores, el perfil de citoquinas secretados por linfocitos T activados es influenciado por varios factores, entre ellos el fino balance entre IL-12 y IL-10 secretadas por DCs estimuladas (78). IL-12 induce la diferenciación de linfocitos T hacia respuesta tipo Th1 (55), mientras que IL-10 bloquea la secreción de IL-12 y conduce la repuesta inmune hacia una respuesta tipo Th2 (79-81).

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Varios estudios realizados en humanos han demostrado que la unión de CD40L con DCs (a CD40) regula la secreción de ciotquinas tanto inflamatorias (IL-12, IL-1) como anti-inflamatorias (IL-10) (78). Estos datos se relacionan con lo observado por nosotros en HKLs de salmón, donde CD40L induce la sobreregulación de citoquinas proinflamatorias (IL-12p40, IL-1β) como también anti-inflamatorias (IL-10).

A pesar que la existencia de una respuesta tipo Th en peces no es del

todo clara, estudios en trucha han demostrado la existencia de genes codificantes para citoquinas claves en la respuesta tipo Th1, como también de tipo Th2 (67, 68, 82), sugiriendo que los peces podrían presentar respuesta tipo helper y que al igual que en humanos la interacción CD40-CD40L sería un punto de control, evitando quizás una respuesta inmune excesiva (83, 84). CD40L además de inducir la expresión de los transcritos mencionados anteriormente, induce una significativa expresión de MHCIIβ en la superficie de HKLs efecto comparable solamente con el efecto inducido por CpG, el cual se ha demostrado en trabajos anteriores que induce maduración de APCs en Salmo salar (60).

Se ha descrito en mamíferos, que las principales células presentadoras

de antígeno, tienen caracterícticas de células adherentes. Con el objetivo de identificar la población que estaría respondiendo a CD40L, hemos aislado células adherentes derivadas de riñón cefálico de salmón y hemos medido el efecto de la unión a CD40L en estas células (Fig. 26). Pese a que todas las

células adherentes son positivas para MHCIIβ, a los 3 días post-estimulación con CpG o CD40L podemos observar la aparición de una población que expresa altos niveles de MHCIIβ. La característica de un aumento en moléculas co-estimulatorias y citoquinas descrita para la población total de células de riñón cefálico (HKLs) se ve reproducida al activar la población de células adherentes. La unión de CD40L por las células adherentes, depletadas de la población no adherente, induce una clara sobreregulación de moléculas coestimualtorias CD40, CD83, B7-H1 y MHCIIβ, como también varias citoquinas IL-10, IL-1β y IL-12p40. Sin embargo, esta inducción es menor que la observada cuando se utiliza HKLs total que contiene células adherentes como también no adherentes (Fig. 24).

Estos resultados permiten postular que CD40L induce la activación

inicial de células adherentes y que la activación de estas células ejercería un efecto directo en la población linfocitaria que contiene putativos linfocitos T, favoreciendo una mayor expresión de moléculas coestimualtorias y permitiendo una respuesta inmune amplificada.

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Esto sugiere además que pese a que CD40L afecta la expresión de varios genes e induce la expresión de MHCII en células adherentes, esta señal por sí sola no es suficiente para montar una correcta respuesta inmune, confirmando que la interacción CD40-CD40L forma parte de una compleja red de componentes celulares y citoquinas, la cual es más claramente graficada cuando se utiliza la población completa de HKLs.

Al menos tres diferentes vías de activación de DCs han sido

identificadas, incluyendo la activación con citoquinas inflamatorias (IL-1 o TNF-α), ligandos de TLR (CpG) o interacción con linfocitos T activado CD40L+ (85), de las cuales la activación vía CpG ha sido utilizada como prototipo de maduración de DCs (85). En el presente estudio hemos comparado la capacidad estimulatoria de CpG versus CD40L en HKLs de salmón. En estudios previos (60), se ha demostrado que un significativo porcentaje de HKLs expresan altos niveles de MHCIIβ en presencia de CpG, indicando que el riñón cefálico posee una población de APCs diferenciadas. Esto no es sorprendente, ya que a diferencia de mamíferos, los teleósteos no poseen nodos linfáticos, por ende se ha sugerido que la presentación antigénica tomaría lugar en centros melanomacrofágicos, los cuales son abundantes en riñón cefálico (70).

El presente estudio demuestra que CpG y CD40L inducen la expresión de MCHIIβ en HKL (Fig. 25) y paralelo al aumento de expresión de MHCIIβ, la estimulación con CD40L induce una disminución en la capacidad de internalizar antígeno por HKLs (Fig. 27), una propiedad comúnmente utilizada para estudiar el estado de maduración de DCs (86, 87).

Nuestros datos muestran que después de la estimulación con CD40L,

HKLs internalizan menos ovoalbúmina comparada con los controles y esta disminución es más notoria después de 7 días de estimulación. Sin embargo, los mecanismos por los cuales CpG y CD40L inducen la disminución en la capacidad de incorporar antígeno en HKLs parece ser diferente, ya que mientras CpG reduce el nivel de OVA incorporada, denotada por la menor intensidad de fluoresencia, HKLs estimulados con CD40L presentan menor número de células capaces de incorporar antígeno, denotado por el menor porcentaje de células positivas para OVA.

Esto sugiere que CpG y CD40L estarían induciendo maduración de

APCs, pero a través de diferentes mecanismos de activación. En humanos es sabido que la estimulación con CD40L, al igual que estímulos microbianos inducen la activación de APCs, las cuales a su vez estimulan linfocitos T naive, aunque no es del todo claro si los diferentes estímulos de activación presentan la misma efectividad en este proceso. Se ha reportado que DCs activadas mediante CD40L son fenotípicamente más estables y presentan una viabilidad más prolongada comparada con DCs activadas mediante análogos de ligandos para TLR (88).

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La identificación del efecto de CD40L en HKLs mostrado en el presente estudio junto con datos anteriores que demuestran la conservación funcional de marcadores de maduración tales como CD80/CD86 (91) apuntan a la existencia de subconjuntos celulares similares a DCs en teleósteos lo que ayudaría a determinar el origen evolutivo de DC-APC.

La diferencia en los mecanismos de activación para CpG y CD40L

observados en células MHCII++ es más claramente graficada en linfocitos B, donde CpG induce un incremento en el número de linfocitos B IgM+/MHCII+ en esplenocitos, mientras que en HKLs CpG induce una disminución en el número de éstas células, además de una disminución en la intensidad de expresión de IgM en su superficie. Por otro lado, CD40L parece no afectar el número ni la intensidad de fluorescencia de IgM en ninguno de los órganos analizados (Fig. 28). Esto reafirma la idea que los mecanismos de activación de CpG y CD40L son diferentes y que el efecto de CpG sobre linfocitos B dependería además del estado de maduración de linfocitos B, denotado por las diferencias observadas entre riñón cefálico y bazo, ya que se ha sugerido que estos órganos podrían presentar linfocitos B en diferentes estados de maduración. Además de los efectos que CpG tiene sobre la expresión de IgM y sobre el número de células IgM+/MHCII+, CpG también induce la secreción de IgM (Fig. 29-30), lo que sugiere que CpG estaría provocando la diferenciación de los linfocitos B hacia células con características de células citoplasmáticas, efecto similar a lo observado en vertebrados superiores (90).

En conclusión, la segunda parte de nuestro estudio presenta la caracterización de la interacción CD40L-CD40 en Salmo salar. Hemos demostrado que CD40L recombinante induce la sobreregulación de los transcritos para diferentes moléculas coestimulatorias y citoquinas en HKLs, además de inducir la expresión de MHCIIβ y disminuir su capacidad de incorporar antígeno. Todos estos datos sugieren fuertemente que CD40L induciría la maduración de APCs indicando que el rol funcional de CD40L ha sido conservado a través 350 millones de años de evolución. Pese a que no hemos logrado demostrar presentación antigénica directamente, la caracterización de CD40L y CD40 ayudará a dilucidar los mecanismos y células involucradas en dicho proceso. Desde un punto de vista pragmático, futuros estudios en este campo permitirán el mejoramiento en estrategias de distribución y formulación de adyudantes con el fin de desarrollar vacunas más eficaces en peces de importancia económica.

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CONCLUSIONES Y PROYECCIONES

La salmonicultura es uno de los pilares de la economía chilena, de ahí la importancia en optimizar los niveles de sanidad y producción en dicha industria. En el presente estudio hemos analizado el efecto de diferentes dietas comerciales en varios parámetros de inmunidad innata, demostrando que el tipo de alimentación es clave en definir el estado inmunológico de los peces. Por otro lado, y muy importante es la caracterización del sistema inmune de Salmo salar, ya que de esta manera se puede optimizar y entender el mecanismo por el cual tanto enfermedades como inmunoestimulantes estarían ejerciendo su acción. Nuestros datos soportan la hipótesis que el sistema inmune en Salmo salar cuenta con poblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos, con una especial característica: Los linfocitos B presentan la capacidad de incorporar antígenos. Estos estudios permitirían por un lado dilucidar la organización del sistema inmune en salmón y por el otro entender el mecanismo evolutivo de sistema inmune en vertebrados superiores.

A través de nuestros estudios hemos caracterizado funcionalmente CD40L y CD40 en una especie de importancia económica como lo es Salmo salar. Hemos demostrado que leucocitos derivados de riñón cefálico de salmón responden a la estimulación con CD40L sobreregulando importantes moléculas coestimualtorias tales como CD40, CD83, B7-H1; aumentando la expresión de varias citoquinas incluyendo IFNs tipo I, IL-10, IL-1β, IL-12p40 y TNFα. Especial atención merece la observación que la estimulación con CD40L induce un aumento en la expresión de MHCIIβ en la superficie de leucocitos y disminuye su capacidad de capturar antígenos. Todas estas son características de APCs maduras o activadas, sugiriendo fuertemente que los teleósteos poseerían componentes similares a APCs capaces de responder a los mismos estímulos y a través de los mismos mecanismos descritos para vertebrados superiores.

La identificación de la interacción CD40L-CD40 proporciona la primera evidencia que sugiere la existencia de linfocitos T y mecanismos regulatorios relacionados en teleósteos, lo que abre la posibilidad de profundizar en estudios celulares del sistema inmune del salmón.

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CpG y CD40L inducen maduración de APCs, pero a través de diferentes mecanismos de activación. En humanos es sabido que la estimulación con CD40L, al igual que estímulos microbianos inducen la activación de APCs, las cuales a su vez estimulan linfocitos T naive, aunque no es del todo claro si los diferentes estímulos de activación presentan la misma efectividad en este proceso.

La identificación del efecto de CD40L en HKLs mostrado en el presente estudio, junto con datos anteriores que demuestran la conservación funcional de marcadores de maduración tales como CD80/CD86, podría dilucidar la existencia de subconjuntos celulares similares a DCs en teleósteos y de esta manera determinar el origen evolutivo de DC-APC. Trabajos futuros deberían ir dirigidos a aislar estas células con el fin de analizar su función en la presentación antigénica y en la regulación de la respuesta inmune.

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