ESTUDIO DEL EFECTO SOBRE LA CINETICA DE CRECIMIENTO DE

Aspergillus flavus y A.parasiticus POR SOBRENADANTES KEFIR Y DE BACTERIAS AISLADAS DEL

KEFIR. León, A.1,2,3; Gamba, R.1,2,4; Giannuzzi, L.2,5; De Antoni,

G.1,2,6. 1Cátedra Microbiología- UNLP. 2CIDCA – UNLP. 3Facultad de Química

Farmacéutica - Universidad de Antioquia-

Colombia. 4Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales-UNRC. 5CONICET. 6CIC-

PBA.

INTRODUCCIÓN• A.flavus y A.parasiticus causan pérdidas en

alimentos: cereales y sus derivados.

• Aflatoxinas: B1, B2, G1 y G2: hepatotóxicas, mutagénicas y posibles carcinógenos y un problema de salud pública (Legan, 1993).

• Kefir: leche fermentada artesanal originaria del Cáucaso euroasiático.

• Microbiota compleja • Descripto Código

Alimentario Argentino: Art 576 - (Res. MSyAS N° 295 del 14.04.99).

• Actividad antimicrobiana (Garrote y col, 2000; Golowczyc y col, 2008)

KEFIR COM0 BIOPRESERVANT

E

ANTECEDENTES DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR BACTERIAS DEL

ÁCIDO LÁCTICO

- Actividad antifúngica de BAL (Magnusson, Ström, Roos, Sjögren, & Schnürer, 2003; Sjögren, Magnusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003, Hassan, & Bullerman, 2008).

- Actividad antifúngica compuestos sobrenadantes de cultivo (Corsetti, Gobbetti, Rossi, & Damiani 1998; Lavermicocca, Valerio, Evidente, Lazzaroni, Corsetti, & Gobbetti, 2000; Gerez, Torino, Rollán, & de Valdez, 2008).

- Inhibición tasa crecimiento KD (mm/h) e incremento fase Lag (h) con ácidos puros y SLC de kefir. (León y col, 2006, 2007, 2008).

– Resistencia al pH ácidoResistencia al pH ácido– Resistencia a la bilisResistencia a la bilis– Producción de ácidos Producción de ácidos

orgánicosorgánicos– Inhibición Inhibición

• Escherichia coliEscherichia coli,,• Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium,,• S.entericaS.enterica,,• S.gallinarumS.gallinarum • Shigella sonneiShigella sonnei

Características de las Características de las BAL seleccionadas de BAL seleccionadas de kefirkefir

• Determinar la capacidad Determinar la capacidad inhibitoria de los inhibitoria de los microorganismos microorganismos aislados del kefir sobre el aislados del kefir sobre el hongo toxigénico hongo toxigénico Aspergillus parasiticus Aspergillus parasiticus NRRL2999. NRRL2999.

• Determinar la capacidad Determinar la capacidad inhibitoria de los inhibitoria de los microorganismos aislados microorganismos aislados del kefir y comparar estos del kefir y comparar estos resultados con los resultados con los obtenidos de obtenidos de sobrenadantes libres de sobrenadantes libres de células (SLC) de kefir, células (SLC) de kefir, sobre el hongo toxigénico sobre el hongo toxigénico Aspergillus flavusAspergillus flavus AFUBA5. AFUBA5.

OBJETIVOS

A.flavus AFUBA5

A. parasiticus NRRL2999

L.plantarum 8312

MATERIALES

Cepas fúngicas:Cepas fúngicas:

• A. flavusA. flavus AFUBA5 AFUBA5 (UBA) (UBA)

• A. parasiticusA. parasiticus NRRL2999 (UNQ)NRRL2999 (UNQ)

Cepas de BAL:Cepas de BAL:

•L. plantarum CIDCA 8316

•L. plantarum CIDCA 8313

•L. plantarum CIDCA 8324

•L. plantarum CIDCA 8327

•L. plantarum CIDCA 83210

•L. plantarum CIDCA 8334

•L. plantarum Qf5

CULTIVO MICROORGANISMOS

• Preparación de BAL:

Cultivo en leche estéril, 30 °C por 48 hs.

Centrifugación por 15min a 13200 rpm.

Obtención del SLC por filtración.

• Preparación cepas fúngicas:

Cultivo siete días agar inclinado PDA, 30 °C.

Diluciones: 104 conidias/ml.

METODOLOGíA

BAL aisladas de gránulos de kefir x x x

Incubación en leche

Gránulos Gránulos CIDCA CIDCA

AGK1-AGK2AGK1-AGK2

Centrifugación Centrifugación y Filtracióny Filtración

SLC + Agar Malta

Plaqueo

SIEMBRA DE 10 µl EN EL CENTRO DE LA

PLACA

Cepa fúngica

CUATRO MEDICIONES CUATRO MEDICIONES DIARIAS DEL DIAMETRODIARIAS DEL DIAMETRO

TASA CRECIMIENTO KTASA CRECIMIENTO KDD (mm/h) (mm/h)

INDICE DE INHIBICION INDICE DE INHIBICION DE LA TASA DE LA TASA

CRECIMIENTO:CRECIMIENTO:

{(K{(KDCDC – K – KDSDS)/ K)/ KDCDC}X100}X100

FASE LAG (hs)FASE LAG (hs)

INDICE DE INCREMENTO INDICE DE INCREMENTO DE LA FASE LAG:DE LA FASE LAG:

{(Lag{(LagSN SN - - LagLagCC)/Lag)/LagCC}X100}X100

PARAMETROS CINÉTICOS ESTUDIADOS

RESULTADORESULTADOSS

SLC DE GRÁNULOS DE KEFIR Y CEPAS

AISLADAS

IILag IIKd

AGK2 - pH3,5 - 50 % - 20°C 37,26 20,15

AGK2 - pH3,0 - 50 % - 20°C 282,55 34,66

AGK1 - pH3,5 - 50 % - 20°C 43,67 19,66

AGK1 - pH3,0 - 50 % - 20°C 102,2 26,11

AGK2- pH3,5 - 10 % - 20°C 5,86 7,45

AGK2 - pH3,0 - 10 % - 20°C 5,64 16,74

AGK1 - pH3,5 - 10 % - 20°C 32,6 3,33

AGK1 - pH3,0 - 10 % - 20°C 27,57 8,33

8316 - 50 % 8,15 2,70

8313 - 50 % 4,43 2,80

83210 - 50 % 10,47 2,97

8324 - 50 % 14,24 0,07

8327 - 50 % 9,13 2,34

8334 - 50 % 1,50 5,46

8316 - 10 % -7,96 27,96

8313 - 10 % -0,85 26,76

83210 - 10 % -7,15 28,86

8324 - 10 % -2,86 26,37

Efecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 y CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus

AFUBA5

Efecto de SLC de GRÁNULOS CIDCA AGK1-AGK2 sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus AFUBA5

IILag e IIKd de A. flavus AFUBA5 Vs SLC de KEFIR

SLC

%

0

50

100

150

200

250

300

350

IILag (%) AF5 IIKd (%) AF5 IILag e IIKd de A. flavus AFUBA5 Vs SLC de KEFIR

SLC

%

0

20

40

60

80

100

IILagIIKd

IILag e IIKd de A. flavus Vs

CEPAS AISLADAS DE KEFIR

SLC

0

20

40

60

80

100

IILag IIKd

IILag e IIKd de A. flavus Vs

CEPAS AISLADAS DE KEFIR

SLC

%

-20

0

20

40

60

80

100

IILag IIKd

Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. flavus AFUBA5

SLC de L. plantarum CIDCA IILag IIKd

8316 - 50 % 38,5000 -17,2300

8316 - 10 % 14,4700 21,9600

8313 - 50 % 45,5700 -17,9900

8313 - 10 % 7,4100 23,6500

83210 - 50 % 44,4900 -12,3400

83210 - 10 % 13,5700 23,0900

8337 - 50 % 42,7300 -19,7700

8337 - 10 % 0,0000 24,8800

Qf5 - 50 % 12,2800 -14,7400

Qf5 - 10 % 2,4000 9,2600

Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. parasiticus NRRL2999

IILag e IIKd de A. parasiticus Vs

SLC DE CEPAS AISLADAS DE KEFIR

SLC

8316 - 0,5%

8316 - 0,1%

8313 - 0,5 %

8313 - 0,1%

83210 - 0,5 %

83210 - 0,1 %

8337 - 0,5 %

8337 - 0,1 %

Qf5 - 0,5%

Qf5 - 0,1%

%

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50IILag IIKd

Efecto de SLC de CEPAS AISLADAS DE KEFIR sobre la Fase LagLag y KdKd de A. parasiticus NRRL2999

CONCLUSIONES• Se determinó que los SLC de kefir obtenidos a 20°C de

incubación inhiben al hongo toxicogénico A. flavus AFUBA5.

• Los SLC cepas de L.plantarum aislados del Kefir, inhiben el crecimiento de hongos toxigénicos A.flavus AFUBA5 y A.parasiticus NRRL2999, pero en una proporción menor que los SLC de kefir.

• El parámetro cinético mas afectado por los SLC, tanto de kefir como de cepas aisladas, es la Fase Lag.

• El efecto inhibidor de los SLC es mayor a medida que desciende el pH. Ya que aumenta la concentración de acido láctico en el medio.

CONCLUSIONES• La capacidad inhibitoria contra los hongos es cepa-dependiente; está relacionada con la capacidad acidificante de la cepa y la producción de ácido láctico.

• Análisis de otros metabolitos diferentes a los ácidos orgánicos capaces de actuar a pH alrededor de 4,0.

• Continuar con la selección cepas potenciales o, mejor aun, consorcios no tan complejos como el kefir, para aplicar en fermentaciones y preservación de alimentos.

• Resaltar la importancia que tiene la comunidad microbiana del kefir y su complejidad; y lo relevante de estudiarlo desde el punto de vista sinecológico.

BIBLIOGRAFIA

• Legan, J. D. (1993). Moulds spoilage of bread: the problem and some solutions. International Biodeterioration Biodegradation, 32, 33-53.

• Stiles, M. E. (1996). Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 70, 331-345.• Magnusson, J., Ström, K., Roos, S., Sjögren, J., & Schnürer, J. (2003). Broad and complex antifungal

activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 219, 129-135.

• Sjögren, J., Magnusson, J., Broberg, A., Schnürer, J., & Kenne, L. (2003). Antifungal 3- hydroxyl fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Applied and Environmental Microbiology, 69, 7554-7557.

• Hassan, Y.I., Bullerman, L. B. (2008) Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp. tolerans isolated from a sourdough bread culture. International Journal Food Microbiology, 121, 112-115.

• Corsetti, A., Gobbetti, M., Rossi, J., & Damiani, P. (1998). Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 253-256.

• Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., & Gobbetti, M. (2000). Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Applied and Environmental Microbiology, 66, 4084-4090.

• Gerez, C.L., Torino, M.I., Rollán, G., de Valdez, G.F. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties, Food Control (2008), doi: 10.1016/j.foodcont.2008.03.005

• Garrote, G.L. (1999) Bacterias Lácticas y Levaduras para la Industria Alimentaria: Kefir. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Exactas, Departamento de Química- Departamento de Ciencias Biológicas.

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• Molina, M. Giannuzzi, L. (1999) Combined effect of temperature and propionic acid concentration on the growth of Aspergillus parasiticus. Food Research International, 32, 677-682.

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• Golowczyc, M. Gugliada, M. Hollman, A. Delfederico, L. Garrote, G. Abraham, A. Semorile, L. De Antoni, G.(2008) Characterization of Homofermentative lactobacilli isolated from kefir grains: potential use as probiotic. Journal of Dairy Research, 75, 1-7.

MUCHAS GRACIAS!!!

INHIBICIÓN A.flavus AFUBA5 MEDIANTE SLC : GRANULOS KEFIR

CIDCA AGK1 y AGK2 CULTIVADOS EN LECHE

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

%

20º,3.5 20º,3.3 20º,3.0 30º,3.5 30º,3.3 30º,3.0 37º,3.5 37º,3.3 37º,3.0

IIKD- K1

IILag -K1

IILag –K2

IIKD- K2

¿Papel de las Bacterias ácido lácticas y metabolitos de la fermentación ácido láctica del Kefir en la inhibición

fúngica?