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E STUD I O D E L CON TR OL

E N L A TR ANSCR I P CI ON D E L

OP E R ON gal

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Elementos reguladores del operón gal. Gal R: molécula represora. OE y OI: Loci del la región Operadora de la trascripción. P1 y P2: región Promotora de la transcripción. cAMP-CRP: Complejo proteína-receptor.

ANTE CE D E NTE S…• P1 y P2 separados 5 pb; los inicios estan en caras

opuestas de la hélice del ADN (giro completo 11pb)• P1 y P2 estan solapados.

• OE y OI se unen a la forma dimérica del represor, luego formará un tetrámero

• OE y OI separados 114 bp, generan un loop de 11 giros helicoidales

• LacI puede reprimir los promotores gal cuando los operadores gal se reemplazan con operadores lac.

• in Vitro sólo Lac forma tetrámero; Gal no (en extractos crudos si)

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OE

OI

R E P R E SOR TE TR A M É R I C

O

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Previos estudios mostraron que in vivo la formación de loop entre la región OE y OI reprimía la transcripcion del operón Gal.

Se estudio in vitro:

•Los efectos del complejo cAM P :CR P sobre la transcripción

•La represión por L acI + (que si forma tetrámero).

•La represión por L ac adi (que no forma tetrámero).

•La represión por GalR (que no forma tetrámero).

•Si la represión selectiva con GalR es por interacción con OE y/o OI

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Se fabricó un molde de AD N plasmídico circular conteniendo el promotor Gal y una secuencia terminadora. A partir de éste se generaron otros moldes con algunas variaciones:•pSA508: Plásmido parental sin promotor.

•pSA509: Plásmido parental con secuencia promotora gal (288 pb) (desde -197,+91)

•pSA510: Plásmido igual al 509, pero con operadores Lac.

•pSA511: Plásmido con promotor Gal, OI de Lac y OE de Gal

•pSA512: Plásmido con promotor Gal, OI de Gal y OE de Lac

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•E fectos del complejo cAM P :CR P sobre la transcripciónSe observa en el gel A (8%):• Ausencia total de bandas para el plasmido control 508 con y sin cAMP. • 4 bandas para el 509 sin cAMP, dos que se piensa corresponden a los transcriptos de P1 y P2; • Una única banda con cAMP, correspondiente a los transcriptos de P1. Es 3 veces mas intensa que la observada en presencia de cAMP

Se observa en el gel B (25%): • Ausencia de bandas para el 508 tanto con como sin cAMP.• Varias bandas para el 509 en ausencia de cAMP, dos que se corresponden con los transcriptos abortados de P2 los cuales forman trímeros y hexámeros. • Una sola banda en presencia de cAMP correspondiente al transcripto abortado de P1 (trímero solamente).

E l cAM P :CR P inhibe la transcripcion de P 2 y activa la de P 1.

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No hay transcripto desde P2 en presencia de cAMPSí hay P1 3 veces más que sin cAMP

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•R epresión de la transcripción desde P 1 y P 2 por el represor L acI + y L acI adi.•Se estudió usando el molde pSA510 (Plásmido igual al

509, pero con operadores Lac).

•Se usaron LacI+ y LacI adi en presencia y ausencia de cAMP

•Los porcentajes se establecen con respecto a reacciones de control en presencia de 1mM de IPTG, inductor de la transcripcion.

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•L acI + inhibe la transcripción desde P1 y P2 (largos y abortados), con y sin cAMP. La represión se da en un 95% a 30 nM de LacI+.

•En presencia de cAMP, P2 siempre está reprimido

LacI+

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•Sin cAMP se observan bandas a todas la concentraciones de LacIadi pero hubo represión de P1 en un 75% y de P2 en menos de un 10%. •Con cAMP la represión de P1 se mantiene pero la represión de P2 se ve levemente aliviada.

LacIadi

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La represión por LacI + fue casi completa alcanzando la mitad de la máxima represión a

concentración 10nM de represor con y sin cAMP.

La represión máxima de P1 por LacIadi fue de tan solo 75% y de P2 10% a una concentración

mucho mayor (90nM) sin cAMP. LacI adi reprime parcialmente P 1 y casi nada a

P 2

Nota: LacI adi alivia la represión de P2 que ejerce el cAMP

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• R epresión de la transcripción desde P 1 y P 2 por GalR

•GalR sin cAM P activa P 2

•GalR alivia la represión sobre P2 de cAMP

•GalR siempre reprime la transcripción desde P 1, con cAMP en un 80% y sin cAMP en 65%

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•L a represión selectiva GalR ¿es por interacción solamente con O E?

Se usó:

•Plásmido con promotor Gal, OI mutado (OCI) y OE de Gal

•Plásmido con promotor Gal, OE mutado (OCE) y OI de Gal

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509 Los resultados de la

transcripcion del O + EO C I son muy similares a los del 509:

•P1 se reprimió en un 80% a 80nM de GalR en presencia y ausencia de cAMP.

•P2 en ausencia de cAMP no fue reprimido mientras que en presencia si lo fue (por el cAMP).

Sobre la transcripcion a partir del O C EO + I GalR casi no tuvo efecto, aun a muy altas concentraciones.

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•El LacI+, tetramérico, es capaz de llevar a cabo una represión completa de P1 y P2 porque forma loop en el ADN.•El Lac adi, incapaz de tetramerizar o formar loop, es capaz de reprimir P1 parcialmente y solo a altas concentraciones y reprime muy poco a P2.•El GalR reprime P1 solo parcialmente y activa P2.•In vivo, GalR es capaz de provocar una represión completa, ya que tetrameriza, se supone que para ello utiliza un componente accesorio que se perdió en la purificación.•El complejo cAMP-CRP activa P1 y reprime P2 totalmente. En presencia de represores P1 no es activado (“gana” el represor). En presencia de represores solo diméricos la represión de P2 se alivia.

R E SUM I E ND O…

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•P 1 y P 2 se sintetizan con igual eficiencia en ausencia de cAM P -CR P

•E s necesaria la tetramerización del represor y generación de looping en el AD N para obtener una represión

•Como las represión afecta tanto los transcriptos largos como los abortados se asume que la inhibición se da en la formación del primer enlace fosfodiéster o en un paso previo a este.

•L a represión parcial por GalR solo requiere de interacción con el operador E , esta represión parcial no involucra loop.

CONCLUSI ONES

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La represión total de P1 y P2, requiere que se forme un loop en la región promotora debido al estado tetramérico de la unión operador-dímero de represor en cada una de los dos subunidades.

En ausencia de la formación de tetrámero, la ocupación de los operadores por los represores en estado dimérico, no causa el looping, y por tanto no se da la represión completa.

Lo que sucede cuando el represor se une a operadores en forma dimérica es la activación de P 2 y la inhibición de P 1.

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M ateriales y M étodos:

pSA508: Plásmido parental sin promotor.

pSA509: Plásmido parental con secuencia promotora gal (288 pb) (desde -197,+91)

pSA510: Plásmido igual al 509, pero con operadores Lac

pSA512: (OLE – OG

I)

pSA521: igual al 510 (todo Lac) con una inserción de 5pb en -50.5

pSA532: (OLE – OL

I), con un inserto de 10bp

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Se estudió:

•El efecto de la unión de los represores diméricos LacIadi y Gal R sobre la transcripción

•El rol individual de los operadores en la regulación por ambos represores

•La unión de la ARN polimerasa a promotores en presencia de represor

•El contacto represor-ARN polimerasa

•Los modelos de represión y activación por represor

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• E fecto de la unión de los represores diméricos LacI adi y Gal R sobre la transcripción

*Se utilizó:

1 molde de ADN gal [con operadores gal, (OGE – O G

I ) ]

1 molde de ADN gal [con operadores lac, (OL E – O L

I ) ]

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R esultados:

•En ausencia de represor se observan bandas en el gel correspondientes a transcriptos de 120 nt de P1 y de 125 de P2

•Con el aumento de GalR disminuye PI en 80% y aumenta P2 en 50% a 50 nM. •Con el aumento de LacIadi sucede lo mismo.

Ambos represores en forma dimérica reprimen la

transcripción desde P 1 y estimulan P 2

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• R ol individual de los operadores en la regulación

*Se usó moldes con distintos operadores:

•1 molde de ADN con operadores lac ambos funcionales

•1 molde de ADN con operador externo gal funcional e interno no funcional (OL

E – OCI )

•1 molde de ADN con operador interno lac y externo no funcional (OC

E – O LI )

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R esultados:

• Siempre que está el OE funcional (columnas 1 y 2), hay represión de P1 y activación de P2 independientemente del estado de OI

• Con el operador E mutado, la represión por LacI es indetectable. (columna 3)

E n ausencia de looping, la ocupación de OE por el represor es responsable de la represión

de P 1 y activación de P 2.

L a unión a O I es irrelevante en la regulación de la

transcripcion de ambos promotores.

FOOTPRINTING CON DNASA I

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Sirve para conocer la secuencia de ADN a la que se unen las proteínas

2. ADN de interés se marca radiactivamente en uno de los extremos de la molécula y en una sola de las hebras del duplex.

3. Se degrada por ruptura al azar con DNAsaI obteniéndose fragmentos de distintos tamaños

4. se lleva a cabo una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida y detección por auto radiografía, y cada banda será representativa de un nucleótido específico en donde el corte se llevo a cabo.

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Si la molécula de ADN esta formando complejos con proteína/s antes de ser tratada con el agente cortante, entonces estos nucleótidos interactuantes con proteínas estarán “protegidos” de la acción química o enzimática de cortado.

Así, algunas de la bandas no estarán presentes en la corrida electroforética, y esto significa, que no hubo corte debido a que estaba siendo protegida por la proteína.

1. Las proteínas se dejan complejar con el ADN2. Se agrega la DNasaI3. Se termina la reacción, se aísla el ADN4. Se corre en gel desnaturalizante5. Se compara con una corrida de ADN desnudo

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• Unión de la AR N polimerasa a promotores en presencia de represor

El mecanismo de represión selectiva de P1 y la activación de P2 por la unión del represor al OE se investigo por protección con DnasaI.

*Se utilizaron mutantes gal P1+P2- y mutantes gal P2- P1+, en estos OI estaba ausente.

*Se varió la concentración de polimerasa de 0 a 800 nM en presencia y ausencia de represor.

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•En ausencia de represor se observa una zona protegida de +24 a -55 para P1 y para P2 de +10 a -49 (por la polimerasa).

•El represor unido a OE protege la secuencia -50 a -70 (sin polimerasa).

•En presencia de ambos (polimerasa y represor) en P1+P2- la protección de la polimerasa cambia, o sea que en la presencia del represor la polimerasa forma un complejo con el AD N distinto al complejo abierto formado en ausencia de represor.

•Los patrones de protección para P2+P1- fueron iguales en ausencia y presencia de represor.

•La presencia del represor favorece la formación de complejos abiertos, polimerasa-P 2.

•Aunque estos resultados sugieren una superposición parcial entre la polimerasa y el represor, esto puede no ser así ya que depende del arreglo espacial de las proteínas en el ADN.

Dimetil sulfato (DMS) protection assay. La técnica es similar al footprinting con DNasaI, con la diferencia que los fragmentos son tratados con cantidades limitadas de DMS de forma que una única guanina sea metilada por cada fragmento. Las guaninas que están protegidas por la proteína no pueden ser metiladas. Luego de la remoción de la proteína, los fragmentos son tratados con piperidina que corta en la posición de los nucleótidos metilados.

Las muestras son luego examinadas por electroforesis en gel desnaturalizante. El patrón de bandas del control de ADN indica la posición de las guaninas que fueron protegidas en el ensayo.

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•Topografía de los complejos AD N-proteínas

•Se construyó una proyección del complejo represor-ARN pol en B-ADN.

•Como P1 y P2 estan separados media vuelta se encuentras en caras opuestas del ADN

•El represor ocupante de OE se encuentra en la misma cara del ADN que la polimerasa ocupando P1.R esu ltados:

•La polimerasa unida al promotor cubre mayoritariamente una cara de la hélice de ADN.

•El represor no evita la unión de la polimerasa

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Posteriormente•Se uso el molde pSA521 con una inserción de 5pb entre OE y los promotores. Esto coloca esto coloca a OE en la misma fase que P2 y opuesta a P1.

•También se utilizo el molde pSA532 con una inserción de 10pb, que agrega una vuelta entera manteniendo la orientación original.

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•El represor reprimió la transcripción desde el promotor que estaba en su misma cara.

•En el molde con inserto de 5pb reprimió a P2 y estimulo a P1, en el de 10pb reprimió a P1 pero no estimulo a P2..

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• Se sabía que para la activación de la transcripcion se requiere contacto entre el activador unido a ADN y el dominio C-terminal de la subunidad α de la polimerasa.

• Por analogía la represión de P1 por la unión del represor a OE podría también involucrar el dominio C-terminal de la subunidad α de ARN pol.

•Se testeó si ese dominio es necesario para la represión de P1 usando polimerasas truncas (ya que la subunidad α no es indispensable para la función del la ARN pol): una con 73 residuos menos (α-256) y otra con 94 residuos menos (α-235)

•Se utilizo un molde OGE – O C

I con GalR y OL E – O C

I con LacI

• E l contacto represor-AR N polimerasa

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R esu ltados:

•Con la subunidad α intacta se observo una inhibición de P1 y estimulación de P2 normal para ambos represores.

•Con la polimerasas truncas ni GalR ni LacI reprimieron P1 ni activaron P2

E l dominio C-terminal de la subunidad α de la polimerasa es necesario para la función normal de los

represores.

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E NTONCE S…

Los resultados anteriores sugieren que mecanismos independientes gobiernan la represión de P1 y activación de P2.

El represor no evita la unión de la ARN pol a P1 y por tanto la represión se da en un paso posterior a la formación del complejo cerrado.

E l represor unido a OE en ausencia de looping reprime a P 1 y estimula a P 2 con participación del dominio C-terminal de la subunidad α de la

AR N polimerasa.

Los efectos son generados porque la unión provoca en la subunidad α un cambio a un estado

desfavorable para el inicio de la transcripcion desde P 1 y favorable desde P 2.