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ESTUDIO DEL CONTENIDO FITOQUÍMICO Y LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE

LAS HOJAS DE CEDRÓN (Aloysia citrodora)

Teresita de Jesús Ariza Ortega314*, Nallely Rosalba Román Cortés314 y Rocío Cruz Muñoz314,315

Resumen

El cedrón (Aloysia citrodora) es una planta espóntanea de América del Sur y

originaria de Perú; popularmente es conocida como cedrón, cidron, limón verbena,

verbena, yerba luisa o yerba de la princesa que crece en forma de arbusto de hasta

1.5 m de altura, sus hojas tienen un olor intenso y se consumen en forma de infusión

en la medicina tradicional para aliviar desordenes gastrointestinales o respiratorios;

además de emplearse como tónico, sedante, antipirético, expectorante,

antihipertensivo y antiespasmódico. La composición química de sus hojas se debe

principalmente a la presencia de aceites esenciales, compuestos fenólicos,

derivados de ácidos hidroxicinámicos, taninos y flavonoides; lo cual convierte a este

organismo en una importante fuente de antioxidantes. Es por ello, que el objetivo

del presente trabajo fue analizar el contenido fitoquímico y el potencial antioxidante

de las hojas de cedrón. Para lo cual se obtuvieron extractos metanólicos por el

método de maceración solido-líquido, y a dichos extractos se les cuantificó el

contenido de antocianinas, flavonoides, fenoles totales, actividad antioxidante y el

porcentaje de inhibición de radicales libres por el método ABTS. En los resultados

se observó que los extractos de cedrón presentaron moderado contenido de fenoles

y flavonoides; con un porcentaje de inhibición de radicales libres máximo de 81.38 ±

7.26, obtenido por el método ABTS.

Palabras clave: antocianinas, flavonoides, ABTS, extracto vegetal

314 División de Ingeniería en Nanotecnología. Universidad Politécnica del Valle de México. 315 Maestría en Ciencias en Tecnología en Productos Biológicos. Universidad Mexiquense del Bicentenario-UES Tultitlán. *teresita.ariza@gmail.com

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Introducción

Los hábitos alimenticios actuales, caracterizados por alimentos de fácil preparación

con contenido de harinas y azúcares refinados, dietas carentes de nutrientes de

origen vegetal funcionalmente saludables; están llevando a la aparición de

epidemias relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo II, enfermedades

cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades crónicas (Johns y Eyzaguirre, 2006).

Esto ha llevado a que, en años recientes, el interés por el estudio de alimentos

funcionales y nutracéuticos vaya en aumento (Chirinos et al., 2013). En la dieta diaria

se consumen lípidos cuya función principal es proveer al organismo de energía y de

ácidos grasos esenciales, su contraparte es la oxidación celular. Por otra parte, el

efecto de los antioxidantes consiste en interrumpir o reducir la velocidad del

proceso de oxidación celular al estabilizar los radicales libres dentro de un

organismo o un producto alimenticio (Vieitez et al., 2018).

En la industria es común la utilización de antioxidantes sintéticos entre los que

figuran el butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT) y el galato de propilo

(PG); para prevenir la rancidez oxidativa, sin embargo, aún existe incertidumbre

sobre la inocuidad de este tipo de compuestos (Olmedo et al., 2012). Los

antioxidantes naturales tienen muchas ventajas como la aceptación por la mayoría

de los consumidores, que son considerados seguros y que normativamente no

requieren cumplir con mayores lineamientos (Sacchetti et al., 2005). El uso de

extractos herbales como aditivos naturales en la industria de los alimentos es una

opción aplicable, sin embargo, esta práctica depende de una buena selección

debido a que algunos compuestos vegetales son en extremos aromáticos o

pungentes por lo que no es correcto la aplicación de forma directa (Suhaj, 2006).

Para la obtención de extractos naturales de plantas existen diversos métodos. El

método más común es la extracción sólido-líquido que consiste en una maceración

simple. Las variables a considerar en este método son: el tipo de disolvente utilizado,

el tiempo y temperatura de extracción, los gramos de muestra vegetal por volumen

de disolvente, el tipo de agitación y el método final de separación de componentes

(Naczk y Shahidi, 2004).

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Un alimento nutracéutico está definido como cualquier producto que pueda

considerarse alimento, capaz de proporcionar beneficios saludables, incluidos la

prevención y el tratamiento de enfermedades; además de satisfacer las necesidades

nutricionales básicas. La actividad antioxidante es considerada como una de estas

propiedades debido a que provee beneficios a la salud como la reducción de riesgo

de enfermedades cardiovasculares y cáncer, al combatir a los radicales libres (Pérez,

2006).

El cedrón es una especie vegetal considerada hipocalórica con altas propiedades

antioxidantes, lo cual indica contiene diversos compuestos polifenólicos como son:

fenoles y flavonoides (Paucar, 2018). También se ha detectado la presencia de

compuestos fenólicos derivados de ácidos hidroxicinámicos, taninos y flavonoides

(Ricco et al., 2011) Se emplean principalmente sus hojas bajo la forma de infusión y

cocimiento (Wernert et al., 2009). El cedrón es un arbusto que puede medir hasta

1.5 m, es de tipo aromático, originario de Chile, Perú y Argentina, posee propiedades

medicinales aromáticas de gran interés terapéutico y pertenece a la familia de las

Verbenáceas (Rojas et al., 2012). Se ha demostrado que el cedrón en infusión posee

propiedades medicinales como tranquilizante, calmante nervioso, expectorante,

sedante, analgésico, diurético; además su aceite esencial compuesto de: limoneno,

linalol, cineol, terpineol y cariofileno presenta acción eupéptica y espasmolítica

(Barrios et al., 2010).

Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue el estudio de los compuestos

fitoquímicos presentes en los extractos metanólicos de las hojas de cedrón (Aloysia

citrodora) así como la determinación de su potencial antioxidante por medio del

radical libre ABTS.

Materiales y métodos

Material biológico. La especie vegetal cedrón (Aloysia citrodora) fue recolectada en

un campo local del Valle de México (Latitud: 19.5649, Longitud: -99.6966). Se

seleccionaron aquellas hojas que no presentaron alteración morfológica visible, ni

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indicios de afecciones patógenas. Cada muestra fue lavada con agua corriente para

eliminar excesos de tierra (en tres ocasiones), posteriormente se enjuagaron en

agua destilada (en tres ocasiones); finalmente se secaron para proceder con los

análisis correspondientes.

Preparación del material vegetal fresco. A 1 g de las hojas secas y molidas se le

adicionaron 10 mL de metanol acuoso al 80% (MeOH ac. 80% v/v); la suspensión fue

sonicada por 15 min a temperatura ambiente y se dejó reposar por 24 h. Finalmente

los extractos metanólicos fueron filtrados y centrifugados por 10 min a 1409 x g, los

sobrenadantes fueron colectados y mantenidos a 4°C para su posterior uso en las

próximas 24 h (Wojdylo et al., 2007).

Cuantificación de antocianinas. Se empleó el método por diferencia de pH,

descrito por Giusti y Wrolstad (2001) con algunas modificaciones, para el cual se

utilizaron dos sistemas tampón: 1) ácido clorhídrico-cloruro de potasio (HCl/KCl) con

pH = 1.0 y 2) ácido acético-acetato de sodio (CH3COOH/C2H3O2Na*3H2O) con pH = 4.5.

Se prepararon 2 tubos de ensaye con 0.2 mL de los extractos metanólicos

previamente preparados; a uno de ellos se le adicionaron 1.8 mL de la solución

tampón con pH = 1.0 y a otro 1.8 mL de la solución tampón con pH= 4.5; las mezclas

fueron agitadas con un vórtex y se midió la absorbancia a longitudes de onda () de

510 y 700 nm cada tubo. Como blancos se utilizaron las correspondientes soluciones

tampón. Se calculó la absorbancia total de la muestra a partir de la siguiente

ecuación: At = [(A510-A700)](pH=1.0) – [(A510-A700)](pH=4.5).

La concentración de pigmentos monoméricos en el extracto se expresa como mg

de cianidina-3-glucósido equivalente a 100 g de peso freso (pf). Y se calculó por

medio de la siguiente ecuación: Antocianinas momoméricas (mg/L) =

(At*PM*FD*1000)/(ε*1) con base al volumen y peso de la muestra preparada.

Estimación del contenido de flavonoides. Se empleó el método colorimétrico con

cloruro de aluminio; en donde a se tomaron 0.5 mL del sobrenadante de los

extractos metanólicos previamente preparados, se les agregaron 1.5 mL de metanol

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(MeOH) acuoso al 95% (v/v), 0.1 mL de cloruro de aluminio al 10% (AlCl3, p/v), 0.1 mL

de acetato de potasio (0.1 M) y 2.8 mL de agua destilada (Chang et al., 2002). La

mezcla se agitó y se incubó por 30 min a temperatura ambiente, transcurrido el

periodo de incubación se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm en

un espectrofotómetro Genesys 10S. Para su cuantificación se elaboró una curva

patrón de la flavona quercetina de (0-300 mg/L). Los resultados del contenido de

flavonoides totales se reportaron como mg equivalentes de quercetina en 100 g-1 de

peso fresco (mg EQ 100 g-1 pf). Los resultados se presentan con la media ± desviación

estándar (DE, n=3). El contenido total de flavonoides se cuantificó empleando la

siguiente formula: (mg de quercetina)/(100 g de pf)=[(Abs-b)/m)/C]*100. En dónde:

Abs corresponde a la absorbancia de la mezcla después de adicionar la muestra o

el estándar, b es la ordenada al origen de la curva estándar, m es la pendiente de la

curva estándar y, C es la concentración de la muestra (g/L).

Determinación de fenoles totales. Se utilizó el método espectrofotométrico

descrito por Folin y Ciocalteu, (1927) con algunas modificaciones de Madhujith y

Shahidi (2005), esta técnica se fundamenta en el carácter reductor del reactivo

Folin-Ciocalteu, con coloración azul. De las muestras previamente preparadas

(extractos MeOH) se tomaron 0.5 mL a los cuales se les agregaron 0.5 mL del reactivo

Folin-Ciocalteu (0.2 N) y 4 mL de Na2CO3 (0.7 M), la mezcla fue agitada

vigorosamente en un equipo vórtex e incubada a temperatura ambiente y en

oscuridad durante aproximadamente 2 h. Una vez finalizada la incubación, la

mezcla se leyó en un espectrofotómetro Genesys 10S a una longitud de onda de 765

nm, registrando de este modo su absorbancia. El blanco empleado fue agua,

siguiendo la misma metodología antes descrita. El control empleado fue ácido

gálico en gradientes de concentración (0-400 mg/L). Las pruebas se realizaron por

cuatriplicado; los resultados se reportan como el promedio de las mismas con su

respectiva desviación estándar y se expresan en mg equivalentes de ácido gálico en

100 g-1 de peso fresco (mg EAG 100 g-1 pf); calculados mediante la siguiente fórmula:

[(Abs-b)/m]/([C]). En dónde: Abs corresponde a la absorbancia después de

adicionada la muestra a analizar o la referencia, m es la pendiente de la curva

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estándar, b = ordenada al origen de la curva estándar y, C es la concentración de la

muestra (g/L).

Determinación de la actividad antioxidante. El potencial antioxidante de la

muestra fue determinado por el método del reactivo ABTS (ácido 2,2’-azino-bis(3-

etilben-zotiazolin)-6-sulfónico). La AAO y el porcentaje de inhibición se

determinaron usando la metodología descrita por Ré et al., (1999) el cual se basa en

la generación del radical catión ABTS•+ (cromóforo azul-verde) mediante la oxidación

del reactivo con persulfato de potasio (K2S2O8); el radical generado se oxida debido

a la presencia de compuestos donadores de hidrógeno, es decir de antioxidantes.

Este método es ampliamente empleado por sus ventajas, entre la que destacan, su

sensibilidad, rapidez, reproducibilidad, estabilidad química, solubilidad en agua;

además de poseer un espectro de absorción en la zona visible (Kuskoski et al., 2005).

Se preparó una solución del radical ABTS•+ (7 mM) con persulfato de potasio (K2S2O4,

2.45 mM); la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente (~25ºC), en oscuridad

durante aproximadamente 16 h antes de ser empleado en los análisis siguientes, la

coloración el azul/verde intenso que permanece estable durante las primeras 48 h,

después de su preparación. Una vez formado el radical libre de ABTS•+, se diluyó con

cantidad suficiente de etanol (a 1 mL del radical se le adicionan de 75 a 100 mL de

etanol) hasta lograr obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.1 a una longitud de onda de

734 nm a una temperatura media de 30ºC. Una vez cumplido este objetivo, se tomó

1 mL del radical formado, se colocó en tubos de ensaye y se le adicionaron 10 µL de

las muestras previamente preparadas (extractos metanólicos). La mezcla fue

agitada vigorosamente en un vórtex y posteriormente se incubo en baño María a

30°C. Finalmente se tomaron lecturas de absorbancia a una longitud de onda de

734 nm de las mezclas a los minutos 1 y 7 después de la incubación. Es importante

mencionar que el blanco de reacción fue etanol puro. El antioxidante de referencia

empleado fue trolox en gradientes de concentración (0-2.0 mM), los resultados se

expresaron como mg equivalentes de trolox por cada 100 g de peso fresco (mg ET

100 g-1 pf). Los ensayos se realizaron por cuatriplicado y los resultados se reportaron

como la media de los tres valores con su respectiva desviación estándar; es

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importante mencionar que la actividad antioxidante al final se calculó en base al

peso y volumen de la muestra preparada (concentración de la muestra). La AAO se

calculó mediante la siguiente fórmula: mg ET 100 g-1 pf = [(Abs-b)/m)*PM)/([C]). En

dónde: Abs corresponde a la absorbancia después de adicionada la muestra a

analizar o la referencia, m es la pendiente de la curva estándar, b es la ordenada al

origen de la curva estándar, PM es el peso molecular del trolox (g/mol) y, C es la

concentración de la muestra (g/L). El porcentaje de inhibición fue calculado con la

fórmula: % Inhibición = [(A0-AF)/A0]*100. En dónde: A0 corresponde a la absorbancia

inicial del radical libre a 734 nm y AF a la absorbancia después de la reacción.

Resultados y discusión

En el presente trabajo se obtuvieron los resultados del perfil fitoquímico de los

extractos metanólicos de las hojas de cedrón (Figura 1), en los que se observa un alto

contenido de fenoles y flavonoides, en comparación al contenido de antocianinas.

Las especies vegetales de uso tradicional ofrecen una gran variedad de beneficios

al consumidor debido a la diversidad de efectos biológicos que ofrecen; las

propiedades medicinales y alimenticias se debe a la presencia de diversas

sustancias químicas (fitoquímicos) con efectos benéficos para la salud (Chirino et

al., 2013). Diversos estudios e investigaciones demuestran la importancia del

consumo y usos de especies vegetales como una fuente de sustancias

nutracéuticas; ya que tienen un papel determinante en la prevención de

enfermedades como diabetes, hipertensión, arterioesclerosis, obesidad, cáncer,

Alzheimer, Parkinson, entre otros (Chao et al., 2012; Mecocci et al., 2014). El contenido

de fenoles y flavonoides puede verse afectado por factores genéticos, bióticos,

abióticos, condiciones edafoclimáticas, tipo de cultivo entre otros (Duarte-Martino

et al., 2012; Ricco et al., 2011). Existen pocos trabajos que exploran la presencia de

antocianinas en las hojas de cedrón; Chirinos et al. (2013), estudió el contenido de

antocianinas en el extracto metanólico de las hojas liofilizadas de cedrón; no

reportando resultados de la presencia de este fitoquímico. El contenido de fenoles

1800

totales de esta especie vegetal se ha reportado empleando diferentes formas de

extracción; Olmedo et al. (2012) realizó una extracción de los aceites esenciales

presentes en cedrón; reporta que los compuestos mayoritarios son geranial, neral y

espatulenol; mismos que presentan un contenido de fenoles de 1400.06 ± 0.06 mg

EAG * g-1 ps; por otro lado Vieitez et al. (2017), realizó extracciones de fluidos

supercríticos en hexano (1270 mg EAG*100 g-1 extracto) y etanol (9760 mg EAG*100

g-1 extracto) de los extractos crudos de cedrón. Finalmente, Wernert et al. (2009),

realizó comparaciones entre dos métodos de cocción de las hojas de cedrón;

observó que el contenido de compuestos fenólico (5000 mg de EAG * 100 g-1 ps) eran

similares entre la infusión y decocción de las hojas de cedrón.

Figura 1. Contenido de antocianinas, fenoles y flavonoides de las hojas secas de cedrón. La concentración de metabolitos se expresó como antocianinas en: mg de ciandina-3-glucósido*100 g-1 ps; flavonoides en: mg EQ*100 g-1 ps; compuestos fenólicos en: mg EAG*100 g-1 ps. Los valores son presentados como promedio, n=4.

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Es importante mencionar que los resultados presentados por otros trabajos para la

especie vegetal cedrón superan a los que se reporta en la presente investigación;

cabe resaltar que todos tienen diferentes procesos de extracción y tratamientos en

el material biológico. Respecto al potencial antioxidante de los extractos

metanólicos de las hojas de cedrón, los resultados de la actividad antioxidante y

porcentaje de inhibición de radicales libres se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 4. Determinación de la actividad antioxidante y porcentaje de inhibición del extracto metanólico de las hojas de cedrón por el método del radical libre ABTS.

Referencia MIN 1 MIN 7 % DE INHIBICIÓN MIN 7 TROLOX 311.878 ± 36.35 367.944 ± 42.84 81.38 ± 7.26 Vitamina C 366.630 ± 40.83 454.022 ± 50.85 80.66 ± 9.48 AAERef (Actividad antioxidante equivalente a Ref) expresados en mg de referencia/100 g de peso seco. Los valores se presentan como promedio ± desviación estándar (D.E.), n=4.

Los nutraceúticos son productos alimenticios que ejercen una acción benéfica a la

salud o bien previenen enfermedades; los antioxidantes son un tipo específico de

nutracéutico (Chaturvedi et al., 2011). Un antioxidante (eliminador de radicales libres)

es un compuesto que inhibe o retrasa la oxidación de sustratos, incluso si el

compuesto está presente en una concentración significativamente más baja que es

la del sustrato oxidado. Entre los antioxidantes más eficaces se encuentran la

vitamina C y E, carotenoides, flavonoides, ácidos fenólicos (Wojdylo et al., 2007;

Serrano y Saura-Calixto 2007). La capacidad antioxidante se determinó por el

método ABTS (ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico) empleando

como referencia TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido

carboxílico 97%) y ácido ascórbico. Chirinos et al. (2013), emplearon las muestras

liofilizadas y realizaron la extracción con HCl, metanol y agua; reportan 448.7 ± 4.2

mol ET g-1 ps lo que corresponde a 112.3 mg ET g-1 ps; valor superior a lo reportado

en el presente estudio; es importante mencionar que estos resultados son de una

especie de cedrón obtenida de la región andina peruana. Se ha reportado la

actividad antioxidante de otras especies vegetales de hoja que son ampliamente

utilizadas en la medicina tradicional. Román et al. (2010) reportó 68.4 ± 0.6% de

1802

inhibición de radicales libres del extracto metanólico de romero (Thymus vulgaris)

por el método ABTS, valor inferior a lo reportado en el presente estudio.

Este trabajo abre el panorama para el estudio más profundo de los componentes

del cedrón permitiendo la incorporación de los compuestos funcionales como

aditivos en la industria de los alimentos propiciando el consumo de compuestos

naturales con actividad biológica positiva para el ser humano. De tal manera que se

generen antioxidantes, fenoles, polifenoles y antocianinas provenientes de

extractos de hojas de cedrón como potenciales productos de consumo cotidiano.

Conclusiones

1. En el presente estudio el extracto metanólico de las hojas de cedrón presentó

diversos niveles de fitoquímicos presentes, mismos que no se encuentran

reportados ampliamente o relacionados con trabajos ya descritos, debido a que

muchos trabajos exploran la presencia de metabolitos secundarios en las

infusiones, con otros métodos de extracción o con otros solventes.

2. Se resalta que el contenido de compuestos fitoquímicos como fenoles y

flavonoides presentes en los extractos analizados se relaciona directamente con

el porcentaje de inhibición de radicales libres; pese a ello esta especie vegetal

puede ser considerada una fuente de compuestos nutracéuticos y bioactivos que

a través del consumo frecuente pueden contribuir a prevenir enfermedades

crónico-degenerativas.

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