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Estudio de los mecanismos que regulan la expresión y
función del ligando de muerte TRAIL en células T
normales y leucémicas.
Tesis Doctoral presentada por Jorge C. Morales Camino para optar al título de Doctor
por la Universidad de Granada.
Directora de la Tesis: María del Carmen Ruiz-Ruiz.
Instituto de Biopatología y Medicina Regenerativa
Universidad de Granada
Granada, mayo 2008
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Jorge Carlos Morales CaminoD.L.: GR.1255-2008ISBN: 978-84-691-4418-3
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AUTORIZACIÓN PARA LA PRESENTACIÓN DE LA TESIS
Dª. MARIA DEL CARMEN RUIZ RUIZ, PROFESORA DEL DEPARTAMENTO
DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR 3 E INMUNOLOGIA DE LA
UNIVERSIDAD DE GRANADA.
CERTIFICA: que la presente tesis titulada “ESTUDIO DE LOS MECANISMOS
QUE REGULAN LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL LIGANDO DE MUERTE
TRAIL EN CÉLULAS T NORMALES Y LEUCÉMICAS”, de la que es autor
JORGE CARLOS MORALES CAMINO, superó el programa de Doctorado
“Inmunología Celular y Molecular” y que ha sido dirigida bajo su dirección en el
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología, Universidad de
Granada.
Revisado el presente trabajo, la directora considera que tiene la calidad científica
necesaria para ser defendido ante el Tribunal que se designe al efecto, por lo que:
AUTORIZA la presentación de la referida Tesis para su defensa y mantenimiento de
acuerdo con lo previsto en la legislación vigente.
Y para que conste y surta sus efectos en el expediente correspondiente, expido la
presente certificación en Granada, 24 de Abril de 2008.
Dra. Maria del Carmen Ruiz Ruiz
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Esta tesis ha sido posible gracias a la ayuda y apoyo de mucha gente, tanto en el
terreno personal como en el laboral…y para no seguir un orden estricto, iré dando las
gracias conforme me vengan a la mente. Principalmente se lo agradezco a mis padres, a
mi familia en general, porque me han aguantado los continuos cambios de humor y me
han dando ánimo los últimos…29 años. Pero si hablamos de aguante, me parece que a
quien más debería agradecer en esta tesis (y me estoy planteando hacerle un altar, la
verdad) es a mi jefa. La Mari, antes conocida como Mari Carmen, la de ratos que hemos
echado discutiendo, gritando, riendo, diseñando experimentos y, últimamente,
soltándome broncas por ser tan coñazo. No me imagino haber hecho este trabajo sin ti,
mezcla de jefa, mentora y hermana mayor. Si alguna vez pensaba en que esto no era lo
mío, solo ver tu esfuerzo me levantaba el ánimo para seguir repitiendo experimentos.
Me has educado casi tanto como persona como investigador, aunque la verdad, creo que
en lo segundo tus enseñanzas han sido más productivas…. Cuando te conocí, tan joven,
sonriente y al mismo tiempo tan seria y formal, ¡quien no querría hacer la tesis contigo!
Bueno, creo que voy a parar, que esto se está pareciendo a una declaración más que a
unos agradecimientos. De todas manera, no puedo quejarme del laboratorio en el que
me ha tocado trabajar, entre Enrique, Ana e Ignacio, siempre he tenido una palabra
amable, una broma en el momento justo o la ayuda que he necesitado cuando no he
sabido como seguir....y entre mis compañeros, bueno, a algunos le cortaba la cabeza,
pero a esos los incluiré en los agradecimientos para que “no se sientan mal”. Si es que
sois más amigos que compañeros de trabajo: Irene, ¿con quien discutiré, iré al cine, de
viaje o le lloraré a las tres de la madrugada cuando nos vayamos cada uno por un lado?;
Ester, compañera de fiestas, siempre con la sonrisa, no olvides que siempre serás mi
“favorita”; Zulema, es imposible ser más buena conmigo; Mª José, eres el mejor equipo
que se puede tener, tanto en el laboratorio como delante de una caña; Diana, has llegado
para quedarte con mi puesto como alborotador del laboratorio,¡eres mi alma gemela!;
Raquel, tú y yo somos la prueba de que dos personas pueden ser amigos ¡sin tener ni
una sola opinión en común!; a Api y Sara les agradezco en bloque, porque son una
unidad, las risas, abrazos y las mil tonterías, ¡si es que he tenido mil madres en este
laboratorio!; Juandi (esta es la única vez que te llamaré como te gusta), gracias por las
fiestas que nos hemos pegado y las tardes juntos en el laboratorio, al principio de los
tiempos; gracias a Domingo por no haber intentado matarme después de todas las cosas
que te digo siempre, ¡lo tuyo si que es paciencia!; Claudia, no te puedes imaginar la
tranquilidad que me transmite el mero hecho de escuchar tu voz; Gustavo, gracias por
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ser tan buen amigo y por haberme ayudado al principio, cuando no sabía ni lo que era
una pipeta; Lucía, me entran ganas de adoptarte todos los días y por ultimo, a Osmany y
Girish, esto…um…gracias…
Cómo me enrollo…bueno, por supuesto le agradezco a Abelardo y a Javier por
haberme ayudado en los seminarios, con los reactivos, planteamiento de experimentos y
hasta adopción en sus laboratorios. Y a toda la gente que ha trabajado con ellos, gracias
por enseñarme técnicas y por vuestra amistad Men, Menchu, Gema, Rocío, Rosario,
Griselda, Jose Antonio, Jose Manuel, Marién, Andreina, Celina y David.
Y por último pero no por ello menos importante, a todos mis amigos que aunque no
hayan estado nunca en el laboratorio, han tenido que escuchar la palabra “TRAIL” hasta
la saciedad, en especial a Eva, que tiene que aguantarme todos los días en casa y que es
la que mejor me da las palmaditas en la espalda cuando más lo necesito.
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ÍNDICE
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I. Introducción
1. Apoptosis ………………………………………………………………………….. 19
1.1 Apoptosis y Equilibrio ……………………………………………………….... 19
1.2 Maquinaria de muerte celular: Caspasas ……………………………………... 20
1.3 Rutas de inducción de apoptosis ……………………………………………..... 23
1.3.1 Ruta intrínseca ………………………………………………………... 23
1.3.2 Ruta extrínseca ……………………………………………………….. 29
1.4 Regulación de la apoptosis …………………………………………………..... 32
2. TRAIL y sus receptores …………………………………………………………. 35
2.1 TRAIL …………………………………………………………..…………….. 35
2.2 Receptores de TRAIL ……………………………..………………………...... 35
2.3 Regulación de la expresión de TRAIL ………………………………………... 37
2.4 Papel fisiológico de TRAIL ………………….………………………………... 39
3. TRAIL en terapia antitumoral ……………………….………………….….….... 41
3.1 Regulación de la expresión de FLIP …………………….……………...……... 41
3.2 Ruta de MAPK ……………………………………….…………………...….. 43
3.3 Ruta de PI3K ………………………………………..….……………………... 44
3.4 Ruta de NF-κB ………………………………………....…………………….... 46
3.5 Regulación del ciclo celular……………….....……………….……………….. 48
3.5.1 Proteínas reguladoras del ciclo celular (CDKs) ……….……………... 48
3.5.2 Organización del citoesqueleto …………..…………..………..…….... 48
4. Epigenética ……………………….……...………………….…...………………... 49
4.1 Metilación del ADN ……………………...…………………………….……... 50
4.2 “Código de Histonas” ………………………….……………….……………... 51
4.2.1 Metilación de histonas ………….………………………………….…... 52
4.2.2 Ubiquitinación de histonas ………………………...…………………... 52
4.2.3 Fosforilación de histonas …………………..…………………………... 53
14
4.2.4 Poli-ADP-ribosilación de histonas ….…………………………………. 53
4.3 Acetilación de histonas …………………..……………………………..……... 54
4.3.1 Histona acetil transferasas (HAT) …………………..…..……………... 54
4.3.2 Histona deacetilasas (HDAC) …………………..…………….………... 55
4.4 Histona deacetilasas y cáncer …………………..……………………………... 60
4.4.1 HDAC y proliferación celular …………………..…..…..……………... 60
4.4.2 HDAC y diferenciación hematopoyética …………..………..…..……... 60
4.4.3 HDAC, angiogénesis y metástasis. ………………………….…..……... 61
4.4.4 HDAC y factores de transcripción …………………..…………..……... 61
4.5 Inhibidores de histona deacetilasas (HDACi) ………….…………..…..……... 63
4.6 HDACi y TRAIL …………………………………………………..…..……... 65
II. Materiales y Métodos ………………………….……...………………….…...…... 69
III. Objetivos ………..……………….……...………………….…...………………... 73
IV. Resultados
1. Regulación de la expresión de TRAIL en células T activadas …………..…….. 87
1.1 Activación del promotor de TRAIL en células T en respuesta al tratamiento
simultáneo con ionomicina y PMA ......………..…..……………............................ 87
1.2 Regulación de la expresión y función de TRAIL por ciclosporina A en
células T activadas ………………………………….….…………..…..……..…… 89
2. Mecanismos que regulan la resistencia a TRAIL en linfocitos T
primarios humanos …...……………………….………….…....……………....... 91
2.1 Resistencia de linfocitos T primarios en reposo y activados a la
inducción de apoptosis por TRAIL ……………………….......…….….…..……… 91
2.2 Expresión de proteínas involucradas en la ruta de señalización de
15
TRAIL en linfocitos T en reposo y activados ……………………....…………..….. 93
2.3 Efecto de diferentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en la
resistencia de linfocitos T primarios humanos ……….……………....…………… 96
2.4 La inhibición de NF-κB sensibiliza a linfocitos T activados a la
apoptosis mediada por TRAIL ………….....…………….…………..…..………… 98
2.5 BAY 11-7085 regula la expresión de receptores de TRAIL y de
genes anti-apoptóticos en linfocitos T activados ….………………………...…… 104
3. Regulación de la sensibilidad a TRAIL en células T leucémicas …………..… 107
3.1 Efecto de diferentes agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL
en células T leucémicas ………….……………………...….….…………..…..… 107
3.2 Regulación por VPA y LY 294002 de factores implicados en la
ruta de señalización de TRAIL en líneas leucémicas T ………….……...….…. 111
3.3 Potenciación por HDACi de la apoptosis mediada por TRAIL
en líneas leucémicas T sensibles ………….……..………….….…………..…..… 113
3.4 HDACi potencian la activación de caspasas y las señales
mitocondriales mediadas por TRAIL en líneas leucémicas T …………...…….…. 118
3.5 Regulación por HDACi de proteínas involucradas en la ruta de
señalización de TRAIL en células T leucémicas ………….…………………….... 121
V. Discusión …...………..………………………………….…………......…....…… 133
VI. Conclusiones …...…...……………………………………….….....……….….... 149
VII. Bibliografía ………………………….................................................………….153
VIII. Publicaciones…………………………….................................................……. 191
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I. INTRODUCCIÓN
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1. APOPTOSIS
1.1 Apoptosis y Equilibrio
El concepto del Yin y el Yang surgido de la filosofía oriental nos recuerda la
naturaleza dual del Universo. Dos fuerzas opuestas pero complementarias que rigen las
reglas de la vida y que nos muestran que nada existe en estado puro. El concepto de
muerte unida a la vida por lazos que se cruzan tejiendo una compleja trama se
encuadrara dentro de este pensamiento. Pero no es necesario ponernos
transcendentales…al fin y al cabo, los organismos pluricelulares han seguido esta
norma desde su aparición sin ni siquiera tener consciencia de ello. La vida para todos
los organismos metazoicos requiere la eliminación de células innecesarias, infectadas o
dañadas. La renovación de tejidos, la angiogénesis, así como la homeostasis del sistema
inmunológico, requieren de manera constante la muerte de algunas células para
mantener la vida del organismo completo. Pero no somos organismos perfectos. Todos
los procesos vitales llevan asociados errores y la regulación del plan de muerte celular
no es una excepción. Enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes son el resultado
de un plan imperfecto en la búsqueda del equilibrio entre la vida y la muerte celular. Y
la patología más común por ausencia de muerte celular es el cáncer. Las células
neoplásicas acumulan alteraciones genéticas que les permiten sobrevivir, a pesar de la
ausencia de factores de supervivencia y las condiciones de hipoxia y estrés oxidativo, y
que con el tiempo determinan la expansión del tumor hasta formar una masa de células
que han perdido su función, que sufren una proliferación y una diferenciación celular
alteradas y que presentan una movilidad y capacidad invasiva incrementadas (Frisch
and Screaton, 2001; Ionov et al., 2000; Reed, 1999; Tschopp et al., 1999).
La eliminación de las células no funcionales, o disfuncionales en el caso de las
diferentes patologías, es llevado a cabo por un mecanismo de muerte celular
programada denominado apoptosis (Kerr et al., 1972) caracterizado por un conjunto de
cambios bioquímicos y morfológicos (Wyllie et al., 1980) que incluye la condensación
del citoplasma así como la compactación de la cromatina dando lugar a densos
agregados que se deslocalizan para situarse junto a la membrana nuclear y que
posteriormente serán degradados por endonucleasas en fragmentos oligonucleosomales
de 180 pares de bases o múltiplo de éstos. De forma paralela tiene lugar la dilatación del
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retículo endoplasmático dando lugar a formación de vesículas que confieren a la célula
el fenotipo típico en forma de “burbujas” (zeosis). Por último, la célula se fragmenta en
los denominados cuerpos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos y otras
células circundantes gracias a la exposición en superficie de marcadores como la
fosfatidilserina, normalmente en la cara interna de la membrana plasmática de la célula
íntegra (Hengartner, 2000), evitando así la propagación del material intracelular y su
exposición al sistema inmune que conllevaría al desarrollo de una respuesta
inflamatoria.
Figura 1. Cambios morfológicos de la célula durante el proceso de muerte por apoptosis
1.2 Maquinaria de muerte celular: Caspasas
Las CASPASAS, Cysteine ASPartyl-specific proteASES, son las proteasas
encargadas de llevar a cabo los cambios morfológicos citados para las células
apoptóticas (Cryns and Yuan, 1998). Son una familia de cisteín-proteasas que tienen
especificidad de corte en residuos de aspártico (Asp). Estas enzimas se encuentran
expresadas de forma constitutiva en forma de proenzimas o zimógenos inactivos que
requieren de proteolisis para activarse (Thornberry and Lazebnik, 1998). Todas las
caspasas presentan características similares en cuanto a su estructura y especificidad por
el sustrato. Los aminoácidos de la enzima que se unen al sustrato, denominados S4-S3-
C U E R P O SA P O P T O T IC O S
C E L U L A E N A P O P T O S IS
R E C O N O C IM IE N T OY F A G O C IT O S IS
C E L U L A N O R M A L
IN D U C C IO ND E A P O P T O S IS
C o n d e n sa c ió n d e la c ro m a tin aD ism in u c ió n d e l v o lu m e n c e lu la r
F ra g m e n ta c ió n n u c le a r F o r m a c ió n d e e s tru c tu ra s p ro tu b e ra n te sD iv is ió n d e la c é lu la e n c u e rp o s a p o p tó tic o s
C U E R P O SA P O P T O T IC O SC U E R P O S
A P O P T O T IC O S
C E L U L A E N A P O P T O S IS
R E C O N O C IM IE N T OY F A G O C IT O S IS
C E L U L A N O R M A L
IN D U C C IO ND E A P O P T O S IS
C o n d e n sa c ió n d e la c ro m a tin aD ism in u c ió n d e l v o lu m e n c e lu la r
F ra g m e n ta c ió n n u c le a r F o r m a c ió n d e e s tru c tu ra s p ro tu b e ra n te sD iv is ió n d e la c é lu la e n c u e rp o s a p o p tó tic o s
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S2-S1, reconocen una secuencia tetrapeptídica en las proteínas diana denominada P4-P3-
P2-P1 a la que cortan en el extremo carboxilo de P1. Esta secuencia se caracteriza por la
absoluta necesidad del residuo de aspártico en la posición P1, mientras que el residuo en
P2 es variable y en posición P3 se suele encontrar un residuo de glutamina. El residuo en
P4 es siempre un aminoácido hidrofóbico, alifático o un residuo de aspártico. Los
aminoácidos de los sitios S3 y S1 son prácticamente idénticos en las distintas caspasas,
mientras que los que participan en la unión al sustrato, S4 y S2, varían significativamente
originando distintas especificidades por el sustrato en las posiciones P4 y P2.
Las caspasas están constituidas por un dominio N-terminal de longitud variable,
seguido de una subunidad larga de unos 20 kDa y una corta de 10 kDa en la región C-
terminal. Su actividad proteolítica reside en un residuo de cisteína que forma parte de
una secuencia pentapeptídica conservada QACXG y se encuentra en la subunidad
grande, mientras que los residuos que forman el sitio de unión para el sustrato se
localizan tanto en la subunidad grande como en la pequeña, aunque el residuo
dominante para la especificidad de sustrato se localiza en la subunidad pequeña. Su
activación requiere de la escisión de estas tres subunidades para formar un tetrámero,
integrado por dos subunidades largas y dos cortas, que presentará dos sitios activos de
catálisis (Wolf and Green, 1999). Esta proteolisis tiene lugar en dos fases: en la primera
se separa la subunidad grande junto con el prodominio, de la subunidad pequeña, y en la
segunda fase este prodominio es escindido. La presencia de aspártico en los sitios de
separación de las subunidades se relaciona con la capacidad de las caspasas para auto-
activarse o ser activadas por otras caspasas dentro de la cascada apoptótica.
Hasta la fecha han sido descritas 12 caspasas en humanos, denominadas caspasas -1
a -10, además de las caspasas-12 y -14 (Pistritto et al., 2002). La enzima denominada en
un primer momento caspasa-13 fue posteriormente identificada como un homólogo
bovino de la caspasa-4 humana (Koenig et al., 2001) y las caspasas -11 es una enzima
murina homóloga a la caspasas -4 humana (Lamkanfi et al., 2002). Recientemente se ha
descrito la denominada caspasa-15 en otras especies.
Según su función dentro de la cascada de señalización apoptótica, las caspasas
pueden clasificarse en iniciadoras o efectoras.
Las caspasas iniciadoras son las primeras en activarse tras un estímulo apoptótico
gracias a la presencia en su prodominio de motivos de interacción proteína-proteína que
les permiten asociarse a proteínas adaptadoras con dominios homólogos. Existen dos
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tipos de motivos de interacción con proteínas: dominios efectores de muerte (DED),
presentes en las caspasas -8 y –10, y dominios de activación y reclutamiento de
caspasas (CARD), en las caspasas -2 y –9. El reclutamiento de las caspasas iniciadoras
por proteínas adaptadoras determinó la aparición de la teoría de activación por un
mecanismo de autocatálisis por proximidad (Salvesen, 1999). Estudios más recientes
han demostrado, sin embargo, que la activación de caspasas iniciadoras no requiere
cortes proteolíticos sino un cambio conformacional que tiene lugar tras la
homodimerización de las formas proenzimáticas monoméricas (Boatright et al., 2003).
El conjunto de caspasas efectoras está integrado por las caspasas -3, -6 y -7,
carentes de dominios DED y CARD, que se activan por procesamiento mediado por
caspasas iniciadoras. Las caspasas efectoras son las encargadas de degradar los distintos
sustratos celulares que provocan los cambios morfológicos y bioquímicos
característicos de la muerte por apoptosis.
Además de las caspasas implicadas en apoptosis existen otros miembros de esta
familia, caspasas -1, -4, -5, -11 y –13, que participan en la respuesta inflamatoria.
Figura 2. Esquema de capasas. Con la flecha gruesa se muestra el
primer corte proteolítico entre lasubunidad grande y la pequeña.Las flechas finas indican otrossitios adicionales de corte. Lossegmentos sombreados indican lasregiones que corresponden a losbucles que constituyen la cavidadcatalítica. (Adaptado de Shy, Y.Mol Cell 2002).
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1.3 Rutas de inducción de apoptosis
Existen dos rutas interconectadas de activación del proceso apoptótico:
- Ruta intrínseca o mitocondrial, disparada por distintos tipos de estrés como es
el caso de la radiación y del tratamiento con drogas genotóxicas que causan
daños en el ADN.
- Ruta extrínseca, mediada por receptores de muerte de la superfamilia del factor
de necrosis tumoral (TNF) y fundamental en procesos fisiológicos como la
muerte celular inducida por activación (AICD) o la citotoxicidad mediada por
linfocitos T CD8+ o células NK.
1.3.1 Ruta intrínseca
La mitocondria juega un papel fundamental en esta ruta apoptótica al actuar como
reservorio de proteínas de localización intermembranal cuya salida al citoplasma por
permeabilización de la membrana mitocondrial externa (PMME) constituye el inicio de
un conjunto de reacciones en cadena que va a tener como consecuencia la entrada en
apoptosis de la célula en respuesta a estímulos tan diversos como la deprivación de
factores de crecimiento, la sobreexpresión de c-Myc, el tratamiento con drogas
quimioterapéuticas, actinomicina D, radiación ultravioleta (UV), estaurosporina, o
glucocorticoides (Duan et al., 2003; Han et al., 2001; Munk et al., 2007; Sutherland et
al., 2006; Wang et al., 2007; Zhou et al., 2005).
Esta PMME suele ir acompañada de una pérdida del potencial de membrana
mitocondrial. Dos mecanismos han sido propuestos para explicar la PMME:
- La formación del poro de permeabilidad transitoria (PPT), que permitiría el
paso de agua y moléculas de bajo peso molecular provocando la pérdida del
equilibrio iónico así como el incremento en el volumen de la matriz mitocondrial
por exceso de hidratación que desencadenaría la ruptura de la membrana
mitocondrial externa. Este poro está formado, entre otros componentes, por el
transportador de nucleótidos de adenina (ANT) a nivel de la membrana
mitocondrial interna y el canal de aniones voltaje dependiente (VDAC) de la
membrana externa. En condiciones fisiológicas es necesario para el
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mantenimiento de la función energética mitocondrial (Mattson and Kroemer,
2003).
- La formación de canales proteicos constituidos por la dimerización de distintos
componentes pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2 que actuarían directamente
sobre la membrana mitocondrial externa, o bien de largos poros derivados de la
asociación de dichas proteínas pro-apoptóticas de la familia de Bcl-2 con
distintos componentes lipídicos (Green and Kroemer, 2004).
Existe una tercera posibilidad surgida de la asociación de los dos modelos
anteriores, en la que miembros pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2, como Bax,
interaccionarían con proteínas del PPT como VDAC para permitir la salida de
citocromo C a través de la membrana mitocondrial externa (Shimizu et al., 1999), o
ANT para formar canales iónicos en la membrana mitocondrial interna (Marzo et al.,
1998).
Figura 3. Mecanismos propuestos para la PMME. a) Apertura del PPT; b) Canal de Bax; c) Canal Bax/ANT; d) Poro lipídico o complejo proteolipídico. La figura a) pertenece a mecanismos de la primera clase, que implican al PPT y a la membrana mitocondrial interna. Las figuras b), c) y d) pertenecen a la segunda clase de mecanismos que implican a las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2.
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Como consecuencia de la PMME en la mitocondria tienen lugar los siguientes
eventos:
Destrucción de la cadena de transporte electrónico.
Este proceso determina la pérdida de la capacidad celular para llevar a cabo la
fosforilación oxidativa y, por tanto, provoca una caída en la producción de ATP, de
manera que la célula no podrá llevar a cabo sus funciones metabólicas (Bradbury et
al., 2000).
Alteración del potencial de oxidación-reducción (redox).
La mitocondria es la principal productora de anión superóxido en la célula.
Existen distintos mecanismos que amortiguan la generación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) evitando su acción citotóxica, pero la alteración del potencial redox
provoca la inactivación dichos mecanismos o disminuye su capacidad,
incrementándose la peroxidación lipídica que originará la ruptura de las membranas
celulares (Le Bras et al., 2005).
Liberación de proteínas del espacio intermembrana de la mitocondria al
citosol.
Se trata de proteínas con capacidad para activar caspasas y nucleasas o neutralizar
inhibidores citosólicos de la cascada apoptótica. Las más relevantes son:
- AIF ( Apoptosis Inducing Factor). Flavoproteína de localización mitocondrial
con capacidad de traslocación al núcleo en respuesta a estímulos apoptogénicos
produciendo la fragmentación del ADN y la compactación de la cromatina
(Wang et al., 2002b).
- Endonucleasa G. Actúa de forma conjunta a AIF en la fragmentación del ADN
nuclear. En ambos casos esta fragmentación es independiente de la actividad
caspasa (Li et al., 2001).
- Citocromo C. Por asociación con la proteína adaptadora Apaf-1, y en presencia
de ATP, el citocromo c liberado de la mitocondria conlleva a la formación del
complejo denominado apoptosoma donde se recluta y se activa la caspasa-9
iniciadora. (Zou et al., 1999).
- Smac/Diablo. Proteína con capacidad de unión e inactivación de proteínas
antiapoptóticas de la familia IAP (proteínas inhibidoras de apoptosis) que a su
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vez mantienen inactivas a la caspasa-9 y a las caspasas efectoras –3 y -7 (Du et
al., 2000).
- Omi/HtrA2. Serín-proteasa con capacidad de unión a los IAPs de forma análoga
a la proteína Smac. En ambas proteínas, Smac y Omi, se ha descrito la capacidad
de inducción de apoptosis independiente de su interacción con las proteínas IAPs
(Liston et al., 2003).
Como ya se ha mencionado anteriormente, proteínas de la familia de Bcl-2 juegan
un papel fundamental en la activación y regulación de la ruta mitocondrial. La proteína
antiapoptótica Bcl-2, que da nombre a toda la familia, recibió dicha denominación tras
haber sido identificada inicialmente en linfomas B foliculares que presentaban la
translocación t(14;18). Al translocarse el gen que codifica Bcl-2 desde el cromosoma 18
al 14, se ubica tras el promotor de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, de forma
que Bcl-2 se transcribe de forma constitutiva, bloqueando la muerte por apoptosis
(Cleary and Sklar, 1987). Existe una veintena de proteínas homólogas que constituyen
Célula normal
Mitocondria
Célula apoptótica
apoptosoma
Núcleo Núcleo
Célula normal
Mitocondria
Célula apoptótica
apoptosoma
Núcleo Núcleo
Figura 4. Activacióm mitocondrial tras el estímulo apoptótico. Las proteínas “sólo BH3” se unena Bcl-2 y dejan el camino libre para que las proteínas tipo Bax formen canales en la membranamitocondrial que permitan la liberación de citocromo c, Smac/DIABLO, AIF y Omi, entre otrosfactores. Con la salida del citocromo c se forma el apoptosoma, Smac/Diablo y Omi se unen a losIAPs, pudiéndose así activarse la caspasa-9 y caspasas efectoras. (Adaptada de Adams, J.Genes&Dev 2003).
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la familia de proteínas Bcl-2, caracterizadas por presentar al menos uno de los cuatro
dominios de homología denominados BH (BH1-BH4) (Ottilie et al., 1997).
Distinguimos tres grupos en los que pueden clasificarse las proteínas de esta familia:
Grupo I: Miembros anti-apoptóticos
Grupo II: Miembros pro-apoptóticos tipo Bax
Grupo III: Miembros pro-apoptóticos “BH3-only”
Miembros pro-apoptóticos tipo Bax
Este grupo se encuentra constituido por las proteínas Bax, Bak y Bok/Mtd, que
presentan los dominios BH1-BH3. Bax y Bak presentan una amplia distribución
mientras que Bok se localiza únicamente a nivel de los tejidos reproductores (Hsu et al.,
1997; Krajewski et al., 1996), lo que determina que tan sólo los dos primeros puedan
considerarse esenciales para el correcto desarrollo de la apoptosis celular, como se ha
observado en distintas modelos murinos deficientes para Bax y Bak (Lindsten et al.,
2000).
En respuesta al estímulo apoptótico, estas proteínas forman canales de
permeabilización en la membrana mitocondrial o interaccionan con las proteínas
formadoras de canales provocando la PMME. Mientras que Bak y Bok se encuentran
constitutivamente unidos a la membrana mitocondrial en células sanas (Griffiths et al.,
1999), Bax requiere del estímulo apoptótico para modificar su extremo C-terminal
hidrofóbico y traslocarse a la mitocondria, en cuya membrana externa se inserta de
manera estable (Borner, 2003; Nechushtan et al., 1999).
Por otra parte, la acción de estas proteínas pro-apoptóticas parece extenderse hasta el
retículo endoplasmático, donde median la apoptosis en respuesta a estímulos que
provocan la salida de calcio (Scorrano et al., 2003).
Miembros pro-apoptóticos “BH3-only”
A este subgrupo pertenecen proteínas como Bad, Bim, Blk, Hrk y Bid (Huang and
Strasser, 2000), emparentadas entre sí y con el resto de miembros de la familia Bcl-2 tan
sólo por presentar el dominio BH3. Parecen actuar como sensores y mediadores de la
28
apoptosis que permiten la transmisión de señales de muerte bien por unión y
neutralización de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 (Cory and Adams,
2002) o por activación directa de Bax y Bak (Wei et al., 2000), pero que son incapaces
de inducir apoptosis en ausencia de estos últimos (Zong et al., 2001).
Bid se presenta como una proteína fundamental en la inducción de apoptosis al
conectar las dos rutas de inducción de apoptosis, intrínseca y extrínseca, como más
adelante explicaremos (Luo et al., 1998).
Miembros antiapoptóticos
Comparten con el resto de proteínas de la familia la presencia de dominios BH, de
los que se requieren más de tres para llevar a cabo su función anti-apoptótica.
Pertenecen a este grupo las proteínas Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bfl1-1, Bcl-w y Mcl-1. Los
dominios BH1-BH4 intervienen en las interacciones con otras proteínas de la familia y
con moléculas localizadas en la cara citoplasmática de las membranas intracelulares
como la membrana mitocondrial externa, retículo endoplasmático y envuelta nuclear.
Los dominios BH1-BH3 forman un surco hidrofóbico estabilizado por BH4 (Petros et
al., 2001) que le permite interaccionar con el dominio BH3 de los miembros pro-
apoptóticos “BH3-only” y los “tipo Bax” de esta misma familia (Sattler et al., 1997).
Bcl-2 es una proteína de 26 kDa que posee los cuatro dominios típicos BH1-BH4. Se
localiza fundamentalmente en la cara citoplasmática de la membrana externa
mitocondrial constituyendo una estructura en forma de poro que permite regular el flujo
de sustancias entre este orgánulo y el citoplasma en respuesta a posibles daños.
Bcl-XL es una de las proteínas más estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en su
estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es de
30 kDa. Su sobreexpresión puede mediar una resistencia significativa a la muerte
celular por apoptosis dependiente de deprivación de factor de crecimiento (Zinkel et al.,
2006).
Ambas proteínas actúan como inhibidores de la apoptosis formando heterodímeros
con Bax y Bak e inhibiendo su función, evitando así la salida de citocromo c y otros
factores apoptogénicos de la mitocondria (Yang et al., 1997). Por otra parte, su
capacidad anti-apoptótica incluye la unión al extremo C-terminal de la proteína Apaf-1,
evitando con ello la asociación y activación de la caspasa-9 (Hu et al., 1998).
29
Mcl-1 es una proteína de 37 kDa ampliamente expresada en distintos tipos de tejidos
y que guarda una gran homología con Bcl-2, aunque presenta una capacidad anti-
apoptótica reducida respecto a dicha proteína cuando se une a distintos miembros pro-
apoptóticos de la familia, como Bax, Bak, Bim, Puma y Noxa (Chen et al., 2005; Wang
et al., 1998b). Aun así, Mcl-1 sufre una rápida degradación en respuesta a distintos
estímulos apoptóticos, lo que revela su papel en la regulación de la supervivencia
celular (Cuconati et al., 2003; Chao et al., 1998; Nijhawan et al., 2003).
1.3.2 Ruta extrínseca
En situaciones tanto fisiológicas como patológicas, la célula puede entrar en
apoptosis en respuesta al estímulo desencadenado por la unión de los denominados
ligandos de muerte a sus receptores específicos. Se trata de proteínas transmembrana
tipo II pertenecientes a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), como
FasL/CD95L o TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand), que presentan en
su región extracelular los denominados dominios de homología a TNF (THD) a través
de los cuales se asocian a sus receptores (Bodmer et al., 2002). Estos ligandos son
expresados por distintas células del sistema inmunológico como linfocitos T, células
NK, monocitos y células dendríticas, participando y permitiendo la eliminación de
células que han cumplido su función, células infectadas, autorreactivas y metaplásicas
(Greil et al., 1998; Perlman et al., 2001; Singh et al., 1999; Yang et al., 2001; Zhang et
al., 2004).
Los receptores pro-apoptóticos a los que se unen estos ligandos son proteínas
transmembrana tipo I de la superfamilia de TNF y reciben el nombre de receptores de
muerte. Se caracterizan por presentar en su región intracelular los denominados
dominios de muerte (DD) a través de los cuales va a transmitir el impulso apoptótico.
Existen además receptores anti-apoptóticos o “decoy” en los que la unión del ligando
no transmite la señal de apoptosis y entre los que podemos incluir receptores solubles
(Gruss and Dower, 1995). Ambos tipos de receptores presentan en su región
extracelular unos dominios ricos en cisteínas (CRDs) que se asocian con las regiones
THD de los ligandos de muerte por medio de puentes disulfuro formando multímeros
funcionales (Banner et al., 1993).
30
La unión del ligando de muerte a su receptor pro-apoptótico va a tener como
consecuencia la trimerización del receptor y el reclutamiento de proteínas
citoplasmáticas adaptadoras con dominios DD homólogos al del receptor, para formar
así el denominado complejo inductor de señales de muerte (DISC). Además de
dominios DD, algunas de estas proteínas adaptadoras, como FADD, presentan
dominios efectores de muerte (DED), que van a permitir el reclutamiento y activación
de las caspasas iniciadoras -8 ó -10 a nivel del DISC (Kischkel et al., 2000).
Ligandos ReceptoresLigandos Receptores
Figura 5. Ligandos y receptores de la familia de TNF. En gris se representan los dominios ricos encisteínas (CRDs); con un rectángulo negro se representan los dominios transmembrana; y finalmente,con un rectángulo sombreado se representan los dominios de muerte.
31
Figura 6. Señalización de apoptosis inducida por el sistema FasL/Fas en células tipo I y tipo II
En función de la necesidad de la ruta intrínseca para la inducción efectiva de la
apoptosis tras la activación de los receptores de muerte, las células pueden clasificarse
en tipo I si no requieren de la vía mitocondrial o en tipo II si requieren la participación
de este orgánulo (Scaffidi et al., 1998). En las células tipo I, las caspasas iniciadoras
activadas a nivel del DISC a su vez activan directamente a las caspasas efectoras -3 y -7
que provocarán finalmente la muerte celular por apoptosis.
En las células tipo II, la caspasa-8, además de cortar y activar a las caspasas
efectoras, corta a la proteína “BH3-only” Bid. Tras el corte por la caspasa, los
fragmentos C-terminal de 15 kDa y N-terminal de 7 kDa se asocian provocando un
cambio en la conformación del denominado cBid ( Bid cortado), que se traslocará a la
membrana mitocondrial provocando su permeabilización y así la liberación de factores
apoptogénicos al citoplasma (Li et al., 1998; Lutter et al., 2001; van Gurp et al., 2003).
Esta PMME está mediada, como ya se ha explicado, por la interacción de cBid con Bcl-
2 y Bcl-XL inactivando la función de estas proteínas anti-apoptóticas. Además cBid se
une y activa directamente a Bax y a Bak (Eskes et al., 2000; Wei et al., 2000). Se ha
postulado también las hipótesis de la homooligomerización de cBid para formar canales
en la membrana externa mitocondrial, aunque este hecho solo se ha demostrado in
Casp-3*, -7*
APOPTOSISAPOPTOSIS
Casp-8*, -10*
Fas/CD95
FasL/CD95L
FADD
procaspasa-8, -10
DISC
Mitocondria
Casp-9*
Citocromo cApaf-1
dATP/ATP
procaspasa-9
Apoptosoma
Fragmentación de Bid
Bax, Bak
Bcl-2
tBid
Casp-3*, -7*
APOPTOSISAPOPTOSIS
Casp-8*, -10*
Fas/CD95
FasL/CD95L
FADD
procaspasa-8, -10
DISC
Mitocondria
Casp-9*
Citocromo cApaf-1
dATP/ATP
procaspasa-9
Apoptosoma
Fragmentación de Bid
Bax, Bak
Bcl-2
tBid
32
vitro(Grinberg et al., 2002), así como de su capacidad para desestabilizar la bicapa
lipidica de la membrana, lo que determinaría la salida al citoplasma de elementos del
espacio intermembrana (Oh et al., 2005). Sea cual fuere el mecanismo de acción de
cBid, una vez liberados los factores pro-apoptóticos de la mitocondria se induce la
formación del apoptosoma y la activación de la caspasa-9 iniciadora, que en este caso
será la principal responsable de la activación de las caspasas efectoras (Zou et al.,
1999). El requerimiento del corte de Bid y la participación de la mitocondria en las
células tipo II parece deberse a una activación insuficiente de caspasa-8 en el DISC
como para generar la suficiente activación de caspasas efectoras que desencadenen la
muerte de la célula.
Por otra parte, y de forma independiente a la colaboración entre ambas rutas, en los
dos tipos de células la señal apoptótica se ve incrementada y prolongada gracias a la
capacidad de la caspasa-3 efectora de activar a la caspasa-8 por un mecanismo de
retroalimentación tanto a través de la caspasa -6 como directamente, siendo este último
el principal mecanismo responsable de la potenciación de la apoptosis en algunas
modelos de células tumorales resistentes la inducción de esta forma de muerte celular
(Yang et al., 2006).
1.4 Regulación de la apoptosis.
Debido al elevado numero de señales que pueden inducir el inicio de la muerte
celular por apoptosis es necesaria la existencia de mecanismos que regulen de manera
estricta la entrada en este proceso, de manera que no ocurra de forma accidental, y solo
tenga lugar en aquellas situaciones en las que sea necesario para conservar la
homeostasis del organismo. Alteraciones en los mecanismos de control de la apoptosis
modifican la sensibilidad o resistencia de las células a la inducción de este tipo de
muerte celular y pueden desencadenar patologías como el cáncer. Entre estos
mecanismos podemos señalar el balance de receptores pro- y anti-apoptóticos (Zhang et
al., 2000) y los niveles intracelulares de proteínas antiapoptóticas como FLIP o los
miembros de las familias de IAP y Bcl-2.
IAPs. Se han descrito hasta 8 proteínas inhibidoras de la apoptosis en humanos,
con capacidad para evitar la actividad de las caspasas -3, -7 y -9 (Deveraux et al., 1997;
33
Shiozaki and Shi, 2004): XIAP, cIAP1, cIAP2, IAP asociado a melanoma (ML-IAP),
proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP), survivina y bruce (Wright and
Duckett, 2005).
Figura 7. Mecanismo de acción de XIAP
Estas proteínas inhibidoras de la apoptosis con capacidad de unión e inactivación de
caspasas tanto iniciadoras como efectoras llevan a cabo su acción a través de los
denominados dominios BIR (Baculoviral IAP Repeat), 80 aminoácidos plegados
alrededor de una atómo de Zinc y que reciben su nombre de la identificación por
primera vez de estas proteínas en células infectadas por baculovirus incapaces de sufrir
apoptosis mediada por caspasas. Pero es el dominio contiguo RING el encargado de la
destrucción de la caspasa, pues actúa como una ligasa de ubiquitina que promueve la
degradación por el proteasoma del propio IAP asociado a la enzima (Yang and Li,
2000). Junto al dominio RING, tanto en c-IAP1 como en c-IAP2 se localiza un dominio
34
CARD que sugiere que estas IAPs podrían regular directa o indirectamente el
procesamiento de las caspasas a través de interacciones por dicho dominio.
FLIP.- Flice Inhibitory Protein o FLIP de origen viral fue descubierto por
primera vez en linfocitos T citotóxicos donde el virus trataba de mantener con vida a la
célula infectada para lograr con éxito su etapa de replicación, evitando la apoptosis
mediada por receptores de muerte (Bertin et al., 1997; Thome et al., 1997). En humanos,
encontramos dos isoformas de la proteína obtenidas por procesamiento alternativo del
ARNm y denominadas por su longitud FLIP largo (FLIPL), de 55 kDa, y FLIP corto
(FLIPS), de 26 kDa (Hu et al., 1997). Ambas isoformas se caracterizan por presentar en
su estructura dos dominios DED, necesarios para cumplir su función inhibidora de
apoptosis, pues a través de éstos pueden asociarse por interacciones homeotípicas con la
proteína adaptadora FADD y ser reclutadas en el DISC en lugar de las caspasas
iniciadoras -8 y -10 (Goltsev et al., 1997). Si bien ésta constituye la estructura básica de
la isoforma FLIPS, en el caso de FLIPL encontramos también un dominio pseudocaspasa
inactivo que va a ser degradado a nivel del DISC como si de la auténtica caspasa -8/-10
se tratara, dando lugar a una fracción de 43 kDa que quedaría anclada al DISC
impidiendo el reclutamiento de la auténtica caspasa al tiempo que se libera un
fragmento de 12 kDa homólogo al de la caspasa iniciadora, evitando el inicio de la
cascada de señales apoptóticas (Krueger et al., 2001; Scaffidi et al., 1999).
Figura 8. Estructura de las isoformas de c-FLIP y de v-FLIP en comparación con procaspasa -8
35
2. TRAIL Y SUS RECEPTORES
2.1 TRAIL
TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) es una proteína transmembrana
tipo II perteneciente a la superfamilia de TNF (Wiley et al., 1995). Con 32 kDa de peso
molecular, está formada por una fracción intracelular seguida de un dominio
extracelular que presenta un 28% de homología con el de CD95L (Wiley et al., 1995).
Este dominio extracelular puede ser liberado al medio, pudiendo así aparecer este
ligando de muerte en forma soluble (Mariani and Krammer, 1998a). De igual forma, se
ha descrito que linfocitos T activados pueden liberar al medio TRAIL como una
proteína completa mediante vesículas (Monleon et al., 2001). Al igual que el resto de
ligandos de muerte, TRAIL se une a sus receptores específicos en forma de
homotrímero, cuya estabilidad y actividad biológica requieren de la presencia de un
átomo de Zinc unido al residuo Cys230 localizado a nivel de los CRDs (Bodmer et al.,
2000), regiones extracelulares ricos en cisternas que se asocian los ligandos de muerte
por medio de puentes disulfuro formando multímeros funcionales (Banner et al., 1993).
2.2 Receptores de TRAIL
TRAIL pude unirse específicamente a cuatro tipo de receptores transmembrana
denominados TRAIL-R1 a -R4, cuyos genes codificantes se localizan en la región p22-
21 del cromosoma 8, lo que sugiere que evolucionaron de un precursor común (Degli-
Esposti, 1999), teoría avalada por la homología superior al 50% de las secuencias
nucleotídicas de los mismos. (Degli-Esposti et al., 1997a). TRAIL puede unirse también
a un receptor soluble denominado osteoprotegerina (OPG) con menor afinidad que al
resto de receptores(Truneh et al., 2000), y que parece estar implicado en la inhibición de
la osteoclastogénesis, así como en la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL en
ciertos tumores, como en cáncer de próstata, por secuestro del ligando de muerte antes
de su acción en la membrana de la célula tumoral (Holen et al., 2002).
36
Los receptores de TRAIL en membrana pueden ser clasificados en pro- y anti-
apoptóticos, en función de su capacidad para inducir la activación de la cascada
apoptótica.
Los receptores TRAIL-R1/DR4 (Pan et al., 1997b) y TRAIL-R2/DR5 (Walczak et
al., 1997) son denominados pro-apoptóticos pues presentan en su región intracelular los
dominio de muerte (DD) necesarios para transmitir la señal de apoptosis tras la unión
del ligando (Cha et al., 2000).
Figura 9. Esquema de la estructura de los receptores de TRAIL.
Los receptores TRAIL-R3/DcR1 (Degli-Esposti et al., 1997b) y TRAIL-R4/DcR2
(Degli-Esposti et al., 1997a) son conocidos como receptores anti-apoptóticos o
“señuelo” debido a su incapacidad para inducir apoptosis tras la unión del ligando.
TRAIL-R3 carece de dominio intracitoplasmático y transmembrana, anclándose
a la membrana a través de un lípido glicosil-fosfatidil-inositol (Degli-Esposti et
al., 1997b), y por lo tanto carece de DD.
TRAIL-R4, por el contrario, sí que presenta regiones citoplasmática y
transmembrana, pero posee un DD truncado que lo incapacita a la hora de
ensamblar la maquinaria necesaria para la activación del proceso apoptótico,
pero que le permite activar la ruta de supervivencia de NFκB tras la unión a
TRAIL (Degli-Esposti et al., 1997a), hecho que también se ha descrito tras la
unión del ligando de muerte a sus receptores pro-apoptóticos (Chaudhary et al.,
1997).
TRAIL
37
El perfil de expresión de receptores pro- y anti-apoptóticos en membrana puede
modular la susceptibilidad celular a la inducción de apoptosis vía TRAIL. Junto con la
capacidad antes mencionada de activación de la ruta de NFκB, los receptores anti-
apoptóticos se postularon en un primer momento como los responsables de la
resistencia a la muerte por el ligando, al secuestrarlo e impedir su unión a receptores
pro-apoptóticos (Pan et al., 1997a). Sin embargo, este mecanismo de resistencia no
aparece en todos los casos, como demuestran estudios más recientes donde se describen
tipos celulares resistentes a TRAIL que no expresan receptores anti-apoptóticos (Kim et
al., 2000).
Otro mecanismo de acción anti-apoptótica conferido a los receptores TRAIL-R3 y
-R4 consistiría en la formación de heterodímeros con el receptor pro-apoptótico TRAIL-
R2 (Munoz-Pinedo et al., 2002), alterando el balance de señalización.
2.3 Regulación de la expresión de TRAIL.
El gen codificante del ligando de muerte se encuentra localizado en el cromosoma 3,
se compone de aproximadamente unas 20 kb y consta de cinco exones de 222, 138, 42,
106 y 1245 pb, separados por cuatro intrones de 8.2, 3.2, 2.3 y 2.3 kb respectivamente
(Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a).
Figura 10. Gen de TRAIL. H. Sapiens cromosoma 3, clon hRPK.44_A_1 (Accesion No. AC007051) (Gong, B. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 745-752 (2000)
Su promotor carece de caja TATA o CAAT típicas, aunque contiene dos secuencias
Sp1 que parecen ser las reguladoras del inicio de transcripción. Además contiene en la
región proximal otros sitios de unión a factores reguladores de la transcripción como
secuencias AP-1 o GAS (Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a). Numerosos
trabajos han descrito la regulación de la expresión de TRAIL por interferones de tipo I
38
(IFN-α e IFN-β) o de tipo II (IFN-γ), tanto en células del sistema inmune (células T,
NK, monocitos y células dendríticas) (Griffith et al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Smyth
et al., 2001) como en otros modelos de células normales y tumorales. Se ha propuesto la
existencia de dos sitios ISRE cercanos al sitio de inicio de transcripción como
responsables de la regulación de la expresión de TRAIL por interferón (Clarke et al.,
2004).
También se ha demostrado que la activación de células T con anticuerpos anti-
CD3/anti-CD28, fitohemaglutinina (PHA), ésteres de forbol/ionomicina y en general
cualquier estímulo que imite la activación del receptor de la célula T para el antígeno
(TCR), conduce a un rápido aumento en la expresión de TRAIL tanto a nivel de ARNm
Figura 11. Secuencia del del promotor de TRAIL.
39
como de proteína en la membrana celular, permaneciendo la célula T activada resistente
a la acción de dicho ligando (Jeremias et al., 1998). Esta inducción de TRAIL en
linfocitos T activados parece estar regulada por el factor de transcripción NF-κB
(Siegmund et al., 2001). De hecho se ha descrito la presencia de dos sitios de unión para
dicho factor, en la región proximal del promotor de TRAIL, necesarios para la
inducción de este ligando en respuesta a la activación de linfocitos T (Baetu et al.,
2001). Artículos recientes también han propuesto una posible regulación de la expresión
de TRAIL por NFAT, pero la contribución exacta de este factor de transcripción aún no
se ha caracterizado (Liu et al., 2006).
2.4 Papel fisiológico de TRAIL
Poco se conoce acerca del papel fisiológico de TRAIL in vivo, pero distintos estudios
parecen indicar su participación en diferenciación, en la hematopoyesis y el
mantenimiento de la homeostasis del sistema inmunitario y en la eliminación de
tumores.
TRAIL en diferenciación celular.- Osteoclastos y células intestinales.
La diferenciación de los osteoclastos hasta constituirse como una célula madura
parece estar relacionada con dos receptores considerados “decoy” de ligandos de
muerte. El primero de estos receptores es RANK, ya que la unión de este receptor a
su ligando, RANKL determina la activación y supervivencia de este tipo celular vía
NF-κB (Fuller et al., 1998; Jilka et al., 1999). El otro receptor implicado en la
diferenciación es OPG (osteoprotegerina), receptor soluble con capacidad de unión a
TRAIL (Emery, 1998), así como a RANKL (Lacey et al., 1998). Este hecho parece
indicar que TRAIL puede jugar un papel en el metabolismo óseo, sobre todo tras
estudios recientes que muestran como TRAIL puede inhibir la osteoclastogénesis in
vitro (Zauli et al., 2004).
Por otra parte, es conocida la actividad de TRAIL a nivel de la proliferación y
diferenciación del epitelio intestinal, ya que interviene en la regulación de la
inflamación a nivel del tracto digestivo y la progresión de ciertos tumores (Strater et
al., 2002). Durante el proceso de diferenciación celular desde las criptas a las
vellosidades intestinales, se observa un incremento en la expresión de TRAIL así
40
como de sus receptores, que no provocan toxicidad en este tipo celular pero puede
favorecer la renovación en caso de células infectadas o transformadas (Zauli and
Secchiero, 2006).
TRAIL en hematopoyesis.- Maduración y eritropoyesis.
Los distintos linajes celulares presentan diferencias en cuanto al sistema formado por
TRAIL sus receptores. Si bien los precursores CD34+ no presentan expresión alguna
del ligando ni sus receptores (Zauli and Secchiero, 2006), se ha descrito que, tanto en
monocitos como neutófilos, la maduración celular provoca la progresiva expresión de
distintos receptores de TRAIL que van a favorecer su delección tras la entrada en
senescencia (Lum et al., 2005; Renshaw et al., 2003). Por otro lado parece que el
ligando de muerte interviene en el proceso de eritropoyesis puesto que los eritroblastos
inmaduros presentan receptores pro-apoptóticos y son sensibles a TRAIL (Secchiero et
al., 2004).
TRAIL en la homeostasis del sistema inmunitario
Se ha descrito que TRAIL media la apoptosis de linfocitos CD8+ una vez realizada
su función (Zerafa et al., 2005), evitándose con ello la expansión de dichas células y el
desarrollo de problemas de autoinmunidad,
Estudios realizados en modelos murinos deficientes en TRAIL muestran que estos
ratones sufren defectos en la apoptosis de timocitos que acaban traduciéndose en una
mayor susceptibilidad a desarrollar enfermedades autoinmunes (Lamhamedi-Cherradi et
al., 2003).
TRAIL en supresión de tumores
TRAIL es expresado por distintas células del sistema inmunitario, como linfocitos
T, células NK, monocitos y células dendríticas (Griffith et al., 1999; Liu et al., 2001;
Mariani and Krammer, 1998a). La estimulación de dichas células a través de
interferones o del TCR, en el caso de los primeros, induce la expresión de este ligando y
así se favorece o se estimula su capacidad de inducción de apoptosis sobre células
tumorales (Takeda et al., 2002).
Pero lo más relevante de este ligando de muerte, y lo que lo diferencia de otros
ligandos de muerte de la familia de TNF, es su capacidad para inducir apoptosis de
manera selectiva en células tumorales y no en células normales (Wiley et al., 1995). Si
41
bien existe un gran número de tumores resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL
(Griffith and Lynch, 1998), su estudiada efectividad en la erradicación de tumores en
modelos murinos acompañada de la ausencia de citotoxicidad en humanos (Ashkenazi
et al., 1999) confieren a TRAIL propiedades como un prometedor agente terapéutico en
la lucha contra el cáncer.
3. TRAIL EN TERAPIA ANTITUMORAL
La capacidad de TRAIL para inducir apoptosis selectivamente en células
transformadas y la necesidad de terapias antitumorales menos agresivas que las
utilizadas actualmente, han propiciado el desarrollo de numerosos estudios dirigidos al
empleo de este ligando en la erradicación de tumores. En la actualidad, anticuerpos
frente a los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y -R2 se encuentran en ensayos
clínicos de fase I y de fase II tras comprobar su capacidad para inducir apoptosis en
líneas tumorales y tumores primarios in vitro (Georgakis et al., 2005; Vulfovich and
Saba, 2005). Este hecho es extensible al empleo del propio TRAIL recombinante, en
forma de homotrímero soluble unido a un átomo de Zinc, tras haberse establecido su
tolerancia por parte de algunas células no transformadas, como hepatocitos o células
neuronales previamente descritas como sensibles al ligando en ciertos estudios (Kelley
et al., 2001).
Dada la existencia de un gran número de modelos tumorales resistentes a TRAIL, la
mayor parte de los estudios se han centrado en el desarrollo de terapias combinadas con
agentes que rompan la resistencia a este ligando. Entre dichos agentes podemos
mencionar drogas genotóxicas, inhibidores de histona deacetilasas, inhibidores del
proteasoma, así como compuestos inhibidores de distintas rutas de supervivencia.
3.1 Regulación de la expresión de FLIP
Una de las piezas claves en la sensibilización de distintos tumores a la acción de
TRAIL radica en la regulación de la proteína FLIP. Competidor natural del
reclutamiento de caspasa-8 a nivel del DISC, FLIP se presenta como la barrera más
42
apical en la ruta de apoptosis mediada por TRAIL. Desde el descubrimiento de esta
proteína (Irmler et al., 1997), distintos agentes se han propuesto como moduladores de
la resistencia a TRAIL al provocar un descenso en los niveles de FLIP. Entre éstos,
destacamos:
Doxorubicina (DRX), antraciclina que inhibe a la enzima topoisomerasa II y
además actúa como agente intercalante de la doble cadena de ADN, impidiendo
de este modo la síntesis de ácidos nucleicos y con ello la progresión tumoral. Se
emplea en el tratamiento de leucemia linfática aguda, leucemia mieloide aguda,
linfoma de Hodgkin y carcinoma de mama entre otros. En algunos modelos,
como en cáncer de próstata, se ha demostrado una sensibilización a TRAIL por
doxorubicina mediada por el descenso en los niveles de FLIP (Kelly et al.,
2002).
Cicloheximida (CHX), inhibidor de la síntesis proteica en organismos
eucariotas producido por la bacteria Streptomyces griseus. Actúa interfiriendo
en la actividad peptidil transferasa del ribosoma 60S, bloqueando la elongación
de la traducción. Su capacidad para sensibilizar a la muerte por apoptosis
mediante regulación de FLIP se ha demostrado en distintos tipos de cáncer
como el carcinoma renal (Brooks and Sayers, 2005) y CLL (Kang et al., 2003).
Actinomicina D, antibiótico polipeptídico aislado de las bacterias de suelo del
género Streptomyces que inhibe el proceso de transcripción. También en ciertos
modelos, como leucemia linfática crónica B, se ha descrito la sensibilización a
TRAIL por este compuesto a través de la regulación de FLIP (Olsson et al.,
2001).
Otros agentes que comienzan a ser empleados en la sensibilización de tumores a
TRAIL por inducir una reducción en los niveles de FLIP, entre otros factores anti-
apoptóticos, son los denominados inhibidores de histona deacetilasa (HDACi)
(Hernandez et al., 2001), cuyo mecanismo de acción aún no completamente
caracterizado será explicado en capítulos posteriores.
La expresión de FLIP se encuentra regulada a través de distintas vías de
supervivencia celular como son la vía de la proteina quinasa II dependiente de
calcio/calmodulina (CaMKII), la vía de las proteinas quinasas activadas por mitógenos
(MAPK), la vía de la fosfatidil-inositol 3’ quinasa (PI3K), o a través del factor de
43
transcripción NF-κB. El empleo de inhibidores específicos de estas rutas provoca el
descenso de los niveles de FLIP y así la sensibilización a TRAIL en distintos modelos
tumorales (Xiao et al., 2005).
3.2 Ruta de MAPK
Las proteinas quinasas activadas por mitógenos transmiten señales implicadas tanto
en proliferación celular como en apoptosis a través de la fosforilación de sustratos como
fosfolipasas, otras quinasas, factores de transcripción o proteínas del citoesqueleto.
Existen tres subfamilias de MAPK, de las cuales sólo dos se encuentran bien
caracterizadas:
ERK1 y ERK2
Quinasas activadas por factores de crecimiento o a través de la proteina quinasa C
(PKC), intervienen en mitosis, meiosis, diferenciación, angiogénesis y apoptosis, así
como en la activación de factores de transcripción relacionados con la supervivencia
celular como NF-κB (Hagemann and Blank, 2001; Johnson and Lapadat, 2002; Lee and
McCubrey, 2002). La actividad ERK1/2 se encuentra aumentada en ciertos tumores,
convirtiéndose en diana de drogas inhibidoras que presentan escasa o nula toxicidad en
células no transformadas, como el PD184352 o PD98059, actualmente en ensayos
clínicos (Sebolt-Leopold, 2000); o la bisindolilmaleimida, inhibidor más apical de la
ruta a nivel de PKC. En ambos casos se ha demostrado la capacidad de estos agentes de
sensibilizar a TRAIL en distintos modelos tumorales (Dai et al., 2003; Ohtsuka and
Zhou, 2002) (Sarker et al., 2001)
JNK y p38
La quinasa c-Jun NH2-terminal en asociación con p38, activadas al igual que
ERK1/2 por quinasas MKK de la ruta de las MAPK, están por el contrario relacionadas
con la inducción de apoptosis a través de la activación de miembros pro-apoptóticos de
la familia de Bcl-2 como Bax o Bim, de la inhibición de miembros anti-apoptóticos
como Bcl-2 o Bcl-XL, así como a través de la proteína supresora de tumores p53
(Corazza et al., 2006; Lee et al., 2005; Shimada et al., 2003)
44
Esta ruta puede ser activada por estímulos pro-apoptóticos como el propio TRAIL,
que favorece la traslocación de c-Jun y Fos al núcleo y la formación de AP-1, factor de
transcripción que determina la síntesis de ligandos pro-apoptóticos como TNFα o FasL
(Corazza et al., 2006; Sah et al., 2003).
Por otro lado, estudios recientes muestran como la inhibición de JNK podría
favorecer la apoptosis debido a la potenciación de la actividad de p38 (Hsu et al., 2007),
quinasa para la que se ha descrito su implicación en la inducción de apoptosis (Amran et
al., 2007; Lim et al., 2006), de forma que inhibidores de la JNK como SP-600125
podrían sensibilizar a TRAIL.
3.3 Ruta de PI3K
La ruta de supervivencia iniciada por PI3K, activada por la unión de estímulos de
supervivencia como EGF a sus receptores específicos (Poulaki et al., 2002) o bien
directamente por el protooncogen Ras (Rodriguez-Viciana et al., 1996), determina la
activación de la quinasa Akt que se encuentra incrementada en un elevado número de
tumores, inhibiendo la actividad de TRAIL (Lane et al., 2007; Oka et al., 2006).
Respuesta Crecimiento Inflamación biológica Desarrollo Apoptosis (FLIP)
Estímulo Factores de Crecimiento Estrés, TNFα
Figura 12. Ruta de las MAPK.
45
Akt, regulada en condiciones no patológicas por la proteína tirosina fosfatasa
inhibidora de tumores PTEN (Li et al., 1997), bloquea señales intracelulares apoptóticas
por fosforilación de distintos sustratos:
• BAD, que pierde así su capacidad de unión e inhibición de Bcl-XL .
• Caspasa -9, inhibiendo su activación.
• MDM2, favoreciendo su unión a p53 y así la degradación de esta proteína
supresora de tumores.
• IKK, potenciando la ruta de supervivencia mediada por NF-κB.
El compuesto LY294002, que bloquea esta ruta de supervivencia inhibiendo de
forma específica a PI3K, se ha descrito como un agente sensibilizador de la apoptosis
mediada por TRAIL en diversos modelos como en células de endotelio vascular
(Alladina et al., 2005), al inducir un descenso en los niveles de FLIP.
Figura 13. Ruta de PI3K/Akt
46
3.4 Ruta de NF-κB
El papel de este factor de transcripción en el mantenimiento de la supervivencia
celular y desarrollo del cáncer es de una gran relevancia, como se puede deducir de su
implicación en las vías previamente citadas, activadas por distintos estímulos. Tanto la
vía de las MAPK como la de PI3K acaban confluyendo en la activación de NF-κB, que
a su vez regula la expresión de distintas proteínas relacionadas con la resistencia a la
apoptosis junto con FLIP, IAP1 e IAP2 (Wang et al., 1998a), XIAP (Stehlik et al.,
1998), Bcl-XL (Chen et al., 1998) o el receptor anti-apoptótico TRAIL-R3 (Bernard et
al., 2001).
Pero la acción de NF-κB, en el contexto de la regulación de la apoptosis mediada por
TRAIL, no se limita a la mediación de estímulos y vías de supervivencia sino que es
mucho más compleja ya que este factor de transcripción también puede intervenir
positivamente en la cascada apoptótica, como demuestra su capacidad para regular la
expresión de TRAIL y de sus receptores de muerte (Baetu et al., 2001). Además, el
propio TRAIL es capaz de inducir la activación de NF-κB. Si bien en un primer
momento se describió este efecto como consecuencia de la unión del ligando de muerte
al receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 (Degli-Esposti et al., 1997a), poco después se
amplió esta actividad a los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y -R2 (Chaudhary et
al., 1997). En definitiva, el concepto de equilibrio con el que comienza este trabajo
vuelve a aparecer en forma de una complicada madeja de señales intracelulares, de
manera que los denominados dominios de muerte de los receptores de TRAIL parecen
mediar dos tipos de señales opuestas, pro-apoptóticas y de supervivencia.
La activación de NFκB por unión de TRAIL a sus distintos receptores requiere el
reclutamiento de la protein quinasa RIP a través del adaptador FADD (Lin et al., 2000;
Varfolomeev et al., 1996). RIP fosforila y activa a IKK, complejo IkB quinasa
compuesto por tres subunidades: IKK1/IKKα, IKK2/IKKβ, ambas subunidades
catalíticas con actividad quinasa, e IKKγ/NEMO, subunidad inhibitoria que es separada
del resto del complejo por la acción de RIP, liberando así a las subunidades con
actividad quinasa de IKK (Mercurio et al., 1997) (Karin and Delhase, 2000).
NFκB se describe como un grupo de factores de transcripción diméricos (Karin and
Lin, 2002) cuyo heterodímero activo más conocido es el compuesto por las subunidades
47
p65/p50. Asociados al inhibidor IκB, dichos heterodímeros se encuentran secuestrados
en el citoplasma (Huang and Miyamoto, 2001). La fosforilación de IκB por parte de
IKK activo determina la ubiquitinación del inhibidor, que es degradado a nivel del
proteasoma, liberándose NFκB que se trasloca al núcleo donde determina la trascripción
de genes relacionados con supervivencia y proliferación (Ehrhardt et al., 2003)
Figura 14. Ruta de activación de NF-κB. Adaptada de Hoffmann A, et al. Science 2002
Una vez establecida la importancia de NF-κB y su estrecha relación con TRAIL,
distintos grupos han demostrado la sensibilización de tumores a este ligando mediante
terapias combinadas con inhibidores de distintos puntos de la ruta de NF-κB, como
MG132 y bortezomib, inhibidores del proteasoma que impiden la degradación de IκB
(Kyritsis et al., 2007; Li et al., 2007); BAY 11-7085, inhibidor de la fosforilación de
IκB (Huerta-Yepez et al., 2004); o SN50, inhibidor de la traslocación de NF-κB al
núcleo (Kasuga et al., 2004).
TRAIL
TRAIL-R1/2
PROTEASOMA
SEÑAL DE LOCALIZACIÓN NUCLEAR
NUCLEO
UBIQUITINACIÓN
48
3.5 Regulación del ciclo celular
3.5.1 Proteínas reguladoras del ciclo celular (CDKs)
La correcta progresión del ciclo celular se encuentra regulada por la denominadas
quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), cuya actividad está a su vez controlada por
fenómenos de fosforilación/defosforilacion y por la unión a las citadas proteínas ciclinas
en respuesta a la estimulación por diversos factores como pueden ser factores de
crecimiento. De forma general, la unión de las ciclina D a las CDK4 y 6 favorece la
progresión de la fase G1, mientras que el complejo CDK2-ciclina E permite la entrada
en fase S, CDK2-cliclina A en G2, CDK1-ciclina A en mitosis y el retorno a G0
requiere de CDK1-ciclina B (Collins and Garrett, 2005).
En células no transformadas, la progresión del ciclo de una fase a la siguiente pasa
por una serie de “puntos de control” donde se diagnostica la correcta ejecución del
proceso y se intentan subsanar las posibles anomalías. De no ser esto posible, la célula
es eliminada por apoptosis. Las células tumorales desarrollan mecanismos para evitar
estos puntos de control íntimamente ligados con las funciones de las CDKs, lo que ha
convertido a estas enzimas en dianas farmacológicas en la lucha contra el cáncer.
Entre los distintos inhibidores de las CDKs, la roscovitina se presenta como un
posible agente pro-apoptótico en combinación con TRAIL. Se ha demostrado su efecto
sensibilizador al ligando en ciertos modelos tumorales, mediado posiblemente por su
capacidad para regular los niveles de proteínas pro-apoptóticas como Bak o de factores
anti-apoptóticos como Mcl-1 y XIAP (Hahntow et al., 2004; Kim et al., 2004).
3.5.2 Organización del citoesqueleto.
El mantenimiento de la integridad del citoesqueleto se encuentra íntimamente ligado
a la correcta progresión del ciclo celular. Los microtúbulos que componen el
citoesqueleto tienen su origen en polímeros dinámicos que intervienen en la movilidad
de la célula, el tráfico intracelular, así como en el crecimiento y la división celular.
La organización del citoesqueleto puede verse alterada por distintos agentes como el
nocodazol, inhibidor de la polimerización de microtúbulos, o el paclitaxel o taxol,
49
inhibidor de la despolimerizacion, produciéndose en ambos casos una parada de ciclo en
fase G2/M y la inducción de apoptosis en la célula (Wang et al., 2000b).
Esta inducción de la cascada apoptótica parece asociada a la capacidad de
regulación de distintas proteínas señalizadoras de la muerte celular por parte de estos
agentes inhibidores de la dinámica de microtúbulos. Se ha descrito el efecto de estos
agentes en la transcripción de proteínas pro-apoptóticas como TRAIL-R1 y -R2, Bax y
Bak, que ven incrementada su expresión (Shankar et al., 2005a), al tiempo que se
reducen los niveles de Bcl-XL, FLIP o XIAP (Liu and Stein, 1997; Park et al., 2004).
Por tanto, estos inhibidores también pueden ser útiles en estrategias de terapias
combinadas con TRAIL que potencien la acción de este ligando sobre ciertos modelos
tumorales (Nimmanapalli et al., 2001).
4. EPIGENÉTICA
La epigenética se define como el conjunto de cambios heredables en la expresión de
los genes no asociados a modificaciones en la secuencia del ADN. La accesibilidad
transitoria de distintas secuencias de ácidos nucleicos, regulada en gran medida por
factores epigenéticos, determina la expresión de genes que codifican proteínas
imprescindibles en procesos como pluripotencialidad, diferenciación y maduración
celulares. Así mismo, los cambios epigenéticos modulan la capacidad transcripcional de
la célula durante procesos inherentes a la correcta progresión del ciclo celular como son
la mitosis, o en su caso la apoptosis (Prigent and Dimitrov, 2003). Por tanto,
disfunciones en esta forma de control de la información genética pueden desembocar en
distintas patologías. Así, existe una íntima relación entre epigenética y cáncer. Los
fenómenos de activación de oncogenes y de inactivación de genes supresores de
tumores asociados a la aparición y el desarrollo de un tumor (Galm et al., 2006) son
fruto en muchas ocasiones de alteraciones en las modificaciones epigenéticas durante el
ciclo celular. Y es por ello que los factores implicados en dichas modificaciones
epigenéticas pueden ser dianas importantes en la lucha contra el cáncer.
50
Las dos principales mecanismos epigenéticos, junto con la impronta genética, son la
metilación del ADN y la modificación de histonas por metilación, acetilación o
fosforilación (Klose and Bird, 2006; Strahl and Allis, 2000).
4.1 Metilación del ADN
La modificación epigenética más extendida en humanos es la metilación de citosinas
que preceden a guanosinas en la secuencia del ADN (dinucleótidos CpG) (Galm et al.,
2006). Esta metilación tiene lugar por unión covalente de un grupo metilo al carbono 5′
del anillo de citosina resultando una 5-metilcitosina, proceso llevado a cabo por unas
enzimas denominadas ADN metiltransferasas (DNMTs). La metilación del ADN inhibe
la expresión génica bien directamente bloqueando la unión de factores de transcripción,
o provocando la unión de las denominadas “proteínas de unión a CpG metilado” (MBP)
que silencian la expresión de los genes por remodelación de la estructura de la
cromatina a la que se unen (Klose and Bird, 2006).
En el ADN de mamíferos encontramos 5-metilcitosinas en aproximadamente el 4%
del ADN genómico y esta metilación basal parece contribuir al mantenimiento de una
gran cantidad de ADN en un estado transcripcional inerte. Existen unos pequeños
tramos de ADN ricos en CpG (de unos 0.5Kb) llamados islas CpG, localizadas
próximas a la las regiones promotoras y que se encuentran normalmente no metiladas
para permitir la expresión génica.
Figura 15. Patrón de metilación de las islas CpG en células tumorales y normales.
51
En la célula transformada los patrones de metilación del ADN se encuentran
profundamente alterados, presentando un espectro de genes hipermetilados específico
para cada tejido y origen del tumor, por lo que pueden actuar como biomarcadores para
la detección del cáncer, así como para predecir la susceptibilidad y respuesta a la terapia
(Baylin and Ohm, 2006). Generalmente, son los promotores de distintos genes
relacionados con la regulación del ciclo celular y apoptosis los que se encuentran
hipermetilados en células tumorales (Widschwendter and Jones, 2002), mientras que el
resto del ADN se presenta hipometilado (Weber et al., 2005). Así, tanto en tumores
hematopoyéticos como sólidos se ha descrito el silenciamiento por hipermetilación del
ADN de genes que codifican moléculas de adhesión, proteínas que regulan la
proliferación, la diferenciación, la reparación del ADN, la muerte por apoptosis, la
angiogénesis, metástasis del tumor e inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas
como p15, p27 o p21 (Gomyo et al., 2004).
4.2 “Código de Histonas”
La condensación del genoma eucariótico en forma de cromatina requiere de la
organización del ADN en unidades denominadas nucleosomas (Khorasanizadeh, 2004),
en los que encontramos 146 pares de bases enrolladas sobre un núcleo proteico en forma
de octámero compuesto por dos copias de cada una de las subunidades histonas H3, H4,
H2A y H2B.
Figura 16. Representación esquemática de un nucleosoma. Adaptado de Ruijter A.J.M.,Biochem. J, 2003
52
Estas histonas presentan un núcleo central altamente conservado, de estructura
globular (Luger et al., 1997), mientras que las colas aminoterminales contienen
secuencias variables particularmente ricas en lisina y arginina. Dichas secuencias actúan
como diana de distintas enzimas responsables de modificaciones post-traduccionales
tales como metilación, fosforilación, ubiquitinación, poli-ADP-ribosilación y
acetilación, que van a influir en el grado de compactación de la cromatina (Spotswood
and Turner, 2002). Esto ha permitido acuñar el término “código de histonas” para hacer
referencia a las modificaciones en la expresión de distintos genes en función de su
accesibilidad determinada por alteraciones reversibles de las histonas.
4.2.1 Metilación de histonas
La metilación de histonas, si bien es un proceso que no altera la carga total de la
proteína, incrementa su carácter básico e hidrofobicidad al tiempo que modifica su
afinidad por moléculas aniónicas como el ADN (Baxter and Cooke, 1995), de forma
que el nucleosoma ve modificada su estructura y función (Rice and Allis, 2001).
Este proceso está mediado por las histona metiltransferasas (HMTs) (Kouzarides,
2002), con capacidad de metilar los residuos de lisina K4, K9, K27, K36 y K79 de la
histona H3 y K20 de la H4, o bien las argininas R2, R17 y R26 de la H3 y R3 de la H4.
Este hecho favorece la liberación de la estructura eucromática del ADN facilitándose la
transcripción por unión de la ARN polimerasa II a los residuos metilados K4, K36 y
K79 de la H3 (Gerber and Shilatifard, 2003).
4.2.2 Ubiquitinación de histonas
La ubiquitina es una proteína altamente conservada de 76 aminoácidos cuya unión a
otras proteínas determina la proteolisis de las mismas a nivel del proteasoma (Adams,
2004), aunque la ubiquitinación a nivel del residuo de lisina K123 de la histona H2B
parece no constituir una señal directa para su degradación, sino tan solo una señal
dentro del código de las histonas para la expresión genética (Osley, 2004), en tanto que
actúa como un elemento regulador de la metilación de los residuos K4 y K36 de la H3
(Krogan et al., 2003).
53
4.2.3 Fosforilación de histonas
En mamíferos, la fosforilación de histonas en respuesta a determinados estímulos
tiene lugar sobre todo en los residuos S10 y S28 de la histona H3 a través de la vía de
las MAPK, de Akt y de IKK-1 (Anest et al., 2003; Hazzalin et al., 1997; Salvador et al.,
2001). Se trata de un proceso dual pues está implicado en la relajación de la cromatina,
permitiendo la transcripción de genes como c-jun, c-fos y c-myc que regulan la síntesis
de proteínas necesarias durante la interfase (Prigent and Dimitrov, 2003); y al mismo
tiempo también se ha descrito su participación en la regulación del ciclo celular durante
los procesos de mitosis y meiosis (Gurley et al., 1998) aunque su papel durante la
condensación de la cromatina asociada a la división celular no se conoce con exactitud.
4.2.4 Poli-ADP-ribosilación de histonas
Al igual que muchas otras proteínas, las histonas pueden ser modificadas por unión
de sucesivos monómeros de ADP-ribosa (poli-ADP-ribosa o PAR) por las PAR
polimerasas (PARPs). La acción de PARP en la regulación de la transcripción radica en
su capacidad para alterar la estructura de la cromatina favoreciendo su condensación y
reprimiendo, por tanto, la transcripción (Huletsky et al., 1989), o bien permitiendo la
asociación de complejos que incluyen distintos factores de transcripción a nivel de
distintos promotores (Kraus et al., 2003).
Figura 17. Efectos de la ubiquitinación (Ub) de H2B sobre la metilación (M) de H3. Adaptado deZhang Y.Genes & Dev. 2003
54
4.3 Acetilación de histonas
La progresión del ciclo celular desde el punto de vista epigenético es fruto del
correcto equilibrio entre la acetilación y la deacetilación de histonas con una relevancia
de proporciones infinitamente mayores respecto al resto de modificaciones a las que
hemos hecho referencia. El proceso de acetilación es llevado a cabo por las histona
acetil transferasas (HAT), enzimas que actúan sobre el grupo amino de los residuos de
lisina de las histonas (Johnson and Turner, 1999) neutralizando su carga positiva y con
ello su capacidad de unión al ADN, mientras que el proceso contrario está mediado por
las histona deacetilasas (HDAC), que eliminan dichos grupos acetilo favoreciendo la
compactación de la cromatina. Así, una situación de hipoacetilación de las histonas
llevado a cabo por las HDAC se correspondería con la disminución en la accesibilidad
al ADN. Por el contrario, la hiperacetilación provocada por la acción de las HAT, o por
inhibición de las HDAC, se traduciría en un incremento de la transcripción (Maison et
al., 2002).
4.3.1 Histona acetil transferasas (HAT)
Se trata de complejos multiproteicos de elevado peso molecular en los que además
de la subunidad catalítica encontramos una subunidad encargada de controlar la
selectividad de sustrato del complejo (Carrozza et al., 2003). Esto se traduce en que, en
función de las proteínas que conformen la región reguladora de este complejo, las HATs
van a reclutarse en diferentes regiones de distintos promotores por interacción con
proteínas activadoras que determinarán la acetilación de las histonas circundantes.
En humanos, podemos clasificar las HATs en tres familias en función de su
homología de secuencia y la similitud en sus funciones biológicas (Roth et al., 2001).
Familia GNAT.- En esta familia distinguimos las HATs Gcn5 y ATF-2,
caracterizadas por presentar un dominio con un átomo de Bromo que le permite
interaccionar con grupos que presenten las lisinas acetiladas, actuando como complejos
co-activadores.
Familia MYST.- En la que encontramos las enzimas MOZ, que actúa
como coactivador, y Tip60, que interviene en procesos como la reparación del ADN y
55
apoptosis (Carapeti et al., 1999). Estructuralmente, se caracterizan por presentar un
dominio catalítico de unos 250 aminoácidos que incluye una región rica en cisteína, una
región de unión a Zinc y un grupo Cromo amino-terminal para el reconocimiento de
grupos lisina metilados (Utley and Cote, 2003).
Familia CBP/p300.- Conjunto de enzimas que comparten en su
estructura la presencia de un residuo catalítico típico de las HATs, un dominio de
Bromo y una región rica en cisteína que permite la interacción proteína-proteína
(Marmorstein and Roth, 2001), pudiendo actuar como modulador global de la
transcripción. Esta enzima interviene activamente en procesos tumorales, debido a su
capacidad de acetilación de la proteína supresora de tumores p53 (Liu et al., 1999).
4.3.2 Histona deacetilasas (HDAC)
Las HDAC son enzimas con capacidad catalítica para eliminar el grupo acetilo de
distintas proteínas, como p53, E2F o tubulina (Hubbert et al., 2002), pero
particularmente de las histonas (Gray and Ekstrom, 2001).
Las HDAC actúan formando un complejo con distintas proteínas encargadas del
reclutamiento y remodelación de la estructura de la cromatina. De forma general,
elevados niveles de acetilación de histonas se asocian a un incremento de la actividad
transcripcional, mientras que la hipoacetilación se asocia con la represión génica (Wade,
2001). La principal señal para la represión de la transcripción mediada por las HDAC se
localiza en el propio ADN, a través de los grupos metilo de las citosinas de las islas
CpG (Klose and Bird, 2006). A estas regiones, como hemos citado previamente, se
asocian las “proteínas de unión a CpG metilado” (MBP) que son las responsables
directas del anclaje de las HDAC al ADN.
Una vez ancladas al ADN, la eliminación del grupo acetilo de las histonas tiene lugar
por un sistema basado en la modificación de la carga de la proteína. El dominio
catalítico de las HDAC, de unos 390 aminoácidos, presenta dos residuos de histidina
adyacentes y separados unos 30 aminoácidos de dos residuos de tirosina, y un átomo de
Zinc que va a retirar el grupo acetilo de la histona por ruptura del enlace convalente
(Buggy et al., 2000; Finnin et al., 1999).
56
Figura 18. Compactación y relajación de la cromatina por acción de las HATs y las HDACs. Adaptado de Hess-Stumpp et al, IJBCB, 2007
En la actualidad, se han descrito hasta 18 HDAC diferentes que pueden clasificarse
en tres familias, las HDAC “clásicas” de clase I y II, que difieren en su localización, y
las HDAC clase III que presentan un mecanismo de acción diferente al de las HDAC
clásicas.
HDAC clase I.- De amplia distribución en distintas líneas celulares y
tejidos y de localización estrictamente nuclear (Fischle et al., 2001), presentan un
mecanismo de acción típico mediado por el átomo de Zinc. A esta familia de proteínas
pertenecen las HDAC1, 2, 3 y 8.
HDAC1 y HDAC2. Con secuencias con un 82% de homología entre sí,
ambas enzimas presentan capacidad de asociación in vivo a diferentes complejos de
57
unión al ADN, entre los que distinguimos los denominados Co-REST, Sin3, y NuRD
(Zhang et al., 1999). En el caso de estos dos últimos, junto con las proteínas que le dan
nombre encontramos otros integrantes como RbAp46 o RbAp48, que se unen a la
histona H4 directamente. La actividad de estos complejos está regulada por
fosforilación, de forma que un estado de hiperfosforilación se asocia con un incremento
en la capacidad de deacetilación de la enzima al tiempo que disminuye la asociación al
ADN para evitar una actividad excesiva. (Heinzel et al., 1997; Taplick et al., 2001).
HDAC3. De idéntico dominio catalítico pero tan solo un 68% de
homología con las HDAC1 y HDAC2, la región C-terminal no conservada de la
HDAC3 es imprescindible para ambas actividades deacetilasa y represora de la
transcripción. Pero lo que la separa del resto de las HDAC es el complejo al que se une,
el cual le confiere individualidad y especificidad.
La actividad de HDAC3 requiere de las presencia de SMRT (silencig mediator for
retinoic acid and thyroid hormone receptors) o N-CoR (nuclear receptor co-repressor),
cuya unión a la enzima les permite actuar como co-represores de la transcripción. A
través de estos complejos, la HDAC3 puede asociarse a otras HDACs como son la
HDAC4, 5 y 7 (Fischle et al., 2001; Yang et al., 2002), aunque también se ha observado
su asociación a las HDAC9 y 7 a través de otras proteínas.
HDAC8. De estructura similar a la HDAC3, está compuesta por un
dominio catalítico asociado a una señal de localización nuclear (NLS), aunque se
desconoce el complejo regulador al que puede encontrarse asociado.
HDAC clase II.- De complejo catalítico similar al de HDACs de clase I,
difieren de éstas en cuanto a su localización, limitada a un menor número de tipos
celulares, pero donde encuentran expresión tanto nuclear como citosólica (Verdin et al.,
2003) (Fischle et al., 1999). A esta familia enzimática pertenecen las HDAC4, 5, 6, 7, 9
y 10.
HDAC4, HDAC5 y HDAC7. Comparten una estructura similar que
incluye el dominio catalítico próximo a la región C-terminal, mientras que hacia la
región N-terminal se localizan el NLS y los dominios de unión a CtBP (roteínas de
unión al extremo C-terminal) y MEF2 (myocite enhancer factor 2).
Estas HDACs se localizan fundamentalmente en células musculares, donde regulan
el papel de MEF2 durante la diferenciación, de forma que su asociación con las HDAC
58
se traduce en una incapacidad de unión al ADN y por tanto de actuar como factor de
transcripción, que es recuperada con la disociación del complejo tras la fosforilación de
HDAC por CaMK (McKinsey et al., 2000).
Las HDAC4, 5 y 7 presentan sitios de unión a SMRT y N-CoR, favoreciendo su
asociación a la HDAC3 y con ello el reclutamiento de esta enzima al ADN (Guenther et
al., 2000).
HDAC6. Esta HDAC presenta dos rasgos estructurales que la separa del
resto de enzimas de la familia. El primero de ellos es la presencia de dos dominios
catalíticos dispuestos en tándem (Marks et al., 2001) y el segundo, un dominio C-
terminal que actúa como señal para la ubiquitinación y que le confiere una mayor
predisposición a la degradación. Estas peculiaridades estructurales parecen asociadas a
su función como tubulina deacetilasa regulando la movilidad celular dependiente de
microtúbulos (Hubbert et al., 2002). Este hecho determina la presencia de una secuencia
de localización citosólica (NES), aunque también se ha descrito su localización a nivel
nuclear, asociada a la HDAC11.
HDAC9. Aunque aparece como variante por procesamiento alternativo
del ARN y por tanto está emparentada con las HDAC4, 5 y 7, la HDAC 9 difiere del
resto de proteínas de la familia en la localización del dominio catalítico, que se
encuentra dispuesto en el extremo N-terminal. Debido a su analogía con las HDAC4, 5
y 7, presenta capacidad de unión y reclutamiento al ADN de la HDAC3, y también se ha
descrito su interacción con MEF2, de lo que se deduce su posible implicación en la
diferenciación del tejido muscular.
HDAC10. Su capacidad de unión a las HDAC1, 2, 3, 4, 5 y 7 parece
indicar que su papel es predominantemente el reclutamiento de otras HDACs al ADN,
en lugar de la deacetilación por sí misma, aunque la presencia de dos sitios de unión a
Rb sugieren la posibilidad de su intervención en la regulación del ciclo celular.
HDAC11. La clasificación de la HDAC11 no se encuentra
completamente establecida. Si bien filogenéticamente parece situarse próxima a las
HDAC3 y 8, no se ha establecido ningún tipo de asociación a los complejos descritos
como Sin3 o SMRT, lo que parece indicar que presenta una función bioquímica
diferente al resto (Gao et al., 2002). Esto ha llevado a que sea clasificada como HDAC
clase IV.
59
Figura 19. Clasificación y realación filogenética de las HDACs. Adaptado de Hess-Stumpp et al, IJBCB, 2007
HDAC clase III o Sirtuinas. Difieren de las HDAC de clase I y II en su
mecanismo de deacetilación de histonas, al emplear un grupo NAD+ como aceptor de
grupos acetilo (Landry et al., 2000), y por no ser susceptibles de inhibición por
compuestos como el TSA (Tricostatina A) (Frye, 1999).
En humanos estas HDAC reciben el nombre de SIRT1-7 y son responsables del
silenciamiento de los telómeros, jugando un importante papel en la formación de la
heterocromatina (Palladino et al., 1993).
60
4.4 Histona deacetilasas y cáncer
Las HDAC regulan la expresión y actividad de numerosas proteínas que juegan un
papel en el inicio y en la progresión del cáncer. De entre los procesos en los que
interviene destacamos los siguientes
4.4.1 HDAC y proliferación celular
La proteína p21, inhibidora de CDKs, se presenta como uno de las dianas de la
acción de HDACs con mayor relevancia para la progresión del ciclo celular. Su
expresión durante el desarrollo se asocia a una hiperacetilación de las histonas H3 y H4
a nivel del promotor (Richon et al., 2000), de forma que la acción de las HDACs, en
especial la HDAC1, determina un descenso en la expresión de este inhibidor de la
proliferación que puede desembocar en una división celular incontrolada, como se ha
observado en distintos modelos tumorales (Ocker and Schneider-Stock, 2007).
4.4.2 HDAC y diferenciación hematopoyética
La progresión desde células precursoras pluripotenciales hasta células
hematopoyéticas maduras requiere de la interrelación de una compleja gama de
moléculas. El bloqueo o desregulación de alguno de los pasos de este proceso de
diferenciación puede determinar la proliferación de células leucémicas y aquí pueden
jugar un papel importante las HDAC. Un ejemplo son los casos de leucemia mieloide
aguda (AML) asociados a la formación de la proteína de fusión AML-ETO, como
consecuencia de la translocación cromosómica t(8;21). Esta proteína de fusión se une a
las HDAC1, 2, 3, 5, 6 y 9 con afinidad variable (Hiebert et al., 2003) y así se asocia al
ADN provocando un descenso, por deacetilación, en los niveles expresión de ciertos
genes como el c-FMS, factor de diferenciación fundamental para macrófagos (Follows
et al., 2003).
61
4.4.3 HDAC, angiogénesis y metástasis
Entres los genes implicados en la progresión tumoral que son regulados por
acetilación y deacetilación de histonas, encontramos algunos relacionados con el
proceso de angiogénesis y con el control de la adhesión, migración e invasión celular.
Se ha demostrado que la situación de hipoxia localizada en el centro del tumor
induce la expresión de HDAC1, y con ello, la represión de p53 así como la inducción
del factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α) y el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF). De este modo HDAC1 regula la angiogénesis (Kim et al., 2001).
Por otra parte, las HDACs clase I regulan directamente la expresión de la E-
cadherina, proteína fundamental en el proceso de adhesión y cuya pérdida determina la
invasión epitelial, primera fase de la metástasis (Peinado et al., 2004).
De la misma forma, las HDACs se encuentran implicadas en la regulación de la
expresión del receptor de quimioquinas CXCR4 en leucemia linfática aguda (ALL),
que interviene en la migración de estas células transformadas hacia hígado, bazo,
cerebro y nódulos linfáticos (Crazzolara and Bernhard, 2005).
4.4.4 HDAC y factores de transcripción
Cada día son más las proteínas no histonas descritas que son susceptibles de
modificación por acetilación y deacetilación por las HATs y HDACs, respectivamente,
alterando su función, capacidad de interacción proteína-proteína, estabilidad y
localización (Glozak et al., 2005). Entre estas proteínas, la acetilación de distintos
factores de transcripción parece jugar un importante papel durante la oncogénesis.
En respuesta a diferentes tipos de daño en el ADN se produce la acetilación de p53
por el complejo p300/CBP, incrementándose así la capacidad de unión de este gen
supresor de tumores a secuencias específicas situadas en ciertos genes, y por tanto su
acción como factor de transcripción. La activación de p53 promueve la parada del ciclo
celular a través de p21, en el caso de daños provocados por agentes alquilantes, e induce
apoptosis por activación de Bax tras daños en la maquinaria de reparación de ácidos
nucleicos (Gu et al., 1997; Sakaguchi et al., 1998).
En linfoma folicular de células B, la traslocación t(14;18) determina la
sobreexpresión de Bcl-2 regulada por los factores de transcripción Sp1 y C/EBP . La
62
interacción de la HDAC2 con dichos factores de transcripción permite su deacetilación
y así se favorece su unión al promotor del gen anti-apoptótico (Duan et al., 2005).
Figura 23. Activación de la transcripción de genes antiapoptóticos por acetilación de NF-κB. Adaptdo de Kagoshima et al, Biochemical Society 2003
NF-κB interviene en el desarrollo de una gran diversidad de procesos oncológicos en
humanos. La actividad y estabilidad de este factor de transcripción también se encuentra
regulada por procesos de acetilación y deacetilación a distintos niveles (Basseres and
Baldwin, 2006). Una vez activado, NF-κB se trasloca al núcleo donde la unidad p65 es
acetilada por p300/CBP en los residuos K218, K221 y K 310, favoreciendo su unión al
ADN y así la transcripción de diversos genes anti-apoptóticos, e impidiendo su
asociación con la proteína inhibidora IκB. Una vez cumplida su función, es deacetilado
por HDAC1, 2 y 3, facilitando el exporte nuclear.
Pero esta asociación acetilación-activación no es estricta en el caso de NF-κB, ya
que la acetilación de los residuos K122 y K123 produce el efecto contrario,
reduciéndose la afinidad del factor de transcripción por el ADN (Kiernan et al., 2003).
En estas condiciones, la inhibición de la actividad HDAC puede ser beneficiosa para
el tratamiento de tumores, siendo este hecho aún más evidente si tenemos en cuenta que
en cada uno de los procesos relacionados con la oncogénesis descritos anteriormente, la
actividad HDAC se traduce en la progresión del tumor. De ahí que la inhibición de estas
enzimas se presente como una diana potencial en la terapia antitumoral.
63
4.5 Inhibidores de histona deacetilasas (HDACi)
Se han descrito un gran número de inhibidores de la actividad enzimática de las
distintas HDACs (HDACi), tanto de origen natural como derivados sintéticos, que
inducen parada de ciclo celular, diferenciación o apoptosis en células tumorales en
cultivo y modelos animales (Johnstone, 2002).
Dichos inhibidores presentan diferentes tipos de estructuras por lo que podemos
distinguir los siguientes grupos:
Ácidos hidroxámicos
La tricostatina A o TSA fue el primer hidroxamato descrito con capacidad de
inhibición de una amplia gama de HDACs (Yoshida et al., 1990). Pero es el vorinostat o
SAHA, inhibidor de HDACs de clases I y II, el único ácido hidroxámico aprobado
actualmente por la “Food and Drug Administration” para ser utilizado en el tratamiento
del linfoma T cutáneo, habiendo superado los ensayos de fase II en los que ha
demostrado su seguridad y eficacia y presentando una respuesta positiva en el 25% de
los casos (Duvic and Vu, 2007).
Otros miembros de esta familia de estructura similar al Vorinostat y que se
encuentran en fase I de ensayos clínicos son el LBH-589 o panobinostat en el
tratamiento de diferentes tipos de leucemias (Giles et al., 2006), el ITF2357 para el
tratamiento del mieloma múltiple y leucemia mieloide aguda (Golay et al., 2007), y el
PXD-101 o bellinostat, que presenta una buena tolerancia y una eficacia antitumoral
considerable en pacientes con un avanzado estado de oncogénesis (Marson et al., 2007).
Péptidos cíclicos
A esta familia estructural pertenecen los HDACi apicidina y depsipéptido. Este
último se caracteriza por inhibir eficazmente a las HDAC1 y 2, al tiempo que presenta
un efecto muy leve sobre las HDAC4 y 6 (Santini et al., 2007). Actualmente se
encuentra en fase II de ensayos clínicos en pacientes con linfoma T cutáneo con un
porcentaje de respuesta positivo del 36%, así como para el tratamiento de linfomas T
64
periféricos y distintos tumores sólidos o hematológicos en combinación con otros
agentes antitumorales (Piekarz et al., 2007).
Benzamidas
A este grupo pertenecen compuestos como N-acetildinalina (CI-994), MGCD-0103
y MS-275, inhibidor específico de las HDACs de clase I ante todo de las HDAC 1 y 3
(Hu et al., 2003). Actualmente en fase I de ensayos clínicos, este compuesto de
actividad comparable al TSA ha demostrado actividad antitumoral en neonatos y
adultos con cáncer de mama y riñón.
Figura 24. Estructura de los distintos HDACi. Adaptado de Minucci and Pelicci, Nature Reviews, 2006
Ácidos alifáticos
El ácido valproico (VPA) y el butirato sódico (NaB) son los representantes más
destacados de esta familia estructural, habiéndose probado sus efectos terapéuticos en
65
síndromes mielodisplásicos (Kuendgen et al., 2004). En el caso del VPA, junto con su
capacidad de inhibición enzimática, se ha demostrado también su implicación en la
degradación de la HDAC2 (Kramer et al., 2003).
4.6 HDACi y TRAIL
Los HDACi, al promover la hiperacetilación de histonas, afectan a la expresión de un
20% de los genes conocidos (Glaser et al., 2003), entre ellos genes implicados en las
rutas de señalización de apoptosis. Diferentes autores han demostrado la inducción por
HDACi de un elevado número de genes pro-apoptóticos como caspasa-8, caspasa-3,
Bid, Bim, Bax o Bak en distintos modelos de células tumorales. También se ha
observado la represión en la expresión de otros tantos genes de carácter anti-apoptótico
como Bcl-2, Bcl-XL o XIAP en respuesta al tratamiento con HDACi (Lindemann et al.,
2004; Shankar et al., 2005b).
Figura 25. Efecto selectivo de los HDACi sobre células transformadas. Adaptado de Minucci and Pelicci, Nature Reviews, 2006
66
Entre los factores pro-apoptóticos regulados por HDACi se encuentran el ligando de
muerte TRAIL y su receptor de muerte TRAIL-R2 (DR5). Mediante estudios con ARN
de interferencia se ha demostrado que la regulación de dichos genes es necesaria para la
inducción de apoptosis por HDACi en ciertos modelos de células leucémicas, como es
el caso de la leucemia mieloide, y que el efecto de estos inhibidores parece ser selectivo
sobre células tumorales y no sobre células normales (Nebbioso et al., 2005). Además, en
tumores hematológicos y ciertos tumores sólidos se ha descrito la sensibilización a
TRAIL mediante el uso de determinados HDACi a concentraciones no tóxicas (Zhang
et al., 2003). En algunos casos se ha observado que el tratamiento simultaneo, pero no
secuencial, de ambos agentes determina un cierto sinergismo en la inducción de
apoptosis, de lo que se deduce que ésta no se debe a la represión de proteínas anti-
apoptóticas mediada por los HDACi, sino que se requiere la coactivación de ambas
rutas apoptóticas, extrínseca por parte de TRAIL e intrínseca por acción de los HDACi
(Rosato et al., 2003).
67
II. OBJETIVOS
68
69
El ligando de muerte TRAIL, cuya expresión se incrementa en la superficie de
células T en respuesta a señales de activación, parece mediar en gran parte la actividad
citotóxica de estas células. Aunque se ha demostrado la regulación de la expresión de
TRAIL por Interferones o por activación de NF-κB no se sabe nada acerca de la
implicación de otros factores de la transcripción que podrían estar jugando un papel
adicional e importante en su regulación, como es el caso de NFAT, factor que interviene
en las señales de activación de los linfocitos T y para el cual se han encontrado varios
sitios de unión en el promotor de TRAIL.
La ausencia de toxicidad de TRAIL para la mayoría de células no transformadas es
el hecho más importante a tener en cuenta a la hora de considerarlo como un agente
antitumoral. También los linfocitos T activados que expresan TRAIL en membrana
parecen ser resistentes a la acción de este ligando, siendo éste un requisito esencial para
que TRAIL pueda funcionar como mediador de la respuesta antitumoral de los propios
linfocitos T. Sin embargo, el mecanismo implicado en la resistencia de células normales
a TRAIL no está completamente caracterizado. En la actualidad se están empleando
distintos agentes en terapias combinadas con TRAIL a fin de mejorar la sensibilidad de
ciertos modelos tumorales a este ligando de muerte. Pero los efectos que dichos agentes
pueden tener sobre la resistencia de células normales no se conocen y en la mayoría de
las ocasiones no han sido analizados. Existe por tanto la necesidad de realizar un estudio
paralelo y comparativo sobre la capacidad de numerosos agentes para potenciar la
apoptosis en células normales y en células tumorales, estudio que nos dará a conocer la
inocuidad o los efectos adversos de estos agentes al mismo tiempo que nos ayudará a
caracterizar los mecanismos de resistencia a TRAIL específicos de las células no
transformadas.
Los inhibidores de HDAC (HDACi) constituyen un nuevo grupo de fármacos que
han demostrado una gran efectividad en la inhibición de la proliferación y supervivencia
de células tumorales. Estos efectos antitumorales parecen deberse principalmente a su
capacidad para regular genes relacionados con el ciclo celular y apoptosis. Al igual que
en el caso de TRAIL, las células no transformadas presentan una alta tolerancia a estos
inhibidores aunque su mecanismo de acción selectivo sobre células tumorales no se
conoce con precisión. Es por ello que, la posibilidad de una terapia combinada con
HDACi a dosis apropiadas y TRAIL puede constituir una estrategia muy útil en el
tratamiento de tumores, especialmente de aquellos más resistentes a TRAIL. Los
70
estudios realizados hasta el momento con HDACi se centran en los efectos concretos de
uno o un par de estos inhibidores sobre un determinado modelo tumoral. Pero el
desarrollo de todo el potencial de esta terapia requiere aún de un estudio comparativo de
la efectividad de HDACi pertenecientes a distintas familias estructurales sobre células
tumorales y células normales, así como de un análisis de los genes diana específicos de
cada uno de estos compuestos, teniendo en cuenta la posible diversidad en su
mecanismo de acción.
OBJETIVOS
En base a los antecedentes y planteamientos expuestos nos propusimos los siguientes
objetivos para la realización de esta tesis doctoral:
1.- Estudio de la regulación de la expresión de TRAIL en linfocitos T en respuesta a
la activación. Implicación del factor de transcripción NFAT.
2.- Caracterización de los mecanismos implicados en la resistencia a TRAIL de
linfocitos T primarios tanto en estado de reposo como activados.
3.- Análisis comparativo de la regulación de la respuesta a TRAIL en células T
primarias y en células leucémicas T.
4.- Estudio de la modulación por inhibidores de HDAC de la apoptosis mediada por
TRAIL en células T leucémicas.
71
III. MATERIALES Y MÉTODOS
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73
1.- Cultivos celulares
Las muestras de sangre utilizadas procedentes de donantes sanos fueron recogidas en
tubos con citrato. Las células mononucleares se obtuvieron por centrifugación en
gradiente de Ficoll- Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), eliminando los
monocitos del cultivo por adhesión a frascos de plástico durante 1 hora a 37 ºC. Los
linfocitos T de sangre periférica fueron aislados por selección negativa mediante un
sistema de unión indirecta a partículas magnéticas formado por un grupo de anticuerpos
frente a CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 y CD235a asociados a biotina
(Human Pan T Cells Isolation Kit II, Miltenyi Bistec, GmbH). La pureza de los
linfocitos T fue superior al 95% de células CD3 positivas tras el análisis por citometría
de flujo con un anticuerpo marcado de forma directa (OKT3-FITC).
Las células T en reposo se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Cambrex, Bio
Sciece, Bélgica) enriquecido con suero bovino fetal (GIBKO, California, USA) al 10%,
L-glutamina 1 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Cambrex)
(medio completo), y se mantuvieron en un incubador a 37 ºC y 5% de CO2.
La activación de linfocitos T se realizó mediante cultivo a la concentración de 2x106
células/ml en presencia de 5 μg/ml PHA (fitohemoglutinina-M, Roche, Indianápolis,
USA) y 1 μg/ml anti-CD28 durante 20 horas. Tras lavar con PBS, los linfocitos se
cultivaron en medio completo suplementado con 25 U/ml de IL-2 durante 5 días.
La separación de las subpoblaciones de linfocitos T activados se realizó por un
sistema de partículas magnéticas asociadas a un anticuerpo frente al CD8 (Human CD8
MicroBeads, Miltenyi Bistec, GmbH) según el protocolo desarrollado por el fabricante.
Las líneas de células T leucémicas Jurkat, CEM-6, MOLT-4 y HPB-ALL , así como
las líneas tumorales de cáncer de mama SKBr3 y BT474 y la de cáncer de cervix Hela,
se mantuvieron en medio completo RPMI 1640 y en un incubador de idénticas
características que los linfocitos T primarios.
Las muestras de sangre de pacientes con linfoma o con leucemia de células T fueron
proporcionadas por el Hospital Virgen de Las Nieves de Granada, y los linfocitos de
sangre periférica fueron obtenidos por centrifugación en gradiente de Ficoll- Histopaque
74
(Sigma-Aldrich) y resuspendidas en medio RPMI 1640 completo, para ser tratadas y
analizadas de forma inmediata.
2.- Reactivos y Anticuerpos
TRAIL humano recombinante, obtenido como se ha descrito previamente
(MacFarlane et al., 1997), fue donado amablemente por el Dr. Abelardo López Rivas
(CABIMER, Sevilla). PMA, ionomicina, PHA, doxorubicina, LY 294002, nocodazol,
ácido valproico (VPA), tricostatina A (TSA), butirato sódico (NaB), MS-275, BAY 11-
7085, sulfosalazina y anticuerpos anti-tubulina y anti-actina se obtuvieron de Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO). Vorinostat (SAHA), apicidina y bisindolilmaleimida (BIS) de
Calbiochem (La Jolla, CA). Velcade (bortezomib) de Janssen-Cilag SA (Madrid,
España). IFN-α de PeproTech EC Ltd. (London, UK). PD 98059 de New England
Biolabs (Beverly, MA). El inhibidor de caspasas Z-VAD de Bachem (Bubendorf,
Suiza). Partenolide, CAPE, anticuerpo monoclonal anti-cFLIP NF6 y anticuerpos frente
a los receptores de TRAIL y frente a TRAIL (2E5) humanos fueron de Alexis
Biochemicals (San Diego, CA). Anticuerpos monoclonales frente a CD28 y fretne a la
subunidad p50 de NF-κB fueron adquiridos de eBioscience (San Diego, CA);
anticuerpo monoclonal anti-caspasa-8 de Cell Diagnostica (Münster, Alemania);
anticuerpo monoclonal anti-FADD de Transducction Laboratorios (Lexington, KY);
anticuerpos monoclonales anti-PARP, anti-XIAP, anti-c-IAP2 y anti-Bax de BD
Biosciences (San Jose, CA). Anticuerpo monoclonal anti-p65 de Santa Cruz
Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anticuerpo monoclonal anti-caspasa-9 y los
inhibidores de caspasas Z-IETD-FMK y Z-LEHD-FMK de R&D Systems
(Minneapolis, MN). Anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2 de Dako (Glostrup, Denmark).
Anticuerpo policlonal de conejo anti-caspasa-3 de Stressgen (Ann Arbor, MI).
Anticuerpo policlonal de conejo anti-histona H4 acetilada de Upstate Biotechnology
(Lake Placid, NY). Anticuerpo monoclonal anti-Bid de Cell Signaling Technology
(Boston, USA). Anticuerpo monoclonal anti-citocromo C de ZYMED Laboratories
(filial de Invitrogen, Carlsbad, CA).
75
3.- Determinación de células apoptóticas
Las células apoptóticas hipodiploides fueron detectadas por citometría de flujo de
acuerdo con el protocolo publicado (Gong, 1994). De forma breve, las células se
lavaron con buffer salino (PBS), se resuspendieron en 100 μl del mismo y se fijaron
durante 5 minutos en 900 μl de una solución de etanol al 70 % frío. Después de lavar el
exceso de etanol, se resuspendieron en 250 μl de PBS, se añadió 250 μl de una solución
de extracción de ADN (0.2 M NaHPO4, 0.1 M ácido cítrico pH 7.8) y se incubaron 10
minutos a 37 ºC. Finalmente, para la tinción del ADN se incubaron en 200 μl de PBS
conteniendo ARNasa a 100 μg/ml y ioduro de propidio a 40 μg/ml, durante 30 minutos
a 37 ºC en oscuridad. El análisis del pico sub-G1 del ciclo celular se realizó midiendo la
fluorescencia del ADN en el detector FL2 o en FL3 del citómetro de flujo (FACScan,
Becton Dickinson) utilizando el programa Cell Quest (BD Biosciences).
Otro método empleado para la cuantificación de la muerte por apoptosis fue la
detección del fosfolípido fosfatidilserina en la cara externa de la membrana celular
mediante la proteína Anexina-V-FLUOS (Roche), que se une al fosfolípido en presencia
de Ca++. Las células se suspendieron en un tampón de incubación compuesto por Hepes
NaOH 10 mM pH 7.4, NaCl 140 mM y CaCl2 5 mM al que se añadió Anexina-V-
FLUOS a la concentración indicada por el fabricante durante 15 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad. La externalización de la fosfatidilserina se detectó en la región
de emisión correspondiente a FL1 del citómetro de flujo.
4.- Análisis por citofluorometría de TRAIL y sus receptores
Para la detección del ligando de muerte y sus receptores en superficie, las células
control y tratadas se lavaron y posteriormente resuspendieron en PBS, donde se
incubaron con el anticuerpo primario monoclonal correspondiente (5 μg/ml) a 4 ºC
durante 30 minutos. Tras lavar con PBS para eliminar los restos del anticuerpo primario
que no se hayan unido al receptor, las células se incubaron con un anticuerpo de cabra
frente a ratón, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Caltag laboratories,
Invitrogen) durante 30 minutos a 4º C. Tras esta segunda incubación, las células se
76
lavaron de nuevo, se resuspendieron en PBS y se analizaron en el detector FL1 del
citómetro FACScan.
5.- Análisis por citofluorometría del nivel de acetilación de histonas
Las pruebas para determinar los niveles de acetilación de histonas se llevaron a cabo
en células Jurkat y CEM-6 según el protocolo descrito por Ronzoni y colaboradores
(Ronzoni et al., 2005). Las células se incubaron a la concentración de 106 /ml durante 4
ó 24 horas con los distintos HDACi, se recogieron, se lavaron con PBS frío y se fijaron
en 500 μl de una solución al 1% de formaldehído en PBS durante 20 minutos a 4 ºC.
Tras la fijación, se lavaron con 1 ml de PBS conteniendo albúmina sérica (Sigma) al 1%
y se permeabilizaron por incubación en 100 μl de PBS con Tritón X-100 al 0.1%
durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron de nuevo con
BSA 1% en PBS, se realizó un bloqueo mediante incubación con 250 μl de suero de
cabra (Sigma) al 10% en PBS durante 30 minutos a 4º C, se centrifugaron y se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo policlonal de conejo
anti-H4-Ac a una concentración de 0.1 μg/ml en 100 μl de PBS-BSA 1%. El exceso de
anticuerpo primario se eliminó mediante lavado con PBS-BSA 1% y el marcaje con el
anticuerpo de cabra frente a conejo marcado con FITC se realizó por incubación con
dicho anticuerpo a una concentración de 1:500 en 100 μl de PBS-BSA 1% durante 1
hora a temperatura ambiente en oscuridad. Tras lavar las muestras con 1 ml de PBS-
BSA 1%, se resuspendieron en 200 μl de PBS y los niveles de acetilación de histonas se
analizaron en la región de emisión correspondiente a FL1 en un citómetro FACScan.
6.- Inmunodetección de proteínas por Western Blot
Las células control y tratadas fueron lavadas con PBS y lisadas en soluciones de
distinta composición en función de la localización de la proteína a detectar.
Para la detección de proteínas citosólicas, las células (2-5x106 según el tipo) se
incubaron durante 30 minutos en hielo con 100 μl de buffer de lisis (150 mM NaCl, 50
77
mM Tris-ClH y NP-40 al 1%). Los sobrenadantes citosólicos se separaron por
centrifugación durante 10 minutos a 13000g y se les añadió tampón de carga.
Para el análisis de proteínas localizadas en el núcleo, como PARP o la histona H4, se
lisaron las membranas celulares mediante congelación y descongelación de las células
resuspendidas en PBS, se añadió tampón de carga y se procedió a la sonicación de la
muestra para romper el ADN.
La separación de fracción membranosa y citosólica para detectar la liberación de
citocromo c de la mitocondria y la translocación de Bax en líneas celulares, se logró
lisando las células en frío durante 5 minutos con 50 μl de buffer compuesto por KCl 80
mM, sacarosa 250 mM, digitonina 500 μg/ml, PMSF 0.1 mM, DTT 1 mM e inhibidores
de proteasas, en PBS y centrifugando 5 minutos a 13000g. Las proteínas del
sobrenadante (fracción citosólica) y las del pellet (fracción membranosa) se mezclaron
con tampón de carga y estas últimas fueron sonicadas para romper el ADN.
Para la detección de factores de transcripción importados al núcleo se llevó a cabo el
lisado de 5x106 células en 300 μl de un buffer hipotónico (10 mM de HEPES pH 7.6,
KCl 10 mM, EDTA 0.1mM, EGTA 0.1mM, DTT 1mM, PMSF 0.5 mM, Na2MoO4
10mM e inhibidores de proteasas) en presencia de NP-40 al 0.6%. Los núcleos de esta
manera obtenidos se incubaron en 50 μl de un buffer de elevado contenido salino (20
mM HEPES pH 7.6, KCl 0.4 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.5
mM, Na2MoO4 10 mM e inhibidores de proteasas) durante 30 minutos en una
plataforma giratoria a 4 ºC. El lisado se centrifugó a 13000 g durante 10 minutos
separándose así las membranas de los extractos nucleares, solubles en el sobrenadante.
En todos los casos las proteínas se cuantificaron por el método Bradford (Sigma)
antes de añadir el tampón de carga, buffer Laemmli compuesto por Tris 2 M pH 6.8,
urea 6 M, B-mercaptoetanol 6%, azul de bromofenol 0.003% y SDS al 3%.
Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida (Bio-Rad) al 7.5%, 10% ó
12%, en función del tamaño de la proteína a detectar, en el sistema Mini Protean (Bio-
Rad) durante 80 minutos a 140 voltios. Una vez separadas las proteínas por tamaño se
transfirieron desde el gel a una membrana de PVDF (Millipore) por transferencia
semiseca empleando el sistema Trans-Blot SD (Bio-Rad) durante 50 minutos a 50 mA.
La membrana se bloqueó con una solución de PBS / 0.1% Tween 20 (PBSt) con 5%
de leche en polvo durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo que se lavó con PBSt
78
antes de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 ºC con el
anticuerpo frente a la proteína a detectar, diluido en PBSt con 1% de leche. Tras la
incubación, se lavó la membrana 5 minutos tres veces con PBSt y finalmente se incubó
durante otra hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (frente a Ig de
ratón o de conejo según el caso) marcado con peroxidasa de rábano (HRP), preparado
en solución de bloqueo. Tras otros tres lavados de 5 minutos con PBSt, la membrana se
reveló por quimioluminiscencia empleando el reactivo ECL (Amersham Biosciences),
quedando la señal recogida en placas fotográficas (AGFA).
7.- Retrotranscripción (RT) y PCR
Se extrajo ARN total empleando el reactivo Trizol (Invitrogen) y siguiendo el
protocolo recomendado. Brevemente, se resuspendieron las células controles y tratadas
en un volumen de 1 ml de Trizol por cada 5-10x106 células. Se añadió 200 μl de
cloroformo y tras mezclar ambas fases, se centrifugó a 12000 g durante 15 minutos a 4
ºC. Se recogió la fase acuosa y se mezcló con 500 μl de isopropanol, dejando incubar
durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar otros 10 minutos a
12000 g. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet de ARN con 1 ml de etanol al
75%. Tras centrifugar a 7500 g durante 5 minutos se eliminó el sobrenadante y se dejó
secar el pellet antes de resuspenderlo en 20 μl de H2O-DEPC.
Tras la cuantificación del ARN total, se partió de 3 μg del mismo para sintetizar
ADNc empleando la transcripta inversa M-MLV (Invitrogen) y oligo(dT) como cebador
en un volumen final de 20 μl. El proceso de retrotranscripción se llevó a cabo a 37 ºC
durante 50 minutos tras los cuales se inactivó por incubación a 70 ºC durante 15
minutos.
Las reacciones de PCR se realizaron con 0.1-2 μl de ADNc, en función del gen a
estudiar, en un volumen final de 50 μl empleado los siguientes pares de cebadores (el
tamaño del fragmento amplificado viene dado entre paréntesis) a una concentración
final de 0.2 μM:
TRAIL (443 pb) sentido 5’- GATCAAGACCATAGTGACCAA-3’ y antisentido 5’-
TGGCATGATCTCACCACAC-3’
79
Bid (588 pb) sentido 5’- ATGGACTGTGAGGTCAACAACGG –3’ y antisentido 5’-
CACGTAGGTGCGTAGGTTCTGGTT A –3’
TRAIL-R1 (506 pb), sentido 5’-CTGAGCAACGCAGACTCGCTGTCCAC-3’, y
antisentido 5’- TCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTGCCAT-3’
TRAIL-R2 (502 pb), sentido 5’- GCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCT-3’ y
antisentido 5’- CCAAATCTCAAAGTACGCACAAACGG-3’
TRAIL-R3 (612 pb), sentido 5'-GAAGAATTTGGTGCCAATGCCACTG-3' y
antisentido 5'-CTCTTGGACTTGGCTGGGAGATGTG-3'.
TRAIL-R4 (453 pb) sentido 5'-CTTTTCCGGCGGCGTTCATGTCCTTC-3' y
antisentido 5'-GTTTCTTCCAGGCTGCTTCCCTTTGTAG-3'
FLIPL (227 pb), sentido 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’, y antisentido 5’-
GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’
FLIPS (100 pb), sentido 5’-AATGTTCTCCAAGCAGCAATCC-3’, y antisentido 5’-
CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT-3’
Bcl-2 (367 pb), sentido 5’-AGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGAC-3’, y antisentido
5’-AGATAGGCACCAGGGTGAGCAAGCT-3’
Bcl-x (257 pb), sentido 5’- CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC-3’, y antisentido 5’-
CTGCGATCCGACTCACCAATAC-3’
Mcl-1 (211 pb), sentido 5’- CTTAGTTGATATTTTGGGCTTGGG-3’, y antisentido 5’-
AGAAGTCAAAAAGTAGTCACTGGG-3’
XIAP ( 487 pb), sentido 5’-GGCCATCTGAGACACATGCAG-3’, y antisentido 5’-
GCATTCACTAGATCTGCAACC-3’
c-IAP1 (171 pb), sentido 5’- CCAGTTCTTTTCTACACTATAAT-3’, y antisentido 5’-
CTTAATCTGTTTATTTACAAGGG-3’
c-IAP2 (150 pb), sentido 5’- CAACATGGAGATTCGAAATCC-3’, y antisentido 5’-
CACATCACTCTTCTGTGAAGGG-3’
β-actina (661 pb), sentido 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ y
antisentido 5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’
80
Las condiciones de los ciclos para las PCRs fueron los siguientes:
TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2 y TRAIL-R3: 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C, y 1 min a
72 °C.
TRAIL-R4, Bcl-2 y β-actina: 1 min a 95 °C, 1 min a 60 °C, y 1 min a 72 °C
FLIPS y FLIPL: 40 seg a 95 °C, 40 seg a 60 °C, y 40 seg a 72 °C.
Bcl-x, Mcl-1, XIAP, cIAP1 y cIAP2 : 1 min a 95 ºC, 1 min a 57 °C y 1 min a 72 °C.
El número de ciclos osciló entre los 30-35 en función del gen. Los productos de PCR
migraron en geles de agarosa (Ecogen) al 1% en tampón TAE y 0,5 μg/ml de bromuro
de etidio.
La reacción de PCR a tiempo real se llevó a cabo en el termociclador iCycler iQ
detection system (Bio-Rad) empleando los reactivos iQ SYBR Green Supermix (Bio-
Rad), de acuerdo con las instrucciones facilitadas por el fabricante: 12.5 μl de reactivo
Supermix 2x, 0.5 μM de cada uno de los cebadores y 1 μl de ADNc en un volumen final
de 25 μl. Cada reacción se llevó a cabo por triplicado. El agente intercalante SYBR
Green se une al ADN de doble cadena inmediatamente después de su síntesis y emite
fluorescencia tras su estimulación (absorción a 497 nm y emisión a 520 nm). La emisión
es recogida por el sistema detector del equipo en cada uno de los ciclos de PCR, siendo
la fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN formado. El ciclo de la PCR en que
se comienza a detectar el incremento de la señal de denomina ciclo umbral o Ct
(threshold cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN de
la muestra. Los valores de Ct de cada muestra se normalizaron con respecto a un gen de
referencia, en concreto el ARNr 18S. La cuantificación relativa de la expresión génica
se determinó usando el método comparativo descrito (Wang et al., 2002a) donde el
número de veces de inducción es igual a 2-ΔΔCt, siendo ΔΔCt la diferencia entre el ΔCt
de la muestra problema y el ΔCt de la muestra control (normalizados según la expresión
del gen ARNr 18S).
Para las reacciones de PCR a tiempo real se utilizaron los siguientes cebadores:
FLIPS (100 pb), sentido 5’-AATGTTCTCCAAGCAGCAATCC-3’, y antisentido 5’-
CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT-3’
FLIPL (102 pb), sentido 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’, y antisentido 5’-
GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’
81
Caspasa-3 (73 pb) forward 5’-TTGAATTGATGCGTGATGTT-3’ y reverse 5’-
TGGCTCAGAAGCACACAAAC-3’
Caspasa-9 (64 pb) forward 5’-GCTTCTCCTCGCTGCATTT-3’ y reverse 5’-
AGCACCATTTTCTTGGCAGT-3’
18s (98 pb) sentido 5’- GATATGCTCATGTGGTGTTG-3’ y antisentido 5’-
AATCTTCTTCAGTCGCTCCA-3’
En todos los casos se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR en las siguientes
condiciones: 30 seg a 95 °C, 30 seg a la Tª de hibridación y 45 seg a 72 °C. Las
temperaturas de hibridación fueron 60 ºC para FLIPs, 56 ºC para FLIPL y 63 ºC para
caspasa-3, caspasa-9.
8.- Microscopía de fluorescencia
La translocación al núcleo de la subunidad p65 del factor de transcripción NF-κB se
observó por microscopía de fluorescencia en linfocitos T activados procedentes de
donantes sanos. Para ello se esterilizaron cubreobjetos con etanol 70% y, una vez secos,
se dispusieron en placas de cultivo. Se añadió 2 ml de poli-L-lisina (Sigma) y se incubó
1 hora a 37 ºC. Una vez transcurrido este tiempo, se recogió el exceso de poli-L-lisina y
se lavó la placa con PBS. Se añadieron 5x106 células en 1 ml de medio completo y se
mantuvieron toda la noche para su adhesión al cubreobjetos. Tras el tratamiento en
presencia o en ausencia del inhibidor de NF-κB durante 1 hora, se retiró el medio y se
lavó la placa con PBS. Las células se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 10
minutos a temperatura ambiente, retirando el exceso mediante lavado con PBS-Tween
0.1%. El marcaje de la proteína p65 se realizó incubando con una solución del
anticuerpo monoclonal 1:100 en PBS-BSA 1% durante toda la noche a 4 ºC y
manteniendo la placa húmeda (envuelta en papel empapado en agua). Posteriormente se
lavó la placa con PBS-Tween 0.1% tres veces durante 5 minutos antes de añadir el
anticuerpo secundario marcado con FITC a una concentración de 1:1000 durante 1 hora
a temperatura ambiente. Por último, los núcleos se marcaron con diclorhidrato 4,6-
Diamino-2-fenil indol (DAPI, Sigma) a una concentración de 2 μg/ml incubando 10
minutos a temperatura ambiente en oscuridad. El exceso se retiró por lavado con PBS-
82
Tween 0.1%. Las células teñidas fueron analizadas en un microscopio de fluorescencia
Leica TCS NT (Leica Microsystems, Alemania).
9.- Obtención y clonaje en el vector reportero de luciferasa (pXP2) de los fragmentos
del promotor de TRAIL
Los distintos fragmentos del promotor del gen de TRAIL, amablemente cedidos por
el Dr. Abelardo López Rivas (CABIMER, Sevilla), se obtuvieron por PCR en base a la
secuencia del promotor del gen humano de TRAIL publicada con número de acceso
AF178756 del Genbank. Los cebadores utilizados, así como el protocolo seguido para
llevar a cabo el clonaje de dichos fragmentes en el vector reportero de luciferasa pXP2,
aparecen descritos en la tesis de la Dr. Carmen Ruiz de Almodóvar Egea (Granada,
2004).
10.-Transfecciones transitorias
Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células Jurkat empleando el
reactivo Lipofectamina (Invitrogen). Las distintas construcciones del promotor de
TRAIL incluidas en el vector pXP2 se mezclaron con Lipofectamina en una proporción
de 3 μl del reactivo por 0.5 μg de plásmido, diluidos ambos previamente en 50 μl de
medio OPTIMEM (GIBKO). Las diluciones del vector llevaban también 0.5 μg de un
plásmido de expresión de β-galactosidasa, que se cotransfecta para normalizar la
eficiencia de transfección. La mezcla de plásmidos y Lipofectamina se incubó durante
20 minutos a temperatura ambiente. Acto seguido, los 100 μl de OPTIMEM
conteniendo el plásmido asociado a Lipofectamina se añadieron a cada pocillo
conteniendo 5x105 células en 500 μl de medio RPMI y se llevó a cabo la incubación de
dichas células durante 24 horas a 37 ºC. Pasado este tiempo las células fueron tratadas o
no con los estímulos correspondientes durante 6 horas, se lisaron con 200 μl de tampón
de lisis suministrado en el kit de luciferasa (Luciferase Assay System, Promega) y se
midió la cantidad de proteínas de cada muestra mediante el método de Bradford.
Finalmente, la actividad luciferasa se midió en un luminómetro siguiendo el protocolo
83
indicado en dicho kit. La eficiencia de transfección se normalizó mediante la medida de
actividad β-galactosidasa. Para medir dicha actividad, se tomó la misma cantidad de
lisado total que se utilizó para medir actividad luciferasa, se mezcló con una solución de
fosfato sódico 0,1M con 0,88 mg de ONPG (Sigma) y 0,1 mM de MgCl2, y se incubó a
37 ºC hasta que la densidad óptica a 420 nm de la muestra se encontraba en el rango de
0.2 a 0.8. Se midió la densidad óptica y con el valor obtenido se normalizó la actividad
luciferasa previamente determinada.
De la misma manera se llevaron a cabo las transfecciones con el vector reportero de
NF-kB, pKBF-Luc cedido amablemente por el Dr. Juan Miguel Redondo (CNIC,
Madrid), así como la determinación de la actividad luciferasa en las células
transfectadas con el mismo.
84
85
IV. RESULTADOS
86
87
1.REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE TRAIL EN CÉLULAS T ACTIVADAS.
1.1 Activación del promotor de TRAIL en células T en respuesta al tratamiento
simultáneo con ionomicina y PMA
Con el objeto de estudiar la regulación de la expresión del ligando de muerte TRAIL
en linfocitos T en diferentes estados de activación, en primer lugar se analizó la
expresión de dicho ligando, a nivel de ARNm, en células T de sangre periférica en
reposo y a los 6 días de activación, como se describe en materiales y métodos. Los
resultados de la figura 1 demuestran que la expresión del ARNm de TRAIL en
linfocitos T activados es considerablemente superior a la observada en células T en
reposo.
Mediante el uso de programas informáticos, como TRANSFAC, se han identificado
en el promotor de TRAIL distintos sitios de unión a factores de transcripción, como
GATA, C/EBP, GAS, ISRE, NF-κB o NFAT. Como ya se ha mencionado en la
introducción, se ha descrito la implicación de NF-κB en la regulación de la expresión de
TRAIL en células T en respuesta a la estimulación con agentes que imitan la activación
del TCR, posiblemente por unión de este factor a dos secuencias consenso localizadas
entre las posiciones -384 a -375 (sitio κB2) y -256 a –265 pb (sitio κB1) del promotor
de TRAIL, con respecto al sitio de inicio de transcripción (Baetu et al., 2001). Sin
embargo, no se sabe nada acerca de la implicación de otros factores de transcripción
que, como NF-κB, se activan en respuesta a la estimulación de la célula T.
Para conocer mejor los factores que regulan la expresión de TRAIL en células T
activadas, utilizamos distintas construcciones del promotor de este ligando que habían
sido obtenidas previamente por la doctora Ruiz de Almodóvar (datos no publicados)
mediante clonaje de diferentes fragmentos de 1295, 787 y 165 pb en el vector pXP2 que
carece de promotor mínimo y que contiene el gen de luciferasa, tal como se describe en
el apartado de materiales y métodos (figura 2A).
Figura 1. Expresión del ARNm deTRAIL en células T activadas. Laexpresión del ARNm de TRAIL seanalizó mediante RT-PCR enlinfocitos T en reposo (R) y a los 6días de activación (A). Comocontrol de carga se muestra laexpresión de β-actina.
TRAIL
β-actina
R A
TRAIL
β-actina
R A
88
Figura 2. El tratamiento simultáneo con ionomicina y PMA induce la actividad transcripcional del promotorde TRAIL en células Jurkat. A) Esquema de los fragmentos de 165, 787 y 1295 pb del promotor de TRAIL quetras ser obtenidos por PCR fueron clonados en el vector pXP2 reportero de luciferasa. Se indican los sitios deunión a NF-κB descritos (κB1 y κB2) y los posibles sitios de unión a NFAT (el fragmento de 1295 pb presenta12 sitios para NFAT, el de 787 pb presenta 10 sitios y el de 165 pb 3 sitios) B) Células Jurkat se transfectaroncon la construcción p787Luc del promotor de TRAIL y la actividad luciferasa de la misma se analizó a las 6horas de tratamiento con PMA (100 nM) +/- ionomicina (1 μg/ml). C) La actividad luciferasa de losfragmentos p1295Luc, p787Luc y p165Luc y del vector vacio pXP2 se analizó en células Jurkat transfectadas ytratadas con PMA + ionomicina. Para normalizar la eficiencia de transfección se contransfectó en todos loscasos un vector de expresión de β-gal. Los resultados mostrados son representativos de al menos 3experimentos independientes.
A
Control PMA+Io PMA Io
2.7x
Act
ivid
ad lu
cife
rasa
(RLU
sx10
5 )
6
5
4
3
2
1
0
1.4x 1.5x
B
Control PMA+Io PMA Io
2.7x
Act
ivid
ad lu
cife
rasa
(RLU
sx10
5 )
6
5
4
3
2
1
0
1.4x 1.5x
B
- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2
2.5
2
1.5
1
0.5
0- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2Act
ividad
luc
ifer
asa
(RLU
sx10
6 )
- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2
C
4.2x
4x
4.2x
- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2
2.5
2
1.5
1
0.5
0- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2Act
ividad
luc
ifer
asa
(RLU
sx10
6 )
- + - + - + - + PMA+Io
p1295Lucp787Lucp165LucpXP2
C
4.2x
4x
4.2x
p1295Luc Luc
p787Luc
+1
Luc
p165Luc Luc
+1
+1
+1
+1
SP-1κB2 κB1
SP-1κB2 κB1
SP-1
p1295Luc Luc
p787Luc
+1
Luc
p165Luc Luc
+1
+1
+1
+1
SP-1κB2 κB1
SP-1κB2 κB1
SP-1
89
Se transfectaron transitoriamente células Jurkat con la construcción de 787 pb, que
contiene los dos sitios de unión a NF-kB mencionados así como posibles sitios de unión
al factor NFAT entre otros, y 24 horas después se activaron mediante tratamiento con
ionomicina y/o PMA durante 6 horas. La actividad transcripcional del fragmento del
promotor se cuantificó midiendo actividad luciferasa en lisados de las células
transfectadas. Como se observa en la figura 2B, dicho fragmento tiene actividad
transcripcional inducible en respuesta a la activación simultánea con ionomicina y el
éster de forbol, pero no con dichos agentes por separado, indicando la importancia de
los factores de transcripción regulados por ambos, NFAT y NF-kB respectivamente, en
la regulación del promotor de TRAIL.
A continuación se comparó la actividad transcripcional de los tres fragmentos, de
1295, 787 y 165 pb, basal y en respuesta al tratamiento con ionomicina y PMA. Como
control de la actividad luciferasa basal se analizó también la actividad del vector vacio
pXP2. Curiosamente, y a pesar de lo descrito en la literatura sobre la localización de los
sitios de unión a NF-κB, no se observaron diferencias ni en la actividad basal ni en la
inducible por el tratamiento con ionomicina y PMA entre los diferentes fragmentos
(figura 2C), lo que sugiere que el fragmento más pequeño de 165 pb contiene no solo
los elementos mínimos necesarios para controlar la expresión basal de este gen sino
posiblemente también los sitios consenso de unión y respuesta a los factores de
transcripción NFAT y NF-κB.
1.2 Regulación de la expresión y función de TRAIL por ciclosporina A en células T
activadas
La activación de la calcineurina, fosfatasa dependiente de Ca2+/calmodulina, es
necesaria para la activación del factor de transcripción NFAT tras la estimulación de la
célula T con agentes que imitan la activación del TCR. Para confirmar la implicación de
este factor de transcripción en la regulación de la expresión de TRAIL en células T en
respuesta a la activación utilizamos la droga inhibidora de calcineurina, ciclosporina A
(Cs A) (Handschumacher et al., 1984). El tratamiento de células T activadas con
ciclosporina A durante 8 horas produjo una disminución en los niveles de ARNm de
TRAIL (figura 3A).
90
C
B
Figura 3. El tratamiento con ciclosporina A reduce la expresión de TRAIL y la actividad citotóxica decélulas T activadas. A) Células T activadas fueron incubadas durante 8 horas en presencia o en ausenciade 500ng/ml CsA y los niveles de ARNm de TRAIL se determinaron mediante RT-PCR. Como control decarga se analizó la expresión de β-actina. B) Células Hela, SKBr3 y BT474 se co-cultivaron durante 24horas con o sin células T activadas a las proporciones indicadas (célula tumoral:célula T) y se analizó elporcentaje de células tumorales en el pico sub-G1 del ciclo celular. C) Células T en reposo y activadas,pretratadas durante 24 horas con o sin 500ng/ml CsA, se co-incubaron con células Hela en unaproporción 1:5 (Hela: células T). Tras 24 horas de co-cultivo se determinó el porcentaje de células Helaen apoptosis. Como control positivo de inducción de apoptosis, las células tumorales en B) y C) se trataroncon TRAIL (250ng/ml). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
A
0
20
40
60
80
100
HeLaBT474SKBr3
Control TRAIL 1:2 1:5
% C
élulas
apo
ptót
icas
+ T activadas
0
20
40
60
80
100
HeLaBT474SKBr3
Control TRAIL 1:2 1:5
% C
élulas
apo
ptót
icas
+ T activadas
Control TRAIL 1:2 1:5
% C
élulas
apo
ptót
icas
+ T activadas
Control CsA
TRAIL
β-actina
Control CsA
TRAIL
β-actina
% C
élul
as a
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
C TRAIL - + - + CsA
+T reposo +T activadas
% C
élul
as a
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
C TRAIL - + - + CsA
+T reposo +T activadas
91
La expresión de TRAIL en linfocitos T activados puede facilitar o potenciar la
acción citotóxica de los mismos sobre células tumorales. Con objeto de conocer la
posible actividad citotóxica de nuestro modelo de células T activadas, realizamos co-
cultivos de dichas células T con diferentes tipos de células tumorales sensibles y
resistentes a TRAIL, a diferentes proporciones, y analizamos la inducción de apoptosis
en las células tumorales. Los resultados de la figura 3B indican que la inducción de
apoptosis en células Hela, sensibles a TRAIL, tras su co-cultivo con células T activadas
en una proporción 1:5 (Hela: células T) es similar a la observada en respuesta al
tratamiento con TRAIL recombinante. Sin embargo, las células T activadas no fueron
capaces de inducir apoptosis en dos líneas de cáncer de mama, SKBr3 y BT474,
resistentes a TRAIL. Sólo se observó un débil efecto en células SKBr3, similar con las
dos proporciones de célula diana: célula efectora y comparable al efecto detectado en
Hela a la proporción 1:2, por lo que pensamos que podría tratarse de un efecto tóxico
inespecífico derivado de la co-incubación. El pretratamiento de los linfocitos T
activados con ciclosporina A redujo parcialmente su capacidad de inducción de
apoptosis en células Hela (figura 3C) sugiriendo la importancia de NFAT en la
expresión del ligando de muerte TRAIL funcional en dichos linfocitos activados.
Observamos además que, a diferencia de ellos, los linfocitos T en reposo no eran
capaces de inducir apoptosis en células Hela (figura 3C).
2. MECANISMOS QUE REGULAN LA RESISTENCIA A TRAIL EN
LINFOCITOS T PRIMARIOS HUMANOS
2.1 Resistencia de linfocitos T primarios en reposo y activados a la inducción de
apoptosis por TRAIL
Diversos grupos han descrito la resistencia a la apoptosis mediada por TRAIL en
células normales y en diferentes subpoblaciones de células sanguíneas (Hasegawa et al.,
2004; Mirandola et al., 2004). Para una mejor caracterización de los efectos de TRAIL
sobre células T primarias, analizamos la inducción de apoptosis en linfocitos T
activados y en reposo, procedentes de 10 donantes sanos diferentes, en respuesta al
tratamiento con una dosis elevada de TRAIL recombinante (250 ng/ml). En todos
loscasos las células primarias demostraron ser resistentes a la apoptosis mediada por
92
TRAIL (figura 4A). Para asegurarnos de la resistencia de este tipo celular repetimos los
experimentos con tratamientos prolongados durante 48 horas y empleando dosis aún
más elevadas del ligando de muerte (500 ng/ml), obteniéndose idénticos resultados
(datos no mostrados). Como control positivo en todos estos experimentos se utilizaron
células T leucémicas Jurkat que son sensibles a TRAIL.
Estudiamos también la activación de la caspasa-8 apical, como primer
acontecimiento bioquímico que tiene lugar tras la unión de TRAIL a sus receptores en la
superficie celular, mediante el análisis del procesamiento de las dos isoformas de
procaspasa-8 (a y b) en los fragmentos proteolíticos intermedios de 43-41 kDa. Como se
observa en la figura 4B, encontramos un bloqueo de la ruta de inducción de apoptosis
por TRAIL a este nivel tan temprano, tanto en células T primarias en reposo.
Figura 4. Los linfocitos T en reposo y activados son resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL. A)Linfocitos T en reposo o activados, procedentes de 10 donantes sanos, se trataron durante 24 horas con250 ng/ml TRAIL. El porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1por citometría de flujo. B) La activación de caspasa-8 se analizó mediante Western Blot en linfocitos T enreposo y activados tras 15 horas de tratamiento con 250 ng/ml TRAIL. En ambos casos, como controlpositivo de células sensibles a la inducción de apoptosis se utilizaron células Jurkat tratadas con TRAIL(100 ng/ml).
0
20
40
60
80
100
0 2
REPOSO-CONTROL
REPOSO-TRAIL
ACTIVADOS-CONTROL
ACTIVADOS-TRAIL
JURKAT-CONTROL
JURKAT-TRAIL
% C
élul
as a
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0Reposo Activados Jurkat
A
Caspasa-8
41-43 kDa
- + - + - + TRAIL
Reposo Activados JurkatB
0
20
40
60
80
100
0 2
REPOSO-CONTROL
REPOSO-TRAIL
ACTIVADOS-CONTROL
ACTIVADOS-TRAIL
JURKAT-CONTROL
JURKAT-TRAIL
% C
élul
as a
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0Reposo Activados Jurkat
A
Caspasa-8
41-43 kDa
- + - + - + TRAIL
Reposo Activados JurkatB
93
2.2 Expresión de proteínas involucradas en la ruta de señalización de TRAIL en
linfocitos T en reposo y activados
Puesto que la apoptosis mediada por TRAIL requiere en primer lugar de la unión del
ligando a sus receptores de muerte TRAIL-R1 y -R2, y dado que se ha descrito la
implicación de los receptores señuelo TRAIL-R3 y –R4 en la resistencia de células
normales a TRAIL, analizamos el patrón de expresión de los receptores de TRAIL en la
membrana de linfocitos T en reposo y activados. Así, observamos que los niveles de
TRAIL-R3 y -R1 eran prácticamente nulos y los de TRAIL-R2 muy bajos en todas las
muestras de linfocitos analizadas, tanto en reposo como activados, encontrando
mínimas diferencias entre donantes.
Por el contrario, en el caso de TRAIL-R4 observamos una alta expresión y,
curiosamente, detectamos dos subpoblaciones celulares caracterizadas por la diferente
intensidad de fluorescencia de los picos mostrados en el análisis por citometría de flujo
(figura 5). El pico de alta intensidad de fluorescencia parece corresponderse con la
subpoblación CD8+ (Hasegawa et al., 2004, Mirandola, 2004 #252) mientras el pico de
baja intensidad de fluorescencia, que presenta una cierta variabilidad entre donantes en
Figura 5. Expresión de los receptores de TRAIL en células T en reposo y activadas. La expresión de losreceptores de TRAIL en membrana se determinó por citometría de flujo en células T en reposo yactivadas utilizando los anticuerpos apropiados (picos sombreados). La línea sólida corresponde a lafluorescencia basal del anticuerpo secundario. Los resultados mostrados son representativos de al menos3 donantes diferentes.
TRAIL-R1 TRAIL-R2 TRAIL-R3 TRAIL-R4
Reposo
Activadas
Intensidad de FluorescenciaIntensidad de Fluorescencia
ATRAIL-R1 TRAIL-R2 TRAIL-R3 TRAIL-R4
Reposo
Activadas
Intensidad de FluorescenciaIntensidad de Fluorescencia
A
94
cuanto a intensidad se refiere, corresponde a la expresión de TRAIL-R4 en las células
CD4+. Encontramos además un cierto incremento en la intensidad de fluorescencia de
las dos subpoblaciones celulares en linfocitos T activados con respecto a los linfocitos
en reposo, así como un aumento del porcentaje de células con mayor expresión de
TRAIL-R4 (figura 5), posiblemente debido al incremento en la relación CD8+/CD4+
que conlleva la activación linfocitaria.
Analizamos a continuación los niveles de expresión de otras proteínas que, junto con
los receptores de muerte, están implicadas en la formación del DISC y por tanto en la
activación de la caspasa-8. Como se observa en la figura 6, tanto las células T activadas
como en reposo expresaban la proteína adaptadora FADD siendo los niveles de esta
proteína similares a los de células Jurkat sensibles a TRAIL. Sin embargo, en el caso de
la proteína inhibidora c-FLIP encontramos que los niveles de la isoforma larga (c-
FLIPL) eran mucho mayores en células T primarias, en reposo y activadas, que en
células Jurkat. También los niveles de la isoforma corta (c-FLIPS), aunque bajos en
células T primarias, eran superiores a los encontrados en esta línea de células T
sensibles a TRAIL (figura 6). Estos datos sobre la expresión de FLIP, junto con los
obtenidos tras el análisis de expresión de los receptores de TRAIL en membrana,
pueden explicar la resistencia de células T primarias a la apoptosis mediada por este
ligando de muerte.
Con excepción de TRAIL-R4, en los factores hasta aquí analizados no encontramos
diferencias significativas entre los niveles de expresión entre células T en reposo y
activadas, a pesar de que varios autores han propuesto una mayor sensibilidad a la
muerte por apoptosis en células T activadas (Green et al., 2003; Krammer et al., 2007).
Analizamos también la expresión de algunos miembros de la familia de Bcl-2,
implicados en la ruta mitocondrial de señalización de TRAIL, en células T en los
Figura 6. Expresión de proteínasimplicadas en la formación delDISC en linfocitos T en reposo yactivados. Los niveles de FADD,FLIPL y FLIPs se analizaron encélulas T en reposo y activadas y encélulas Jurkat mediante Western-blot.Como control de carga se analizó laexpresión de α-tubulina. Losresultados mostrados sonrepresentativos de al menos 3donantes diferentes.
FADD
FLIPL
FLIPS
α-Tubulina
Jurkat Reposo Activados
FADD
FLIPL
FLIPS
α-Tubulina
Jurkat Reposo Activados
95
diferentes estadios de activación y observamos que los niveles de la propia proteína
anti-apoptótica Bcl-2 eran similares en células en reposo y activadas, mientras que otras
proteínas pro-apoptóticas pertenecientes a la misma familia variaban su expresión con la
activación (figura 7A).
En concreto, encontramos una reducción reproducible y muy significativa en la
expresión de Bid en células T activadas, y un cierto incremento en el contenido
intracelular de Bax en las células T activadas respecto al estado de reposo en la mayoría
de los casos analizados. En cuanto a los niveles de la proteína inhibidora de apoptosis
XIAP, no encontramos diferencias en la expresión en respuesta a la activación.
Curiosamente, cuando analizamos los niveles de expresión del ARNm de Bid mediante
PCR semi-cuantitativa observamos que eran similares en células T en reposo y
activadas, lo que sugiere la existencia de mecanismos post-transduccionales
responsables de la regulación de esta proteína en ambos tipos de células T (figura 7B).
Figura 7. Expresión de factores intracelulares implicados en la ruta de señalización de TRAIL enlinfocitos T en reposo y activados. A) La expresión de Bax, Bid, Bcl-2 y XIAP se determinó por WesternBlot en células T en reposo y activadas. Como control de carga se analizó la expresión de α-tubulina.Los resultados mostrados son representativos de al menos tres donantes diferentes. B) Los niveles deARNm de Bid se determinaron en células T en reposo y activadas mediante PCR semi-cuantitativa,utilizando diferentes cantidades de ADNc (2, 1 y 0,5 μl). Como control de cantidad de ARNm se muestrala expresión de β-actina.
Bax
Bid
Bcl-2
XIAP
α-Tubulina
Reposo ActivadasA
Reposo Activadas
Bid
β-actina
B
Bax
Bid
Bcl-2
XIAP
α-Tubulina
Reposo ActivadasA
Reposo Activadas
Bid
β-actina
B
96
2.3 Efecto de diferentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en la resistencia de
linfocitos T primarios humanos
Se han descrito numerosos modelos de células tumorales resistentes a TRAIL en los
cuales dicha resistencia es debida, entre otras causas, a la baja expresión de receptores
pro-apoptóticos y a los elevados niveles de proteínas anti-apoptóticas intracelulares. Sin
embargo, la mayoría de estos tumores pueden sensibilizarse a TRAIL mediante el
empleo de diferentes estrategias terapéuticas como son las drogas quimioterapéuticas,
inhibidores de histona deacetilasa, inhibidores del proteasoma o inhibidores de rutas de
supervivencia (Inoue et al., 2004; Kandasamy and Srivastava, 2002; Sayers and
Murphy, 2006; Shankar and Srivastava, 2004; Singh et al., 2003). Decidimos estudiar el
efecto de algunos agentes, pertenecientes a los mencionados grupos farmacológicos,
sobre la resistencia de células T primarias a la apoptosis mediada por TRAIL.
Concretamente, analizamos el efecto del agente genotóxico doxorubicina, del inhibidor
de la polimerización de los microtúbulos de actina nocodazol, del inhibidor de la PKC
bisindolilmaleimida (BIS), del inhibidor de PI3K LY294002, del inhibidor de histona
deacetilasa ácido valproico (VPA) y del inhibidor del proteasoma velcade (bortezomib),
utilizando concentraciones de dichos agentes establecidas en base a publicaciones
previas y a su capacidad para sensibilizar a las líneas tumorales CEM-6, línea de células
leucémicas T que presentan una moderada sensibilidad a TRAIL, y SKBr3, línea de
células de cáncer de mama muy resistentes a este ligando de muerte.
En la figura 8 se observa cómo doxorubicina, LY294002 y VPA eran capaces de
potenciar la acción de TRAIL en células CEM-6 mientras que nocodazol y bortezomib
sensibilizaban claramente a las células SKBr3, a las concentraciones establecidas. Sin
embargo en ninguno de los casos encontramos sensibilización de linfocitos T primarios,
ni en reposo ni activados, a la apoptosis mediada por TRAIL. Es importante señalar que
tanto doxorubicina, como nocodazol, y en especial bortezomib presentaron una alta
toxicidad para los linfocitos T primarios activados. También el inhibidor de PKC, BIS,
presentó cierto efecto sobre estas células. Y el bortezomib resultó ser además
ligeramente tóxico para los linfocitos T en reposo (figura 8A, D, E, F). Por el contrario,
los inhibidores LY294002 y VPA mostraron una ausencia total de toxicidad para los
linfocitos T primarios, tanto en reposo como activados, lo que sugiere su posible
utilización como agentes antitumorales en combinación con TRAIL.
97
A
0
20
40
60
80
100
1 2 3Reposo Activados CEM
ControlTRAILDXRDXR + TRAIL
100
80
60
40
20
0
% C
élul
as A
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
1 2 3
100
80
60
40
20
0
ControlTRAILLYLY + TRAIL *
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados CEM
A
B
A
0
20
40
60
80
100
1 2 3Reposo Activados CEM
ControlTRAILDXRDXR + TRAIL
ControlTRAILDXRDXR + TRAIL
100
80
60
40
20
0
% C
élul
as A
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
1 2 3
100
80
60
40
20
0
ControlTRAILLYLY + TRAIL
ControlTRAILLYLY + TRAIL *
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados CEM
A
B
0
20
40
60
80
100
1 2 3
100
80
60
40
20
0
CControlTRAILVPAVPA + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
% C
élul
as A
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0
ControlTRAILVPAVPA + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
ControlTRAILNZNZ + TRAIL
100
80
60
40
20
0
***
Reposo Activados SKBr3
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados CEM
C
D
0
20
40
60
80
100
1 2 3
100
80
60
40
20
0
CControlTRAILVPAVPA + TRAIL
ControlTRAILVPAVPA + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
% C
élul
as A
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0
ControlTRAILVPAVPA + TRAIL
ControlTRAILVPAVPA + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
ControlTRAILNZNZ + TRAIL
ControlTRAILNZNZ + TRAIL
100
80
60
40
20
0
***
Reposo Activados SKBr3
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados CEM
C
D
98
2.4 La inhibición de NF-κB sensibiliza a linfocitos T activados a la apoptosis mediada
por TRAIL
Junto a los agentes descritos en el apartado anterior analizamos también el efecto del
inhibidor de NF-κB, BAY 11-7085, sobre linfocitos T primarios y su resistencia a
TRAIL. En el caso de las células T en reposo, encontramos una gran variabilidad en la
respuesta a este inhibidor entre los diferentes donantes estudiados (figura 9A). En 9 de
las 10 muestras analizadas el inhibidor del factor de transcripción por sí solo presentaba
efectos citotóxicos de intensidad variable en función del donante. En cuanto al efecto
regulador de la apoptosis mediada por TRAIL, si bien en 4 de los 10 casos se apreciaba
una sensibilización significativa de los linfocitos T en reposo a este ligando de muerte,
Figura 8. Resistencia de linfocitos T primarios a TRAIL tras el tratamiento con distintos agentessensibilizadores. Linfocitos T en reposo y activados fueron preincubados con (A) doxorubicina (DXR,100 ng/ml ), (B) LY 294002 (10 μM), (E) bortezomib (BZ, 50 nM ) o (F) BIS (6 μM) durante 1 h; o con(C) VPA (1 mM ) o (D) nocodazol (NZ, 400 ng/ml) durante 7h. Tras la preincubación, las células fuerontratadas con 250 ng/ml de TRAIL durante 24 h. Células CEM (A-C) y SKBr3 (D, E) fueron preincubadasen las mismas condiciones antes de ser tratadas con 50 ng/ml o 250 ng/ml de TRAIL, respectivamente,durante 20 horas. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1mediante citometría de flujo. Las barras de error muestran la SD de tres experimentos independientes.La significación estadística se corresponde con *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001, según el test deStudent.
0
20
40
60
80
100
1 2 3Reposo Activados SKBr3
100
80
60
40
20
0
EControlTRAILBZBZ + TRAIL **
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
% C
élul
as A
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0
F
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados
ControlTRAILBIS-IBIS-I + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3Reposo Activados SKBr3
100
80
60
40
20
0
EControlTRAILBZBZ + TRAIL
ControlTRAILBZBZ + TRAIL **
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
% C
élul
as A
popt
ótic
as
100
80
60
40
20
0
F
% C
élul
as A
popt
ótic
as
Reposo Activados
ControlTRAILBIS-IBIS-I + TRAIL
ControlTRAILBIS-IBIS-I + TRAIL
99
en otros 5 casos el porcentaje de células apoptóticas era inferior en respuesta al
tratamiento combinado con BAY 11-7085 y TRAIL que tras el tratamiento solo con el
inhibidor. Como se observa en la figura 9B, el inhibidor de NF-κB también presentó
una toxicidad variable, en función del donante, para los linfocitos T activados. Sin
embargo, en este caso encontramos una sensibilización significativa en todas las
muestras analizadas, con excepción de una de ellas en el que el inhibidor solo provocó
un efecto tóxico muy elevado (93% de células en apoptosis).
Se llevó a cabo un estudio de dosis-respuesta con el inhibidor BAY 11-7085,
tratando de encontrar la dosis que con menor efecto tóxico indujera sensibilización a
TRAIL en células T activadas. Concentraciones inferiores a 2.5 μM, aunque
Figura 9. Sensibilización de linfocitos T primarios a TRAIL por inhibición de NF-κB. Linfocitos Ten reposo (A) o activados (B) de 10 donantes diferentes fueron preincubados durante 1 hora con BAY11-7085 (2.5 μM) y a continuación tratados con TRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. El porcentaje decélulas apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1 del ciclo celular.
% C
élul
as a
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
100
80
60
40
20
0
A
% C
élul
as a
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
100
80
60
40
20
0
A
0
20
40
60
80
100
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
100
80
60
40
20
0
B
% C
élul
as a
popt
ótic
as
0
20
40
60
80
100
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
100
80
60
40
20
0
B
% C
élul
as a
popt
ótic
as
A
B
100
presentaban baja toxicidad, no sensibilizaban a TRAIL de forma estadísticamente
significativa por lo que dicha dosis se estableció como la óptima para continuar el
estudio del efecto de este inhibidor en linfocitos T activados (figura 10). Estos
resultados coinciden con los publicados por otros autores en los que se utilizan dosis
similares del inhibidor de NF-κB para inducir la sensibilización a TRAIL de distintas
líneas de células tumorales (Huerta-Yepez et al., 2004).
Simultáneamente al estudio de sensibilización a TRAIL en linfocitos T
comprobamos que el inhibidor BAY 11-7085 efectivamente bloqueaba la activación de
NF-κB. Se ha descrito que este compuesto actúa inhibiendo a la quinasa IKK y así la
fosforilación de IκB, necesaria para la activación y translocación al núcleo de NF-κB
(Bremner and Heinrich, 2002). Analizamos por microscopía de fluorescencia la
localización nuclear de la subunidad p65 de NF-κB en linfocitos T tratados o no con
BAY 11-7085 (figura 11A). Aún presentando estas células una morfología esférica
constituida por núcleo en su práctica totalidad, el bloqueo de la entrada de la subunidad
p65 es claro en células tratadas, donde la mayor parte de dicha subunidad se localiza en
las regiones perinucleares. Analizamos también la capacidad de BAY 11-7085 para
inhibir la función de NF-κB como factor de transcripción. Para ello, se transfectaron
células Jurkat con el vector pKBF-Luc, que contiene tres copias de la secuencia de
unión a NF-κB del promotor de H-2Kb placed upstream of a herpes simplex virus
thymidine kinase minimal promoter driving the luciferase reporter gene, y se trataron
con ionomicina y PMA para inducir la activación de NF-κB. Como se muestra en la
Figura 10. Efecto de distintas dosis deBAY 11-7085 en la sensibilización delinfocitos T activados a TRAIL.Linfocitos T activados de distintosdonantes sanos fueron preincubadoscon distintas dosis de BAY 11-7085durante 1 hora antes del tratamientocon TRAIL (250 ng/ml) durante 24horas. El porcentaje de célulasapoptóticas se determinó por citometríade flujo. Las barras de error muestranla SD de tres experimentosindependientes. Significación estadística**p < 0.01, según el test de Student.
**CONTROLTRAIL-250
100
80
60
40
20
0
**
Control 1 2,5
% C
élul
as A
popt
ótic
as
BAY 11-7085 (μM)
**CONTROLTRAIL-250
100
80
60
40
20
0
**
Control 1 2,5
% C
élul
as A
popt
ótic
as
BAY 11-7085 (μM)
101
figura 11B, el pretratamiento con distintas concentraciones de BAY 11-7085 provocó
una inhibición, casi completa en el caso de la dosis más alta, de la actividad luciferasa
inducida en respuesta a la activación con ionomicina y PMA.
Figura 11. BAY 11-7085 inhibe la activación de NF-κB. A) LinfocitosT activados de donantes sanos seincubaron 1 hora con o sin BAY 11-7085 (2.5 μM) para determinar, mediante microscopía defluorescencia, la localización de la subunidad p65 del factor de transcripción NF-κB (fluorescenciaverde). La localización nuclear se estableció por tinción con DAPI (azul). B) Se transfectaron célulasJuktar con el vector NFκB-Luc. A las 24 horas se preincubaron con diferentes dosis de BAY 11-7085 (1 y2.5 μM) durante 1 hora y a continuación se trataron con PMA (100 nM) + Ionomicina (1μg/ml) durante4 horas para finalmente analizar la actividad luciferasa. Los datos mostrados son representativos de tresexperimentos independientes.
CONTROL + BAY (1H.)CONTROL + BAY (1H.)
0
400000
800000
1200000
1600000
2000000
2400000Control
PIo
Pio+BAY-1
Pio+BAY2,5
Act
ividad
Luc
ifer
asa
(RLU
s)
ControlPMA+IoPMA+Io+BAY-1mMPMA+Io+BAY-2,5mM
0
400000
800000
1200000
1600000
2000000
2400000Control
PIo
Pio+BAY-1
Pio+BAY2,5
Act
ividad
Luc
ifer
asa
(RLU
s)
ControlPMA+IoPMA+Io+BAY-1mMPMA+Io+BAY-2,5mM
A
B
102
Una vez analizada la capacidad de BAY 11-7085 para inhibir la activación de NF-
κB, se examinaron los efectos de otros inhibidores de este factor de transcripción para
confirmar la implicación del mismo en el mecanismo de sensibilización de linfocitos T
a TRAIL. En concreto, utilizamos sulfosalazina, partenolide y el éster feniletílico del
ácido caféico (CAPE). Mientras que la sulfosalazina permitió la sensibilización de los
linfocitos T activados a TRAIL, los otros dos agentes, aún habiéndose descrito también
como inhibidores específicos de NF-κB (Bork et al., 1997; Natarajan et al., 1996; Wahl
et al., 1998), presentaron un efecto muy débil (partenolide) o ningún efecto (CAPE)
sobre la resistencia a TRAIL (figura 12A). Para comprobar que las concentraciones de
los agentes empleados en el estudio inhibían la activación de NF-κB estudiamos la
presencia de las subunidades p65 y p50 en el núcleo de células T activadas y tratadas
con los inhibidores, esta vez mediante Western-blot. Así observamos que, tanto BAY
11-7085 como sulfosalazina y parthenolide reducían significativamente los niveles de
expresión de ambas subunidades en el núcleo, en comparación con los niveles en células
control no tratadas. Sin embargo no encontramos ningún efecto del CAPE sobre la
expresión de NF-κB en el núcleo lo que explicaría la ausencia de sensibilización a
TRAIL en respuesta al tratamiento con dicho agente (figura 12B).
Figura 12. Efecto de diferentes inhibidores de NF-κB sobre la resistencia de linfocitos T activados aTRAIL. (A) Células T activadas fueron preincubadas 1 hora con 1.5 mM de sulfosalazina (SS), 2.5 μMde partenolinde (PT) o 50 μg/ml de CAPE antes de ser tratadas 24 horas con TRAIL (250 ng/ml). Elporcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis del pico sub-G1 por citometría de flujo.Las barras de error muestran la SD de tres experimentos independientes.* p<0.05 según el test T deStudent. (B) La expresión de las subunidades de NF-κB p50 y p65 se determinó por Western Blot en losextractos nucleares procedentes de células T activadas y tratadas durante 4 horas con los inhibidoresindicados en (A), o con BAY 11-7085 (2.5 μM). Como control de carga se utilizó la proteína nuclearPARP.
Control SS PT CAPE
*
CONTROLTRAIL
p65
p50
PARP
C BAY SS PT CAPE
100
80
60
40
20
0
% C
élul
as a
popt
ótic
as
*
A B
Control SS PT CAPE
*
CONTROLTRAILCONTROLTRAIL
p65
p50
PARP
C BAY SS PT CAPE
p65
p50
PARP
C BAY SS PT CAPE
100
80
60
40
20
0
% C
élul
as a
popt
ótic
as
*
A B
103
Por otro lado, comprobamos que la inducción de apoptosis por TRAIL en células T
sensibilizadas por inhibición de NF-κB era un proceso dependiente de la activación de
caspasas. Se preincubaron células T activadas con el inhibidor general de caspasas Z-
VAD antes del tratamiento con BAY 11-7085 y TRAIL, y así observamos una
inhibición no solo del efecto sensibilizador del BAY 11-7085 sino también de su efecto
citotóxico (figura 13A). De la misma manera se encontró un bloqueo de los efectos del
inhibidor de NF-κB en células T en reposo (figura 13B). Solamente en aquellos casos
en que la toxicidad del BAY 11-7085 era extrema, el pretratamiento con ZVAD no
logró inhibir este efecto lo que sugiere que el inhibidor de NF-κB, por si solo, es capaz
de activar vías de señalización de muerte celular dependientes e independientes de
caspasas en linfocitos T (datos no mostrados). Observamos también la activación de
caspasa-8 en respuesta a TRAIL en células T activadas preincubadas con BAY 11-7085,
lo que confirma la activación de la ruta de señalización de TRAIL desde su extremo
más apical en linfocitos T sensibilizados por el inhibidor de NF-κB (figura 13C).
Figura 13. TRAIL induce la activación de caspasas en linfocitos T primarios sensibilizados porinhibición de NF-κB. Linfocitos T activados (A) o en reposo (B) fueron preincubados en presencia o enausencia de Z-VAD (50 μM) y/o BAY 11-7085 (2.5μM) durante 1 hora y a continuación tratados con o sinTRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría deflujo. C) La activación de caspasa-8 se analizó mediante Western Blot en linfocitos T activados tratadoscon TRAIL (250 ng/ml) durante 20 horas tras pretratamiento de 1 hora con BAY 11-7085 (2.5μM). Comocontrol de carga se analizó la expresión de α-tubulina. Los datos mostrados son resultadosrepresentativos de tres experimentos independientes con diferentes donantes.
% C
élul
as A
popt
ótic
as
-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
-
Z-VAD
100
80
60
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0
-
Z-VAD
0
20
40
60
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1 2 3 4
-
Z-VAD
100
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40
20
0
-
Z-VAD
0
20
40
60
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100
1 2 3 4
100
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60
40
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0
-
Z-VAD-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
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60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
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40
20
0
-
Z-VAD-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
-
Z-VAD-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
-
Z-VAD
100
80
60
40
20
0
A B
-
Z-VAD
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
100
80
60
40
20
0
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
% C
élul
as A
popt
ótic
as
-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
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Z-VAD
100
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-
Z-VAD
0
20
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1 2 3 4
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Z-VAD
100
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0
-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
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-
Z-VAD-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
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-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
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1 2 3 4
-
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100
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0
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Z-VAD
-
Z-VAD
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Z-VAD-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
-
Z-VAD
-
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0
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1 2 3 4
100
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100
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Z-VAD-
Z-VAD
0
20
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1 2 3 4
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Z-VAD-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
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Z-VAD
-
Z-VAD
-
Z-VAD-
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-
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1 2 3 4
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Z-VAD-
Z-VAD
-
Z-VAD
0
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1 2 3 4
-
Z-VAD
100
80
60
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20
0
A B
-
Z-VAD
-
Z-VAD
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL0
20
40
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80
100
1 2 3 40
20
40
60
80
100
1 2 3 4
-
Z-VAD
-
Z-VAD
0
20
40
60
80
100
1 2 3 40
20
40
60
80
100
1 2 3 4
100
80
60
40
20
0
Control TRAIL BAY BAY+TRAIL
Caspasa-8
41-43 kDa
- + - + TRAIL- - + + BAY 11-7085
α-Tubulina
C
Caspasa-8
41-43 kDa
- + - + TRAIL- - + + BAY 11-7085
Caspasa-8
41-43 kDa
- + - + TRAIL- - + + BAY 11-7085
α-Tubulina
C
A B
C
104
2.5 BAY 11-7085 regula la expresión de receptores de TRAIL y de genes anti-
apoptóticos en linfocitos T activados
El papel regulador del factor de transcripción NF-κB sobre la expresión de
receptores y proteínas de la ruta de señalización de TRAIL se encuentra ampliamente
descrito (Bernard et al., 2001; Micheau et al., 2001; Ravi et al., 2001). A fin de
comprender el mecanismo por el que la inhibición de este factor de transcripción induce
sensibilización a TRAIL en linfocitos T primarios, estudiamos la posible regulación de
diversos factores implicados en la apoptosis mediada por este ligando y utilizamos para
ello células T activadas como modelo celular, dado que la sensibilización en dichas
células era mucho más consistente y reproducible que en el caso de los linfocitos T en
reposo. Analizamos en primer lugar la expresión de los receptores TRAIL-R1, TRAIL-
R2 y TRAIL-R4 en la superficie de células T activadas tras el tratamiento con BAY 11-
7085. Como se observa en la figura 14A, no encontramos efecto alguno sobre la
expresión de los receptores pro-apoptóticos en membrana mientras que los niveles del
receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 se veían reducidos sensiblemente tras el tratamiento
con el inhibidor en todos los casos estudiados, afectando dicha reducción de forma
similar a las subpoblaciones CD4+ y CD8+. A nivel de ARNm observamos una pérdida
en la expresión de todos los receptores, dependiente del tiempo de tratamiento con BAY
11-7085 (figura 14B).
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
ATRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
ATiempo (horas) 0 6 9
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
β-Actina
BTiempo (horas) 0 6 9
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
β-Actina
Tiempo (horas) 0 6 9
TRAIL-R1
TRAIL-R2
TRAIL-R4
β-Actina
B
105
La diferencia en la expresión de TRAIL-R4 entre las subpoblaciones CD4+ y CD8+
parece acentuarse aún más tras el tratamiento con el inhibidor de NF-κB, dado que en
este contexto el porcentaje de células CD4+ que expresan dicho receptor es muy bajo
(pico no sombreado de menor fluorescencia en el panel inferior de la figura 14A)
mientras que el 100% de las células CD8 siguen expresándolo, aunque con menor
intensidad. Estudiamos por ello la inducción de apoptosis por TRAIL en ambas
subpoblaciones linfocitarias tras el pretratamiento con BAY 11-7085 y observamos que
no existían diferencias significativas en la sensibilización de las dos subpoblaciones con
respecto a la población total (figura 14C). Esto sugiere que la pérdida de expresión de
este receptor, si bien puede jugar algún papel en la sensibilización a TRAIL de los
linfocitos T activados por inhibición de NF-κB, no debe ser la única causa de la misma.
Estudiamos entonces la expresión de distintas proteínas anti-apoptóticas como c-
FLIP, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 en linfocitos T activados en
respuesta al tratamiento con BAY 11-7085, no observando cambios en los niveles de
ARNm de c-FLIPL, Bcl-x y Mcl-1 tras 9 horas de tratamiento (figura 15A). Por el
Figura 14. Expresión de receptores de TRAIL en linfocitos T activados en respuesta a BAY 11-7085.A) Linfocitos T activados fueron incubados en presencia (picos no sombreados) o ausencia (picossombreados) de BAY 11-7085 (2.5 μM) durante 15 horas y la expresión de los receptores TRAIL-R1, -R2 y -R4 fue analizada por citometría de flujo. La línea discontinua muestra la florescencia basal delanticuerpo secundario. B) Los niveles de ARNm de los receptores fueron analizados por RT-PCR enlinfocitos T activados tras el tratamiento con BAY 11-7085 (2.5 μM) a los tiempos indicados. Comocontrol de la cantidad de ARNm se analizó la expresión de β-actina. C) La población total de linfocitosT activados de donantes sanos y las subpoblaciones separadas CD4+ y CD8+ se pretrataron 1 horacon BAY 11-7085 (2.5 μM) antes de ser incubadas con TRAIL (250 ng/ml) durante 24 horas. Elporcentaje de células apoptóticas se determinó por citometría de flujo. Los resultados mostrados sonrepresentativos de tres experimentos independientes utilizando células de distintos donantes.
% C
élul
as A
popt
ótic
as 100
80
60
40
20
0
Cels T Totales CD4+ CD8+
ControlTRAILBAYBAY + TRAIL
C
ControlTRAILBAYBAY + TRAIL
% C
élul
as A
popt
ótic
as 100
80
60
40
20
0
Cels T Totales CD4+ CD8+
ControlTRAILBAYBAY + TRAIL
C
ControlTRAILBAYBAY + TRAIL
C
106
contrario, el descenso en los niveles de ARNm de c-FLIPs, Bcl-2, XIAP, c-IAP1 y c-
IAP2 fue significativo y dependiente del tiempo, tras la exposición al inhibidor.
Figura 15. Expresión de factores intracelulares implicados en la ruta de señalización de TRAIL encéluas T activadas en respuesta a BAY 11-7085. Linfocitos T activados fueron tratados con BAY 11-7085 (2.5 μM) durante los tiempos indicados. Los niveles de ARNm de los genes c-FLIP, Bcl-2, Bcl-x,Mcl-1, XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 se determinaron por RT-PCR (A). Los niveles de proteína de los genesmencionados (B) y de Bid (D) se analizaron por Western-blot. Como control de cantidad de carga seanalizó la expresión de β-actina (A) o α-tubulina (B, D). C) Los niveles de ARNm de Bcl-2 sedeterminaron mediante PCR a tiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado ynormalizando los resultados con respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras.Las barras de error representan la SD del triplicado. En todas las figuras los datos mostrados sonrepresentativos de al menos 3 experimentos independientes con células de diferentes donantes.
Tiempo (horas) 0 6 9
c-FLIPL
c-FLIPS
Bcl-2
Bcl-x
Mcl-1
XIAP
c-IAP1
c-IAP2
β-Actina
ATiempo (horas) 0 6 9
c-FLIPL
c-FLIPS
Bcl-2
Bcl-x
Mcl-1
XIAP
c-IAP1
c-IAP2
β-Actina
A
c-FLIPL
c-FLIPS
c-IAP2
XIAP
Bcl-2
α-Tubulina
- + BAY / 24 horas
Bcl-2
α-Tubulina
B
- + BAY / 30 horas
c-FLIPL
c-FLIPS
c-IAP2
XIAP
Bcl-2
α-Tubulina
- + BAY / 24 horas
Bcl-2
α-Tubulina
B
- + BAY / 30 horas
0
1
2C
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
0.33
- + BAY / 6 horas0
1
2C
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
0.33
- + BAY / 6 horas
D - + BAY / 20 horas
Bid
α-Tubulina
D - + BAY / 20 horas
Bid
α-Tubulina
B
107
Determinamos también si los cambios observados a nivel de ARNm se
correspondían con un descenso de los niveles de proteína y encontramos una pérdida de
todas las analizadas tras 24 horas de tratamiento con el inhibidor, con la excepción de
Bcl-2 (figura 15B, panel superior). El hecho de que los niveles de Bcl-2 no varíen a este
tiempo puede deberse a que la vida media de esta proteína es muy larga (Reed, 1996).
Así, encontramos que efectivamente se producía una reducción en la expresión de Bcl-2
tras 30 horas de tratamiento con BAY 11-7085 (figura 15B, panel inferior).
Confirmamos también, mediante PCR a tiempo real, que la proteína Bcl-2 se regulaba a
nivel transcripcional por el inhibidor de NF-κB en células T activadas (figura 15C).
Además de todos los factores anti-apoptóticos mencionados, estudiamos la posible
regulación por BAY 11-7085 de la proteína pro-apoptótica Bid, dada la disminución de
los niveles de expresión de la misma en células T activadas con respecto a las células T
en reposo (figura 7). Sin embargo, como se observa en la figura 15D, no encontramos
ningún cambio en la expresión de Bid en las células T activadas tratadas con el
inhibidor de NF-κB. En conjunto, todos estos datos indican que la regulación de
diversas proteínas anti-apoptóticas, incluyendo entre ellas el receptor TRAIL-R4, puede
ser el mecanismo por el cual la inhibición de NF-κB sensibiliza a las células T activadas
a la apoptosis mediada por TRAIL.
3. REGULACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A TRAIL EN CÉLULAS T
LEUCÉMICAS.
3.1 Efecto de diferentes agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en células
T leucémicas
Como ya se ha mencionado en el apartado anterior, numerosos agentes con
diferentes mecanismos de acción se están ensayando en estrategias de terapia
antitumoral combinada con TRAIL gracias a la capacidad de los mismos para romper la
resistencia a este ligando o para potenciar su acción a dosis mínimas. Paralelamente al
estudio descrito en el apartado anterior sobre la regulación de la resistencia a TRAIL de
linfocitos T primarios de donantes sanos, analizamos la posible sensibilización a TRAIL
en líneas de células T leucémicas, en concreto en las líneas celulares Jurkat, CEM-6 y
MOLT-4.
108
0
20
40
60
80
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1 2 3 4
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20
40
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1 2 3 4JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
B
JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
AControl RoscovitinaTRAIL Roscovitina + TRAIL
Control NocodazolTRAIL Nocodazol + TRAIL
0
20
40
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1 2 3 4
0
20
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1 2 3 4JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
B
JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
AControl RoscovitinaTRAIL Roscovitina + TRAIL
Control NocodazolTRAIL Nocodazol + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
B
JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
% C
élulas
Apo
ptot
icas
AControl RoscovitinaTRAIL Roscovitina + TRAILControl RoscovitinaTRAIL Roscovitina + TRAIL
Control NocodazolTRAIL Nocodazol + TRAILControl NocodazolTRAIL Nocodazol + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
C
D
JURKAT CEM-6 MOLT-4
% C
élulas
Apo
ptot
icas
% C
élulas
Apo
ptot
icas
Control BAYTRAIL BAY + TRAIL
JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
Control LYTRAIL LY + TRAIL
0
20
40
60
80
100
1 2 3
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4
C
D
JURKAT CEM-6 MOLT-4
% C
élulas
Apo
ptot
icas
% C
élulas
Apo
ptot
icas
Control BAYTRAIL BAY + TRAILControl BAYTRAIL BAY + TRAIL
JURKAT CEM-6 MOLT-4 CELs T ACTIVADAS
Control LYTRAIL LY + TRAILControl LYTRAIL LY + TRAIL
109
En la figura 16 se muestra la actividad de diferentes agentes, utilizados a
concentraciones seleccionadas en base a publicaciones previas, sobre dichas líneas.
Tanto la roscovitina, inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas, como el nocodazol
eran capaces de inducir muerte celular en las tres líneas, de forma similar a la observada
en células T activadas (figura 16A, B). Y el tratamiento combinado con cualquiera de
estos agentes y TRAIL solo suponía, a lo sumo, una suma de los efectos de ambos por
separado. Curiosamente, cuando analizamos el efecto del inhibidor de NF-κB BAY 11-
7085 encontramos que, a diferencia de la sensibilización que producía en linfocitos T
primarios, en líneas leucémicas T no potenciaba la inducción de apoptosis por TRAIL,
aunque sí presentaba un efecto citotóxico importante en las mismas (figura 16C).
Estudiamos también el efecto de bortezomib, doxorubicina, BIS, PD 98059
(inhibidor de MEK) e IFN-α. De todos ellos, únicamente la doxorubicina presentaba un
cierto efecto potenciador de la apoptosis en las tres líneas celulares, especialmente en
células CEM-6 (figura 8A), mientras que el resto no producían ningún cambio en la
viabilidad celular ni en la respuesta a TRAIL, a excepción del bortezomib que resultó
ser ligeramente citotóxico (tabla I).
Figura 16. Inducción de apoptosis por agentes moduladores de la sensibilidad a TRAIL en células Tleucémicas. Las líneas leucémicas T Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron pretratadas con (A) roscovitina20 μM, (B) nocodazol 400 ng/ml o (E) VPA 1 mM durante 7 horas; o con (C) BAY 11-7085 2.5μM o (D)LY 294002 10μM durante 1 hora. Tras la preincubación, las células fueron tratadas con 100 ng/ml deTRAIL durante 20 h. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. En A,B yC se muestra el resultado de un tratamiento idéntico, pero con 250 ng/ml TRAIL, en linfocitos T activadoscomo control del efecto citotóxico de la droga (A,B) o de sensibilización a TRAIL (C).
0
20
40
60
80
100
1 2 3
% C
élulas
Apo
ptót
icas
EControl VPATRAIL VPA + TRAIL
JURKAT CEM-6 MOLT-40
20
40
60
80
100
1 2 3
% C
élulas
Apo
ptót
icas
EControl VPATRAIL VPA + TRAILControl VPATRAIL VPA + TRAIL
JURKAT CEM-6 MOLT-4
110
JURKAT CEM-6 MOLT-4
BAY 117085 (2.5 mM) + / - + / - + / -
NOCODAZOL (400 ng/ml) + / - + / - + /-
ROSCOVITINA (20 mM) + / - + / - + / -
BORTEZOMIB (50 nM) (+) / - (+) / - (+) / -
DOXO (100 ng/ml) - / (+) - / + (+) /(+)
BIS (6 mM) - / - - / - - / -
PD 98059 (50 mM) - / - - / - - / -
IFN-a (3 ng/ml) - / - - / - - / -
LY 294002 (10 mM) (+) / + (+) / + (+) / +
VPA (1 mM) - / + - / + - / +
Los resultados previos obtenidos con linfocitos T primarios sugerían la posible
utilización del inhibidor de PI3K, LY294002, así como del inhibidor de HDAC, VPA,
en el tratamiento de tumores dada la baja toxicidad de ambos compuestos para dichas
células. Además habíamos visto que los dos potenciaban la apoptosis mediada por
TRAIL en células CEM-6 (figura 8B, C). Los mismos resultados fueron obtenidos
cuando analizamos su efecto en células Jurkat y MOLT-4.
Especialmente llamativo fue el efecto del VPA, tanto por su escasa acción citotóxica
como por su mayor capacidad para potenciar la acción de TRAIL en las tres líneas
celulares estudiadas (figura 16D,E). Este efecto potenciador del VPA se observó incluso
reduciendo el tiempo de preincubación con el mismo a 4 horas y utilizando dosis bajas
de TRAIL del orden de 10 a 50 ng/ml (figura 17).
Tabla I. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad y la sensibilización a TRAIL de células Tleucémicas. Células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 se preincubaron con los agentes indicados durante 1hora, excepto con nocodazol, roscovitina y VPA en que la preincubación fue de 7 horas y con IFN-α enque fue de 20 horas. Tras el pretratamiento se incubaron con o sin TRAIL (100 ng/ml) y se determinó lainducción de apoptosis por citometría de flujo. Se indica: citotoxicidad / sensibilización a TRAIL.
111
3.2 Regulación por VPA y LY 294002 de factores implicados en la ruta de
señalización de TRAIL en líneas leucémicas T
A fin de caracterizar el posible efecto de los inhibidores de HDAC y de PI3K sobre
la expresión de proteínas intracelulares pertenecientes a la vía de señalización de
TRAIL en células T leucémicas, estudiamos los niveles de ARNm de Bcl-2, Bcl-XL, c-
IAP1, c-IAP2 y XIAP tras 15 horas de tratamiento con dichos inhibidores (figura 18A).
En ninguna de las tres líneas leucémicas T empleadas en el estudio encontramos
diferencias entre las células tratadas y los controles no tratados. Sólo se muestran los
resultados de células Jurkat como modelo representativo. En paralelo se analizó la
expresión de dichas proteínas en células T activadas como modelo celular en el que el
tratamiento con VPA y LY 294002 no regula la sensibilidad a TRAIL.
Figura 17. Efecto potenciador de VPA de la apoptosis mediada por TRAIL en células T leucémicas.Células leucémicas T Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron pretratadas o no durante 4 horas con VPA1mM y a continuación incubadas con 10, 20 ó 50 ng/ml de TRAIL durante 20 horas. El porcentaje decélulas apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo. Los datosson representativos de tres experimentos independientes.
0
20
40
60
80
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0 10 20 30 40 50
JURKAT controlJURKAT + VPACEM controlCEM + VPA
MOLT controlMOLT + VPA
ng/ml TRAIL
% C
élul
as A
popt
otic
as
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
JURKAT controlJURKAT + VPACEM controlCEM + VPA
MOLT controlMOLT + VPA
ng/ml TRAIL
% C
élul
as A
popt
otic
as
c-IAP1
c-IAP2
β-Actina
Bcl-x
XIAP
Bcl-2
C VPA LYC VPA LY
Jurkat T activadasA
c-IAP1
c-IAP2
β-Actina
Bcl-x
XIAP
Bcl-2
C VPA LYC VPA LY
Jurkat T activadasA
112
Sin embargo, cuando analizamos los niveles de FLIP sí observamos un descenso
claro en los niveles del ARNm de FLIPs en las tres líneas leucémicas, Jurkat, CEM-6 y
MOLT-4, en respuesta al tratamiento con ambos inhibidores, pero no en las células T no
transformadas (figura 18B). En los niveles de FLIPL, por el contrario, no se observó
variación alguna ni en células T normales ni en leucémicas. La regulación selectiva de
la expresión de FLIPs por VPA y LY 294002 en células T leucémicas se confirmó
analizando los niveles de ARNm por PCR a tiempo real en células Jurkat y en células T
activadas (figura 18C).
Se ha descrito la regulación de la expresión del receptor TRAIL-R2 por inhibidores
de HDAC en otros modelos tumorales (Insinga et al., 2005; VanOosten et al., 2005).
Figura 18. Expresión de factores anti-apoptóticos en líneas leucémicas T y células T activadas enrespuesta al tratamiento con VPA y LY 294002. Células T activadas, células Jurkat (A, B, C), CEM-6 yMOLT-4 (B) fueron tratadas con LY 294002 10μM o VPA 1 mM durante 15 horas. Los niveles de ARNmde Bcl-2, Bcl-x, c-IAP1, c-IAP2, XIAP (A) y FLIP (B) se determinaron mediante RT-PCR, empleándoseel producto de PCR de la β-actina como control de carga. En (C) los niveles de ARNm de FLIPs seanalizaron mediante PCR a tiempo real llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizandolos resultados con respecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras deerror representan la SD del triplicado. Los resultados mostrados en los 3 paneles son representativos detres donantes diferentes en el caso de linfocitos T activados, y de tres experimentos independientes en elcaso de las líneas celulares.
C VPA L Y C VPA LY C VPA LY
JHM1 CEM MOLT
β-Actina
FLIPL
FLIPS
C VPA LY
T ActivadasBC VPA L Y C VPA LY C VPA LY
JHM1 CEM MOLT
β-Actina
FLIPL
FLIPS
C VPA LY
T ActivadasB
0
1
2
0,31 0,35
0
1
2Jurkat T activadas
C VPA LY C VPA LY
C
0
1
2
0,31 0,35
0
1
2Jurkat T activadas
C VPA LY C VPA LY
CC
113
Por ello, analizamos también la capacidad del VPA para incrementar los niveles de
expresión en membrana de este receptor en las diferentes líneas leucémicas T. Como se
observa en la figura 19, el tratamiento con VPA produjo un cierto aumento en los
niveles de TRAIL-R2 en células Jurkat y CEM-6, pero muy débil en células MOLT-4.
3.3 Potenciación por HDACi de la apoptosis mediada por TRAIL en líneas
leucémicas T sensibles
La ausencia de toxicidad del VPA en linfocitos T primarios, así como su gran
capacidad para potenciar la inducción de apoptosis por TRAIL en líneas de células T
leucémicas, sitúan a este compuesto, de entre todos los analizados en nuestro estudio,
como el mejor candidato para ser utilizado en terapias combinadas con TRAIL.
Decidimos entonces estudiar el efecto de distintos inhibidores de HDAC, pertenecientes
a diferentes familias estructurales, en la sensibilidad a TRAIL de células T primarias y
de células leucémicas T, para de este modo establecer posibles diferencias en los
mecanismos de acción de los mismos y conocer cual de ellos es el más efectivo y
selectivo en el tratamiento de leucemias de células T. En concreto, trabajamos con los
siguientes HDACi: tricostatina A (TSA) y vorinostat (SAHA), pertenecientes a la
familia de los hidroxamatos; VPA y butirato sódico (NaB), representativos del grupo de
ácidos alifáticos; MS-275, perteneciente a la familia de las benzamidas; y apicidina
como inhibidor del grupo de péptidos cíclicos.
MOLT-4CEM-6 Jurkat
Intensidad de Fluorescencia
Figura 19. Expresión de TRAIL-R2 en membrana en células T leucémicas en respuesta altratamiento con VPA. Células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4 fueron incuabadas con (picos nosombreados) o sin (picos sombreados) VPA 1 mM durante 24 horas. La expresión del receptorTRAIL-R2 en membrana se analizó mediante citometría de flujo. La línea discontinua muestra lafluorescencia basal del anticuerpo secundario.
114
En primer lugar tratamos células Jurkat y linfocitos T activados procedentes de
donantes sanos con distintas concentraciones de cada uno de los inhibidores de HDAC,
para comparar la posible acción citotóxica sobre ambos tipos celulares y establecer el
límite de tolerancia de las células no transformadas. La selección de las concentraciones
se realizó en base a las utilizadas por otros autores en diferentes modelos de células
tumorales.
Figura 20. Inducción de apoptosis por diferentes HDACi en células Jurkat y linfocitos T activados.Linfocitos T activados (A) y células Jurkat (B) fueron incubadas durante 24 horas en presencia deHDACi a distintas concentraciones: TSA 10, 30, 50, 75 y 100 ng/ml; VPA 0.5, 0.75, 1, 2.5 y 5 mM;SAHA 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 2 μM; MS-275 0.5, 0.75, 1, 2.5 y 5 μM; NaB 0.1, 0.3, 0.5, 1 y 5 mM; y apicidina10, 25, 50, 100 y 250 nM. El porcentaje de células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1del ciclo celular. Los datos son representativos de al menos tres donantes independientes en el caso delinfocitos T y de 3 experimentos independientes en el caso de células Jurkat.
0
20
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100
1 2 3 4 5 6 7TSA VPA SAHA MS-275 NaB ApicidinaC TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
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ótic
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A
0
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1 2 3 4 5 6 7TSA VPA SAHA MS-275 NaB ApicidinaC TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
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A
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1 2 3 4 5 6 7C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
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B
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1 2 3 4 5 6 7C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
élul
as a
popt
ótic
as
B
115
Las células T activadas resultaron ser resistentes a todas las dosis de los distintos
HDACi, con excepción de los hidroxamatos (SAHA y especialmente TSA, figura 20A).
El mismo patrón de resistencia se observó en células T no estimuladas (datos no
mostrados). Por el contrario, las células Jurkat resultaron mucho más sensibles a la
inducción de apoptosis por estos inhibidores (figura 20B). Las líneas T leucémicas
CEM-6 y MOLT-4 mostraron una sensibilidad similar a la de células Jurkat (datos no
mostrados).
A partir de estos resultados seleccionamos una dosis de cada uno de los HDACi no
tóxica para los linfocitos T primarios y además subletal para las líneas de células T
leucémicas, de modo que se pudiese claramente diferenciar el posible efecto
potenciador de la apoptosis mediada por TRAIL. Así establecimos las siguientes dosis:
10 ng/ml de TSA, 1 mM de VPA, 0.5 μM de SAHA, 1 μM de MS-275, 0.5 mM de
NaB y 50 nM de apicidina. Para comprobar que las dosis elegidas de estos inhibidores
efectivamente producían un efecto sobre la acetilación de histonas, estudiamos por
citometría de flujo los niveles de la histona H4 acetilada. Observamos en células Jurkat
un nivel máximo de acetilación a las 4 horas de tratamiento con los HDACi mientras
que a las 24 horas el nivel de acetilación basal se recuperaba (figura 21). Resultados
similares se obtuvieron en células CEM-6 por lo que se estableció el tiempo de 4 horas
como el óptimo de pretratamiento con los HDACi.
Figura 21. HDACi incrementan el nivel de acetilación de histonas en células Jurkat. Células Jurkatfueron tratadas con los distintos HDACi a concentraciones subletales (TSA 10 ng/ml, VPA 1mM, SAHA0.5 μM , MS-275 1μM, NaB 0.5 mM y apicidina 50 nM) durante 4 y 24 horas. Los niveles de acetilaciónse analizaron por citometría de flujo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados sonrepresentativos de tres experimentos independientes.
0
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1 2
Negativo ControlTSA VPASAHA MS-275NaB Apicidina
4 horas 24 horas Inte
nsid
ad d
e fl
uore
scen
cia
0
10
20
30
40
50
60
1 2
Negativo ControlTSA VPASAHA MS-275NaB Apicidina
4 horas 24 horas Inte
nsid
ad d
e fl
uore
scen
cia
116
Una vez establecidas las dosis y tiempos de tratamiento con los inhibidores
comenzamos a analizar el efecto sobre la apoptosis mediada por TRAIL en células
Jurkat, CEM-6 y MOLT-4. Los HDACi de las distintas familias estructurales
potenciaban de forma similar en las tres líneas celulares la inducción de apoptosis por
TRAIL, con excepción de la apicidina que a la concentración empleada incrementaba la
sensibilidad a TRAIL tan solo en células Jurkat, pero no en las líneas CEM-6 y MOLT-
4 (figura 22A, B, C). De forma paralela, se analizó la posible sensibilización a la
apoptosis mediada por TRAIL en linfocitos T activados de donantes sanos, no
encontrándose efecto alguno en ninguno de los casos analizados (figura 22D).
Figura 22. HDACi potencian la apoptosis mediada por TRAIL en líneas leucémicas T sensibles,pero no sensibilizan linfocitos T activados. Células Jurkat, CEM-6, MOLT-4 y linfocitos T activadosfueron pretratadas durante 4 horas con los distintos HDACi a las siguientes concentraciones: TSA 10ng/ml, VPA 1mM, SAHA 0.5 mM , MS-275 1mM, NaB 0.5 mM y apicidina 50 nM y posteriormente seincubaron con TRAIL (100 ng/ml en líneas y 250 ng/ml en primarias) durante 20 horas. El porcentajede células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo. Lasbarras de error representan la SD de al menos 3 experimentos independientes.
0
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-
+ TRAIL
0
20
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-
+ TRAIL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
Jurkat
0
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100-
+ TRAIL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
CEM-6
% C
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as
MOLT-4
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
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-
+ TRAIL
Linfocitos T activados
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
0
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-
+ TRAIL
0
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-
+ TRAIL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
Jurkat
0
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80
100-
+ TRAIL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
CEM-6
% C
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MOLT-4
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
% C
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-
+ TRAIL
Linfocitos T activados
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
117
Estudiamos también el efecto de HDACi a las concentraciones establecidas sobre
otra línea de células T leucémicas, HPB-ALL, que se caracteriza por presentar una alta
resistencia a TRAIL, a diferencia de las tres líneas anteriores que se consideran
sensibles a este ligando. En este caso, a pesar de utilizar una dosis más alta de TRAIL,
no encontramos ningún efecto de sensibilización (figura 23A). Tampoco observamos
sensibilización a la apoptosis mediada por TRAIL en linfocitos primarios de sangre
periférica de pacientes con linfoma T cutáneo, leucemia T aguda, leucemia T precursora
y leucemia T crónica (figura 23B-E). Estos resultados sugieren que los HDACi son
capaces de potenciar o facilitar la inducción de apoptosis en células T leucémcias
sensibles a TRAIL pero no en aquellas que son resistentes a este ligando.
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-
+ TRAIL
% C
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as HPB-ALL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina0
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+ TRAIL
% C
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as HPB-ALL
C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
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+ TRAIL
Linfoma T Cutáneo
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+ TRAIL
Leucemia T Aguda
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C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina0
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+ TRAIL
Linfoma T Cutáneo
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+ TRAIL
Leucemia T Aguda
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C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
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+ TRAIL Leucemia T Precursora
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+ TRAIL
Leucemia T Crónica
% C
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C TSA VPA MS-275 NaB Apicidina C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina0
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+ TRAIL Leucemia T Precursora
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+ TRAIL
Leucemia T Crónica
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as
C TSA VPA MS-275 NaB Apicidina C TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
Figura 23. HDACi no facilitan la apoptosismediada por TRAIL en distintos modelos deleucemias T resistentes. La línea celularHPB-ALL y las células primarias de pacientescon linfoma T cutáneo, leucemia T aguda,leucemia T precursora y leucemia T crónicafueron pretratadas durante 4 horas con losdistintos HDACi (TSA 10 ng/ml, VPA 1mM,SAHA 0.5 μM , MS-275 1μM, NaB 0.5 mM yapicidina 50 nM) y posteriormente seincubaron con TRAIL (250 ng/ml) durante 24horas. El porcentaje de células apoptóticas sedeterminó por análisis del pico sub-G1mediante citometría de flujo.
118
3.4 HDACi potencian la activación de caspasas y las señales mitocondriales mediadas
por TRAIL en líneas leucémicas T
Una vez demostrada la potenciación del proceso apoptótico mediante la combinación
de los HDACi y TRAIL en células Jurkat, CEM-6 y MOLT-4, analizamos a qué nivel
de la ruta de señalización de TRAIL tiene lugar dicha potenciación. En primer lugar
determinamos la activación de caspasas-8, -9 y –3 en respuesta a TRAIL en células
Jurkat preincubadas o no con los diferentes HDACi. Como se demuestra en la figura 24,
todos los inhibidores, en mayor o menor medida, aumentaron la activación de todas las
caspasas. Resultados similares se obtuvieron en células CEM y MOLT-4, excepto con
la apicidina (datos no mostrados).
Para determinar si el efecto fundamental de los HDACi sobre la ruta de TRAIL tiene
lugar en las etapas iniciales en las que se activa la caspasa-8 o en una fase posterior, a
nivel de las señales mitocondriales y la activación de caspasa-9, se comparó el efecto de
inhibidores específicos de ambas caspasas sobre la inducción de apoptosis por HDACi
Figura 24. HDACi potencian la activación de caspasas -8, -9 y -3 en respuesta a TRAIL en célulasJurkat. Células Jurkat fueron pretratadas durante 4 horas con los distintos HDACi a lasconcentraciones subletales anteriormente descritas y a continuación fueron tratadas con TRAIL (100ng/ml) durante 20 horas. La fragmentación de caspasas se determinó por Western Blot.
Caspasa-8
43/41 kDa
Caspasa-9
37-35 kDa
Caspasa-3
20/17 kDa
TRAIL - + - + - + - + - + - + - + - +
HDACi TSA VPA SAHA MS NaB Apicidina _____ _____ _____ _____ ______ ______
Caspasa-8
43/41 kDa
Caspasa-9
37-35 kDa
Caspasa-3
20/17 kDa
TRAIL - + - + - + - + - + - + - + - +
HDACi TSA VPA SAHA MS NaB Apicidina _____ _____ _____ _____ ______ ______TRAIL - + - + - + - + - + - + - + - +
HDACi TSA VPA SAHA MS NaB Apicidina _____ _____ _____ _____ ______ ______
119
y TRAIL con el del inhibidor general de caspasas Z-VAD. Encontramos que tanto el
inhibidor de caspasa-8, Z-IETD, como el de caspasa-9, Z-LEHD, producían un bloqueo
similar al del Z-VAD de la apoptosis mediada por TRAIL en células Jurkat pretratadas
con HDACi (figura 25). Estos datos sugieren que ambas caspasas son necesarias para la
potenciación de la apoptosis por HDACi.
Analizamos entonces el efecto de los inhibidores de caspasas en la activación de las
mismas en células Jurkat preincubadas con un HDACi, en este caso MS-275, y tratadas
con TRAIL (figura 26). Observamos, como era de esperar, que el inhibidor de la
caspasa-8 no solo bloqueaba la activación de esta caspasa sino también la de la –9 y la -
3 y la degradación de un sustrato de esta última, PARP. Pero también el inhibidor de
caspasa-9 evitaba la activación de caspasa-8, de caspasa-3 y la degradación de PARP
tanto en células tratadas con TRAIL como en los tratamientos combinados de HDACi y
TRAIL. Los mismos resultados se obtuvieron con otros inhibidores de HDACi. Estos
datos parecen indicar que el incremento en la activación de la caspasa-8 podría deberse
en gran parte a una potenciación en la activación de la caspasa-9 que, vía caspasa-3 por
0
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100HDACi HDACi+TRAIL
ZVAD50uM+HDACi ZVAD50uM+HDACi+T
inhCASP8-50uM+HDACi inhCASP8-50uM+HDACi+T
inhCASP9-50uM+HDACi inhCASP9-50uM+HDACi+T
-
Z-VAD
Z-IETD
Ac-LEHD
TRAIL
Z-VAD + TRAIL
Z-IETD + TRAIL
Ac-LEHD + TRAIL
% C
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Control TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina0
20
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100HDACi HDACi+TRAIL
ZVAD50uM+HDACi ZVAD50uM+HDACi+T
inhCASP8-50uM+HDACi inhCASP8-50uM+HDACi+T
inhCASP9-50uM+HDACi inhCASP9-50uM+HDACi+T
-
Z-VAD
Z-IETD
Ac-LEHD
TRAIL
Z-VAD + TRAIL
Z-IETD + TRAIL
Ac-LEHD + TRAIL
% C
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100HDACi HDACi+TRAIL
ZVAD50uM+HDACi ZVAD50uM+HDACi+T
inhCASP8-50uM+HDACi inhCASP8-50uM+HDACi+T
inhCASP9-50uM+HDACi inhCASP9-50uM+HDACi+T
-
Z-VAD
Z-IETD
Ac-LEHD
TRAIL
Z-VAD + TRAIL
Z-IETD + TRAIL
Ac-LEHD + TRAIL
% C
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ótic
as
Control TSA VPA SAHA MS-275 NaB Apicidina
Figura 25. La inhibición de caspasas bloquea la apoptosis inducida por el tratamiento combinadode HDACi y TRAIL. Células Jurkat se pretrataron durante 4 horas con las concentraciones subletalesde los distintos HDACi en presencia o ausencia de los inhibidores de caspasas Z-VAD, Z-IETD o Z-LEHD (20 μM). Posteriormente se trataron con TRAIL (100 ng/ml) durante 20 horas y el porcentajede células apoptóticas se determinó por análisis del pico sub-G1 mediante citometría de flujo.
120
retroalimentación, activaría a la caspasa-8. La dosis de inhibidores de caspasas utilizada
en estos experimentos (20 μM) es la mínima concentración descrita con capacidad para
inhibir de forma específica la activación de caspasas. A pesar de ello, no podemos
desechar la posibilidad de una acción inespecífica generalizada de los inhibidores
empleados.
Estudiamos también la posible potenciación por HDACi de señales mitocondriales
descritas como necesarias para la inducción de apoptosis por TRAIL en la gran mayoría
de las células tumorales. En concreto, analizamos la translocación de Bax a la
mitocondria así como la salida de citocromo c al citosol, eventos que tienen lugar como
consecuencia de la activación de la caspasa-8 apical. En la figura 27 podemos observar
Figura 26. Efecto de los inhibidores de caspasas -8 y -9 en la activación de caspasas en respuesta altratamiento combinado con HDACi y TRAIL. Células Jurkat fueron pretratadas durante 4 horas conMS-275 (1 μM) en presencia o ausencia de Z-IETD o Z-LEHD (20 μM) y posteriormente se trataroncon TRAIL (100 ng/ml) durante 20 horas. La fragmentación de caspasas se determinó por WesternBlot.
Caspasa 8
43/41 kDa
β-Actina
Caspasa 9
37-35 kDa
PARP85 kDa
β-Actina
Caspasa 3
20/17 kDa
β-Actina
MS-275 - - + + - + - +TRAIL - + - + + + + +
Z-IETD-FMK - - - - + + - -Ac-LEHD-CMK - - - - - - + +
Caspasa 8
43/41 kDa
β-Actina
Caspasa 9
37-35 kDa
PARP85 kDa
β-Actina
Caspasa 3
20/17 kDa
β-Actina
MS-275 - - + + - + - +TRAIL - + - + + + + +
Z-IETD-FMK - - - - + + - -Ac-LEHD-CMK - - - - - - + +
121
que el pretratamiento de células Jurkat con VPA (como modelo de HDACi) potenciaba
la translocación de Bax y especialmente la liberación de citocromo c en respuesta a
TRAIL. Estos datos confirman la acción de los inhibidores de HDAC sobre las señales
iniciales de la ruta de inducción de apoptosis por este ligando.
3.5 Regulación por HDACi de proteínas involucradas en la ruta de señalización de
TRAIL en células T leucémicas
Los estudios preliminares con VPA habían demostrado la regulación de la
expresión del receptor TRAIL-R2 en líneas de células T leucémicas, especialmente en
células Jurkat y CEM-6 (figura 19). Analizamos si este fenómeno se reproducía en
respuesta al tratamiento con todos los HDACi a las concentraciones previamente
seleccionadas como subletales que potencian la apoptosis mediada por TRAIL. En la
figura 28A se observa que, con excepción del TSA, efectivamente todos ellos inducían
un cierto incremento en la expresión de este receptor pro-apoptótico en células Jurkat,
siendo dicho incremento de menor magnitud en el caso de la apicidina. En células
CEM-6 también se observó la regulación de la expresión de TRAIL-R2, aunque de
manera más débil que en Jurkat, con todos los HDACi excepto con TSA y apicidina
(figura 28B). Estudiamos además si estos inhibidores afectaban a la expresión del
receptor TRAIL-R1, pero en este caso no encontramos ningún tipo de regulación
consistente de manera que la expresión de este receptor en la membrana de células
Figura 27. VPA potencia la salida de citocromo c y el reclutamiento de Bax a la mitocondria enrespuesta a TRAIL. Células Jurkat fueron pretratadas con VPA 1mM durante 4 horas y acontinuación se incubaron con TRAIL 100 ng/ml durante 20 horas. Se prepararon extractoscitosólicos y membranosos (pellet) y se detectaron las proteínas citocromo c y Bax por Western Blot.La expresión de β-actina y Bcl-2 se analizó como control de carga de los extractos citosólicos y demembrana, respectivamente.
Bax
Citocromo c
Bcl-2
PELLET CITOSOL
Bax
Citocromo C
β-Actina
TRAIL - + - + - + - +
VPA - - + + - - + +
Bax
Citocromo c
Bcl-2
PELLET CITOSOL
Bax
Citocromo C
β-Actina
TRAIL - + - + - + - +
VPA - - + + - - + +
122
Jurkat y CEM-6 es prácticamente nula en todos los casos figura, tanto en células control
como tratadas (28C, D).
ApicidinaNaB MS-275
SAHATSA VPA
Intensidad de Fluorescencia
A
ApicidinaNaB MS-275
SAHATSA VPA
Intensidad de Fluorescencia
A
NaB MS-275
TSA SAHAVPAB
Intensidad de Fluorescencia
ApicidinaNaB MS-275
TSA SAHAVPAB
Intensidad de Fluorescencia
Apicidina
ApicidinaNaB MS-275
TSA VPA SAHAC
Intensidad de Fluorescencia
ApicidinaNaB MS-275
TSA VPA SAHAC
Intensidad de Fluorescencia
123
Al igual que ocurre con el receptor TRAIL-R2, la literatura describe el incremento
de TRAIL tras el tratamiento con HDACi en otros modelos tumorales (Insinga et al.,
2005; Nebbioso et al., 2005), siendo ésta una de las posibles causas del efecto citotóxico
de los inhibidores por sí mismos. Las concentraciones subletales de HDACi utilizadas
para potenciar la inducción de apoptosis por TRAIL en nuestro modelo celular son
similares a las usadas por dichos autores. Analizamos por tanto si a dichas
concentraciones tenía lugar algún tipo de regulación en la expresión de este ligando de
muerte, obteniendo un resultado negativo con todos los HDACi (figura 29A). Sin
embargo encontramos que, concentraciones más elevadas de algunos de estos
inhibidores, que sí resultaban tóxicas para nuestras células (figura 20B), eran capaces de
inducir la expresión de TRAIL (figura 29B). En concreto observamos una clara
regulación de la expresión de este ligando en respuesta al tratamiento con TSA, VPA y
NaB, que podría explicar en parte la inducción de apoptosis por los mismos a dichas
concentraciones.
Figura 28. HDACi incrementan la expresión de TRAIL-R2 pero no de TRAIL-R1 en células Tleucémicas. Las líneas leucémicas Jurkat (A y C) y CEM-6 (B y D) fueron tratadas durante 20 horascon las concentraciones subletales de los distintos HDACi. La expresión de los receptores TRAIL-R2(A, B) y –R1 (C, D) se determinó por citometría de flujo. Los picos sombreados corresponden a laexpresión del receptor en las células sin tratar mientras que los no sombreados corresponden a laexpresión en células tratadas. La fluorescencia basal del anticuerpo secundario se representa con lalínea discontinua. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
ApicidinaNaB MS-275
TSA
Intensidad de Fluorescencia
SAHAVPAD
ApicidinaNaB MS-275
TSA
Intensidad de Fluorescencia
SAHAVPAD
124
Siguiendo la misma línea de trabajo basada en la comparación de la actividad de los
distintos HDACi tratamos de caracterizar el efecto de los mismos, incluyendo el VPA
ya estudiado previamente, sobre proteínas intracelulares pertenecientes a la vía de
señalización de TRAIL. Los efectos del NaB en algunos casos no fueron analizados por
Figura 29. Regulación de la expresión de TRAIL por HDACi en células T leucémicas. Células Jurkatfueron tratadas durante 20 horas con (A) concentraciones subletales de los distintos HDACi o (B)concentraciones elevadas de los mismos (TSA 50ng/ml, VPA 2.5mM, MS-275 2.5μM, NaB 5mM yapicidina 0.25 μM) y la expresión de TRAIL se determinó por citometría de flujo. El pico discontinuocorresponde a la fluorescencia basal del anticuerpo secundario, el pico sombreado refleja la expresiónde TRAIL en las células sin tratar mientras que le pico no sombreado corresponde a la expresión delligando tras el tratamiento con los distintos HDACi. Los resultados son representativos de dosexperimentos independientes y similares a los obtenidos en la línea CEM-6.
ApicidinaNaB
MS-275TSA VPAA
ApicidinaNaB
MS-275TSA VPAA
ApicidinaNaB
MS-275TSA VPA
Intensidad de Fluorescencia
B
ApicidinaNaB
MS-275TSA VPA
Intensidad de Fluorescencia
B
125
ser un inhibidor de la misma familia estructural que el VPA, ácidos alifáticos, y haber
demostrado las mismas acciones que éste en todas las determinaciones hasta aquí
realizadas. Esto no ocurre sin embargo con TSA y SAHA, pertenecientes ambos a la
familia de los ácidos hidroxámicos, por lo que continuamos el análisis de los dos
inhibidores. Estudiamos los niveles de expresión del ARNm de FLIP, Bcl-XL, Mcl-1, c-
IAP1 y c-IAP2 en células Jurkat y en CEM-6 en respuesta al tratamiento con los
diferentes inhibidores de HDAC a las concentraciones subletales. Tanto en células
CEM-6 como en Jurkat, de las que se muestran los resultados obtenidos como
representación de las líneas leucémicas, no encontramos diferencias entre células
tratadas y controles en los niveles de ARNm de ninguno de los factores analizados, con
excepción de FLIPs cuyos niveles se reducían especialmente tras el tratamiento con
VPA, SAHA y MS-275, y ligeramente en respuesta al TSA (figura 30A). Estos datos
coinciden con los ya obtenidos al analizar los efectos del VPA de manera individual
(figura 18).
Comprobamos los posibles cambios a nivel de proteína de FLIP y de otros factores
como Bcl-2 y XIAP en células Jurkat. En el caso de estos dos últimos no encontramos
regulación en respuesta a ninguno de los HDACi (figura 30B). Sin embargo, sí
observamos una reducción más o menos pronunciada en los niveles de FLIPL, lo que
sugiere una posible regulación postransduccional de esta proteína No pudimos analizar
la expresión de FLIPs a nivel de proteína, posiblemente por no alcanzar dicha expresión
los umbrales de detección del método y/o el anticuerpo empleado. Analizamos en
paralelo los niveles de estas proteínas en linfocitos T activados de donantes sanos, como
ya hicimos previamente con los de ARNm en respuesta a VPA (figura 18), para
establecer una relación entre las posibles variaciones de las mismas y el efecto
potenciador de la apoptosis mediada por TRAIL. Como era de esperar, no observamos
ningún cambio en los niveles de las proteínas estudiadas, ni siquiera en los de FLIPL
(figura 30B). Tanto en linfocitos T activados como en células Jurkat comprobamos que
los tratamientos con HDACi habían resultado efectivos mediante determinación de la
acetilación de la histona H4 a las 4 horas de tratamiento (figura 30B). Resultados
similares a los de células Jurkat, incluyendo la regulación postransduccional de FLIPL,
se obtuvieron en células CEM-6 y MOLT-4 (figura 30C y datos no mostrados).
126
Figura 30. Expresión de factores antiapoptóticos en líneas leucémicas T en respuesta altratamiento con HDACi. A) Células Jurkat fueron tratadas con concentraciones subletales de losdiferentes HDACi durante 15 horas. Los niveles de ARNm se determinaron mediante RT-PCR. B)Células Jurkat y linfocitos T activados se incubaron durante 4 horas (para detectar acetilación dehistona H4) o 24 horas (para analizar el resto de proteínas) con concentraciones subletales dediferentes HDACi. C) Células CEM-6 y MOLT-4 se incubaron 24 horas como en (B). Los niveles delas proteínas indicadas en B y C se analizaron mediante Western-blot. En todos los casos se muestrala expresión de β-actina como control de carga. Los resultados son representativos de tresexperimentos independientes.
c-IAP2
Bcl-x
β-Actina
Mcl-1
c-IAP1
FLIPL
FLIPs
β-Actina
A
c-IAP2
Bcl-x
β-Actina
Mcl-1
c-IAP1
FLIPL
FLIPs
β-Actina
A
β-Actina
Jurkat Linfocitos T activadosC TSA VPA SAHA MS
XIAP
H4-Ac
Bcl-2
C TSA VPA SAHA MS
B
CEM-6 MOLT-4
β-Actina
FLIPL
C
FLIPL
C TSA VPA SAHA MS C TSA VPA SAHA MS
β-Actina
Jurkat Linfocitos T activadosC TSA VPA SAHA MS
XIAP
H4-Ac
Bcl-2
C TSA VPA SAHA MS
B
CEM-6 MOLT-4
β-Actina
FLIPL
C
FLIPL
C TSA VPA SAHA MS C TSA VPA SAHA MS
127
Dado que no podíamos observar los niveles de FLIPs a nivel de proteína,
confirmamos la regulación de la expresión de este factor anti-apoptótico a nivel de
ARNm mediante PCR a tiempo real. Como se observa en la figura 31 encontramos una
reducción significativa en la expresión de este gen en células Jurkat en respuesta al
tratamiento con VPA, SAHA, MS-275 y NaB (datos no mostrados) pero no con TSA y
apicidina. Analizamos también por esta técnica los niveles de ARNm de FLIPL pero en
este caso, aunque se apreciaban ciertas variaciones, no eran significativas lo que
corroboraba los resultados previamente obtenidos mediante PCR no cuantitativa.
En los estudiados realizados sobre la activación de caspasas, especialmente en
células Jurkat y CEM-6, en ocasiones encontrábamos un cierto incremento en la
expresión de caspasa-3 y de caspasa-9 en respuesta al tratamiento con algunos de los
inhibidores de HDAC. Otros autores han descrito la regulación de caspasas por HDACi
en diferentes modelos tumorales. Analizamos más en detalle esta posible regulación de
la expresión de caspasa-3 y -9 en células Jurkat, ya que también podría contribuir al
efecto potenciador de la inducción de apoptosis por TRAIL. Los resultados de la figura
Figura 31. El tratamiento con determinados HDACi reduce la expresión del ARNm de FLIPs encélulas T leucémicas. Células Jurkat fueron tratadas con concentraciones subletales de los diferentesHDACi durante 15 horas. Los niveles de ARNm de FLIPs y FLIPL se determinaron mediante PCR atiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizando los resultados conrespecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras de errorrepresentan la SD del triplicado.
0,87
0,38
0,290,41
0,87
0
1
2FLIPs
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
1,150,71
1,74
0,81
1,41
0
1
2
3
4
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
FLIPL
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
0,87
0,38
0,290,41
0,87
0
1
2FLIPs
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
1,150,71
1,74
0,81
1,41
0
1
2
3
4
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
FLIPL
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
128
32 indican que, efectivamente, a nivel de proteína los HDACi parecen regular la
expresión de ambas caspasas. Sin embargo dicha regulación no es significativa cuando
se analizan los niveles de ARNm mediante PCR a tiempo real, con excepción de la
inducción de caspasa-3 por VPA. Es posible que en este caso esté ocurriendo también
algún tipo de regulación postransduccional, como con FLIPL.
En resumen, todos estos datos sugieren que, al menos en el caso del VPA, SAHA,
NaB y MS-275, los HDACi pueden potenciar la apoptosis mediada por TRAIL en
células T leucémicas desde sus estadios iniciales, de forma que el incremento
previamente observado en la activación de la caspasa -8 se podría correlacionar con el
B
Figura 32. Regulación de la expresión de caspasas por HDACi en células Jurkat. Células Jurkatfueron tratadas con dosis subletales de HDACi durante 24 (A) o 15 (B) horas. En (A) los niveles decaspasa-3 y -9 se analizaron a nivel de proteína por Western Blot determinándose la expresión de β-actina como control de carga. En (B) se analizaron los niveles de ARNm de ambas caspasas por PCRa tiempo real, llevando a cabo los experimentos por triplicado y normalizando los resultados conrespecto a la expresión del ARNr 18S, para cada una de las muestras. Las barras de error representanla SD del triplicado. Los resultados mostrados son representativos de al menos dos experimentosindependientes.
A
β-Actina
Caspasa-9
Caspasa-3
C TSA VPA SAHA MS
β-Actina
Caspasa-9
Caspasa-3
C TSA VPA SAHA MS
1,52
0,71
1,32
4,29
2,14
0
2
4
6
8
0,71
0,71
0,93
1,74
1,41
0
1
2
3
4
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
Caspasa-3 Caspasa-9
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
1,52
0,71
1,32
4,29
2,14
0
2
4
6
8
0,71
0,71
0,93
1,74
1,41
0
1
2
3
4
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
Incr
emen
to e
xpre
sión
(tant
o po
r 1)
Caspasa-3 Caspasa-9
C TSA VPA SAHA MS Apicidina
129
aumento en la expresión del receptor TRAIL-R2 y la pérdida de FLIP. Pero no podemos
descartar la posible regulación de otros factores anti- o pro-apoptóticos, como las
caspasas, que contribuyan a potenciar las señales mitocondriales y la activación de
caspasa-9.
130
131
V. DISCUSIÓN
132
133
1. REGULACIÓN DEL PROMOTOR DE TRAIL
La importancia de TRAIL como agente terapéutico frente al cáncer radica en su
conocida implicación inmunológica frente al desarrollo de tumores, además de en su
acción selectiva sobre células tumorales y no sobre células normales. La expresión de
TRAIL en superficie se incrementa en células T y en otras células del sistema inmune
en respuesta a señales de activación, mediando en gran parte la actividad citotóxica de
estas células (Kemp et al., 2005; Takeda et al., 2002). La descripción de los elementos
reguladores de la expresión de TRAIL es fundamental para poder controlar su expresión
en dichas células, de manera que TRAIL puede ser una herramienta terapéutica muy útil
en el tratamiento del cáncer no solo administrándolo de manera exógena sino también
potenciando su expresión endógena en células con capacidad citotóxica.
Los trabajos iniciales sobre el promotor de TRAIL describieron la presencia de
numerosos sitios de unión a factores de trascripción, entre ellos NFAT, y demostraron
su regulación por interferón (Gong and Almasan, 2000; Wang et al., 2000a). En células
T se ha descrito la implicación de NF-κB en la regulación de la expresión de TRAIL
tras el tratamiento con agentes que imitan la estimulación del TCR - PMA/ionomicina,
PHA, anticuerpos frente a CD3 y CD28 – y se ha caracterizado un sitio de unión a este
factor de transcripción en la región -265 a -256 del promotor de TRAIL (Baetu et al.,
2001). Sin embargo, el mayor incremento en la expresión de TRAIL en respuesta a
tratamientos combinados con PMA/ionomicina que en tratamientos sólo con PMA
parece indicar una cooperación de NF-κB con NFAT en la regulación del promotor.
Nuestro trabajo ha tratado de establecer el posible papel de NFAT en la regulación de
TRAIL en respuesta a la activación de la célula T, al igual que se ha descrito su
implicación en la regulación de la expresión de otros ligandos de muerte como son
TNF-α y CD95L (McCaffrey et al., 1994; Rengarajan et al., 2000). En nuestro modelo
de células Jurkat hemos demostrado que efectivamente el tratamiento con PMA solo no
es suficiente para inducir la expresión del promotor de TRAIL, como tampoco lo es el
tratamiento solo con ionomicina, lo que confirma la importancia tanto de NF-κB como
de NFAT en la regulación de TRAIL en células T en respuesta a la activación. Por otro
lado, el descenso observado en los niveles de expresión de TRAIL en células T
activadas en respuesta al tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A, también
confirma la implicación de este factor de transcripción en la regulación del ligando de
134
muerte y coincide con los resultados obtenidos previamente en células T de ratón, en las
que se observó una reducción en los niveles de TRAIL en membrana tras el tratamiento
con dicho inhibidor (Mariani and Krammer, 1998b). Además, por primera vez, nuestros
resultados demuestran que el tratamiento con ciclosporina A determina no sólo el
descenso en los niveles de ARNm de TRAIL en células T activadas, sino también el
descenso en la acción citotóxica de las mismas sobre células tumorales sensibles a
TRAIL, indicando la importancia de NFAT en la regulación de la expresión del ligando
de muerte con capacidad para funcionar como tal en la membrana de la célula T. Es
importante mencionar que las células Hela, utilizadas como modelo de línea tumoral en
estos experimentos, son resistentes a CD95L (Ref. Muñoz-Pinedo, JBC, 2003) por lo
que podemos descartar que el efecto citotóxico regulable por ciclosporina observado sea
debido a la expresión de este ligando en los linfocitos T activados. En resultados
preliminares no mostrados hemos encontrado que dicho efecto citotóxico es similar en
linfocitos T CD4+ y T CD8+ activados purificados, e incluso ligeramente superior en
los primeros, lo que está de acuerdo con datos previamente publicados describiendo la
actividad antitumoral de células T CD4+ citotóxicas mediada por TRAIL (Dorothee et
al., 2002).
Los resultados obtenidos tras el estudio de la actividad de los distintos fragmentos
del promotor de TRAIL demuestran que el tratamiento simultáneo con
PMA/ionomicina determina la activación del promotor en una magnitud similar
utilizando los fragmentos de 165, 787 y 1295 pb, de lo que se deduce la importancia de
la región de 165 pb más próxima al sitio de inicio de transcripción en su regulación,
aunque esta región no contiene el sitio para NF-κB descrito por Baetu y colaboradores.
En este sentido, nuestros resultados coinciden los de un trabajo reciente sobre la
inhibición de NF-κB mediante el tratamiento con prostaglandinas y su implicación en la
expresión de TRAIL en células T (Fionda et al., 2007), donde observan una inducción
con PMA/ionomicina similar en fragmentos de 300 y 165 pb del promotor. De hecho, se
ha descrito recientemente un sitio de unión para NF-κB entre los nucleótidos -75 a -65
que no había sido señalado previamente debido a que este sitio se solapa con el sitio
SP1 encontrado en el análisis inicial de la secuencia del promotor (Matsuda et al.,
2005). La unión de NF-kB a este sitio podría explicar la estimulación por
PMA/ionomicina en nuestro fragmento de 165 pb del promotor de TRAIL. Por otro
lado, podemos decir que el sitio de unión a NFAT también se encuentra en esta región.
135
Según el estudio realizado con programas informáticos, en este fragmento de 165 pb
existen 3 secuencias consenso para NFAT. Sería interesante caracterizar en un futuro
cual o cuales de ellos son los responsables de la regulación de la expresión de TRAIL
por este factor de transcripción.
2. REGULACIÓN DE LA RESISTENCIA DE LINFOCITOS T PRIMARIOS A
TRAIL
La ausencia de toxicidad de TRAIL para la mayoría de células no transformadas es
el hecho más importante a tener en cuenta a la hora de considerarlo como un agente
antitumoral, si bien el mecanismo implicado en esta resistencia no está completamente
caracterizado. De ahí que en el presente trabajo hayamos tratado de analizar la respuesta
de linfocitos T en reposo y activados a TRAIL. Hemos encontrado que la ruta de
señalización de apoptosis se ve inhibida en el nivel más apical, esto es, no llega a
activarse la caspasa-8 en células T en ninguno de los dos estadios analizados: reposo y
activación. El análisis de la expresión de las proteínas más importantes que participan
en la formación del DISC indica que:
- La activación de células T no regula la expresión de los niveles de FADD,
caspasa-8, c-FLIP ni de los receptores de TRAIL, con la excepción de TRAIL-R4.
- Comparando con la línea de células T leucémicas sensibles a TRAIL, Jurkat, la
expresión de FADD y caspasa-8 en células T normales es similar mientras que los
niveles de c-FLIP son mucho mayores que en la línea celular. Recientemente se ha
descrito esta proteína inhibidora de la apoptosis como una de las claves de la resistencia
de células NK a la muerte por TRAIL (Mirandola et al., 2004). Es posible que en
linfocitos T juegue un papel similar.
- Los niveles de TRAIL-R1, -R2 y -R3 en membrana son muy bajos, mientras
que en el caso del receptor anti-apoptótico TRAIL-R4 podemos distinguir dos picos con
baja y alta intensidad de fluorescencia, respectivamente. Este patrón de expresión de
receptores pro- y anti-apoptóticos podría estar íntimamente ligado con la ausencia de
activación de caspasa-8 tras tratamiento con TRAIL y, por tanto, con la resistencia de
linfocitos T a la muerte mediada por TRAIL.
136
En relación con la expresión de los receptores de TRAIL, encontramos ciertas
discrepancias con los trabajos publicados por otros autores. Mientras que estudios
previos aseguran que células T en reposo no presentan una significativa expresión de
receptores con excepción de TRAIL-R4 en la subpoblación de células CD8+ (Mirandola
et al., 2004), nuestros datos obtenidos mediante análisis citofluorimétrico revelan la
existencia de un pico de baja intensidad de fluorescencia de TRAIL-R4, que se presenta
con una cierta variabilidad entre células T de distintos donantes y que debe
corresponderse con la subpoblación de linfocitos T CD4+. Por otra parte, dichos
trabajos afirman que la activación de la subpoblación CD8+ incrementa la expresión de
los receptores TRAIL-R1 y -R2 (Hasegawa et al., 2004) o de TRAIL-R2, -R3 y -R4
(Mirandola et al., 2004), mientras que en la subpoblación CD4+ la activación no
provoca cambio alguno en la expresión de receptores (Hasegawa et al., 2004). En
contraste con los estudios de Mirandola, realizados con poblaciones purificadas CD4+ y
CD8+, nosotros trabajamos con la población global de células T CD3+, es decir, en
condiciones similares a las fisiológicas donde la coexistencia de ambas subpoblaciones
durante el cultivo y la activación celular puede influir en su comportamiento y por tanto
en el patrón de expresión de receptores de las mismas. Las discrepancias encontradas
pueden deberse también a la forma de activación empleada.
La inhibición de NF-κB se ha propuesto recientemente como un mecanismo de
sensibilización de algunos tumores resistentes a TRAIL ya que este factor de
transcripción se encuentra activado de forma constitutiva modulando la expresión de
ciertas proteínas antiapoptóticas en algunos modelos tumorales (Huerta-Yepez et al.,
2004). En este trabajo se muestra como los inhibidores de NF-κB pueden igualmente
sensibilizar a los linfocitos T activados a la muerte por TRAIL. Este efecto se ha
observado especialmente con los inhibidores BAY 11-7085 y sulfosalazina. En el caso
de partenolide el efecto es demasiado bajo para ser significativo, a pesar de que inhibe
claramente la translocación de las subunidades p50 y p65 de NF-κB al núcleo, pudiendo
este hecho deberse a que este compuesto presenta otros efectos colaterales como es la
activación de la vía de JNK y la inhibición de STAT3 (Nakshatri et al., 2004; Sobota et
al., 2000) que pueden interferir con las señales derivadas de la inhibición de NF-κB.
Si bien es cierto que la expresión de los receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y
-R2 en membrana es demasiado baja en células T activadas como para ser detectada
mediante análisis citofluorimétrico, y que el tratamiento con BAY 11-7085 induce una
137
reducción a nivel de ARNm de dichos receptores, hemos encontrado una clara
activación de caspasa-8 en respuesta a TRAIL en células pretratadas con el inhibidor de
NF-κB. Por tanto, los niveles de ambos receptores o de cualquiera de ellos en la
membrana de linfocitos T activados deben ser suficientes para transmitir la señal de
muerte tras la interacción con su ligando TRAIL. Además de la regulación de estos dos
receptores hemos demostrado un descenso claro en la expresión de TRAIL-R4, tanto a
nivel de ARNm como de proteína en membrana. Esta reducción debería tener más
relevancia en el caso de linfocitos T CD4+ ya que supone que el porcentaje de células
que expresan dicho receptor tras el pretramiento con BAY 11-7085 es muy bajo,
mientras que el 100% de células T CD8+ siguen siendo positivas para el mismo. A
pesar de ello, los resultados obtenidos con poblaciones de células T CD4+ y CD8+
aisladas demuestran que la sensibilización a TRAIL por el inhibidor de NF-κB es
similar en ambas subpoblaciones. Estos resultados pueden explicarse si tenemos en
cuenta el papel regulador propuesto recientemente para TRAIL-R4 (Clancy et al.,
2005). Estos autores demuestran que TRAIL-R4 puede asociarse con TRAIL-R2
formando un complejo inhibidor de muerte, de manera independiente de la presencia del
ligando, y que dicho complejo preformado parece controlar la sensibilidad de linfocitos
T CD8+ a la apoptosis mediada por TRAIL. De este modo, la reducción de los niveles
de expresión de TRAIL-R4 por inhibición de NF-κB en la población CD8+ puede
contribuir de manera significativa en su sensibilización a TRAIL. En cualquier caso, no
podemos descartar la existencia de otros mecanismos implicados en dicha
sensibilización. Además de los niveles de TRAIL-R4, el tratamiento con BAY 11-7085
disminuye la expresión de proteínas anti-apoptóticas previamente descritas como
regulables por NF-κB, tales como FLIPs, XIAP y c-IAP2. Aunque se desconoce la
contribución de cada uno de estos factores en la resistencia a la muerte mediada por
TRAIL de los linfocitos T activados, en conjunto, la regulación todos ellos puede
explicar la sensibilización a TRAIL de estas células en respuesta a la inhibición de NF-
κB. En el caso de Bcl-2, aunque se produce una reducción temprana en los niveles de
ARNm, nuestros datos sugieren que este factor anti-apoptótico no debe estar implicado
en el efecto del inhibidor de NF-κB ya que en los tiempos en que se detecta
sensibilización a TRAIL (24 horas) todavía no se observan cambios en los niveles de
proteína.
138
En relación con los linfocitos T en reposo, el comportamiento observado es distinto
al de las células T activadas de modo que la respuesta de estas células al tratamiento con
el inhibidor de NF-κB varía entre diferentes donantes. En estado de reposo, el nivel de
activación de este factor de transcripción es muy bajo, incrementándose posteriormente
en respuesta a señales activadoras. A este hecho debe unirse la presencia de complejos
homodiméricos de p50 en células en reposo que actúan como represores de la
transcripción, en contraposición con los heterodímeros de p50/p65 que se localizan en
células T activadas y que son activadores de la transcripción (Algarte et al., 1995). Estas
características del factor de transcripción NF-κB en células T en reposo, junto con las
propias particularidades de cada donante, pueden influir sobre los efectos del inhibidor
BAY 11-7085 en dichas células. Además, debemos tener en cuenta la capacidad de
TRAIL para activar NF-κB cuando se une a los receptores pro-apoptóticos y a TRAIL-
R4 en determinados tipos celulares (Franco et al., 2001). Es posible que esto pueda estar
ocurriendo en las células T en reposo, lo que explicaría que TRAIL pueda contrarrestar
los efectos citotóxicos del propio inhibidor de NF-κB en estas células. Por otro lado está
descrito que, en general, los linfocitos T en reposo presentan una mayor resistencia a la
muerte por apoptosis que los linfocitos T activados (Wesselborg et al., 1993), por lo que
deben existir mecanismos diferentes en ambos estadios de activación que regulan la
inducción de apoptosis y que por tanto pueden afectar al umbral de sensibilización a
TRAIL. Diferentes autores han descrito diversos cambios en la expresión de factores
pro- y anti-apoptóticos como posible causa de las diferencias en la susceptibilidad a
apoptosis entre células T en reposo y activadas (Bosque et al., 2005; Broome et al.,
1995; Schmitz et al., 2003). Nuestro análisis comparativo entre ambos tipos de células
muestra una menor expresión de Bax en linfocitos T en reposo que podría explicar su
mayor resistencia a la muerte por apoptosis. Sin embargo, la expresión del receptor
señuelo TRAIL-R4 también es menor en estas células y los niveles de la proteína Bid
son significativamente mayores que en células T activadas, lo que en principio estaría
relacionado con una mayor sensibilidad a TRAIL. Sería interesante realizar un análisis
más exhaustivo de los mecanismos de resistencia a TRAIL y la posible activación de
NF-κB en respuesta a este ligando en células T en reposo. En relación con los bajos
niveles de Bid encontrados en linfocitos T activados, pensamos que deben ser
suficientes para permitir la sensibilización a TRAIL dado que no se incrementan en
respuesta al tratamiento con BAY 11-7085.
139
La activación de NF-κB es esencial en numerosos procesos fisiológicos y juega
un papel crucial en el desarrollo de la respuesta inmunitaria, por ejemplo en la
proliferación de linfocitos y en la producción de citoquinas, lo que sugiere que el uso de
inhibidores de NF-κB puede dar lugar a una gran variedad de efectos colaterales.
Nuestros resultados demuestran que dichos inhibidores no solo sensibilizan a linfocitos
T activados a la apoptosis mediada por TRAIL sino que también presentan una
toxicidad variable para las células T, tanto en reposo como activadas. Recientemente se
ha descrito la implicación de NF-κB en la resistencia de células uroteliales normales
humanas a TRAIL (Steele et al., 2006). En conjunto, estos datos sugieren que NF-κB
puede jugar algún papel en la resistencia de algunas células primarias a TRAIL y
cuestionan la posible utilización de inhibidores de NF-κB en terapia antitumoral.
Aunque los inhibidores del proteasoma bloquean la activación de NF-κB, no hemos
observado efectos en la resistencia de células T a la apoptosis mediada por TRAIL tras
el pretratamiento con bortezomib. Esto es debido posiblemente a que dichos inhibidores
presentan multitud de efectos biológicos de manera que el resultado neto de todos ellos
puede no ser apropiado para inducir la sensibilización de los linfocitos T a TRAIL. Sin
embargo, sí presentan una elevada toxicidad especialmente para los linfocitos T
activados. De forma similar, otros moduladores de la sensibilidad de células tumorales a
TRAIL, como la doxorubicina o el nocodazol, muestran una toxicidad moderada para
linfocitos T activados. Estos resultados ponen en duda la posible utilización de dichos
compuestos en terapias combinadas con TRAIL. Por el contrario, otros agentes como
los inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) se presentan como una prometedora
estrategia en la sensibilización de células tumorales a la apoptosis mediada por TRAIL
debido a su falta de toxicidad y a su incapacidad para sensibilizar a células T primarias.
También los inhibidores de la vía PI3K/Akt podrían ser útiles en el tratamiento de
tumores con una elevada actividad de esta ruta de supervivencia que produce un
bloqueo en la señalización de apoptosis en respuesta a TRAIL (Nam et al., 2003;
Nesterov et al., 2001).
140
3. POTENCIACIÓN POR INHIBIDORES DE HDAC DE LA APOPTOSIS
MEDIADA POR TRAIL EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS
Como hemos indicado previamente, la importancia de TRAIL como agente
terapéutico frente al cáncer radica en su falta de toxicidad para la mayoría de las células
no transformadas. En linfocitos T de donantes sanos hemos observado que la ruta de
señalización de apoptosis mediada por TRAIL se ve inhibida desde su etapa más apical,
esto es, a nivel de la activación de la caspasa-8 iniciadora, posiblemente debido a que
los niveles de la proteína inhibidora de apoptosis c-FLIP son elevados y a que la
expresión de los receptores pro-apoptóticos es muy baja. En el presente trabajo
demostramos que inhibidores de HDAC pertenecientes a diferentes categorías
estructurales potencian la ruta de señalización de TRAIL en células T leucémicas sin
que se llegue a romper la resistencia apical presentada por los linfocitos T primarios.
Curiosamente la potenciación de la apoptosis por HDACi parece deberse en parte a la
regulación selectiva de la expresión del receptor TRAIL-R2 y de la proteína anti-
apoptótica FLIP en células T leucémicas, pero no en células T normales.
Entre los posibles agentes empleados en terapia antitumoral, los HDACi se han
perfilado en los últimos años como una estrategia interesante en la lucha contra el
cáncer en combinación con TRAIL. La mayor parte de los estudios se han centrado
hasta ahora en leucemia linfática crónica B (B-CLL), donde se ha observado que la
sensibilización a TRAIL por HDACi, como el TSA, está mediada por un aumento en la
formación del DISC asociado al receptor TRAIL-R1 (MacFarlane et al., 2005); y en
leucemia mieloide aguda (AML), donde se ha demostrado que el MS-275 incrementa la
expresión de TRAIL (Nebbioso et al., 2005). Algunos de los HDACi frecuentemente
utilizados, como el VPA o el MS-275 son específicos de HDAC tipo I (HDAC1,
HDAC2, HDAC3 y HDAC8) mientras que los hidroxamatos (TSA y SAHA) actúan de
forma no selectiva, tanto sobre las HDAC de tipo I como de tipo II (HDAC4, HDAC5,
HDAC6 y HDAC7). Se ha demostrado que ciertos tumores solamente son susceptibles a
la inducción de apoptosis por determinados HDACi, como es el caso de algunas
leucemias linfáticas agudas B y T en las que el MS-275 no es capaz de provocar la
muerte celular, mientras que sí lo hacen VPA y SAHA (Tsapis et al., 2007). También se
ha descrito que la inhibición de HDAC de clase I, pero no de clase II, es fundamental
para la sensibilización a TRAIL de células de B-CLL (Inoue et al., 2006a). Nuestros
141
resultados demuestran un comportamiento uniforme de distintos HDACi, con
independencia del tipo de HDAC sobre el que ejercen su acción inhibidora, en el
mantenimiento de la resistencia a TRAIL de linfocitos no transformados, así como en la
sensibilización a TRAIL de las diferentes líneas de leucemias T sensibles a este ligando.
La única excepción la constituye la apicidina, ya que en el caso de este HDACi
observamos una menor potenciación de la inducción de apoptosis por TRAIL en células
Jurkat, en comparación con el resto de los inhibidores, y prácticamente nula en el caso
de las líneas CEM-6 y MOLT-4, a pesar de que a las concentraciones empleadas se
detecta claramente el incremento en los niveles de acetilación de histonas en dichas
células. En realidad la apicidina, comparada con el resto de HDACi utilizados en este
trabajo, constituye una excepción en la mayoría de los aspectos analizados.
Diversos estudios han descrito el incremento de los niveles de TRAIL-R2 en
extractos citosólicos de diferentes tipos de células sensibles al ligando de muerte
TRAIL en respuesta al tratamiento con HDACi (Inoue et al., 2004; Nakata et al., 2004).
El estudio comparativo del efecto de HDACi pertenecientes a las distintas familias
estructurales en líneas de células T leucémicas nos ha permitido demostrar que la
mayoría de ellos inducen un incremento en los niveles del receptor TRAIL-R2 en
membrana, con excepción de la apidicina y del TSA. Además de los cambios en la
expresión de este receptor, se ha descrito la regulación de diversas proteínas pro- y anti-
apoptóticas por diferentes HDACi en diversos modelos de células tumorales (Rosato et
al., 2003; Sanda et al., 2007). Tras el análisis de la expresión de numerosos genes
implicados en la ruta de señalización de TRAIL, nuestros resultados han demostrado
que la mayoría de los HDACi analizados, de nuevo con la excepción de TSA y
apicidina, provocan un descenso en los niveles de ARNm de FLIPs en las distintas
líneas leucémicas T sensibles a TRAIL. Aunque los niveles de esta proteína son bajos
en las líneas leucémicas, con respecto a la expresión en linfocitos T de donantes sanos,
es posible que juegue un papel importante en la sensibilización a TRAIL. Además
hemos observado una pérdida en la expresión de la proteína FLIPL que parece tener
lugar a nivel postransduccional, ya que no va a acompañada de una regulación de los
niveles de ARNm. Por tanto, la regulación de FLIP, junto con el incremento en los
niveles de TRAIL-R2, pueden explicar la mayor activación de la caspasa-8 iniciadora
en los tratamientos combinados de HDACi y TRAIL. Es importante señalar que
recientemente se ha publicado un trabajo donde se demuestra que la potenciación de la
142
ruta de TRAIL por HDACi no depende del incremento en la expresión de receptor
TRAIL-R2 en diferentes modelos tumorales (Inoue et al., 2006b).
En general, nuestros datos indican que no todos los HDACi parecen compartir
un mismo mecanismo de acción ni presentar similares efectos sobre las líneas T
leucémicas. La escasa o nula capacidad de la apicidina para potenciar la acción de
TRAIL en las distintas líneas leucémicas T correlaciona con su baja o nula capacidad
para regular los niveles tanto del receptor TRAIL-R2 como de la proteína FLIPs.
Recientemente se ha descrito que la apicidina inhibe selectivamente a las HDAC2 y
HDAC3 (Khan et al., 2008), lo que sugiere que ambas HDAC pueden no estar
implicadas en la regulación de FLIPs y TRAIL-R2 en células T leucémicas y que solo
en células Jurkat podrían jugar algún papel en la regulación de la sensibilidad a TRAIL,
por un mecanismo independiente de la modulación de estos genes. El caso del TSA es
más controvertido ya que, si bien hemos mostrado su incapacidad para modular la
expresión del receptor TRAIL-R2 y de FLIPs a la concentración seleccionada, también
es cierto que este HDACi sí potencia la inducción de apoptosis por TRAIL en las tres
líneas leucémicas sensibles. Por el contrario el SAHA, perteneciente a la misma familia
y con igual espectro de acción que el TSA (inhibición de HDAC tipos I y II), presenta
ambos efectos de incremento del receptor y potenciación de la apoptosis. Es posible que
la actividad del TSA sea menor que la del SAHA sobre determinadas HDAC cuya
inhibición es necesaria para regular la expresión del receptor de TRAIL y de FLIPs. En
cualquier caso, estos datos sugieren que la causa de la potenciación de la apoptosis
mediada por TRAIL no debe ser la regulación de uno o dos genes solamente, hecho que
además viene apoyado por el amplio espectro de la acción reguladora de los HDACi.
Uno de los múltiples factores que pueden contribuir a la acción de HDACi es
NF-κB. Algunos estudios han demostrado que TSA inhibe la activación de este factor
de transcripción favoreciendo la entrada en apoptosis de la célula tumoral (Hu and
Colburn, 2005; Yao et al., 2006) mientras que en otros se ha descrito la activación de
NF-κB por distintos HDACi, como TSA, SAHA y apicidina (Ashburner et al., 2001;
Domingo-Domenech et al., 2007; Kim et al., 2006). Si esta última hipótesis es correcta,
la capacidad de activación de NF-κB por parte de los distintos HDACi en nuestro
modelo de células T leucémicas puede ser diferente, de forma que el efecto pro-
apoptótico de los inhibidores puede estar compensado en mayor o menor medida por la
activación de la vía de supervivencia de NF-κB(Mayo et al., 2003). Además se sabe que
143
TRAIL-R2 y FLIP pueden ser regulados por NF-κB por lo que los niveles de estas
proteínas en respuesta al tratamiento con HDACi se verían afectados de forma diferente
dependiendo del grado de activación de este factor de transcripción. Por otra parte,
aunque se ha descrito la inducción de apoptosis en linfomas T cutáneos por el
tratamiento con elevadas dosis de SAHA (Duvic and Vu, 2007), a las dosis subletales
utilizadas en nuestro trabajo de este y de otros HDACi no hemos encontrado
sensibilización a TRAIL de células primarias procedentes de pacientes con linfoma T
cutáneo o con diferentes tipos de leucemias T. La baja toxicidad de los HDACi y la
ausencia de sensibilización a TRAIL en células T leucémicas primarias así como en
células T normales también podrían venir determinadas por una mayor activación de
NF-κB en estas células.
La diferencia en el mecanismo de acción de los HDACi parece ir ligada no solo
a su estructura y a su actividad sobre HDAC concretas, sino que también varía en
función del modelo tumoral empleado. Así, estudios realizados por varios autores sobre
el efecto del ácido hidroxámico SAHA indican que este inhibidor puede regular la
expresión de genes diferentes en distintos tipos de células tumorales. Por ejemplo, en
células de hepatoma induce un aumento en la expresión de Bim y de Bcl-xs, mientras
que en células de cáncer de mama puede modular la expresión Bim, Bak, XIAP,
survivina y Bcl-2, y en células de mieloma múltiple es capaz de inducir la expresión de
otras proteínas pro-apoptóticas como Bax, Noxa y Puma (además de Bim y Bak)
(Emanuele et al., 2007; Fandy et al., 2005). En nuestro modelo de células T leucémcias
no hemos observado regulación de ninguna de las proteínas analizadas de la familia de
Bcl-2 ni de los IAPs en respuesta al tratamiento con SAHA ni con ningún otro HDACi.
En relación con esta ausencia de regulación de proteínas de la familia de Bcl-2, no
debemos olvidar que las líneas tumorales analizadas necesitan activar la ruta
mitocondrial a través de Bid para completar la señalización de muerte celular en
respuesta a TRAIL. Un estudio reciente demuestra cómo la sobreexpresión de Bcl-2 o
de Bcl-xL pueden bloquear la inducción de apoptosis por combinación de ciertos
HDACi y TRAIL en células Jurkat, poniendo de manifiesto la relevancia de esta ruta
mitocondrial (Shankar et al., 2005b). De hecho, según algunos trabajos, la mitocondria
es la vía fundamental afectada por los HDACi en ciertos modelos tumorales como la
línea de leucemia mieloide sensible a TRAIL U937, ya que la potenciación de la
apoptosis no está asociada a un incremento de receptores de muerte ni a un descenso en
144
los niveles de FLIP (Rosato et al., 2003). En el trabajo de Shankar y colaboradores (Ref.
Shankar) el tratamiento con HDACi a concentraciones ligeramente superiores a las de
nuestro estudio provoca en células U937 el descenso de XIAP, c-IAP, Mcl-1, Bcl-2 y
Bcl-xL. En nuestro caso, a pesar de no haber observado regulación de las proteínas
analizadas relacionadas con la ruta mitocondrial no podemos descartar un posible efecto
a nivel de esta ruta, por regulación de otros factores pro- o anti-apoptóticos distintos a
los hasta ahora analizados, en la acción de los HDACi en células T leucémicas,
especialmente en el caso del TSA que solo es capaz de regular los niveles de FLIPL pero
no de TRAIL-R4 ni FLIPs.
Ciertos estudios han demostrado también la regulación de la expresión de
caspasas-3 y -9 en células tratadas con diversos inhibidores de HDAC (Shankar et al.,
2005b; Wallace et al., 2006). Nuestro estudio comparativo de los niveles de ARNm de
ambas caspasas por PCR a tiempo real ha demostrado que tan sólo se produce un
incremento en los mismos tras el tratamiento con VPA, pero no con el resto de
inhibidores, lo que vuelve a confirmar la acción diferencial sobre distintos genes de los
distintos HDACi en nuestro modelo celular. Sin embargo a nivel de proteína sí hemos
observado un cierto incremento en la expresión de ambas caspasas en respuesta al
tratamiento con todos los HDACi analizados. Esta regulación podría jugar un papel
importante en la potenciación de la apoptosis mediada por TRAIL y, sobretodo, en la
inducida por TSA. La regulación a nivel de proteína, y no de ARNm, de caspasas puede
explicarse debido a la capacidad de los HDAC para modificar distintas proteínas no
histonas, algunas de las cuales presentan distintos efectos a nivel postraduccional. Uno
de estos efectos está relacionado con la estabilidad de las proteínas. Se ha descrito que
tanto la acetilación como la ubiquitinación pueden tener lugar en el mismo residuo de
lisina, existiendo una regulación cruzada de ambas modificaciones (Caron et al., 2005).
La competencia entre ambos procesos influye en la estabilidad de la proteína ya que las
HDACs pueden disminuir la vida media mediante cambios conformacionales que
provocan la exposición de los residuos de lisina para su ubiquitinación (Giandomenico
et al., 2003). De esta forma los distintos HDACi, al permitir la acetilación de los
residuos de lisina, pueden estar impidiendo la degradación de las caspasas-3 y -9 a nivel
del proteasoma, provocando una mayor actividad de las mismas a pesar de no existir
modulación a nivel del promotor. En el caso de FLIPL hemos observado una regulación
contraria a la de caspasas, es decir, una pérdida de expresión a nivel de proteína, pero no
145
es de extrañar si tenemos en cuenta que las HDACs pueden tener muchos otros efectos
por ejemplo en la interacción o en la localización de proteínas, cuyas consecuencias
pueden ser muy variadas.
Por otro lado, los resultados obtenidos con los inhibidores de caspasas parecen
demostrar la importancia de la vía mitocondrial en la potenciación de la apoptosis. Dado
que el inhibidor de caspasa-9 bloquea de manera muy significativa la activación de
caspasa-8 en respuesta al tratamiento con HDACi y TRAIL, debemos entender que
estos facilitan la activación de caspasa-9 de forma independiente de la activación de la
caspasa-8 apical y que en gran medida esta última se activa como consecuencia de la
activación de la caspasa-9 y de caspasas efectoras (ruta de amplificación de la señal de
muerte celular) (Slee et al., 1999). Un estudio reciente muestra cómo la potenciación de
la apoptosis por combinación de TSA y TRAIL en células de cáncer torácico se bloquea
mediante la inhibición de la caspasa-9 (Reddy et al., 2007). Sin embargo, no debemos
olvidar la posible acción inespecífica de los inhibidores de caspasas a las
concentraciones utilizadas por lo que sería interesante realizar un estudio más
exhaustivo de la acción de los HDACi en células sin caspasa-8. Por tanto, ensayos con
ARNi de esta caspasa podrían ser muy útiles para conocer la verdadera implicación de
la caspasas-8 y –9 en la potenciación de la apoptosis por dichos inhibidores. Además, el
análisis de la posible potenciación de la formación del DISC podría ayudar a establecer
la relevancia de dichas caspasas.
Por otra parte, futuros estudios deberían incluir la regulación de la expresión y
función por HDACi de otras proteínas que favorecen la activación de caspasa-9, como
son Smac/DIABLO y Apaf-1, a la vista de los datos obtenidos por otros autores
mediante ensayos de micro-array (Peart et al., 2005). También se ha descrito que, junto
con inducción de apoptosis por regulación de la expresión de TRAIL en células
leucémicas, los HDACi a concentraciones elevadas pueden provocar la muerte celular
mediante producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Ruefli et al., 2001). Sería
interesante analizar si el tratamiento con HDACi a las concentraciones empleadas para
la sensibilización de leucemias T a TRAIL provoca igualmente un incremento en la
producción de ROS que favorece la acción de este ligando de muerte.
146
147
VI. CONCLUSIONES
148
149
1.- El factor de transcripción NFAT está implicado en la regulación de la expresión
del ligando de muerte TRAIL funcional en células T activadas, encontrándose el sitio de
unión a este factor en la región de 165 pb del promotor proximal al sitio de inicio de
transcripción.
2.- Los linfocitos T en reposo y activados presentan una resistencia similar a la
apoptosis mediada por TRAIL. Entre los posibles mecanismos que controlan dicha
resistencia encontramos la expresión de las proteínas anti-apoptóticas TRAIL-R4 y
FLIP así como la baja expresión en membrana de los receptores pro-apoptóticos
TRAIL-R1 y –R2.
3.- Inhibidores de la activación del factor de transcripción NF-κB, como el compuesto
BAY 11-7085, sensibilizan a los linfocitos T activados a la apoptosis mediada por
TRAIL mediante la regulación de la expresión de diversos factores anti-apoptóticos
implicados en la ruta de señalización de TRAIL.
4.- Inhibidores de HDAC pertenecientes a diferentes grupos estructurales, con
excepción del péptido cíclico apicidina, potencian la apoptosis mediada por TRAIL en
diferentes líneas leucémicas T sensibles a este ligando, pero no en células T leucémicas
resistentes ni en linfocitos T primarios.
5.- Los inhibidores de HDAC potencian todas las señales implicadas en la ruta de
apoptosis mediada por TRAIL en líneas de células T leucémicas: activación de
caspasas-8 y –9, eventos mitocondriales y activación de caspasas efectoras como la
caspasa-3.
6.- Los inhibidores de HDAC SAHA, VPA, MS-275 y butirato sódico, incrementan
la expresión del receptor pro-apoptótico TRAIL-R2 y reducen la expresión de FLIP en
células T leucémicas.
150
151
VII. BIBLIOGRAFÍA
152
153
Adams, J. (2004) The proteasome: a suitable antineoplastic target. Nat Rev Cancer, 4,
349-360.
Algarte, M., Lecine, P., Costello, R., Plet, A., Olive, D. and Imbert, J. (1995) In vivo
regulation of interleukin-2 receptor alpha gene transcription by the coordinated
binding of constitutive and inducible factors in human primary T cells. Embo J,
14, 5060-5072.
Alladina, S.J., Song, J.H., Davidge, S.T., Hao, C. and Easton, A.S. (2005) TRAIL-
induced apoptosis in human vascular endothelium is regulated by
phosphatidylinositol 3-kinase/Akt through the short form of cellular FLIP and
Bcl-2. J Vasc Res, 42, 337-347.
Amran, D., Sanchez, Y., Fernandez, C., Ramos, A.M., de Blas, E., Breard, J., Calle, C.
and Aller, P. (2007) Arsenic trioxide sensitizes promonocytic leukemia cells to
TNFalpha-induced apoptosis via p38-MAPK-regulated activation of both
receptor-mediated and mitochondrial pathways. Biochim Biophys Acta, 1773,
1653-1663.
Anest, V., Hanson, J.L., Cogswell, P.C., Steinbrecher, K.A., Strahl, B.D. and Baldwin,
A.S. (2003) A nucleosomal function for IkappaB kinase-alpha in NF-kappaB-
dependent gene expression. Nature, 423, 659-663.
Ashburner, B.P., Westerheide, S.D. and Baldwin, A.S., Jr. (2001) The p65 (RelA)
subunit of NF-kappaB interacts with the histone deacetylase (HDAC)
corepressors HDAC1 and HDAC2 to negatively regulate gene expression. Mol
Cell Biol, 21, 7065-7077.
Ashkenazi, A., Pai, R.C., Fong, S., Leung, S., Lawrence, D.A., Marsters, S.A., Blackie,
C., Chang, L., McMurtrey, A.E., Hebert, A., DeForge, L., Koumenis, I.L.,
Lewis, D., Harris, L., Bussiere, J., Koeppen, H., Shahrokh, Z. and Schwall, R.H.
(1999) Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J Clin
Invest, 104, 155-162.
Baetu, T.M., Kwon, H., Sharma, S., Grandvaux, N. and Hiscott, J. (2001) Disruption of
NF-kappaB signaling reveals a novel role for NF-kappaB in the regulation of
TNF-related apoptosis-inducing ligand expression. J Immunol, 167, 3164-3173.
154
Banner, D.W., D'Arcy, A., Janes, W., Gentz, R., Schoenfeld, H.J., Broger, C.,
Loetscher, H. and Lesslauer, W. (1993) Crystal structure of the soluble human
55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor
activation. Cell, 73, 431-445.
Basseres, D.S. and Baldwin, A.S. (2006) Nuclear factor-kappaB and inhibitor of
kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene, 25,
6817-6830.
Baxter, A.G. and Cooke, A. (1995) The genetics of the NOD mouse. Diabetes Metab
Rev, 11, 315-335.
Baylin, S.B. and Ohm, J.E. (2006) Epigenetic gene silencing in cancer - a mechanism
for early oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer, 6, 107-116.
Bernard, D., Quatannens, B., Vandenbunder, B. and Abbadie, C. (2001) Rel/NF-kappaB
transcription factors protect against tumor necrosis factor (TNF)-related
apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis by up-regulating the
TRAIL decoy receptor DcR1. J Biol Chem, 276, 27322-27328.
Bertin, J., Armstrong, R.C., Ottilie, S., Martin, D.A., Wang, Y., Banks, S., Wang, G.H.,
Senkevich, T.G., Alnemri, E.S., Moss, B., Lenardo, M.J., Tomaselli, K.J. and
Cohen, J.I. (1997) Death effector domain-containing herpesvirus and poxvirus
proteins inhibit both Fas- and TNFR1-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U
S A, 94, 1172-1176.
Boatright, K.M., Renatus, M., Scott, F.L., Sperandio, S., Shin, H., Pedersen, I.M., Ricci,
J.E., Edris, W.A., Sutherlin, D.P., Green, D.R. and Salvesen, G.S. (2003) A
unified model for apical caspase activation. Mol Cell, 11, 529-541.
Bodmer, J.L., Meier, P., Tschopp, J. and Schneider, P. (2000) Cysteine 230 is essential
for the structure and activity of the cytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem, 275,
20632-20637.
Bodmer, J.L., Schneider, P. and Tschopp, J. (2002) The molecular architecture of the
TNF superfamily. Trends Biochem Sci, 27, 19-26.
Bork, P.M., Schmitz, M.L., Kuhnt, M., Escher, C. and Heinrich, M. (1997)
Sesquiterpene lactone containing Mexican Indian medicinal plants and pure
155
sesquiterpene lactones as potent inhibitors of transcription factor NF-kappaB.
FEBS Lett, 402, 85-90.
Borner, C. (2003) The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death
decisions. Mol Immunol, 39, 615-647.
Bosque, A., Pardo, J., Martinez-Lorenzo, M.J., Iturralde, M., Marzo, I., Pineiro, A.,
Alava, M.A., Naval, J. and Anel, A. (2005) Down-regulation of normal human T
cell blast activation: roles of APO2L/TRAIL, FasL, and c- FLIP, Bim, or Bcl-x
isoform expression. J Leukoc Biol, 77, 568-578.
Bradbury, D.A., Simmons, T.D., Slater, K.J. and Crouch, S.P. (2000) Measurement of
the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of
cell viability, necrosis and apoptosis. J Immunol Methods, 240, 79-92.
Bremner, P. and Heinrich, M. (2002) Natural products as targeted modulators of the
nuclear factor-kappaB pathway. J Pharm Pharmacol, 54, 453-472.
Brooks, A.D. and Sayers, T.J. (2005) Reduction of the antiapoptotic protein cFLIP
enhances the susceptibility of human renal cancer cells to TRAIL apoptosis.
Cancer Immunol Immunother, 54, 499-505.
Broome, H.E., Dargan, C.M., Krajewski, S. and Reed, J.C. (1995) Expression of Bcl-2,
Bcl-x, and Bax after T cell activation and IL-2 withdrawal. J Immunol, 155,
2311-2317.
Buggy, J.J., Sideris, M.L., Mak, P., Lorimer, D.D., McIntosh, B. and Clark, J.M. (2000)
Cloning and characterization of a novel human histone deacetylase, HDAC8.
Biochem J, 350 Pt 1, 199-205.
Carapeti, M., Aguiar, R.C., Watmore, A.E., Goldman, J.M. and Cross, N.C. (1999)
Consistent fusion of MOZ and TIF2 in AML with inv(8)(p11q13). Cancer
Genet Cytogenet, 113, 70-72.
Caron, C., Boyault, C. and Khochbin, S. (2005) Regulatory cross-talk between lysine
acetylation and ubiquitination: role in the control of protein stability. Bioessays,
27, 408-415.
Carrozza, M.J., Utley, R.T., Workman, J.L. and Cote, J. (2003) The diverse functions of
histone acetyltransferase complexes. Trends Genet, 19, 321-329.
156
Clancy, L., Mruk, K., Archer, K., Woelfel, M., Mongkolsapaya, J., Screaton, G.,
Lenardo, M.J. and Chan, F.K. (2005) Preligand assembly domain-mediated
ligand-independent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2
regulates TRAIL-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 18099-
18104.
Clarke, N., Jimenez-Lara, A.M., Voltz, E. and Gronemeyer, H. (2004) Tumor
suppressor IRF-1 mediates retinoid and interferon anticancer signaling to death
ligand TRAIL. Embo J, 23, 3051-3060.
Cleary, M.L. and Sklar, J. (1987) Formation of a hybrid bcl-2/immunoglobulin
transcript as a result of t(14;18) chromosomal translocation. Haematol Blood
Transfus, 31, 314-319.
Collins, I. and Garrett, M.D. (2005) Targeting the cell division cycle in cancer: CDK
and cell cycle checkpoint kinase inhibitors. Curr Opin Pharmacol, 5, 366-373.
Corazza, N., Jakob, S., Schaer, C., Frese, S., Keogh, A., Stroka, D., Kassahn, D.,
Torgler, R., Mueller, C., Schneider, P. and Brunner, T. (2006) TRAIL receptor-
mediated JNK activation and Bim phosphorylation critically regulate Fas-
mediated liver damage and lethality. J Clin Invest, 116, 2493-2499.
Cory, S. and Adams, J.M. (2002) The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-
death switch. Nat Rev Cancer, 2, 647-656.
Crazzolara, R. and Bernhard, D. (2005) CXCR4 chemokine receptors, histone
deacetylase inhibitors and acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma, 46,
1545-1551.
Cryns, V. and Yuan, J. (1998) Proteases to die for. Genes Dev, 12, 1551-1570.
Cuconati, A., Mukherjee, C., Perez, D. and White, E. (2003) DNA damage response and
MCL-1 destruction initiate apoptosis in adenovirus-infected cells. Genes Dev,
17, 2922-2932.
Cha, S.S., Sung, B.J., Kim, Y.A., Song, Y.L., Kim, H.J., Kim, S., Lee, M.S. and Oh,
B.H. (2000) Crystal structure of TRAIL-DR5 complex identifies a critical role
of the unique frame insertion in conferring recognition specificity. J Biol Chem,
275, 31171-31177.
157
Chao, J.R., Wang, J.M., Lee, S.F., Peng, H.W., Lin, Y.H., Chou, C.H., Li, J.C., Huang,
H.M., Chou, C.K., Kuo, M.L., Yen, J.J. and Yang-Yen, H.F. (1998) mcl-1 is an
immediate-early gene activated by the granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor (GM-CSF) signaling pathway and is one component of the
GM-CSF viability response. Mol Cell Biol, 18, 4883-4898.
Chaudhary, P.M., Eby, M., Jasmin, A., Bookwalter, A., Murray, J. and Hood, L. (1997)
Death receptor 5, a new member of the TNFR family, and DR4 induce FADD-
dependent apoptosis and activate the NF-kappaB pathway. Immunity, 7, 821-
830.
Chen, L., Willis, S.N., Wei, A., Smith, B.J., Fletcher, J.I., Hinds, M.G., Colman, P.M.,
Day, C.L., Adams, J.M. and Huang, D.C. (2005) Differential targeting of
prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary
apoptotic function. Mol Cell, 17, 393-403.
Chen, Y., Zhou, J., Yue, B., Xiang, Z., Song, X., Li, C. and Wang, B. (1998) Bcl-2 gene
and its family genes Bax, Bcl-Xl as well as Fas/Apo-1 and their clinical
significance in acute leukemia. Chin Med J (Engl), 111, 682-685.
Dai, Y., Dent, P. and Grant, S. (2003) Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing
ligand (TRAIL) promotes mitochondrial dysfunction and apoptosis induced by
7-hydroxystaurosporine and mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors
in human leukemia cells that ectopically express Bcl-2 and Bcl-xL. Mol
Pharmacol, 64, 1402-1409.
Degli-Esposti, M. (1999) To die or not to die--the quest of the TRAIL receptors. J
Leukoc Biol, 65, 535-542.
Degli-Esposti, M.A., Dougall, W.C., Smolak, P.J., Waugh, J.Y., Smith, C.A. and
Goodwin, R.G. (1997a) The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-kappaB and
protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incomplete death
domain. Immunity, 7, 813-820.
Degli-Esposti, M.A., Smolak, P.J., Walczak, H., Waugh, J., Huang, C.P., DuBose, R.F.,
Goodwin, R.G. and Smith, C.A. (1997b) Cloning and characterization of
TRAIL-R3, a novel member of the emerging TRAIL receptor family. J Exp
Med, 186, 1165-1170.
158
Deveraux, Q.L., Takahashi, R., Salvesen, G.S. and Reed, J.C. (1997) X-linked IAP is a
direct inhibitor of cell-death proteases. Nature, 388, 300-304.
Domingo-Domenech, J., Pippa, R., Tapia, M., Gascon, P., Bachs, O. and Bosch, M.
(2007) Inactivation of NF-kappaB by proteasome inhibition contributes to
increased apoptosis induced by histone deacetylase inhibitors in human breast
cancer cells. Breast Cancer Res Treat.
Dorothee, G., Vergnon, I., Menez, J., Echchakir, H., Grunenwald, D., Kubin, M.,
Chouaib, S. and Mami-Chouaib, F. (2002) Tumor-infiltrating CD4+ T
lymphocytes express APO2 ligand (APO2L)/TRAIL upon specific stimulation
with autologous lung carcinoma cells: role of IFN-alpha on APO2L/TRAIL
expression and -mediated cytotoxicity. J Immunol, 169, 809-817.
Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. and Wang, X. (2000) Smac, a mitochondrial protein that
promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP
inhibition. Cell, 102, 33-42.
Duan, H., Heckman, C.A. and Boxer, L.M. (2005) Histone deacetylase inhibitors down-
regulate bcl-2 expression and induce apoptosis in t(14;18) lymphomas. Mol Cell
Biol, 25, 1608-1619.
Duan, S., Hajek, P., Lin, C., Shin, S.K., Attardi, G. and Chomyn, A. (2003)
Mitochondrial outer membrane permeability change and hypersensitivity to
digitonin early in staurosporine-induced apoptosis. J Biol Chem, 278, 1346-
1353.
Duvic, M. and Vu, J. (2007) Vorinostat: a new oral histone deacetylase inhibitor
approved for cutaneous T-cell lymphoma. Expert Opin Investig Drugs, 16,
1111-1120.
Ehrhardt, H., Fulda, S., Schmid, I., Hiscott, J., Debatin, K.M. and Jeremias, I. (2003)
TRAIL induced survival and proliferation in cancer cells resistant towards
TRAIL-induced apoptosis mediated by NF-kappaB. Oncogene, 22, 3842-3852.
Emanuele, S., Lauricella, M., Carlisi, D., Vassallo, B., D'Anneo, A., Di Fazio, P.,
Vento, R. and Tesoriere, G. (2007) SAHA induces apoptosis in hepatoma cells
and synergistically interacts with the proteasome inhibitor Bortezomib.
Apoptosis, 12, 1327-1338.
159
Eskes, R., Desagher, S., Antonsson, B. and Martinou, J.C. (2000) Bid induces the
oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane.
Mol Cell Biol, 20, 929-935.
Fandy, T.E., Shankar, S., Ross, D.D., Sausville, E. and Srivastava, R.K. (2005)
Interactive effects of HDAC inhibitors and TRAIL on apoptosis are associated
with changes in mitochondrial functions and expressions of cell cycle regulatory
genes in multiple myeloma. Neoplasia, 7, 646-657.
Finnin, M.S., Donigian, J.R., Cohen, A., Richon, V.M., Rifkind, R.A., Marks, P.A.,
Breslow, R. and Pavletich, N.P. (1999) Structures of a histone deacetylase
homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors. Nature, 401, 188-193.
Fionda, C., Nappi, F., Piccoli, M., Frati, L., Santoni, A. and Cippitelli, M. (2007)
Inhibition of trail gene expression by cyclopentenonic prostaglandin 15-deoxy-
delta12,14-prostaglandin J2 in T lymphocytes. Mol Pharmacol, 72, 1246-1257.
Fischle, W., Dequiedt, F., Fillion, M., Hendzel, M.J., Voelter, W. and Verdin, E. (2001)
Human HDAC7 histone deacetylase activity is associated with HDAC3 in vivo.
J Biol Chem, 276, 35826-35835.
Fischle, W., Emiliani, S., Hendzel, M.J., Nagase, T., Nomura, N., Voelter, W. and
Verdin, E. (1999) A new family of human histone deacetylases related to
Saccharomyces cerevisiae HDA1p. J Biol Chem, 274, 11713-11720.
Follows, G.A., Tagoh, H., Lefevre, P., Hodge, D., Morgan, G.J. and Bonifer, C. (2003)
Epigenetic consequences of AML1-ETO action at the human c-FMS locus.
Embo J, 22, 2798-2809.
Franco, A.V., Zhang, X.D., Van Berkel, E., Sanders, J.E., Zhang, X.Y., Thomas, W.D.,
Nguyen, T. and Hersey, P. (2001) The role of NF-kappa B in TNF-related
apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis of melanoma cells. J
Immunol, 166, 5337-5345.
Frisch, S.M. and Screaton, R.A. (2001) Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Biol, 13,
555-562.
Frye, R.A. (1999) Characterization of five human cDNAs with homology to the yeast
SIR2 gene: Sir2-like proteins (sirtuins) metabolize NAD and may have protein
ADP-ribosyltransferase activity. Biochem Biophys Res Commun, 260, 273-279.
160
Fuller, K., Wong, B., Fox, S., Choi, Y. and Chambers, T.J. (1998) TRANCE is
necessary and sufficient for osteoblast-mediated activation of bone resorption in
osteoclasts. J Exp Med, 188, 997-1001.
Galm, O., Herman, J.G. and Baylin, S.B. (2006) The fundamental role of epigenetics in
hematopoietic malignancies. Blood Rev, 20, 1-13.
Gao, L., Cueto, M.A., Asselbergs, F. and Atadja, P. (2002) Cloning and functional
characterization of HDAC11, a novel member of the human histone deacetylase
family. J Biol Chem, 277, 25748-25755.
Georgakis, G.V., Li, Y., Humphreys, R., Andreeff, M., O'Brien, S., Younes, M.,
Carbone, A., Albert, V. and Younes, A. (2005) Activity of selective fully human
agonistic antibodies to the TRAIL death receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 in
primary and cultured lymphoma cells: induction of apoptosis and enhancement
of doxorubicin- and bortezomib-induced cell death. Br J Haematol, 130, 501-
510.
Gerber, M. and Shilatifard, A. (2003) Transcriptional elongation by RNA polymerase II
and histone methylation. J Biol Chem, 278, 26303-26306.
Giandomenico, V., Simonsson, M., Gronroos, E. and Ericsson, J. (2003) Coactivator-
dependent acetylation stabilizes members of the SREBP family of transcription
factors. Mol Cell Biol, 23, 2587-2599.
Giles, F., Verstovsek, S., Faderl, S., Vey, N., Karp, J., Roboz, G., Khan, K.D., Cooper,
M., Bilgrami, S.F., Ferrant, A., Daenen, S., Karsten, V., Cahill, A., Albitar, M.,
Kantarjian, H., O'Brien, S. and Feldman, E. (2006) A phase II study of
cloretazine (VNP40101M), a novel sulfonylhydrazine alkylating agent, in
patients with very high risk relapsed acute myeloid leukemia. Leuk Res, 30,
1591-1595.
Glaser, K.B., Staver, M.J., Waring, J.F., Stender, J., Ulrich, R.G. and Davidsen, S.K.
(2003) Gene expression profiling of multiple histone deacetylase (HDAC)
inhibitors: defining a common gene set produced by HDAC inhibition in T24
and MDA carcinoma cell lines. Mol Cancer Ther, 2, 151-163.
Glozak, M.A., Sengupta, N., Zhang, X. and Seto, E. (2005) Acetylation and
deacetylation of non-histone proteins. Gene, 363, 15-23.
161
Golay, J., Cuppini, L., Leoni, F., Mico, C., Barbui, V., Domenghini, M., Lombardi, L.,
Neri, A., Barbui, A.M., Salvi, A., Pozzi, P., Porro, G., Pagani, P., Fossati, G.,
Mascagni, P., Introna, M. and Rambaldi, A. (2007) The histone deacetylase
inhibitor ITF2357 has anti-leukemic activity in vitro and in vivo and inhibits IL-
6 and VEGF production by stromal cells. Leukemia, 21, 1892-1900.
Goltsev, Y.V., Kovalenko, A.V., Arnold, E., Varfolomeev, E.E., Brodianskii, V.M. and
Wallach, D. (1997) CASH, a novel caspase homologue with death effector
domains. J Biol Chem, 272, 19641-19644.
Gomyo, Y., Sasaki, J., Branch, C., Roth, J.A. and Mukhopadhyay, T. (2004) 5-aza-2'-
deoxycytidine upregulates caspase-9 expression cooperating with p53-induced
apoptosis in human lung cancer cells. Oncogene, 23, 6779-6787.
Gong, B. and Almasan, A. (2000) Genomic organization and transcriptional regulation
of human Apo2/TRAIL gene. Biochem Biophys Res Commun, 278, 747-752.
Gray, S.G. and Ekstrom, T.J. (2001) The human histone deacetylase family. Exp Cell
Res, 262, 75-83.
Green, D.R., Droin, N. and Pinkoski, M. (2003) Activation-induced cell death in T
cells. Immunol Rev, 193, 70-81.
Green, D.R. and Kroemer, G. (2004) The pathophysiology of mitochondrial cell death.
Science, 305, 626-629.
Greil, R., Egle, A. and Villunger, A. (1998) On the role and significance of Fas (Apo-
1/CD95) ligand (FasL) expression in immune privileged tissues and cancer cells
using multiple myeloma as a model. Leuk Lymphoma, 31, 477-490.
Griffith, T.S. and Lynch, D.H. (1998) TRAIL: a molecule with multiple receptors and
control mechanisms. Curr Opin Immunol, 10, 559-563.
Griffith, T.S., Wiley, S.R., Kubin, M.Z., Sedger, L.M., Maliszewski, C.R. and Fanger,
N.A. (1999) Monocyte-mediated tumoricidal activity via the tumor necrosis
factor-related cytokine, TRAIL. J Exp Med, 189, 1343-1354.
Griffiths, G.J., Dubrez, L., Morgan, C.P., Jones, N.A., Whitehouse, J., Corfe, B.M.,
Dive, C. and Hickman, J.A. (1999) Cell damage-induced conformational
changes of the pro-apoptotic protein Bak in vivo precede the onset of apoptosis.
J Cell Biol, 144, 903-914.
162
Grinberg, M., Sarig, R., Zaltsman, Y., Frumkin, D., Grammatikakis, N., Reuveny, E.
and Gross, A. (2002) tBID Homooligomerizes in the mitochondrial membrane
to induce apoptosis. J Biol Chem, 277, 12237-12245.
Gruss, H.J. and Dower, S.K. (1995) Tumor necrosis factor ligand superfamily:
involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood, 85, 3378-3404.
Gu, W., Shi, X.L. and Roeder, R.G. (1997) Synergistic activation of transcription by
CBP and p53. Nature, 387, 819-823.
Guenther, M.G., Lane, W.S., Fischle, W., Verdin, E., Lazar, M.A. and Shiekhattar, R.
(2000) A core SMRT corepressor complex containing HDAC3 and TBL1, a
WD40-repeat protein linked to deafness. Genes Dev, 14, 1048-1057.
Gurley, K.E., Vo, K. and Kemp, C.J. (1998) DNA double-strand breaks, p53, and
apoptosis during lymphomagenesis in scid/scid mice. Cancer Res, 58, 3111-
3115.
Hagemann, C. and Blank, J.L. (2001) The ups and downs of MEK kinase interactions.
Cell Signal, 13, 863-875.
Hahntow, I.N., Schneller, F., Oelsner, M., Weick, K., Ringshausen, I., Fend, F.,
Peschel, C. and Decker, T. (2004) Cyclin-dependent kinase inhibitor
Roscovitine induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia,
18, 747-755.
Han, S., Choi, H., Ko, M.G., Choi, Y.I., Sohn, D.H., Kim, J.K., Shin, D., Chung, H.,
Lee, H.W., Kim, J.B., Park, S.D. and Seong, R.H. (2001) Peripheral T cells
become sensitive to glucocorticoid- and stress-induced apoptosis in transgenic
mice overexpressing SRG3. J Immunol, 167, 805-810.
Handschumacher, R.E., Harding, M.W., Rice, J., Drugge, R.J. and Speicher, D.W.
(1984) Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A.
Science, 226, 544-547.
Hasegawa, H., Yamada, Y., Harasawa, H., Tsuji, T., Murata, K., Sugahara, K., Tsuruda,
K., Masuda, M., Takasu, N. and Kamihira, S. (2004) Restricted expression of
tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 4 in human
peripheral blood lymphocytes. Cell Immunol, 231, 1-7.
163
Hazzalin, C.A., Cuenda, A., Cano, E., Cohen, P. and Mahadevan, L.C. (1997) Effects of
the inhibition of p38/RK MAP kinase on induction of five fos and jun genes by
diverse stimuli. Oncogene, 15, 2321-2331.
Heinzel, T., Lavinsky, R.M., Mullen, T.M., Soderstrom, M., Laherty, C.D., Torchia, J.,
Yang, W.M., Brard, G., Ngo, S.D., Davie, J.R., Seto, E., Eisenman, R.N., Rose,
D.W., Glass, C.K. and Rosenfeld, M.G. (1997) A complex containing N-CoR,
mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional repression. Nature, 387,
43-48.
Hengartner, M.O. (2000) The biochemistry of apoptosis. Nature, 407, 770-776.
Hernandez, A., Thomas, R., Smith, F., Sandberg, J., Kim, S., Chung, D.H. and Evers,
B.M. (2001) Butyrate sensitizes human colon cancer cells to TRAIL-mediated
apoptosis. Surgery, 130, 265-272.
Hiebert, S.W., Reed-Inderbitzin, E.F., Amann, J., Irvin, B., Durst, K. and Linggi, B.
(2003) The t(8;21) fusion protein contacts co-repressors and histone
deacetylases to repress the transcription of the p14ARF tumor suppressor. Blood
Cells Mol Dis, 30, 177-183.
Holen, I., Croucher, P.I., Hamdy, F.C. and Eaton, C.L. (2002) Osteoprotegerin (OPG) is
a survival factor for human prostate cancer cells. Cancer Res, 62, 1619-1623.
Hsu, S.S., Huang, C.J., Cheng, H.H., Chou, C.T., Lee, H.Y., Wang, J.L., Chen, I.S., Liu,
S.I., Lu, Y.C., Chang, H.T., Huang, J.K., Chen, J.S. and Jan, C.R. (2007)
Anandamide-induced Ca2+ elevation leading to p38 MAPK phosphorylation
and subsequent cell death via apoptosis in human osteosarcoma cells.
Toxicology, 231, 21-29.
Hsu, S.Y., Kaipia, A., McGee, E., Lomeli, M. and Hsueh, A.J. (1997) Bok is a pro-
apoptotic Bcl-2 protein with restricted expression in reproductive tissues and
heterodimerizes with selective anti-apoptotic Bcl-2 family members. Proc Natl
Acad Sci U S A, 94, 12401-12406.
Hu, E., Dul, E., Sung, C.M., Chen, Z., Kirkpatrick, R., Zhang, G.F., Johanson, K., Liu,
R., Lago, A., Hofmann, G., Macarron, R., de los Frailes, M., Perez, P., Krawiec,
J., Winkler, J. and Jaye, M. (2003) Identification of novel isoform-selective
164
inhibitors within class I histone deacetylases. J Pharmacol Exp Ther, 307, 720-
728.
Hu, J. and Colburn, N.H. (2005) Histone deacetylase inhibition down-regulates cyclin
D1 transcription by inhibiting nuclear factor-kappaB/p65 DNA binding. Mol
Cancer Res, 3, 100-109.
Hu, S., Vincenz, C., Ni, J., Gentz, R. and Dixit, V.M. (1997) I-FLICE, a novel inhibitor
of tumor necrosis factor receptor-1- and CD-95-induced apoptosis. J Biol Chem,
272, 17255-17257.
Hu, Y., Benedict, M.A., Wu, D., Inohara, N. and Nunez, G. (1998) Bcl-XL interacts
with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation. Proc Natl Acad
Sci U S A, 95, 4386-4391.
Huang, D.C. and Strasser, A. (2000) BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic
cell death. Cell, 103, 839-842.
Huang, T.T. and Miyamoto, S. (2001) Postrepression activation of NF-kappaB requires
the amino-terminal nuclear export signal specific to IkappaBalpha. Mol Cell
Biol, 21, 4737-4747.
Hubbert, C., Guardiola, A., Shao, R., Kawaguchi, Y., Ito, A., Nixon, A., Yoshida, M.,
Wang, X.F. and Yao, T.P. (2002) HDAC6 is a microtubule-associated
deacetylase. Nature, 417, 455-458.
Huerta-Yepez, S., Vega, M., Jazirehi, A., Garban, H., Hongo, F., Cheng, G. and
Bonavida, B. (2004) Nitric oxide sensitizes prostate carcinoma cell lines to
TRAIL-mediated apoptosis via inactivation of NF-kappa B and inhibition of
Bcl-xl expression. Oncogene, 23, 4993-5003.
Huletsky, A., de Murcia, G., Muller, S., Hengartner, M., Menard, L., Lamarre, D. and
Poirier, G.G. (1989) The effect of poly(ADP-ribosyl)ation on native and H1-
depleted chromatin. A role of poly(ADP-ribosyl)ation on core nucleosome
structure. J Biol Chem, 264, 8878-8886.
Inoue, S., MacFarlane, M., Harper, N., Wheat, L.M., Dyer, M.J. and Cohen, G.M.
(2004) Histone deacetylase inhibitors potentiate TNF-related apoptosis-inducing
ligand (TRAIL)-induced apoptosis in lymphoid malignancies. Cell Death Differ,
11 Suppl 2, S193-206.
165
Inoue, S., Mai, A., Dyer, M.J. and Cohen, G.M. (2006a) Inhibition of histone
deacetylase class I but not class II is critical for the sensitization of leukemic
cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced
apoptosis. Cancer Res, 66, 6785-6792.
Inoue, S., Twiddy, D., Dyer, M.J. and Cohen, G.M. (2006b) Upregulation of TRAIL-R2
is not involved in HDACi mediated sensitization to TRAIL-induced apoptosis.
Cell Death Differ, 13, 2160-2162.
Insinga, A., Monestiroli, S., Ronzoni, S., Gelmetti, V., Marchesi, F., Viale, A., Altucci,
L., Nervi, C., Minucci, S. and Pelicci, P.G. (2005) Inhibitors of histone
deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death
receptor pathway. Nat Med, 11, 71-76.
Ionov, Y., Yamamoto, H., Krajewski, S., Reed, J.C. and Perucho, M. (2000) Mutational
inactivation of the proapoptotic gene BAX confers selective advantage during
tumor clonal evolution. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 10872-10877.
Irmler, M., Thome, M., Hahne, M., Schneider, P., Hofmann, K., Steiner, V., Bodmer,
J.L., Schroter, M., Burns, K., Mattmann, C., Rimoldi, D., French, L.E. and
Tschopp, J. (1997) Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature,
388, 190-195.
Jeremias, I., Herr, I., Boehler, T. and Debatin, K.M. (1998) TRAIL/Apo-2-ligand-
induced apoptosis in human T cells. Eur J Immunol, 28, 143-152.
Jilka, R.L., Weinstein, R.S., Bellido, T., Roberson, P., Parfitt, A.M. and Manolagas,
S.C. (1999) Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with
parathyroid hormone. J Clin Invest, 104, 439-446.
Johnson, C.A. and Turner, B.M. (1999) Histone deacetylases: complex transducers of
nuclear signals. Semin Cell Dev Biol, 10, 179-188.
Johnson, G.L. and Lapadat, R. (2002) Mitogen-activated protein kinase pathways
mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science, 298, 1911-1912.
Johnstone, R.W. (2002) Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of
cancer. Nat Rev Drug Discov, 1, 287-299.
Kandasamy, K. and Srivastava, R.K. (2002) Role of the phosphatidylinositol 3'-
kinase/PTEN/Akt kinase pathway in tumor necrosis factor-related apoptosis-
166
inducing ligand-induced apoptosis in non-small cell lung cancer cells. Cancer
Res, 62, 4929-4937.
Kang, J., Kisenge, R.R., Toyoda, H., Tanaka, S., Bu, J., Azuma, E. and Komada, Y.
(2003) Chemical sensitization and regulation of TRAIL-induced apoptosis in a
panel of B-lymphocytic leukaemia cell lines. Br J Haematol, 123, 921-932.
Karin, M. and Delhase, M. (2000) The I kappa B kinase (IKK) and NF-kappa B: key
elements of proinflammatory signalling. Semin Immunol, 12, 85-98.
Karin, M. and Lin, A. (2002) NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat
Immunol, 3, 221-227.
Kasuga, C., Ebata, T., Kayagaki, N., Yagita, H., Hishii, M., Arai, H., Sato, K. and
Okumura, K. (2004) Sensitization of human glioblastomas to tumor necrosis
factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) by NF-kappaB inhibitors.
Cancer Sci, 95, 840-844.
Kayagaki, N., Yamaguchi, N., Nakayama, M., Eto, H., Okumura, K. and Yagita, H.
(1999) Type I interferons (IFNs) regulate tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand (TRAIL) expression on human T cells: A novel
mechanism for the antitumor effects of type I IFNs. J Exp Med, 189, 1451-1460.
Kelley, S.K., Harris, L.A., Xie, D., Deforge, L., Totpal, K., Bussiere, J. and Fox, J.A.
(2001) Preclinical studies to predict the disposition of Apo2L/tumor necrosis
factor-related apoptosis-inducing ligand in humans: characterization of in vivo
efficacy, pharmacokinetics, and safety. J Pharmacol Exp Ther, 299, 31-38.
Kelly, M.M., Hoel, B.D. and Voelkel-Johnson, C. (2002) Doxorubicin pretreatment
sensitizes prostate cancer cell lines to TRAIL induced apoptosis which
correlates with the loss of c-FLIP expression. Cancer Biol Ther, 1, 520-527.
Kemp, T.J., Ludwig, A.T., Earel, J.K., Moore, J.M., Vanoosten, R.L., Moses, B.,
Leidal, K., Nauseef, W.M. and Griffith, T.S. (2005) Neutrophil stimulation with
Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) results in the release of
functional soluble TRAIL/Apo-2L. Blood, 106, 3474-3482.
Kerr, J.F., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 26,
239-257.
167
Khan, N., Jeffers, M., Kumar, S., Hackett, C., Boldog, F., Khramtsov, N., Qian, X.,
Mills, E., Berghs, S.C., Carey, N., Finn, P.W., Collins, L.S., Tumber, A.,
Ritchie, J.W., Jensen, P.B., Lichenstein, H.S. and Sehested, M. (2008)
Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone
deacetylase inhibitors. Biochem J, 409, 581-589.
Khorasanizadeh, S. (2004) The nucleosome: from genomic organization to genomic
regulation. Cell, 116, 259-272.
Kiernan, R., Bres, V., Ng, R.W., Coudart, M.P., El Messaoudi, S., Sardet, C., Jin, D.Y.,
Emiliani, S. and Benkirane, M. (2003) Post-activation turn-off of NF-kappa B-
dependent transcription is regulated by acetylation of p65. J Biol Chem, 278,
2758-2766.
Kim, E.H., Kim, S.U., Shin, D.Y. and Choi, K.S. (2004) Roscovitine sensitizes glioma
cells to TRAIL-mediated apoptosis by downregulation of survivin and XIAP.
Oncogene, 23, 446-456.
Kim, K., Fisher, M.J., Xu, S.Q. and el-Deiry, W.S. (2000) Molecular determinants of
response to TRAIL in killing of normal and cancer cells. Clin Cancer Res, 6,
335-346.
Kim, M.S., Kwon, H.J., Lee, Y.M., Baek, J.H., Jang, J.E., Lee, S.W., Moon, E.J., Kim,
H.S., Lee, S.K., Chung, H.Y., Kim, C.W. and Kim, K.W. (2001) Histone
deacetylases induce angiogenesis by negative regulation of tumor suppressor
genes. Nat Med, 7, 437-443.
Kim, Y.K., Lee, E.K., Kang, J.K., Kim, J.A., You, J.S., Park, J.H., Seo, D.W., Hwang,
J.W., Kim, S.N., Lee, H.Y., Lee, H.W. and Han, J.W. (2006) Activation of NF-
kappaB by HDAC inhibitor apicidin through Sp1-dependent de novo protein
synthesis: its implication for resistance to apoptosis. Cell Death Differ, 13,
2033-2041.
Kischkel, F.C., Lawrence, D.A., Chuntharapai, A., Schow, P., Kim, K.J. and Ashkenazi,
A. (2000) Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and
caspase-8 to death receptors 4 and 5. Immunity, 12, 611-620.
Klose, R.J. and Bird, A.P. (2006) Genomic DNA methylation: the mark and its
mediators. Trends Biochem Sci, 31, 89-97.
168
Koenig, U., Eckhart, L. and Tschachler, E. (2001) Evidence that caspase-13 is not a
human but a bovine gene. Biochem Biophys Res Commun, 285, 1150-1154.
Kouzarides, T. (2002) Histone methylation in transcriptional control. Curr Opin Genet
Dev, 12, 198-209.
Krajewski, S., Krajewska, M. and Reed, J.C. (1996) Immunohistochemical analysis of
in vivo patterns of Bak expression, a proapoptotic member of the Bcl-2 protein
family. Cancer Res, 56, 2849-2855.
Kramer, O.H., Zhu, P., Ostendorff, H.P., Golebiewski, M., Tiefenbach, J., Peters, M.A.,
Brill, B., Groner, B., Bach, I., Heinzel, T. and Gottlicher, M. (2003) The histone
deacetylase inhibitor valproic acid selectively induces proteasomal degradation
of HDAC2. Embo J, 22, 3411-3420.
Krammer, P.H., Arnold, R. and Lavrik, I.N. (2007) Life and death in peripheral T cells.
Nat Rev Immunol, 7, 532-542.
Kraus, J., Borner, C. and Hollt, V. (2003) Distinct palindromic extensions of the 5'-
TTC...GAA-3' motif allow STAT6 binding in vivo. Faseb J, 17, 304-306.
Krogan, N.J., Keogh, M.C., Datta, N., Sawa, C., Ryan, O.W., Ding, H., Haw, R.A.,
Pootoolal, J., Tong, A., Canadien, V., Richards, D.P., Wu, X., Emili, A.,
Hughes, T.R., Buratowski, S. and Greenblatt, J.F. (2003) A Snf2 family ATPase
complex required for recruitment of the histone H2A variant Htz1. Mol Cell, 12,
1565-1576.
Krueger, A., Schmitz, I., Baumann, S., Krammer, P.H. and Kirchhoff, S. (2001)
Cellular FLICE-inhibitory protein splice variants inhibit different steps of
caspase-8 activation at the CD95 death-inducing signaling complex. J Biol
Chem, 276, 20633-20640.
Kuendgen, A., Strupp, C., Aivado, M., Bernhardt, A., Hildebrandt, B., Haas, R.,
Germing, U. and Gattermann, N. (2004) Treatment of myelodysplastic
syndromes with valproic acid alone or in combination with all-trans retinoic
acid. Blood, 104, 1266-1269.
Kyritsis, A.P., Tachmazoglou, F., Rao, J.S. and Puduvalli, V.K. (2007) Bortezomib
sensitizes human astrocytoma cells to tumor necrosis factor related apoptosis-
169
inducing ligand induced apoptosis. Clin Cancer Res, 13, 6540-6541; author
reply 6541-6542.
Lacey, D.L., Timms, E., Tan, H.L., Kelley, M.J., Dunstan, C.R., Burgess, T., Elliott, R.,
Colombero, A., Elliott, G., Scully, S., Hsu, H., Sullivan, J., Hawkins, N., Davy,
E., Capparelli, C., Eli, A., Qian, Y.X., Kaufman, S., Sarosi, I., Shalhoub, V.,
Senaldi, G., Guo, J., Delaney, J. and Boyle, W.J. (1998) Osteoprotegerin ligand
is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell, 93,
165-176.
Lamhamedi-Cherradi, S.E., Zheng, S.J., Maguschak, K.A., Peschon, J. and Chen, Y.H.
(2003) Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in
TRAIL-/- mice. Nat Immunol, 4, 255-260.
Lamkanfi, M., Declercq, W., Kalai, M., Saelens, X. and Vandenabeele, P. (2002) Alice
in caspase land. A phylogenetic analysis of caspases from worm to man. Cell
Death Differ, 9, 358-361.
Landry, J., Sutton, A., Tafrov, S.T., Heller, R.C., Stebbins, J., Pillus, L. and Sternglanz,
R. (2000) The silencing protein SIR2 and its homologs are NAD-dependent
protein deacetylases. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5807-5811.
Lane, D., Robert, V., Grondin, R., Rancourt, C. and Piche, A. (2007) Malignant ascites
protect against TRAIL-induced apoptosis by activating the PI3K/Akt pathway in
human ovarian carcinoma cells. Int J Cancer, 121, 1227-1237.
Le Bras, M., Clement, M.V., Pervaiz, S. and Brenner, C. (2005) Reactive oxygen
species and the mitochondrial signaling pathway of cell death. Histol
Histopathol, 20, 205-219.
Lee, H.J., Wang, C.J., Kuo, H.C., Chou, F.P., Jean, L.F. and Tseng, T.H. (2005)
Induction apoptosis of luteolin in human hepatoma HepG2 cells involving
mitochondria translocation of Bax/Bak and activation of JNK. Toxicol Appl
Pharmacol, 203, 124-131.
Lee, J.T., Jr. and McCubrey, J.A. (2002) The Raf/MEK/ERK signal transduction
cascade as a target for chemotherapeutic intervention in leukemia. Leukemia, 16,
486-507.
170
Li, H., Zhu, H., Xu, C.J. and Yuan, J. (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates
the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell, 94, 491-501.
Li, J., Yen, C., Liaw, D., Podsypanina, K., Bose, S., Wang, S.I., Puc, J., Miliaresis, C.,
Rodgers, L., McCombie, R., Bigner, S.H., Giovanella, B.C., Ittmann, M., Tycko,
B., Hibshoosh, H., Wigler, M.H. and Parsons, R. (1997) PTEN, a putative
protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate
cancer. Science, 275, 1943-1947.
Li, L.Y., Luo, X. and Wang, X. (2001) Endonuclease G is an apoptotic DNase when
released from mitochondria. Nature, 412, 95-99.
Li, W., Zhang, X. and Olumi, A.F. (2007) MG-132 sensitizes TRAIL-resistant prostate
cancer cells by activating c-Fos/c-Jun heterodimers and repressing c-FLIP(L).
Cancer Res, 67, 2247-2255.
Lim, S.J., Lee, Y.J. and Lee, E. (2006) p38MAPK inhibitor SB203580 sensitizes human
SNU-C4 colon cancer cells to exisulind-induced apoptosis. Oncol Rep, 16,
1131-1135.
Lin, Y., Devin, A., Cook, A., Keane, M.M., Kelliher, M., Lipkowitz, S. and Liu, Z.G.
(2000) The death domain kinase RIP is essential for TRAIL (Apo2L)-induced
activation of IkappaB kinase and c-Jun N-terminal kinase. Mol Cell Biol, 20,
6638-6645.
Lindemann, R.K., Gabrielli, B. and Johnstone, R.W. (2004) Histone-deacetylase
inhibitors for the treatment of cancer. Cell Cycle, 3, 779-788.
Lindsten, T., Ross, A.J., King, A., Zong, W.X., Rathmell, J.C., Shiels, H.A., Ulrich, E.,
Waymire, K.G., Mahar, P., Frauwirth, K., Chen, Y., Wei, M., Eng, V.M.,
Adelman, D.M., Simon, M.C., Ma, A., Golden, J.A., Evan, G., Korsmeyer, S.J.,
MacGregor, G.R. and Thompson, C.B. (2000) The combined functions of
proapoptotic Bcl-2 family members bak and bax are essential for normal
development of multiple tissues. Mol Cell, 6, 1389-1399.
Liston, P., Fong, W.G. and Korneluk, R.G. (2003) The inhibitors of apoptosis: there is
more to life than Bcl2. Oncogene, 22, 8568-8580.
171
Liu, L., Scolnick, D.M., Trievel, R.C., Zhang, H.B., Marmorstein, R., Halazonetis, T.D.
and Berger, S.L. (1999) p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are
acetylated in vivo in response to DNA damage. Mol Cell Biol, 19, 1202-1209.
Liu, Q.Y. and Stein, C.A. (1997) Taxol and estramustine-induced modulation of human
prostate cancer cell apoptosis via alteration in bcl-xL and bak expression. Clin
Cancer Res, 3, 2039-2046.
Liu, S., Yu, Y., Zhang, M., Wang, W. and Cao, X. (2001) The involvement of TNF-
alpha-related apoptosis-inducing ligand in the enhanced cytotoxicity of IFN-
beta-stimulated human dendritic cells to tumor cells. J Immunol, 166, 5407-
5415.
Liu, Y., Borchert, G.L., Surazynski, A., Hu, C.A. and Phang, J.M. (2006) Proline
oxidase activates both intrinsic and extrinsic pathways for apoptosis: the role of
ROS/superoxides, NFAT and MEK/ERK signaling. Oncogene, 25, 5640-5647.
Luger, K., Rechsteiner, T.J., Flaus, A.J., Waye, M.M. and Richmond, T.J. (1997)
Characterization of nucleosome core particles containing histone proteins made
in bacteria. J Mol Biol, 272, 301-311.
Lum, J.J., Bren, G., McClure, R. and Badley, A.D. (2005) Elimination of senescent
neutrophils by TNF-related apoptosis-inducing [corrected] ligand. J Immunol,
175, 1232-1238.
Luo, X., Budihardjo, I., Zou, H., Slaughter, C. and Wang, X. (1998) Bid, a Bcl2
interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in
response to activation of cell surface death receptors. Cell, 94, 481-490.
Lutter, M., Perkins, G.A. and Wang, X. (2001) The pro-apoptotic Bcl-2 family member
tBid localizes to mitochondrial contact sites. BMC Cell Biol, 2, 22.
MacFarlane, M., Ahmad, M., Srinivasula, S.M., Fernandes-Alnemri, T., Cohen, G.M.
and Alnemri, E.S. (1997) Identification and molecular cloning of two novel
receptors for the cytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem, 272, 25417-25420.
MacFarlane, M., Kohlhaas, S.L., Sutcliffe, M.J., Dyer, M.J. and Cohen, G.M. (2005)
TRAIL receptor-selective mutants signal to apoptosis via TRAIL-R1 in primary
lymphoid malignancies. Cancer Res, 65, 11265-11270.
172
Maison, C., Bailly, D., Peters, A.H., Quivy, J.P., Roche, D., Taddei, A., Lachner, M.,
Jenuwein, T. and Almouzni, G. (2002) Higher-order structure in pericentric
heterochromatin involves a distinct pattern of histone modification and an RNA
component. Nat Genet, 30, 329-334.
Mariani, S.M. and Krammer, P.H. (1998a) Differential regulation of TRAIL and CD95
ligand in transformed cells of the T and B lymphocyte lineage. Eur J Immunol,
28, 973-982.
Mariani, S.M. and Krammer, P.H. (1998b) Surface expression of TRAIL/Apo-2 ligand
in activated mouse T and B cells. Eur J Immunol, 28, 1492-1498.
Marks, P.A., Richon, V.M., Breslow, R. and Rifkind, R.A. (2001) Histone deacetylase
inhibitors as new cancer drugs. Curr Opin Oncol, 13, 477-483.
Marmorstein, R. and Roth, S.Y. (2001) Histone acetyltransferases: function, structure,
and catalysis. Curr Opin Genet Dev, 11, 155-161.
Marson, C.M., Mahadevan, T., Dines, J., Sengmany, S., Morrell, J.M., Alao, J.P., Joel,
S.P., Vigushin, D.M. and Charles Coombes, R. (2007) Structure-activity
relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent inhibitors of
histone deacetylase. Bioorg Med Chem Lett, 17, 136-141.
Marzo, I., Brenner, C., Zamzami, N., Jurgensmeier, J.M., Susin, S.A., Vieira, H.L.,
Prevost, M.C., Xie, Z., Matsuyama, S., Reed, J.C. and Kroemer, G. (1998) Bax
and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of
apoptosis. Science, 281, 2027-2031.
Matsuda, T., Almasan, A., Tomita, M., Uchihara, J.N., Masuda, M., Ohshiro, K.,
Takasu, N., Yagita, H., Ohta, T. and Mori, N. (2005) Resistance to Apo2 ligand
(Apo2L)/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-
mediated apoptosis and constitutive expression of Apo2L/TRAIL in human T-
cell leukemia virus type 1-infected T-cell lines. J Virol, 79, 1367-1378.
Mattson, M.P. and Kroemer, G. (2003) Mitochondria in cell death: novel targets for
neuroprotection and cardioprotection. Trends Mol Med, 9, 196-205.
Mayo, M.W., Denlinger, C.E., Broad, R.M., Yeung, F., Reilly, E.T., Shi, Y. and Jones,
D.R. (2003) Ineffectiveness of histone deacetylase inhibitors to induce apoptosis
173
involves the transcriptional activation of NF-kappa B through the Akt pathway.
J Biol Chem, 278, 18980-18989.
McCaffrey, P.G., Kim, P.K., Valge-Archer, V.E., Sen, R. and Rao, A. (1994)
Cyclosporin A sensitivity of the NF-kappa B site of the IL2R alpha promoter in
untransformed murine T cells. Nucleic Acids Res, 22, 2134-2142.
McKinsey, T.A., Zhang, C.L. and Olson, E.N. (2000) Activation of the myocyte
enhancer factor-2 transcription factor by calcium/calmodulin-dependent protein
kinase-stimulated binding of 14-3-3 to histone deacetylase 5. Proc Natl Acad Sci
U S A, 97, 14400-14405.
Mercurio, F., Zhu, H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li, J., Young,
D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning, A. and Rao, A. (1997) IKK-1 and IKK-
2: cytokine-activated IkappaB kinases essential for NF-kappaB activation.
Science, 278, 860-866.
Micheau, O., Lens, S., Gaide, O., Alevizopoulos, K. and Tschopp, J. (2001) NF-kappaB
signals induce the expression of c-FLIP. Mol Cell Biol, 21, 5299-5305.
Mirandola, P., Ponti, C., Gobbi, G., Sponzilli, I., Vaccarezza, M., Cocco, L., Zauli, G.,
Secchiero, P., Manzoli, F.A. and Vitale, M. (2004) Activated human NK and
CD8+ T cells express both TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and
TRAIL receptors but are resistant to TRAIL-mediated cytotoxicity. Blood, 104,
2418-2424.
Monleon, I., Martinez-Lorenzo, M.J., Monteagudo, L., Lasierra, P., Taules, M.,
Iturralde, M., Pineiro, A., Larrad, L., Alava, M.A., Naval, J. and Anel, A. (2001)
Differential secretion of Fas ligand- or APO2 ligand/TNF-related apoptosis-
inducing ligand-carrying microvesicles during activation-induced death of
human T cells. J Immunol, 167, 6736-6744.
Munk, M., Memon, A.A., Nexo, E. and Sorensen, B.S. (2007) Inhibition of the
epidermal growth factor receptor in bladder cancer cells treated with the DNA-
damaging drug etoposide markedly increases apoptosis. BJU Int, 99, 196-201.
Munoz-Pinedo, C., Ruiz de Almodovar, C. and Ruiz-Ruiz, C. (2002) Death on the
beach: a rosy forecast for the 21st century. Cell Death Differ, 9, 1026-1029.
174
Nakata, S., Yoshida, T., Horinaka, M., Shiraishi, T., Wakada, M. and Sakai, T. (2004)
Histone deacetylase inhibitors upregulate death receptor 5/TRAIL-R2 and
sensitize apoptosis induced by TRAIL/APO2-L in human malignant tumor cells.
Oncogene, 23, 6261-6271.
Nakshatri, H., Rice, S.E. and Bhat-Nakshatri, P. (2004) Antitumor agent parthenolide
reverses resistance of breast cancer cells to tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand through sustained activation of c-Jun N-terminal
kinase. Oncogene, 23, 7330-7344.
Nam, S.Y., Jung, G.A., Hur, G.C., Chung, H.Y., Kim, W.H., Seol, D.W. and Lee, B.L.
(2003) Upregulation of FLIP(S) by Akt, a possible inhibition mechanism of
TRAIL-induced apoptosis in human gastric cancers. Cancer Sci, 94, 1066-1073.
Natarajan, K., Singh, S., Burke, T.R., Jr., Grunberger, D. and Aggarwal, B.B. (1996)
Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of
nuclear transcription factor NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 9090-
9095.
Nebbioso, A., Clarke, N., Voltz, E., Germain, E., Ambrosino, C., Bontempo, P.,
Alvarez, R., Schiavone, E.M., Ferrara, F., Bresciani, F., Weisz, A., de Lera,
A.R., Gronemeyer, H. and Altucci, L. (2005) Tumor-selective action of HDAC
inhibitors involves TRAIL induction in acute myeloid leukemia cells. Nat Med,
11, 77-84.
Nechushtan, A., Smith, C.L., Hsu, Y.T. and Youle, R.J. (1999) Conformation of the
Bax C-terminus regulates subcellular location and cell death. Embo J, 18, 2330-
2341.
Nesterov, A., Lu, X., Johnson, M., Miller, G.J., Ivashchenko, Y. and Kraft, A.S. (2001)
Elevated AKT activity protects the prostate cancer cell line LNCaP from
TRAIL-induced apoptosis. J Biol Chem, 276, 10767-10774.
Nijhawan, D., Fang, M., Traer, E., Zhong, Q., Gao, W., Du, F. and Wang, X. (2003)
Elimination of Mcl-1 is required for the initiation of apoptosis following
ultraviolet irradiation. Genes Dev, 17, 1475-1486.
Nimmanapalli, R., Perkins, C.L., Orlando, M., O'Bryan, E., Nguyen, D. and Bhalla,
K.N. (2001) Pretreatment with paclitaxel enhances apo-2 ligand/tumor necrosis
175
factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis of prostate cancer
cells by inducing death receptors 4 and 5 protein levels. Cancer Res, 61, 759-
763.
Ocker, M. and Schneider-Stock, R. (2007) Histone deacetylase inhibitors: signalling
towards p21cip1/waf1. Int J Biochem Cell Biol, 39, 1367-1374.
Oh, K.J., Barbuto, S., Meyer, N., Kim, R.S., Collier, R.J. and Korsmeyer, S.J. (2005)
Conformational changes in BID, a pro-apoptotic BCL-2 family member, upon
membrane binding. A site-directed spin labeling study. J Biol Chem, 280, 753-
767.
Ohtsuka, T. and Zhou, T. (2002) Bisindolylmaleimide VIII enhances DR5-mediated
apoptosis through the MKK4/JNK/p38 kinase and the mitochondrial pathways. J
Biol Chem, 277, 29294-29303.
Oka, N., Tanimoto, S., Taue, R., Nakatsuji, H., Kishimoto, T., Izaki, H., Fukumori, T.,
Takahashi, M., Nishitani, M. and Kanayama, H.O. (2006) Role of
phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway in bladder cancer cell apoptosis
induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Cancer Sci,
97, 1093-1098.
Olsson, A., Diaz, T., Aguilar-Santelises, M., Osterborg, A., Celsing, F., Jondal, M. and
Osorio, L.M. (2001) Sensitization to TRAIL-induced apoptosis and modulation
of FLICE-inhibitory protein in B chronic lymphocytic leukemia by actinomycin
D. Leukemia, 15, 1868-1877.
Osley, M.A. (2004) H2B ubiquitylation: the end is in sight. Biochim Biophys Acta,
1677, 74-78.
Ottilie, S., Diaz, J.L., Horne, W., Chang, J., Wang, Y., Wilson, G., Chang, S., Weeks,
S., Fritz, L.C. and Oltersdorf, T. (1997) Dimerization properties of human BAD.
Identification of a BH-3 domain and analysis of its binding to mutant BCL-2 and
BCL-XL proteins. J Biol Chem, 272, 30866-30872.
Palladino, F., Laroche, T., Gilson, E., Pillus, L. and Gasser, S.M. (1993) The
positioning of yeast telomeres depends on SIR3, SIR4, and the integrity of the
nuclear membrane. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 58, 733-746.
176
Pan, G., Ni, J., Wei, Y.F., Yu, G., Gentz, R. and Dixit, V.M. (1997a) An antagonist
decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science,
277, 815-818.
Pan, G., O'Rourke, K., Chinnaiyan, A.M., Gentz, R., Ebner, R., Ni, J. and Dixit, V.M.
(1997b) The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. Science, 276, 111-113.
Park, S.J., Wu, C.H., Gordon, J.D., Zhong, X., Emami, A. and Safa, A.R. (2004) Taxol
induces caspase-10-dependent apoptosis. J Biol Chem, 279, 51057-51067.
Peart, M.J., Smyth, G.K., van Laar, R.K., Bowtell, D.D., Richon, V.M., Marks, P.A.,
Holloway, A.J. and Johnstone, R.W. (2005) Identification and functional
significance of genes regulated by structurally different histone deacetylase
inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 3697-3702.
Peinado, H., Ballestar, E., Esteller, M. and Cano, A. (2004) Snail mediates E-cadherin
repression by the recruitment of the Sin3A/histone deacetylase 1
(HDAC1)/HDAC2 complex. Mol Cell Biol, 24, 306-319.
Perlman, H., Pagliari, L.J., Nguyen, N., Bradley, K., Liu, H. and Pope, R.M. (2001) The
Fas-FasL death receptor and PI3K pathways independently regulate monocyte
homeostasis. Eur J Immunol, 31, 2421-2430.
Petros, A.M., Medek, A., Nettesheim, D.G., Kim, D.H., Yoon, H.S., Swift, K.,
Matayoshi, E.D., Oltersdorf, T. and Fesik, S.W. (2001) Solution structure of the
antiapoptotic protein bcl-2. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 3012-3017.
Piekarz, R.L., Sackett, D.L. and Bates, S.E. (2007) Histone deacetylase inhibitors and
demethylating agents: clinical development of histone deacetylase inhibitors for
cancer therapy. Cancer J, 13, 30-39.
Pistritto, G., Jost, M., Srinivasula, S.M., Baffa, R., Poyet, J.L., Kari, C., Lazebnik, Y.,
Rodeck, U. and Alnemri, E.S. (2002) Expression and transcriptional regulation
of caspase-14 in simple and complex epithelia. Cell Death Differ, 9, 995-1006.
Poulaki, V., Mitsiades, C.S., Kotoula, V., Tseleni-Balafouta, S., Ashkenazi, A., Koutras,
D.A. and Mitsiades, N. (2002) Regulation of Apo2L/tumor necrosis factor-
related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in thyroid carcinoma cells.
Am J Pathol, 161, 643-654.
177
Prigent, C. and Dimitrov, S. (2003) Phosphorylation of serine 10 in histone H3, what
for? J Cell Sci, 116, 3677-3685.
Ravi, R., Bedi, G.C., Engstrom, L.W., Zeng, Q., Mookerjee, B., Gelinas, C., Fuchs, E.J.
and Bedi, A. (2001) Regulation of death receptor expression and
TRAIL/Apo2L-induced apoptosis by NF-kappaB. Nat Cell Biol, 3, 409-416.
Reddy, R.M., Yeow, W.S., Chua, A., Nguyen, D.M., Baras, A., Ziauddin, M.F.,
Shamimi-Noori, S.M., Maxhimer, J.B., Schrump, D.S. and Nguyen, D.M.
(2007) Rapid and profound potentiation of Apo2L/TRAIL-mediated cytotoxicity
and apoptosis in thoracic cancer cells by the histone deacetylase inhibitor
Trichostatin A: the essential role of the mitochondria-mediated caspase
activation cascade. Apoptosis, 12, 55-71.
Reed, J.C. (1996) A day in the life of the Bcl-2 protein: does the turnover rate of Bcl-2
serve as a biological clock for cellular lifespan regulation? Leuk Res, 20, 109-
111.
Reed, J.C. (1999) Dysregulation of apoptosis in cancer. J Clin Oncol, 17, 2941-2953.
Rengarajan, J., Mittelstadt, P.R., Mages, H.W., Gerth, A.J., Kroczek, R.A., Ashwell,
J.D. and Glimcher, L.H. (2000) Sequential involvement of NFAT and Egr
transcription factors in FasL regulation. Immunity, 12, 293-300.
Renshaw, S.A., Parmar, J.S., Singleton, V., Rowe, S.J., Dockrell, D.H., Dower, S.K.,
Bingle, C.D., Chilvers, E.R. and Whyte, M.K. (2003) Acceleration of human
neutrophil apoptosis by TRAIL. J Immunol, 170, 1027-1033.
Rice, J.C. and Allis, C.D. (2001) Histone methylation versus histone acetylation: new
insights into epigenetic regulation. Curr Opin Cell Biol, 13, 263-273.
Richon, V.M., Sandhoff, T.W., Rifkind, R.A. and Marks, P.A. (2000) Histone
deacetylase inhibitor selectively induces p21WAF1 expression and gene-
associated histone acetylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 10014-10019.
Rodriguez-Viciana, P., Marte, B.M., Warne, P.H. and Downward, J. (1996)
Phosphatidylinositol 3' kinase: one of the effectors of Ras. Philos Trans R Soc
Lond B Biol Sci, 351, 225-231; discussion 231-222.
Ronzoni, S., Faretta, M., Ballarini, M., Pelicci, P. and Minucci, S. (2005) New method
to detect histone acetylation levels by flow cytometry. Cytometry A, 66, 52-61.
178
Rosato, R.R., Almenara, J.A., Dai, Y. and Grant, S. (2003) Simultaneous activation of
the intrinsic and extrinsic pathways by histone deacetylase (HDAC) inhibitors
and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
synergistically induces mitochondrial damage and apoptosis in human leukemia
cells. Mol Cancer Ther, 2, 1273-1284.
Roth, S.Y., Denu, J.M. and Allis, C.D. (2001) Histone acetyltransferases. Annu Rev
Biochem, 70, 81-120.
Ruefli, A.A., Ausserlechner, M.J., Bernhard, D., Sutton, V.R., Tainton, K.M., Kofler,
R., Smyth, M.J. and Johnstone, R.W. (2001) The histone deacetylase inhibitor
and chemotherapeutic agent suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) induces a
cell-death pathway characterized by cleavage of Bid and production of reactive
oxygen species. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10833-10838.
Sah, N.K., Munshi, A., Kurland, J.F., McDonnell, T.J., Su, B. and Meyn, R.E. (2003)
Translation inhibitors sensitize prostate cancer cells to apoptosis induced by
tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) by activating
c-Jun N-terminal kinase. J Biol Chem, 278, 20593-20602.
Sakaguchi, K., Herrera, J.E., Saito, S., Miki, T., Bustin, M., Vassilev, A., Anderson,
C.W. and Appella, E. (1998) DNA damage activates p53 through a
phosphorylation-acetylation cascade. Genes Dev, 12, 2831-2841.
Salvador, L.M., Park, Y., Cottom, J., Maizels, E.T., Jones, J.C., Schillace, R.V., Carr,
D.W., Cheung, P., Allis, C.D., Jameson, J.L. and Hunzicker-Dunn, M. (2001)
Follicle-stimulating hormone stimulates protein kinase A-mediated histone H3
phosphorylation and acetylation leading to select gene activation in ovarian
granulosa cells. J Biol Chem, 276, 40146-40155.
Salvesen, G.S. (1999) Programmed cell death and the caspases. Apmis, 107, 73-79.
Sanda, T., Okamoto, T., Uchida, Y., Nakagawa, H., Iida, S., Kayukawa, S., Suzuki, T.,
Oshizawa, T., Suzuki, T., Miyata, N. and Ueda, R. (2007) Proteome analyses of
the growth inhibitory effects of NCH-51, a novel histone deacetylase inhibitor,
on lymphoid malignant cells. Leukemia, 21, 2344-2353.
179
Santini, V., Gozzini, A. and Ferrari, G. (2007) Histone deacetylase inhibitors: molecular
and biological activity as a premise to clinical application. Curr Drug Metab, 8,
383-393.
Sarker, M., Ruiz-Ruiz, C. and Lopez-Rivas, A. (2001) Activation of protein kinase C
inhibits TRAIL-induced caspases activation, mitochondrial events and apoptosis
in a human leukemic T cell line. Cell Death Differ, 8, 172-181.
Sattler, M., Liang, H., Nettesheim, D., Meadows, R.P., Harlan, J.E., Eberstadt, M.,
Yoon, H.S., Shuker, S.B., Chang, B.S., Minn, A.J., Thompson, C.B. and Fesik,
S.W. (1997) Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between
regulators of apoptosis. Science, 275, 983-986.
Sayers, T.J. and Murphy, W.J. (2006) Combining proteasome inhibition with TNF-
related apoptosis-inducing ligand (Apo2L/TRAIL) for cancer therapy. Cancer
Immunol Immunother, 55, 76-84.
Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., Friesen, C., Li, F., Tomaselli, K.J., Debatin,
K.M., Krammer, P.H. and Peter, M.E. (1998) Two CD95 (APO-1/Fas) signaling
pathways. Embo J, 17, 1675-1687.
Scaffidi, C., Schmitz, I., Krammer, P.H. and Peter, M.E. (1999) The role of c-FLIP in
modulation of CD95-induced apoptosis. J Biol Chem, 274, 1541-1548.
Scorrano, L., Oakes, S.A., Opferman, J.T., Cheng, E.H., Sorcinelli, M.D., Pozzan, T.
and Korsmeyer, S.J. (2003) BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum
Ca2+: a control point for apoptosis. Science, 300, 135-139.
Schmitz, I., Krueger, A., Baumann, S., Schulze-Bergkamen, H., Krammer, P.H. and
Kirchhoff, S. (2003) An IL-2-dependent switch between CD95 signaling
pathways sensitizes primary human T cells toward CD95-mediated activation-
induced cell death. J Immunol, 171, 2930-2936.
Sebolt-Leopold, J.S. (2000) Development of anticancer drugs targeting the MAP kinase
pathway. Oncogene, 19, 6594-6599.
Secchiero, P., Melloni, E., Heikinheimo, M., Mannisto, S., Di Pietro, R., Iacone, A. and
Zauli, G. (2004) TRAIL regulates normal erythroid maturation through an ERK-
dependent pathway. Blood, 103, 517-522.
180
Shankar, S., Chen, X. and Srivastava, R.K. (2005a) Effects of sequential treatments
with chemotherapeutic drugs followed by TRAIL on prostate cancer in vitro and
in vivo. Prostate, 62, 165-186.
Shankar, S., Singh, T.R., Fandy, T.E., Luetrakul, T., Ross, D.D. and Srivastava, R.K.
(2005b) Interactive effects of histone deacetylase inhibitors and TRAIL on
apoptosis in human leukemia cells: involvement of both death receptor and
mitochondrial pathways. Int J Mol Med, 16, 1125-1138.
Shankar, S. and Srivastava, R.K. (2004) Enhancement of therapeutic potential of
TRAIL by cancer chemotherapy and irradiation: mechanisms and clinical
implications. Drug Resist Updat, 7, 139-156.
Shimada, K., Nakamura, M., Ishida, E., Kishi, M. and Konishi, N. (2003) Roles of p38-
and c-jun NH2-terminal kinase-mediated pathways in 2-methoxyestradiol-
induced p53 induction and apoptosis. Carcinogenesis, 24, 1067-1075.
Shimizu, S., Narita, M. and Tsujimoto, Y. (1999) Bcl-2 family proteins regulate the
release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC.
Nature, 399, 483-487.
Shiozaki, E.N. and Shi, Y. (2004) Caspases, IAPs and Smac/DIABLO: mechanisms
from structural biology. Trends Biochem Sci, 29, 486-494.
Siegmund, D., Hausser, A., Peters, N., Scheurich, P. and Wajant, H. (2001) Tumor
necrosis factor (TNF) and phorbol ester induce TNF-related apoptosis-inducing
ligand (TRAIL) under critical involvement of NF-kappa B essential modulator
(NEMO)/IKKgamma. J Biol Chem, 276, 43708-43712.
Singh, R.K., Varney, M.L., Buyukberber, S., Ino, K., Ageitos, A.G., Reed, E.,
Tarantolo, S. and Talmadge, J.E. (1999) Fas-FasL-mediated CD4+ T-cell
apoptosis following stem cell transplantation. Cancer Res, 59, 3107-3111.
Singh, T.R., Shankar, S., Chen, X., Asim, M. and Srivastava, R.K. (2003) Synergistic
interactions of chemotherapeutic drugs and tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand on apoptosis and on regression of breast
carcinoma in vivo. Cancer Res, 63, 5390-5400.
Slee, E.A., Harte, M.T., Kluck, R.M., Wolf, B.B., Casiano, C.A., Newmeyer, D.D.,
Wang, H.G., Reed, J.C., Nicholson, D.W., Alnemri, E.S., Green, D.R. and
181
Martin, S.J. (1999) Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade:
hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-
dependent manner. J Cell Biol, 144, 281-292.
Smyth, M.J., Cretney, E., Takeda, K., Wiltrout, R.H., Sedger, L.M., Kayagaki, N.,
Yagita, H. and Okumura, K. (2001) Tumor necrosis factor-related apoptosis-
inducing ligand (TRAIL) contributes to interferon gamma-dependent natural
killer cell protection from tumor metastasis. J Exp Med, 193, 661-670.
Sobota, R., Szwed, M., Kasza, A., Bugno, M. and Kordula, T. (2000) Parthenolide
inhibits activation of signal transducers and activators of transcription (STATs)
induced by cytokines of the IL-6 family. Biochem Biophys Res Commun, 267,
329-333.
Spotswood, H.T. and Turner, B.M. (2002) An increasingly complex code. J Clin Invest,
110, 577-582.
Steele, L.P., Georgopoulos, N.T., Southgate, J., Selby, P.J. and Trejdosiewicz, L.K.
(2006) Differential susceptibility to TRAIL of normal versus malignant human
urothelial cells. Cell Death Differ, 13, 1564-1576.
Stehlik, C., de Martin, R., Kumabashiri, I., Schmid, J.A., Binder, B.R. and Lipp, J.
(1998) Nuclear factor (NF)-kappaB-regulated X-chromosome-linked iap gene
expression protects endothelial cells from tumor necrosis factor alpha-induced
apoptosis. J Exp Med, 188, 211-216.
Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000) The language of covalent histone modifications.
Nature, 403, 41-45.
Strater, J., Walczak, H., Pukrop, T., Von Muller, L., Hasel, C., Kornmann, M., Mertens,
T. and Moller, P. (2002) TRAIL and its receptors in the colonic epithelium: a
putative role in the defense of viral infections. Gastroenterology, 122, 659-666.
Sutherland, K.D., Vaillant, F., Alexander, W.S., Wintermantel, T.M., Forrest, N.C.,
Holroyd, S.L., McManus, E.J., Schutz, G., Watson, C.J., Chodosh, L.A.,
Lindeman, G.J. and Visvader, J.E. (2006) c-myc as a mediator of accelerated
apoptosis and involution in mammary glands lacking Socs3. Embo J, 25, 5805-
5815.
182
Takeda, K., Smyth, M.J., Cretney, E., Hayakawa, Y., Kayagaki, N., Yagita, H. and
Okumura, K. (2002) Critical role for tumor necrosis factor-related apoptosis-
inducing ligand in immune surveillance against tumor development. J Exp Med,
195, 161-169.
Taplick, J., Kurtev, V., Kroboth, K., Posch, M., Lechner, T. and Seiser, C. (2001)
Homo-oligomerisation and nuclear localisation of mouse histone deacetylase 1.
J Mol Biol, 308, 27-38.
Thome, M., Schneider, P., Hofmann, K., Fickenscher, H., Meinl, E., Neipel, F.,
Mattmann, C., Burns, K., Bodmer, J.L., Schroter, M., Scaffidi, C., Krammer,
P.H., Peter, M.E. and Tschopp, J. (1997) Viral FLICE-inhibitory proteins
(FLIPs) prevent apoptosis induced by death receptors. Nature, 386, 517-521.
Thornberry, N.A. and Lazebnik, Y. (1998) Caspases: enemies within. Science, 281,
1312-1316.
Truneh, A., Sharma, S., Silverman, C., Khandekar, S., Reddy, M.P., Deen, K.C.,
McLaughlin, M.M., Srinivasula, S.M., Livi, G.P., Marshall, L.A., Alnemri, E.S.,
Williams, W.V. and Doyle, M.L. (2000) Temperature-sensitive differential
affinity of TRAIL for its receptors. DR5 is the highest affinity receptor. J Biol
Chem, 275, 23319-23325.
Tsapis, M., Lieb, M., Manzo, F., Shankaranarayanan, P., Herbrecht, R., Lutz, P. and
Gronemeyer, H. (2007) HDAC inhibitors induce apoptosis in glucocorticoid-
resistant acute lymphatic leukemia cells despite a switch from the extrinsic to
the intrinsic death pathway. Int J Biochem Cell Biol, 39, 1500-1509.
Tschopp, J., Martinon, F. and Hofmann, K. (1999) Apoptosis: Silencing the death
receptors. Curr Biol, 9, R381-384.
Utley, R.T. and Cote, J. (2003) The MYST family of histone acetyltransferases. Curr
Top Microbiol Immunol, 274, 203-236.
van Gurp, M., Festjens, N., van Loo, G., Saelens, X. and Vandenabeele, P. (2003)
Mitochondrial intermembrane proteins in cell death. Biochem Biophys Res
Commun, 304, 487-497.
VanOosten, R.L., Moore, J.M., Karacay, B. and Griffith, T.S. (2005) Histone
deacetylase inhibitors modulate renal cell carcinoma sensitivity to TRAIL/Apo-
183
2L-induced apoptosis by enhancing TRAIL-R2 expression. Cancer Biol Ther, 4,
1104-1112.
Varfolomeev, E.E., Boldin, M.P., Goncharov, T.M. and Wallach, D. (1996) A potential
mechanism of "cross-talk" between the p55 tumor necrosis factor receptor and
Fas/APO1: proteins binding to the death domains of the two receptors also bind
to each other. J Exp Med, 183, 1271-1275.
Verdin, E., Dequiedt, F. and Kasler, H.G. (2003) Class II histone deacetylases: versatile
regulators. Trends Genet, 19, 286-293.
Vulfovich, M. and Saba, N. (2005) Technology evaluation: mapatumumab, Human
Genome Sciences/GlaxoSmithKline/Takeda. Curr Opin Mol Ther, 7, 502-510.
Wade, P.A. (2001) Transcriptional control at regulatory checkpoints by histone
deacetylases: molecular connections between cancer and chromatin. Hum Mol
Genet, 10, 693-698.
Wahl, C., Liptay, S., Adler, G. and Schmid, R.M. (1998) Sulfasalazine: a potent and
specific inhibitor of nuclear factor kappa B. J Clin Invest, 101, 1163-1174.
Walczak, H., Degli-Esposti, M.A., Johnson, R.S., Smolak, P.J., Waugh, J.Y., Boiani,
N., Timour, M.S., Gerhart, M.J., Schooley, K.A., Smith, C.A., Goodwin, R.G.
and Rauch, C.T. (1997) TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for
TRAIL. Embo J, 16, 5386-5397.
Wallace, D.M., Donovan, M. and Cotter, T.G. (2006) Histone deacetylase activity
regulates apaf-1 and caspase 3 expression in the developing mouse retina. Invest
Ophthalmol Vis Sci, 47, 2765-2772.
Wang, C.Y., Mayo, M.W., Korneluk, R.G., Goeddel, D.V. and Baldwin, A.S., Jr.
(1998a) NF-kappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1
and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. Science, 281, 1680-1683.
Wang, K., Gross, A., Waksman, G. and Korsmeyer, S.J. (1998b) Mutagenesis of the
BH3 domain of BAX identifies residues critical for dimerization and killing.
Mol Cell Biol, 18, 6083-6089.
Wang, K.K., Liu, N., Radulovich, N., Wigle, D.A., Johnston, M.R., Shepherd, F.A.,
Minden, M.D. and Tsao, M.S. (2002a) Novel candidate tumor marker genes for
lung adenocarcinoma. Oncogene, 21, 7598-7604.
184
Wang, M.J., Liu, S., Liu, Y. and Zheng, D. (2007) Actinomycin D enhances TRAIL-
induced caspase-dependent and -independent apoptosis in SH-SY5Y
neuroblastoma cells. Neurosci Res, 59, 40-46.
Wang, Q., Ji, Y., Wang, X. and Evers, B.M. (2000a) Isolation and molecular
characterization of the 5'-upstream region of the human TRAIL gene. Biochem
Biophys Res Commun, 276, 466-471.
Wang, T.H., Wang, H.S. and Soong, Y.K. (2000b) Paclitaxel-induced cell death: where
the cell cycle and apoptosis come together. Cancer, 88, 2619-2628.
Wang, X., Yang, C., Chai, J., Shi, Y. and Xue, D. (2002b) Mechanisms of AIF-
mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans. Science, 298,
1587-1592.
Weber, M., Davies, J.J., Wittig, D., Oakeley, E.J., Haase, M., Lam, W.L. and Schubeler,
D. (2005) Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of
differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat
Genet, 37, 853-862.
Wei, M.C., Lindsten, T., Mootha, V.K., Weiler, S., Gross, A., Ashiya, M., Thompson,
C.B. and Korsmeyer, S.J. (2000) tBID, a membrane-targeted death ligand,
oligomerizes BAK to release cytochrome c. Genes Dev, 14, 2060-2071.
Wesselborg, S., Janssen, O. and Kabelitz, D. (1993) Induction of activation-driven
death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells. J
Immunol, 150, 4338-4345.
Widschwendter, M. and Jones, P.A. (2002) The potential prognostic, predictive, and
therapeutic values of DNA methylation in cancer. Commentary re: J. Kwong et
al., Promoter hypermethylation of multiple genes in nasopharyngeal carcinoma.
Clin. Cancer Res., 8: 131-137, 2002, and H-Z. Zou et al., Detection of aberrant
p16 methylation in the serum of colorectal cancer patients. Clin. Cancer Res., 8:
188-191, 2002. Clin Cancer Res, 8, 17-21.
Wiley, S.R., Schooley, K., Smolak, P.J., Din, W.S., Huang, C.P., Nicholl, J.K.,
Sutherland, G.R., Smith, T.D., Rauch, C., Smith, C.A. and et al. (1995)
Identification and characterization of a new member of the TNF family that
induces apoptosis. Immunity, 3, 673-682.
185
Wolf, B.B. and Green, D.R. (1999) Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase
family proteinases. J Biol Chem, 274, 20049-20052.
Wright, C.W. and Duckett, C.S. (2005) Reawakening the cellular death program in
neoplasia through the therapeutic blockade of IAP function. J Clin Invest, 115,
2673-2678.
Wyllie, A.H., Kerr, J.F. and Currie, A.R. (1980) Cell death: the significance of
apoptosis. Int Rev Cytol, 68, 251-306.
Xiao, C., Yang, B.F., Song, J.H., Schulman, H., Li, L. and Hao, C. (2005) Inhibition of
CaMKII-mediated c-FLIP expression sensitizes malignant melanoma cells to
TRAIL-induced apoptosis. Exp Cell Res, 304, 244-255.
Yang, J., Liu, X., Bhalla, K., Kim, C.N., Ibrado, A.M., Cai, J., Peng, T.I., Jones, D.P.
and Wang, X. (1997) Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c
from mitochondria blocked. Science, 275, 1129-1132.
Yang, R., Xu, D., Zhang, A. and Gruber, A. (2001) Immature dendritic cells kill ovarian
carcinoma cells by a FAS/FASL pathway, enabling them to sensitize tumor-
specific CTLs. Int J Cancer, 94, 407-413.
Yang, S., Thor, A.D., Edgerton, S. and Yang, X. (2006) Caspase-3 mediated feedback
activation of apical caspases in doxorubicin and TNF-alpha induced apoptosis.
Apoptosis, 11, 1987-1997.
Yang, W.M., Tsai, S.C., Wen, Y.D., Fejer, G. and Seto, E. (2002) Functional domains
of histone deacetylase-3. J Biol Chem, 277, 9447-9454.
Yang, Y.L. and Li, X.M. (2000) The IAP family: endogenous caspase inhibitors with
multiple biological activities. Cell Res, 10, 169-177.
Yao, J., Duan, L., Fan, M. and Wu, X. (2006) NF-kappaB signaling pathway is involved
in growth inhibition, G2/M arrest and apoptosis induced by Trichostatin A in
human tongue carcinoma cells. Pharmacol Res, 54, 406-413.
Yoshida, M., Kijima, M., Akita, M. and Beppu, T. (1990) Potent and specific inhibition
of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A. J
Biol Chem, 265, 17174-17179.
186
Zauli, G., Rimondi, E., Nicolin, V., Melloni, E., Celeghini, C. and Secchiero, P. (2004)
TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) blocks osteoclastic
differentiation induced by RANKL plus M-CSF. Blood, 104, 2044-2050.
Zauli, G. and Secchiero, P. (2006) The role of the TRAIL/TRAIL receptors system in
hematopoiesis and endothelial cell biology. Cytokine Growth Factor Rev, 17,
245-257.
Zerafa, N., Westwood, J.A., Cretney, E., Mitchell, S., Waring, P., Iezzi, M. and Smyth,
M.J. (2005) Cutting edge: TRAIL deficiency accelerates hematological
malignancies. J Immunol, 175, 5586-5590.
Zhang, J.Q., Okumura, C., McCarty, T., Shin, M.S., Mukhopadhyay, P., Hori, M.,
Torrey, T.A., Naghashfar, Z., Zhou, J.X., Lee, C.H., Roopenian, D.C., Morse,
H.C., 3rd and Davidson, W.F. (2004) Evidence for selective transformation of
autoreactive immature plasma cells in mice deficient in Fasl. J Exp Med, 200,
1467-1478.
Zhang, X.D., Franco, A.V., Nguyen, T., Gray, C.P. and Hersey, P. (2000) Differential
localization and regulation of death and decoy receptors for TNF-related
apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in human melanoma cells. J Immunol, 164,
3961-3970.
Zhang, X.D., Gillespie, S.K., Borrow, J.M. and Hersey, P. (2003) The histone
deacetylase inhibitor suberic bishydroxamate: a potential sensitizer of melanoma
to TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induced apoptosis. Biochem
Pharmacol, 66, 1537-1545.
Zhang, Y., Ng, H.H., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Bird, A. and Reinberg, D.
(1999) Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core
complex and a connection with DNA methylation. Genes Dev, 13, 1924-1935.
Zhou, L.L., Zhou, L.Y., Luo, K.Q. and Chang, D.C. (2005) Smac/DIABLO and
cytochrome c are released from mitochondria through a similar mechanism
during UV-induced apoptosis. Apoptosis, 10, 289-299.
Zinkel, S., Gross, A. and Yang, E. (2006) BCL2 family in DNA damage and cell cycle
control. Cell Death Differ, 13, 1351-1359.
187
Zong, W.X., Lindsten, T., Ross, A.J., MacGregor, G.R. and Thompson, C.B. (2001)
BH3-only proteins that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce
apoptosis in the absence of Bax and Bak. Genes Dev, 15, 1481-1486.
Zou, H., Li, Y., Liu, X. and Wang, X. (1999) An APAF-1.cytochrome c multimeric
complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem,
274, 11549-11556.
188
189
VIII. PUBLICACIONES
190
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K
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Molecular Immunology 44 (2007) 2587–2597
Regulation of the resistance to TRAIL-induced apoptosis inhuman primary T lymphocytes: Role of NF-�B inhibition
Jorge Carlos Morales, Marıa Jose Ruiz-Magana, Carmen Ruiz-Ruiz ∗Departamento de Bioquımica y Biologıa Molecular 3 e Inmunologıa, Facultad de Medicina,
Universidad de Granada, Avda. de Madrid 11, 18012 Granada, Spain
Received 17 October 2006; received in revised form 13 December 2006; accepted 14 December 2006Available online 25 January 2007
bstract
Several combined strategies have been recently proposed to overcome the resistance to tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducingigand (TRAIL) showed by some tumor cells, thus improving the use of this death ligand in antitumor therapy. However, the molecular mechanismsf the tumor selective activity of TRAIL are not completely understood and hence the effects of the combined therapy on normal cells arenknown. Here, we have studied the resistance of primary T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis. No significant differences were foundn the expression of proteins involved in TRAIL-mediated apoptosis between resting and activated T cells. The low expression of death receptorsRAIL-R1/-R2 as well as the high levels of the antiapoptotic proteins TRAIL-R4 and cellular Fas-associated death domain-like IL-1�-convertingnzyme-inhibitory protein (c-FLIP) may explain the lack of caspase-8 activation observed upon TRAIL treatment in both cell types. We have alsonalyzed the effect of different sensitizing agents such as genotoxic drugs, phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) inhibitors, proteasome inhibitors,
icrotubule depolymerizing agents, histone deacetilase inhibitors (HDACi), and NF-�B inhibitors. Although some of them induced T cell death,nly NF-�B inhibitors sensitized activated T cells to TRAIL-induced apoptosis, maybe through the regulation of the antiapoptotic proteins TRAIL-4, c-FLIPS and members of the inhibitors of apoptosis proteins (IAP) family. These results question the safety of the combined treatments withRAIL and NF-�B inhibitors against tumors.2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
ecimttpb
Ttm
eywords: Apoptosis; TRAIL; T lymphocytes; Antitumor therapy
. Introduction
TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO-2L)nd CD95 ligand (CD95L or FasL/APO-1L) are type II trans-embrane proteins that belong to the tumour necrosis factor
TNF) superfamily. They are potent inducers of apoptosis uponinding to their respective death domain-containing receptors,lso known as death receptors (Suda et al., 1993; Wiley et al.,995). Cytoplasmic death domains serve to recruit intracellulardapter molecules such as Fas-associated death domain proteinFADD) that in turn engage procaspase-8, thereby forming theeath-inducing signalling complex (DISC). Caspase-8 is acti-
ated in the DISC allowing the initiation of a cascade of eventshat leads to apoptotic cell death (Chinnaiyan et al., 1995; Sprickt al., 2000). Such direct connection to the cell’s death machin-∗ Corresponding author. Tel.: +34 958 24 35 22; fax: +34 958 24 90 15.E-mail address: [email protected] (C. Ruiz-Ruiz).
aRtfaau
161-5890/$ – see front matter © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.oi:10.1016/j.molimm.2006.12.015
ry suggests a therapeutic potential for CD95L and TRAIL inancer treatment. Concerning CD95L, although it can efficientlynduce apoptosis in a variety of tumour cells, its administration
ay not be a useful strategy as it is associated with severe liveroxicity (Ogasawara et al., 1993). In contrast, TRAIL has no sys-emic toxicity in preclinical studies with mice and non-humanrimates when administered at doses that inhibit the growth ofreast and colon cancer xenografts (Walczak et al., 1999).
TRAIL can bind to four specific type I membrane receptors.RAIL-R1/DR4 and TRAIL-R2/DR5 are death receptors, as
hey contain the intracellular death domain essential for trans-itting the apoptotic signals (MacFarlane et al., 1997; Pan et
l., 1997b; Walczak et al., 1997). TRAIL-R3/DcR1 and TRAIL-4/DcR2 are known as antiapoptotic or decoy receptors because
hey do not contain an intact death domain. They act as non-
unctional binding partners for TRAIL, thereby attenuating itspoptotic activity (Degli-Esposti et al., 1997; MacFarlane etl., 1997; Pan et al., 1997a). TRAIL receptors appear to bebiquitously expressed with transcripts detected in most human
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588 J.C. Morales et al. / Molecular
issues as well as in tumor cell lines of different lineages. More-ver, unlike CD95L, TRAIL is expressed constitutively and its widely distributed in normal organs and tissues (Wiley et al.,995), which is in relation with its lack of toxicity to normalells. Even though a recombinant form of human TRAIL haseen shown to cause apoptosis in human hepatocytes (Jo et al.,000), more recent data have demonstrated that different recom-inant versions of TRAIL vary considerably in toxicity towardsormal human cells, but all of them maintain their antitumorroperties (Lawrence et al., 2001).
To date, the mechanisms of TRAIL resistance in normal cellsnd some tumor cells are not completely understood. As regu-ation of TRAIL-mediated apoptosis is exerted at several stageslong the signalling pathway, resistance can occur by differenteans. Initially, the degree of TRAIL sensitivity or resistanceas proposed to be dependent on the levels of expression, local-
zation and function of death and decoy receptors (Sheridan etl., 1997; Zhang et al., 2000). However, a correlation betweenell survival and the expression of decoy or death receptors hasot been conclusively demonstrated. On the other hand, sev-ral intracellular molecules can block the apoptotic effect ofRAIL. The cellular Fas-associated death domain-like IL-1�-onverting enzyme-inhibitory protein (c-FLIP) modulates thepoptotic pathway right at the beginning because it competesith caspase-8 for binding to FADD (MacFarlane et al., 2002;iegmund et al., 2002). Bcl-2 and Bcl-XL impede the activationf the mitochondrial pathway thereby blocking the release ofytochrome c from mitochondria to cytosol (Ruiz de Almodovart al., 2001). The inhibitors of apoptotic proteins XIAP, c-IAP1nd c-IAP2 act by inhibiting active caspases (Cummins et al.,004; Li et al., 2004). The antiapoptotic signals induced by NF-B (Ravi et al., 2001), protein kinase B (PKB)/Akt (Whang etl., 2004), protein kinase C (PKC) or mitogen-activated proteininase (MAPK) (Ortiz-Ferron et al., 2006; Sarker et al., 2001)ave also been involved in the resistance to TRAIL-inducedpoptosis of different types of cells.
Despite the controversial results about the physiological rolef TRAIL in vivo, several studies point to a role for TRAIL inhe suppression of autoimmune diseases and the immune surveil-ance of developing and metastatic tumors (Cretney et al., 2006).n this respect, it has been reported that TRAIL is implicated inhe antitumor cytotoxicity of dendritic cells, monocytes, NKells and even B cells (Fanger et al., 1999; Griffith et al., 1999;emp et al., 2004; Takeda et al., 2001). Moreover, TRAIL is
nduced on the surface of human T lymphocytes upon activa-ion through the T cell antigen receptor (TCR) or treatment withype I interferons, mediating an important part of the cytotoxicctivity of T cells (Dorothee et al., 2002; Kayagaki et al., 1999).he resistance of immune cells to TRAIL-induced apoptosis isssential for them to act as mediators of antitumoral response. Inhis work, we have investigated the mechanisms of TRAIL resis-ance in resting and activated primary human T lymphocytes.
e have analyzed the expression of several proteins involved
n the TRAIL signalling pathway, such as TRAIL receptors andomponents of the DISC, in both cell types. Furthermore, weave studied their susceptibility to TRAIL upon combinationith agents that regulate TRAIL sensitivity in tumor cells. Ourtsh
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esults show that NF-�B inhibitors are able to sensitize primaryctivated T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis and reg-late the expression of several antiapoptotic proteins in theseells.
. Materials and methods
.1. Reagents and antibodies
Human recombinant TRAIL was prepared as describedreviously (MacFarlane et al., 1997). Phytohemagglutinin,oxorubicin, LY294002, nocodazole, valproic acid, BAY 11-085, sulfasalazine and mouse anti-�-tubulin mAb were fromigma–Aldrich (St. Louis, MO). Velcade (bortezomib) was fromanssen-Cilag SA (Madrid, Spain). Z-VAD-FMK was providedy Bachem (Bubendorf, Switzerland). Parthenolide, CAPE,nti-cFLIP monoclonal antibody NF6 and mouse anti-humanRAIL receptor antibodies for flow cytometry studies wereurchased from Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Mousenti-human CD28 and polyclonal anti-human NF-�B p50 anti-odies were from eBioscience (San Diego, CA). Anti-humanaspase-8 monoclonal antibody was purchased from Cell Diag-ostica (Munster, Germany). Mouse anti-FADD was obtainedrom Transduction Laboratories (Lexington, KY). Monoclonalntibodies against poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), XIAPnd c-IAP2 were obtained from BD Biosciences (San Jose, CA).ouse anti-p65 was obtained from Santa Cruz Biotechnology
nc. (Santa Cruz, CA). Monoclonal antibody anti-Bcl-2 wasrom Dako (Glostrup, Denmark).
.2. Cells and cell culture
Blood samples were obtained from healthy donors bynformed consent and collected into citrate tubes. Peripherallood mononuclear cells (PBMC) were prepared by Ficoll–istopaque density gradient centrifugation (Sigma–Aldrich)
nd adherent monocytes were depleted by culture on plasticishes for 1 h at 37 ◦C. Peripheral blood T lymphocytes werehen isolated by negative selection with an indirect magneticabelling system consisting of a cocktail of biotin-conjugatedntibodies against CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123,nd CD235a (Human Pan T Cells Isolation Kit II, Miltenyiiotec, GmbH). Purity of T cells was >95% CD3+ as deter-ined by flow cytometry. Purified resting T lymphocytes were
esuspended in RPMI 1640 medium (BioWhittaker Inc.) con-aining 10% fetal bovine serum, 1 mM l-glutamine, 100 U/mlenicillin and 100 �g/ml streptomycin and incubated as indi-ated at 37 ◦C in a humidified 5% CO2, 95% air incubator. Forctivation, resting T cells were cultured at 2 × 106 cells/ml with�g/ml PHA and 1 �g/ml anti-CD28 for 20 h. After washing,ells were incubated in complete medium supplemented with
The human cell lines Jurkat, CEM and SKBR3 were all main-ained in culture in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovineerum, l-glutamine, penicillin and streptomycin at 37 ◦C in aumidified 5% CO2, 95% air incubator.
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J.C. Morales et al. / Molecular
.3. Determination of apoptotic cells
Hypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometryccording to published procedures (Gong et al., 1994). Briefly,ells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), fixedn cold 70% ethanol, and then stained with propidium iodidehile treating with RNase. Quantitative analysis of sub-G1 cellsas carried out in a FACScan cytometer using the Cell Quest
oftware (BD Biosciences).
.4. Cytofluorometric analysis of TRAIL receptors
To detect TRAIL receptors at the cell surface, control orreated cells were incubated with primary antibodies (5 �g/ml)t 4 ◦C for 30 min. After washing with PBS to remove unboundrimary antibody, cells were incubated with goat anti-mouseuorescein isothiocyanate-conjugated antibody (Caltag Labo-atories) for 30 min at 4 ◦C. Cells were then washed again,esuspended in PBS and analyzed in a FACScan flow cytometer.
.5. Immunoblot detection of proteins
For detection of cytosolic proteins, cells were lysed in ice-old lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris–Cl, 1% NP-40) for0 min. Proteins of cytosolic supernatants were resolved on 10%DS-PAGE gels and detected as reported previously (Ruiz-Ruiznd Lopez-Rivas, 1999).
For nuclear proteins extractions, cells were lysed with00 �l of hypotonic buffer (10 mM HEPES, pH 7.6, 10 mMCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mMhenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 mM Na2MoO4, androtease inhibitors) containing 0.6% of Nonidet P-40. Nucleiere then centrifuged and incubated in 50 �l of high salt-
ontaining buffer (20 mM HEPES, pH 7.6, 0.4 M KCl, 1 mMDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10 mMa2MoO4, and protease inhibitors) for 30 min on a rocking plat-
orm at 4 ◦C. Nuclei were centrifuged at 13,000 × g for 10 min,o get the supernatants containing the nuclear extracts. Proteinsere then separated through 10% SDS-PAGE gel and detected
s described (Ruiz-Ruiz and Lopez-Rivas, 1999).
.6. Reverse transcription (RT)-PCR
Total RNA was extracted from T lymphocytes with Trizoleagent (Invitrogen) as recommended by the supplier. cDNAsere synthesized from 3 �g of total RNA by using M-MLV
everse transcriptase (Invitrogen) and oligo(dT) primer in aotal volume of 20 �l. Reverse transcription was performed at7◦ for 50 min followed by 15 min at 70◦ for inactivation. PCReactions were performed with 0, 1–2 �l cDNA (depending onhe gene) in a 50-�l volume and using the following primer pairsfragments size indicated in brackets): TRAIL-R1 (506 bp),orward 5′-CTGAGCAACGCAGACTCGCTGTCCAC-3′ and
everse 5′-TCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTGCCAT-3′;RAIL-R2 (502 bp), forward 5′-GCCTCATGGACAATGA-ATAAAGGTGGCT-3′ and reverse 5′-CCAAATCTCAAAG-ACGCACAAACGG-3′; TRAIL-R3 (612 bp), forward 5′-GA-aTtd
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GAATTTGGTGCCAATGCCACTG-3′ and reverse 5′-CTC-TGGACTTGGCTGGGAGATGTG-3′; TRAIL-R4 (453 bp),
orward 5′-CTTTTCCGGCGGCGTTCATGTCCTTC-3′ andeverse 5′-GTTTCTTCCAGGCTGCTTCCCTTTGTAG-3′;-FLIPL (227 bp), forward 5′-AATTCAAGGCTCAGAAGC-A-3′ and reverse 5′-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3′; c-LIPS (100 bp), forward 5′-AATGTTCTCCAAGCAGCAATC--3′ and reverse 5′-CCAAGAATTTTCAGATCAGGACAAT-′; Bcl-2 (367 bp), forward 5′-AGATGTCCAGCCAGCTGC-CCTGAC-3′ and reverse 5′-AGATAGGCACCAGGGTGA-CAAGCT-3′; Bcl-x (257 bp), forward 5′-CATGGCAGCAGT-AAGCAAGC-3′ and reverse 5′-CTGCGATCCGACTCAC-AATAC-3′; Mcl-1 (211 bp), forward 5′-CTTAGTTGAT-TTTTGGGCTTGGG-3′ and reverse 5′-AGAAGTCAAAAA-TAGTCACTGGG-3′; XIAP (858 bp), forward 5′-GGCCA-CTGAGACACATGCAG-3′ and reverse 5′-GCATTCACTA-ATCTGCAACC-3′; c-IAP1 (171 bp), forward 5′-CCAGTT-TTTTCTACACTATAAT-3′ and reverse 5′-CTTAATCTGT-TATTTACAAGGG-3′; c-IAP2 (150 bp), forward 5′-CAAC-TGGAGATTCGAAATCC-3′ and reverse 5′-CACATCACT-TTCTGTGAAGGG-3′; �-actin (661 bp), forward 5′-TGAC-GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′ and reverse′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′. PCRycle conditions were as follows: 1 min at 95 ◦C, 1 min at 55 ◦Cnd 1 min at 72 ◦C for TRAIL-R1, TRAIL-R2 and TRAIL-R3;min at 95 ◦C, 1 min at 60 ◦C, and 1 min at 72 ◦C for TRAIL-4, Bcl-2 and �-actin; 40 seg at 95 ◦C, 40 seg at 60 ◦C, and 40
eg at 72 ◦C for c-FLIPS and c-FLIPL; 1 min at 95 ◦C, 1 mint 57 ◦C, and 1 min at 72 ◦C for Bcl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1nd c-IAP2. The number of cycles varied between 30 and 35,epending on the gene analyzed. The products were resolvedn a 1% agarose gel and visualized with ethidium bromide.
. Results
.1. Resistance of resting and activated primary human Tymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis
The resistance of different peripheral blood cell subpopula-ions to TRAIL-mediated cytotoxicity has recently been reportedHasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004). To further char-cterize the effect of TRAIL on primary human T lymphocytese first analyzed the induction of apoptosis on resting and acti-ated T cells from 10 different healthy donors after treatment for4 h with 250 ng/ml recombinant TRAIL. As shown in Fig. 1A,ll of the resting and activated primary T cell samples wereesistant to TRAIL-induced apoptosis as assessed by sub-G1NA content. Moreover, we did not observe any effect on pri-ary T cell viability after incubation either for 2 days or with
igher doses of TRAIL (data not shown). In this set of experi-ents, we used TRAIL-sensitive Jurkat cells as a positive control
Fig. 1). We also examined the activation of apical caspase-8
s it is the first biochemical event that occurs upon ligation ofRAIL receptors at the cell surface. To this end, we analyzedhe processing of the procaspase into the 43–41 kDa interme-iate proteolytic fragments corresponding to the cleavage of
2590 J.C. Morales et al. / Molecular Immunology 44 (2007) 2587–2597
Fig. 1. Primary T cells are resistant to TRAIL-induced apoptosis. (A) Resting and activated T cells from 10 different healthy donors were treated for 24 h with250 ng/ml recombinant TRAIL. Apoptosis was assessed by analysis of the percentage of cells with sub-G1 content. (B) Resting and activated T lymphocytes wereincubated for 15 h with 250 ng/ml TRAIL and caspase-8 activation was determined by Western blot as described in Section 2. As a positive control, apoptosis (A)and caspase-8 activation (B) were determined in Jurkat T cells after treatment with 100 ng/ml TRAIL. (C) Cell surface TRAIL receptors expression was analyzed byfl s repo ctivates
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ow cytometry in resting and activated T lymphocytes (shaded peaks). Solid linef FADD and c-FLIP was determined by Western blot in Jurkat, resting and ahown are representative of at least three different donors.
rocaspase-8a and -8b. Data presented in Fig. 1B shows thatRAIL was not able to induce activation of caspase-8 in either
esting or activated primary T lymphocytes, which indicates anpical block of the TRAIL signalling pathway in both types ofells.
These results led us to examine the expression of proteinsnown to participate in the formation of the DISC and thusn the activation of caspase-8. Firstly, we analyzed the sur-ace expression of TRAIL receptors in resting and activated
lymphocytes. In agreement with previous data (Hasegawa etl., 2004), we observed that the expression of death receptorsRAIL-R1 and -R2, as well as decoy receptor TRAIL-R3, wasarely detectable in all analyzed resting T cells, with very weakifferences among donors. In contrast, when we examined thexpression of TRAIL-R4, two subsets of cells with different fluo-escence intensities were detected (Fig. 1C). The highly positiveRAIL-R4 peak seems to correspond to the CD8+ T cell sub-opulation (Hasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004) whilehe less fluorescent peak, which varies from very low to mod-rate intensity among different donors, corresponds to CD4+ Tells. T cell activation did not change significantly the expres-ion of TRAIL receptors except for TRAIL-R4 (Fig. 1C). Forhis receptor, we found a slight enhancement in the fluorescencentensity of the two subpopulations, as well as an increase in theercentage of TRAIL-R4 highly positive cells, which is likelyue to the observed increment of the CD8+/CD4+ ratio withinhe population of activated T cells compared to the resting onedata not shown). Regarding the expression of intracellular pro-
eins involved in the activation of caspase-8, we observed thathe levels of FADD in resting and activated T cells were similaro that found in the TRAIL-sensitive Jurkat cell line (Fig. 1D).owever, it is also known that human T lymphocytes expressazaw
resent background fluorescence with secondary antibody alone. (D) Expressiond T cells. �-Tubulin was used as a control of loaded protein. In B–D, results
he inhibitory protein c-FLIP (Bosque et al., 2005; Schmitz etl., 2003). When we compared the expression of this proteinetween Jurkat and primary T cells we detected a much higherevel of the long isoform, c-FLIPL, in both resting and activated Tymphocytes than in Jurkat cells. The expression of the c-FLIPSsoform was low in primary T cells but barely perceptible inurkat cells (Fig. 1D). Taken together, these results suggest thateveral factors may be responsible for the resistance of restingnd activated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis.
.2. Effect of different modulators of TRAIL sensitivity onhe resistance of human primary T lymphocytes
Deregulated expression of TRAIL receptors and intracellularntiapoptotic proteins seem to cause resistance to TRAIL-nduced apoptosis in several types of tumor cells, which reduceshe effectiveness of TRAIL in cancer therapy. However, most ofhese TRAIL-resistant cancer cells can be sensitized by severalherapeutic approaches such as conventional chemotherapeu-ic drugs, histone deacetylase inhibitors (HDACi), inhibitors ofurvival pathways or proteasome inhibitors (Inoue et al., 2004;andasamy and Srivastava, 2002; Sayers and Murphy, 2006;hankar and Srivastava, 2004; Singh et al., 2003). We ana-
yzed the effect of some agents belonging to these functionalroups on the resistance of primary T lymphocytes to TRAIL-ediated apoptosis. As shown in Fig. 2, we specifically tested the
enotoxic drug doxorubicin, the PI3K inhibitor LY294002, theDACi valproic acid (VPA), the microtubule depolymerizing
gent nocodazole and the proteasome inhibitor Velcade (borte-omib). Working concentrations of these agents were chosenccording to previous reports and on the basis of experimentsith the T-lymphoblastic leukemic CEM cell line and the breast
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Fig. 2. Primary T lymphocytes remain resistant to TRAIL upon treatment with different sensitizing agents. Resting and activated T lymphocytes were preincubatedwith (A) 100 ng/ml doxorubicin (DXR), (B) 10 �M LY 294002 or (E) 50 nM bortezomib (BZ) for 1 h, or with (C) 1mM valproic acid (VPA) or (D) 400 ng/mlnocodazole (NZ) for 7 h. After preincubation, cells were treated with or without 250 ng/ml recombinant TRAIL for 24 h. CEM (A–C) and SKBr3 (D and E) cellsw /ml rec pende(
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ere preincubated in the same conditions before treatment with 50 and 250 ngells was determined by flow cytometry. Error bars show S.D. from three indetwo-tailed).
ancer SKBr3 cell line, which show a moderate sensitivity andhigh resistance to TRAIL, respectively. Pretreatment with
ither doxorubicin, LY294002 or VPA increased the suscepti-ility of CEM cells to TRAIL while bortezomib and nocodazolelearly sensitized TRAIL-resistant SKBr3 cells. However, weid not find TRAIL sensitization in either resting or activatedcells in response to pretreatment with any of the indicated
gents. Interestingly, doxorubicin, nocodazole and bortezomibhowed a remarkable toxicity against activated T cells, whereasnly bortezomib was slightly toxic to resting ones (Fig. 2A,and E).
.3. NF-κB inhibitors sensitize human activated Tymphocytes to TRAIL-induced apoptosis
In addition to the above agents, we also analyzed the effect
f the NF-�B inhibitor BAY 11-7085. Data presented in Fig. 3Andicates that the response of resting T lymphocytes to thisnhibitor varies among different donors. BAY 11-7085 alone wasoxic to varying degrees to 9/10 samples. Surprisingly, whileBati
combinant TRAIL, respectively, for 20 h. The percentage of sub-G1 apoptoticnt experiments. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 by unpaired Student’s t-test
t caused a significant sensitization to TRAIL-induced apop-osis in 4/10 samples, in five different ones the percentage ofpoptotic cells decreased following treatment with both BAY1-7085 and TRAIL compared to cells treated with the NF-B inhibitor alone. In the case of activated T lymphocytes, aariable toxicity was also found in response to BAY 11-7085lone (Fig. 3B). However, we observed that preincubation withhe NF-�B inhibitor induced a different but substantial sensi-ization to TRAIL-mediated apoptosis in all donors analyzed,xcept for one in which the inhibitor alone showed an extremeoxicity.
To further establish that the death process promoted by theF-�B inhibitor was apoptosis, resting and activated T lym-hocytes from donors previously proved to be sensitized toRAIL (Fig. 3A and B, respectively) were preincubated with theeneral caspase inhibitor Z-VAD-FMK before treatment with
AY 11-7085 and TRAIL. Representative samples in Fig. 3Cnd D show that not only TRAIL-mediated cell death but alsohe cytotoxic effect of BAY 11-7085 were almost completelynhibited by Z-VAD. It is worth mentioning that Z-VAD was
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Fig. 3. BAY 11-7085 sensitizes activated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis. Resting (A and C) and activated (B and D) T lymphocytes from 10 differenthealthy donors (A and B) and one representative donor (C and D) were preincubated for 1 h with 2.5 �M BAY 11-7085 and then treated with or without 250 ng/mlTRAIL for 24 h. In C and D, preincubation was carried out in the presence or in the absence of 50 �M Z-VAD. Apoptosis was determined by flow cytometry. Resultsin C and D are representative of three different experiments. (E) Activation of caspase-8 was determined by Western blot in activated T lymphocytes incubatedw BAr
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ith or without 250 ng/ml TRAIL for 20 h after pretreatment for 1 h with 2.5 �Mepresentative of three different experiments.
ot able to inhibit cell death in the samples in which BAY1-7085 alone was extremely toxic (data not shown). This sug-ests that BAY 11-7085 may activate both caspase-dependentnd caspase-independent cell death signalling pathways in Tymphocytes. On the other hand, we observed the processingf apical procaspase-8 in response to TRAIL in activated Tymphocytes preincubated with BAY 11-7085 (Fig. 3E), whichonfirm the induction of the TRAIL signalling pathway in Tells sensitized by treatment with the NF-�B inhibitor.
To determine the specific involvement of NF-�B in the mech-nism of BAY 11-7085-induced sensitization, we examinedhe effects of different NF-�B inhibitors on the resistance ofctivated T cells to TRAIL-mediated cell death. Sulfasalazine,arthenolide and caffeic acid phenetyl ester (CAPE) have alleen reported to be specific NF-�B inhibitors (Bork et al.,
997; Natarajan et al., 1996; Wahl et al., 1998). We observedhat activated T lymphocytes were significantly sensitized toRAIL-induced apoptosis upon pretreatment with sulfasalazine.owever, parthenolide and CAPE showed a very week and nol
t
Y 11-7085. �-Tubulin was used as a control of loaded protein. Data shown are
ffect, respectively, on the resistance to TRAIL (Fig. 4A). Weext confirmed that all these compounds effectively inhibitedF-�B at the concentrations used in this study. To this end, we
nalyzed the presence of the p65 (RelA) and the p50 (NF-�B1)ubunits of NF-�B in nuclear extracts of activated T lymphocytesollowing treatment with the NF-�B inhibitors. Western blotnalysis showed that BAY 11-7085, sulfasalazine and partheno-ide significantly reduced the levels of p65 and p50 in the nucleusf activated T cells, while CAPE only had a slight effect on theuclear translocation of the NF-�B subunits (Fig. 4B), whichay explain the lack of sensitization to TRAIL-induced apop-
osis showed by this agent.
.4. BAY 11-7085 regulates the expression of TRAILeceptors and antiapoptotic genes in activated T
ymphocytesThe transcription factor NF-�B has been reported to regulatehe expression of some TRAIL receptors as well as that of
J.C. Morales et al. / Molecular Immu
Fig. 4. Effect of different NF-�B inhibitors on the resistance of activated T cellsto TRAIL. (A) Activated T cells were preincubated for 1 h with 1.5 mM sul-fasalazine (SS), 2.5 �M parthenolide (PT) or 50 �g/ml CAPE, before treatmentwith 250 ng/ml TRAIL for 24 h. Sub-G1 apoptotic cells were analyzed by flowcytometry. Error bars show S.D. from three independent experiments. *p < 0.05by unpaired Student’s t-test (two-tailed). (B) Expression of the p50 and p65 sub-units of NF-�B was determined by Western blot in nuclear extracts of activatedTce
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cells after treatment for 4 h with the indicated inhibitors. PARP was used asontrol of loaded protein. Results shown are representative of three independentxperiments.
everal antiapoptotic proteins involved in TRAIL signallingpoptotic pathway (Micheau et al., 2001; Ravi et al., 2001;tehlik et al., 1998; Wang et al., 1998). In order to understand
he mechanism for NF-�B inhibition-induced sensitization ofuman primary T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis,e first analyzed the expression of TRAIL-R1, -R2 and -R4n the surface of activated T lymphocytes upon treatmentith BAY 11-7085. As shown in Fig. 5A, we did not observe
ny change in the expression of death receptors, although theurface level of the antiapoptotic receptor TRAIL-R4 waseduced in response to the NF-�B inhibitor in all samplesnalyzed. Moreover, when we determined the expression ofRAIL receptors at the mRNA level we observed a clear
ime-dependent down-regulation of all of them after treatmentith BAY 11-7085 (Fig. 5B). TRAIL-R3 expression wasndetectable at the mRNA level (data not shown).
We then examined the effects of BAY 11-7085 on the expres-ion of different antiapoptotic genes, namely c-FLIP, Bcl-2,cl-x, Mcl-1, XIAP, c-IAP1 and c-IAP2, in activated T lym-hocytes. We found no marked changes in the mRNA levelsf c-FLIPL, Bcl-x and Mcl-1 for up to 9 h following treatmentith BAY 11-7085 (Fig. 5C). In contrast, a significant and time-ependent decrease in the mRNA expression of c-FLIPS, Bcl-2,IAP, c-IAP1 and c-IAP2 was observed in T cells exposed to
he NF-�B inhibitor (Fig. 5C). We further analyzed whether theecrease of these antiapoptotic genes was paralleled by changes
n the levels of the corresponding proteins. Results in Fig. 5Dndicate that all the proteins analyzed, with the exception ofcl-2, were down-regulated after 24 h of treatment with BAY1-7085. The absence of down-regulation of Bcl-2 at this timeeRdo
nology 44 (2007) 2587–2597 2593
ay be due to the long half-life of the protein (Reed, 1996). Alto-ether, regulation of these antiapoptotic proteins and changes inhe expression of TRAIL-R4, may account for the sensitizationf T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosis observed inesponse to NF-�B inhibition.
. Discussion
The significance of TRAIL as an anti-cancer therapeuticgent is supported by its known involvement in immuneurveillance against tumors. Surface expression of TRAIL ispregulated in virtually all cell types of the immune system inesponse to activation signals, mediating to a great degree theytotoxic activity of these cells (Fanger et al., 1999; Griffitht al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Kemp et al., 2004, 2005;akeda et al., 2001). The lack of toxicity to most normal cells
s an important feature for TRAIL to act as an anti-tumor agentlthough the molecular mechanisms of TRAIL resistance inormal cells are not completely understood. Here, we havenalyzed the response of resting and activated T lymphocyteso TRAIL. We have shown for the first time that the TRAILignalling pathway is inhibited at the most apical level in both,esting and activated T cells, as no caspase-8 activation wasbserved in response to TRAIL. The analysis of the expressionf the most important proteins involved in the formation of theISC indicate that: (1) long-term T cell activation (day 6) doesot modulate the expression levels of FADD, caspase-8, c-FLIPnd TRAIL receptors, with the exception of TRAIL-R4; (2)hen comparison with the TRAIL sensitive Jurkat cells, the
xpression of the antiapoptotic protein c-FLIP is much higher inlymphocytes than in this cell line; (3) the levels of expression
f TRAIL-R1, -R2 and -R3 receptors on the surface of T cellsre barely detectable while the expression of TRAIL-R4 showswo peaks with low and high fluorescence intensity, respec-ively. From these data we can infer that several factors may beesponsible for the lack of caspase-8 activation upon treatmentith TRAIL and hence for the resistance of resting and
ctivated T lymphocytes to TRAIL-induced apoptosis. It haseen recently described that c-FLIP is involved the resistance ofK cells to TRAIL-induced apoptosis (Mirandola et al., 2004).ur results about the expression of c-FLIP, in agreement withrevious reports (Bosque et al., 2005; Mirandola et al., 2004;chmitz et al., 2003), suggest that this inhibitory protein couldlso play a role in the resistance of T lymphocytes.
Regarding the expression of TRAIL receptors, there are someiscrepancies between authors. Previous studies have reportedhat resting T cells do not show significant expression of TRAILeceptors, with the exception of TRAIL-R4 on the CD8+ subpop-lation (Hasegawa et al., 2004; Mirandola et al., 2004). However,e have observed that the intensity of the TRAIL-R4 less flu-rescence peak, which seems to correspond to the CD4+ cells,ay vary among donors. On the other hand, those reports show
hat activation of CD8+ T cells up-regulate the expression of
ither TRAIL-R1 and -R2 (Hasegawa et al., 2004) or TRAIL-2, -R3 and -R4 (Mirandola et al., 2004) while no changes areetected in the expression of TRAIL receptors upon activationf CD4+ T cells (Hasegawa et al., 2004). In contrast to Miran-
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Fig. 5. Expression of TRAIL receptors and antiapoptotic genes in activated T lymphocytes in response to BAY 11-7085. (A) Activated T cells were incubated with(unshaded peaks) or without (shaded peaks) 2.5 �M BAY for 15 h and cell surface TRAIL-R1, -R2 and -R4 receptors expression was assessed by flow cytometry.Dashed lines show background fluorescence with secondary antibody. mRNA levels of TRAIL-R1, -R2, -R4 (B), c-FLIPL, c-FLIPS, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, XIAP,c th 2.5u P ando tein.d
dTiMcT
da
-IAP1 and c-IAP2 (C) were determined in activated T cells after treatment wised as control of RNA input. (D) Expression of c-FLIPL, c-FLIPS, Bcl-2, XIAr without 2.5 �M BAY for 24 h. �-Tubulin was used as control of loaded proifferent donors.
ola et al., we have worked with the whole population of CD3+
lymphocytes as CD4+ and CD8+ T cells subpopulations coex-
st and may influence each other in physiological conditions.oreover, not only CD8+ cytotoxic T cells but also CD4+ Tells seem to be involved in antitumor immune response viaRAIL (Dorothee et al., 2002; Kayagaki et al., 1999). Contra-
wTaT
�M BAY for 6 and 9 h by RT-PCR as described under Section 2. �-Actin wasc-IAP2 was analyzed by Western blot in activated T lymphocytes treated with
Data shown are representative of at least three independent experiments with
ictory data concerning the expression of TRAIL receptors inctivated T lymphocytes may also be due to differences in the
ay of T cell activation. Independently of the reported profile ofRAIL receptors expression, it is important to emphasize thatll studies agree in the resistance of activated T lymphocytes toRAIL-induced apoptosis.
Immu
faitKoTc1ltlbt(iITcstoTTrcwolstR(cibatabcaatBoill
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NF-�B inhibition has been recently proposed as a mechanismor sensitization of some tumor resistant cells to TRAIL-inducedpoptosis since this transcription factor is constitutively activen certain tumors modulating the expression of several antiapop-otic proteins (Huerta-Yepez et al., 2004; Karacay et al., 2004;asuga et al., 2004). Our findings reveal that several inhibitorsf NF-�B are also able to sensitize activated T lymphocytes toRAIL-mediated apoptosis. Specifically, we have observed alear sensitization to TRAIL with the NF-�B inhibitors BAY1-7085 and sulfasalazine while the effect of parthenolide is tooow to be significant. As all these agents were able to inhibit theranslocation of p65 and p50 subunits to the nucleus, we specu-ate that the weak sensitization observed with parthenolide maye due to the additional activities that have been reported forhis compound, such as JNK activation and STAT3 inhibitionNakshatri et al., 2004; Sobota et al., 2000), which can interferen some way with the signals derived from NF-�B inhibition.nterestingly, BAY 11-7085 reduces the mRNA expression ofRAIL-R1 and TRAIL-R2 receptors in activated T lympho-ytes, although we could not estimate this decrease at the level ofurface protein expression. Despite that the levels of death recep-ors are too low to be detected by FACS analysis, we have clearlybserved activation of the initiator caspase-8 in response toRAIL upon pretreatment of T lymphocytes with BAY 11-7085.hus, the above data suggest that TRAIL-R1, TRAIL-R2 or both
eceptors must be present on the surface of activated T lympho-ytes and are able to transmit the apoptotic signals. In addition,e have demonstrated for the first time that NF-�B inhibition notnly down-regulates the expression of TRAIL-R4 at the mRNAevel but also modestly reduces TRAIL-R4 expression at the cellurface. TRAIL-R4 has been recently proposed to be a regula-ory rather than a decoy receptor as it associates with TRAIL-2 forming a ligand-independent, death-inhibitory complex
Clancy et al., 2005). Moreover, authors demonstrate that thisomplex regulates the sensitivity of CD8+ T cells to TRAIL-nduced apoptosis. Therefore, down-regulation of TRAIL-R4y NF-�B inhibition may be involved in the sensitization ofctivated T lymphocytes to TRAIL. We have further observedhat BAY 11-7085 down-regulates the expression levels of somentiapoptotic proteins known to be transcriptionally modulatedy NF-�B, such as c-FLIPS, XIAP and c-IAP2. Although theontribution of each factor in mediating TRAIL resistance ofctivated T lymphocytes is unknown, the overall results providemechanism for the sensitization of activated T lymphocytes
o TRAIL-mediated apoptosis by NF-�B inhibition. Regardingcl-2, even though there is a clear decrease of mRNA levels,ur findings suggest that this antiapoptotic factor must not benvolved in the effect of the NF-�B inhibitor as the proteinevels do not change at the time we observe sensitization of Tymphocytes.
Our data indicate that the response of resting T lymphocyteso TRAIL-induced apoptosis upon NF-�B inhibition vary amongifferent donors. While NF-�B is actively involved in T cell pro-
iferation and activation, only low levels of constitutive NF-�Binding activity are usually found in resting T cells. Moreover,omodimeric complexes of the NF-�B p50 subunit, which gen-rally function as transcriptional repressors, have been reporteddtai
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o bind to the DNA in the nuclei of resting T cells, in sharpontrast with the transcriptionally active p65/p50 heterodimersound in activated T lymphocytes (Algarte et al., 1995; Kang etl., 1992). These special features of NF-�B activity in resting Tymphocytes, together with individual singularities, may influ-nce the effect of BAY 11-7085. Furthermore, TRAIL has beeneported to activate NF-�B through TRAIL-R1 and TRAIL-2 in many cell types (Franco et al., 2001; Hao et al., 2003;chneider et al., 1997). Our striking findings about the blockadef cell death observed in some resting T cells upon treatment withoth, BAY 11-7085 and TRAIL, might be due to the activation ofF-�B by TRAIL, which could counteract the cytotoxic effectf the NF-�B inhibitor. It would be interesting to determinehether NF-�B activation is the predominant effect of TRAIL
eceptors engagement in resting T lymphocytes. On the otherand, although we have detected similar levels of pro- and anti-poptotic genes in resting and activated T lymphocytes (Fig. 1nd data not shown) it is known that only the last ones are ableo undergo activation-induced cell death (AICD) (Wesselborgt al., 1993) indicating that different mechanisms of apoptosisesistance work in both types of cells, which may also influencehe sensitization to TRAIL.
Although proteasome inhibitors block NF-�B activation, weave not observed any effect of either bortezomib or MG132 onhe resistance of T lymphocytes to TRAIL-mediated apoptosisFig. 2E and data not shown). This is not surprising as the biolog-cal effects of proteasome inhibitors are multiple and the finalesult of all of them may be not suitable for the sensitizationf T cells to TRAIL. In spite of that, our results indicate thatortezomib is highly toxic especially for activated T lympho-ytes. Similarly, other modulators of TRAIL sensitivity in tumorells, such as doxorubicin and nocodazole, show a moderateoxicity against activated T cells. In contrast, and in agreementith previous reports, our findings suggest that HDAC inhibitorsay be a valuable therapeutic strategy to sensitize tumor cells
o TRAIL-induced apoptosis as they seem to be non-toxic andhey do not regulate TRAIL resistance in primary T cells (Inouet al., 2004). PI3K/Akt inhibitors may also be useful in thereatment of tumors with high level of activity of this survivalathway that seems to block the apoptotic signals derived fromRAIL receptors engagement (Nam et al., 2003; Nesterov et al.,001).
NF-�B activation is essential to numerous physiological pro-esses and plays a crucial role in the immune response, e.g. inymphocyte proliferation and cytokine production, which sug-ests that general NF-�B inhibitors will probably produce ayriad of side-effects. In the present study, we have demon-
trated that NF-�B inhibitors not only sensitize primary activatedlymphocytes to TRAIL-induced apoptosis but also show a
ariable toxicity to resting and activated T cells. It is worth men-ioning a recent report describing that the mechanism of TRAILesistance in normal human urothelial cells is mainly dependentn the NF-�B pathway (Steele et al., 2006). Together with these
ata, our results suggest a likely role for NF-�B in the resis-ance of some normal cells types to TRAIL-induced apoptosisnd challenge the use of NF-�B inhibitors as a useful approachn antitumor therapy.
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cknowledgements
This work was supported by a grant from the Ministerio deducacion y Ciencia SAF2003-02486 (to C.R.-R.). J.C.M. wasupported by a fellowship from the Ministerio de Educacion yiencia. We would like to thank Dr. Abelardo Lopez-Rivas andr. F. Javier Oliver for invaluable advice and for the generousonation of reagents.
eferences
lgarte, M., Lecine, P., Costello, R., Plet, A., Olive, D., Imbert, J., 1995. Invivo regulation of interleukin-2 receptor alpha gene transcription by thecoordinated binding of constitutive and inducible factors in human primaryT cells. EMBO J. 14, 5060–5072.
ork, P.M., Schmitz, M.L., Kuhnt, M., Escher, C., Heinrich, M., 1997.Sesquiterpene lactone containing Mexican Indian medicinal plants andpure sesquiterpene lactones as potent inhibitors of transcription factor NF-kappaB. FEBS Lett. 402, 85–90.
osque, A., Pardo, J., Martinez-Lorenzo, M.J., Iturralde, M., Marzo, I., Pineiro,A., Alava, M.A., Naval, J., Anel, A., 2005. Down-regulation of normalhuman T cell blast activation: roles of APO-2L/TRAIL, FasL, and c- FLIP,Bim, or Bcl-x isoform expression. J. Leukoc. Biol. 77, 568–578.
lancy, L., Mruk, K., Archer, K., Woelfel, M., Mongkolsapaya, J., Screaton,G., Lenardo, M.J., Chan, F.K., 2005. Preligand assembly domain-mediatedligand-independent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2regulates TRAIL-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102,18099–18104.
retney, E., Shanker, A., Yagita, H., Smyth, M.J., Sayers, T.J., 2006. TNF-related apoptosis-inducing ligand as a therapeutic agent in autoimmunityand cancer. Immunol. Cell Biol. 84, 87–98.
ummins, J.M., Kohli, M., Rago, C., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., Bunz,F., 2004. X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a non-redundant modulator of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand (TRAIL)-mediated apoptosis in human cancer cells. Cancer Res. 64,3006–3008.
hinnaiyan, A.M., O’Rourke, K., Tewari, M., Dixit, V.M., 1995. FADD, a noveldeath domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas andinitiates apoptosis. Cell 81, 505–512.
egli-Esposti, M.A., Dougall, W.C., Smolak, P.J., Waugh, J.Y., Smith, C.A.,Goodwin, R.G., 1997. The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-kappaBand protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incompletedeath domain. Immunity 7, 813–820.
orothee, G., Vergnon, I., Menez, J., Echchakir, H., Grunenwald, D., Kubin,M., Chouaib, S., Mami-Chouaib, F., 2002. Tumor-infiltrating CD4+ T lym-phocytes express APO2 ligand (APO-2L)/TRAIL upon specific stimulationwith autologous lung carcinoma cells: role of IFN-alpha on APO-2L/TRAILexpression and -mediated cytotoxicity. J. Immunol. 169, 809–817.
anger, N.A., Maliszewski, C.R., Schooley, K., Griffith, T.S., 1999. Humandendritic cells mediate cellular apoptosis via tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL). J. Exp. Med. 190, 1155–1164.
ranco, A.V., Zhang, X.D., Van Berkel, E., Sanders, J.E., Zhang, X.Y., Thomas,W.D., Nguyen, T., Hersey, P., 2001. The role of NF-kappaB in TNF-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis of melanoma cells.J. Immunol. 166, 5337–5345.
ong, J.P., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z., 1994. A selective procedure forDNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis andflow cytometry. Anal. Biochem. 218, 314–319.
riffith, T.S., Wiley, S.R., Kubin, M.Z., Sedger, L.M., Maliszewski, C.R.,Fanger, N.A., 1999. Monocyte-mediated tumoricidal activity via the tumornecrosis factor-related cytokine, TRAIL. J. Exp. Med. 189, 1343–1354.
ao, X.S., Hao, J.H., Liu, F.T., Newland, A.C., Jia, L., 2003. Potential mech-anisms of leukemia cell resistance to TRAIL-induced apoptosis. Apoptosis8, 601–607.
asegawa, H., Yamada, Y., Harasawa, H., Tsuji, T., Murata, K., Sugahara, K.,Tsuruda, K., Masuda, M., Takasu, N., Kamihira, S., 2004. Restricted expres-
N
nology 44 (2007) 2587–2597
sion of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 4 inhuman peripheral blood lymphocytes. Cell. Immunol. 231, 1–7.
uerta-Yepez, S., Vega, M., Jazirehi, A., Garban, H., Hongo, F., Cheng, G.,Bonavida, B., 2004. Nitric oxide sensitizes prostate carcinoma cell lines toTRAIL-mediated apoptosis via inactivation of NF-kappaB and inhibition ofBcl-xl expression. Oncogene 23, 4993–5003.
noue, S., MacFarlane, M., Harper, N., Wheat, L.M., Dyer, M.J., Cohen, G.M.,2004. Histone deacetylase inhibitors potentiate TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis in lymphoid malignancies. CellDeath Differ. 11 (Suppl. 2), S193–S206.
o, M., Kim, T.H., Seol, D.W., Esplen, J.E., Dorko, K., Billiar, T.R., Strom, S.C.,2000. Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand. Nat. Med. 6, 564–567.
andasamy, K., Srivastava, R.K., 2002. Role of the phosphatidylinosi-tol 3′-kinase/PTEN/Akt kinase pathway in tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in non-small cell lung cancercells. Cancer Res. 62, 4929–4937.
ang, S.M., Tran, A.C., Grilli, M., Lenardo, M.J., 1992. NF-kappa B subunit reg-ulation in non-transformed CD4+ T lymphocytes. Science 256, 1452–1456.
aracay, B., Sanlioglu, S., Griffith, T.S., Sandler, A., Bonthius, D.J., 2004. Inhi-bition of the NF-kappaB pathway enhances TRAIL-mediated apoptosis inneuroblastoma cells. Cancer Gene Ther. 11, 681–690.
asuga, C., Ebata, T., Kayagaki, N., Yagita, H., Hishii, M., Aral, H., Sato, K.,Okumura, K., 2004. Sensitization of human glioblastomas to tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) by NF-kappaB inhibitors.Cancer Sci. 95, 840–844.
ayagaki, N., Yamaguchi, N., Nakayama, M., Eto, H., Okumura, K., Yagita,H., 1999. Type I interferons (IFNs) regulate tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) expression on human T cells: a novelmechanism for the antitumor effects of type I IFNs. J. Exp. Med. 189,1451–1460.
emp, T.J., Ludwig, A.T., Earel, J.K., Moore, J.M., VanOosten, R.L., Moses, B.,Leidal, K., Nauseef, W.M., Griffith, T.S., 2005. Neutrophil stimulation withMycobacterium bovis bacillus calmette-guerin (BCG) results in the releaseof functional soluble TRAIL/APO-2L. Blood 106, 3474–3482.
emp, T.J., Moore, J.M., Griffith, T.S., 2004. Human B cells express functionalTRAIL/Apo-2 ligand after CpG-containing oligodeoxynucleotide stimula-tion. J. Immunol. 173, 892–899.
awrence, D., Shahrokh, Z., Marsters, S., Achilles, K., Shih, D., Mounho, B.,Hillan, K., Totpal, K., DeForge, L., Schow, P., Hooley, J., Sherwood, S.,Pai, R., Leung, S., Khan, L., Gliniak, B., Bussiere, J., Smith, C.A., Strom,S.S., Kelley, S., Fox, J.A., Thomas, D., Ashkenazi, A., 2001. Differentialhepatocyte toxicity of recombinant APO-2L/TRAIL versions. Nat. Med. 7,383–385.
i, L., Thomas, R.M., Suzuki, H., De Brabander, J.K., Wang, X., Harran, P.G.,2004. A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL-and TNFalpha-mediated cell death. Science 305, 1471–1474.
acFarlane, M., Ahmad, M., Srinivasula, S.M., Fernandes-Alnemri, T., Cohen,G.M., Alnemri, E.S., 1997. Identification and molecular cloning of two novelreceptors for the cytotoxic ligand TRAIL. J. Biol. Chem. 272, 25417–25420.
acFarlane, M., Harper, N., Snowden, R.T., Dyer, M.J., Barnett, G.A., Pringle,J.H., Cohen, G.M., 2002. Mechanisms of resistance to TRAIL-inducedapoptosis in primary B cell chronic lymphocytic leukaemia. Oncogene 21,6809–6818.
icheau, O., Lens, S., Gaide, O., Alevizopoulos, K., Tschopp, J., 2001. NF-kappaB signals induce the expression of c-FLIP. Mol. Cell. Biol. 21,5299–5305.
irandola, P., Ponti, C., Gobbi, G., Sponzilli, I., Vaccarezza, M., Cocco, L.,Zauli, G., Secchiero, P., Manzoli, F.A., Vitale, M., 2004. Activated humanNK and CD8+ T cells express both TNF-related apoptosis-inducing lig-and (TRAIL) and TRAIL receptors but are resistant to TRAIL-mediatedcytotoxicity. Blood 104, 2418–2424.
akshatri, H., Rice, S.E., Bhat-Nakshatri, P., 2004. Antitumor agent partheno-
lide reverses resistance of breast cancer cells to tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand through sustained activation of c-Jun N-terminalkinase. Oncogene 23, 7330–7344.am, S.Y., Jung, G.A., Hur, G.C., Chung, H.Y., Kim, W.H., Seol, D.W., Lee,B.L., 2003. Upregulation of FLIP(S) by Akt, a possible inhibition mecha-
Immu
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S
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S
S
S
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S
S
S
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W
W
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W
W
W
W
J.C. Morales et al. / Molecular
nism of TRAIL-induced apoptosis in human gastric cancers. Cancer Sci. 94,1066–1073.
atarajan, K., Singh, S., Burke Jr., T.R., Grunberger, D., Aggarwal, B.B., 1996.Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation ofnuclear transcription factor NF-kappaB. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,9090–9095.
esterov, A., Lu, X., Johnson, M., Miller, G.J., Ivashchenko, Y., Kraft, A.S.,2001. Elevated AKT activity protects the prostate cancer cell line LNCaPfrom TRAIL-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276, 10767–10774.
gasawara, J., Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai,T., Kitamura, Y., Itoh, N., Suda, T., Nagata, S., 1993. Lethal effect of theanti-Fas antibody in mice. Nature 364, 806–809.
rtiz-Ferron, G., Tait, S.W., Robledo, G., de Vries, E., Borst, J., Lopez-Rivas, A., 2006. The mitogen-activated protein kinase pathway can inhibitTRAIL-induced apoptosis by prohibiting association of truncated Bid withmitochondria. Cell Death Differ. 13, 1857–1865.
an, G., Ni, J., Wei, Y.F., Yu, G., Gentz, R., Dixit, V.M., 1997a. An antagonistdecoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science277, 815–818.
an, G., O’Rourke, K., Chinnaiyan, A.M., Gentz, R., Ebner, R., Ni, J., Dixit,V.M., 1997b. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. Science 276,111–113.
avi, R., Bedi, G.C., Engstrom, L.W., Zeng, Q., Mookerjee, B., Gelinas,C., Fuchs, E.J., Bedi, A., 2001. Regulation of death receptor expressionand TRAIL/APO-2L-induced apoptosis by NF-kappaB. Nat. Cell Biol. 3,409–416.
eed, J.C., 1996. A day in the life of the Bcl-2 protein: does the turnover rateof Bcl-2 serve as a biological clock for cellular lifespan regulation? Leuk.Res. 20, 109–111.
uiz-Ruiz, M.C., Lopez-Rivas, A., 1999. p53-Mediated up-regulation of CD95is not involved in genotoxic drug-induced apoptosis of human breast tumorcells. Cell Death Differ. 6, 271–280.
uiz de Almodovar, C., Ruiz-Ruiz, C., Munoz-Pinedo, C., Robledo, G., Lopez-Rivas, A., 2001. The differential sensitivity of Bc1-2-overexpressing humanbreast tumor cells to TRAIL or doxorubicin-induced apoptosis is dependenton Bc1-2 protein levels. Oncogene 20, 7128–7133.
arker, M., Ruiz-Ruiz, C., Lopez-Rivas, A., 2001. Activation of protein kinaseC inhibits TRAIL-induced caspases activation, mitochondrial events andapoptosis in a human leukemic T cell line. Cell Death Differ. 8, 172–181.
ayers, T.J., Murphy, W.J., 2006. Combining proteasome inhibition with TNF-related apoptosis-inducing ligand (APO-2L/TRAIL) for cancer therapy.Cancer Immunol. Immunother. 55, 76–84.
chmitz, I., Krueger, A., Baumann, S., Schulze-Bergkamen, H., Krammer,P.H., Kirchhoff, S., 2003. An IL-2-dependent switch between CD95 sig-naling pathways sensitizes primary human T cells toward CD95-mediatedactivation-induced cell death. J. Immunol. 171, 2930–2936.
chneider, P., Thome, M., Burns, K., Bodmer, J.L., Hofmann, K., Kataoka, T.,Holler, N., Tschopp, J., 1997. TRAIL receptors 1 (DR4) and 2 (DR5) signalFADD-dependent apoptosis and activate NF-kappaB. Immunity 7, 831–836.
hankar, S., Srivastava, R.K., 2004. Enhancement of therapeutic potential ofTRAIL by cancer chemotherapy and irradiation: mechanisms and clinicalimplications. Drug Resist. Update 7, 139–156.
heridan, J.P., Marsters, S.A., Pitti, R.M., Gurney, A., Skubatch, M., Baldwin,
D., Ramakrishnan, L., Gray, C.L., Baker, K., Wood, W.I., Goddard, A.D.,Godowski, P., Ashkenazi, A., 1997. Control of TRAIL-induced apoptosisby a family of signaling and decoy receptors. Science 277, 818–821.iegmund, D., Hadwiger, P., Pfizenmaier, K., Vornlocher, H.P., Wajant, H., 2002.Selective inhibition of FLICE-like inhibitory protein expression with small
Z
nology 44 (2007) 2587–2597 2597
interfering RNA oligonucleotides is sufficient to sensitize tumor cells forTRAIL-induced apoptosis. Mol. Med. 8, 725–732.
ingh, T.R., Shankar, S., Chen, X., Asim, M., Srivastava, R.K., 2003. Synergisticinteractions of chemotherapeutic drugs and tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand on apoptosis and on regression ofbreast carcinoma in vivo. Cancer Res. 63, 5390–5400.
obota, R., Szwed, M., Kasza, A., Bugno, M., Kordula, T., 2000. Partheno-lide inhibits activation of signal transducers and activators of transcription(STATs) induced by cytokines of the IL-6 family. Biochem. Biophys. Res.Commun. 267, 329–333.
prick, M.R., Weigand, M.A., Rieser, E., Rauch, C.T., Juo, P., Blenis, J., Kram-mer, P.H., Walczak, H., 2000. FADD/MORT1 and caspase-8 are recruited toTRAIL receptors 1 and 2 and are essential for apoptosis mediated by TRAILreceptor 2. Immunity 12, 599–609.
teele, L.P., Georgopoulos, N.T., Southgate, J., Selby, P.J., Trejdosiewicz, L.K.,2006. Differential susceptibility to TRAIL of normal versus malignanthuman urothelial cells. Cell Death Differ. 13, 1564–1576.
tehlik, C., de Martin, R., Kumabashiri, I., Schmid, J.A., Binder, B.R., Lipp,J., 1998. Nuclear factor (NF)-kappa B-regulated X-chromosome-linked IAPgene expression protects endothelial cells from tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis. J. Exp. Med. 188, 211–216.
uda, T., Takahashi, T., Golstein, P., Nagata, S., 1993. Molecular cloning andexpression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factorfamily. Cell 75, 1169–1178.
akeda, K., Hayakawa, Y., Smyth, M.J., Kayagaki, N., Yamaguchi, N., Kakuta,S., Iwakura, Y., Yagita, H., Okumura, K., 2001. Involvement of tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in surveillance of tumormetastasis by liver natural killer cells. Nat. Med. 7, 94–100.
ahl, C., Liptay, S., Adler, G., Schmid, R.M., 1998. Sulfasalazine: a potentand specific inhibitor of nuclear factor kappa B. J. Clin. Invest. 101, 1163–1174.
alczak, H., Degli-Esposti, M.A., Johnson, R.S., Smolak, P.J., Waugh, J.Y.,Boiani, N., Timour, M.S., Gerhart, M.J., Schooley, K.A., Smith, C.A., Good-win, R.G., Rauch, C.T., 1997. TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediatingreceptor for TRAIL. EMBO J. 16, 5386–5397.
alczak, H., Miller, R.E., Ariail, K., Gliniak, B., Griffith, T.S., Kubin, M.,Chin, W., Jones, J., Woodward, A., Le, T., Smith, C., Smolak, P., Goodwin,R.G., Rauch, C.T., Schuh, J.C., Lynch, D.H., 1999. Tumoricidal activity oftumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo. Nat. Med.5, 157–163.
ang, C.Y., Mayo, M.W., Korneluk, R.G., Goeddel, D.V., Baldwin Jr., A.S.,1998. NF-kappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. Science 281, 1680–1683.
esselborg, S., Janssen, O., Kabelitz, D., 1993. Induction of activation-drivendeath (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells. J.Immunol. 150, 4338–4345.
hang, Y.E., Yuan, X.J., Liu, Y., Majumder, S., Lewis, T.D., 2004. Regulationof sensitivity to TRAIL by the PTEN tumor suppressor. Vitam. Horm. 67,409–426.
iley, S.R., Schooley, K., Smolak, P.J., Din, W.S., Huang, C.P., Nicholl, J.K.,Sutherland, G.R., Smith, T.D., Rauch, C., Smith, C.A., Goodwin, R.G., 1995.Identification and characterization of a new member of the TNF family that
induces apoptosis. Immunity 3, 673–682.hang, X.D., Franco, A.V., Nguyen, T., Gray, C.P., Hersey, P., 2000. Differentiallocalization and regulation of death and decoy receptors for TNF-relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) in human melanoma cells. J. Immunol.164, 3961–3970.