estudio de la fracciÓn proteica de leche y fÓrmulas

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

Facultad de Ciencias

Departamento de Química-Física Aplicada

ESTUDIO DE LA FRACCIÓN PROTEICA DE

LECHE Y FÓRMULAS INFANTILES

SOMETIDAS A ALTAS PRESIONES

Fca Isabel Bravo Vázquez

Tesis doctoral

Junio 2012

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS


INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA

ALIMENTACIÓN


Facultad de Ciencias

Departamento de Química-Física Aplicada

ESTUDIO DE LA FRACCIÓN PROTEICA DE LECHE Y FÓRMULAS INFANTILES SOMETIDAS A ALTAS PRESIONES

Memoria presentada por

FCA ISABEL BRAVO VÁZQUEZ

Para optar al grado de

Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Directoras:

Dras. Rosina López-Alonso Fandiño y Elena Molina Hernández

Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Universidad Autónoma de Madrid

Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

CIAL Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

c/ Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco Universidad Autónoma de Madrid 28049 Madrid

ROSINA LÓPEZ‐ALONSO FANDIÑO, PROFESORA DE INVESTIGACIÓN y ELENA MOLINA

HERNÁNDEZ, CIENTÍFICA TITULAR, CON DESTINO EN EL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN

CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN

INFORMAN:

Que el presente trabajo titulado “Estudio de la fracción proteica de leche y fórmulas infantiles

sometidas a altas presiones” y que constituye la Memoria que presenta Francisca Isabel Bravo

Vázquez para optar al grado de Doctora, se ha realizado bajo su dirección en el Departamento

de Bioactividad y Análisis de Alimentos del Instituto de Investigación en Ciencias de la

Alimentación (CIAL, CSIC‐UAM).

Y para que conste firmamos el presente informe a 8 de junio de 2012.

Fdo.: Rosina López‐Alonso Fandiño Fdo.: Elena Molina Hernández

VoBo Tutora:

Fdo.: Fco. Javier Señoráns

AGRADECIMIENTOS

Esta Tesis Doctoral ha sido desarrollada en el Departamento de Caracterización de Alimentos del Instituto de Fermentaciones Industriales (IFI, CSIC) y en el Departamento de Bioactividad y Análisis de Alimentos del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL, CSIC-UAM). Durante la realización de la misma he disfrutado de un contrato de Técnico de Apoyo a la Investigación financiado por la Comunidad de Madrid.

Este trabajo ha sido realizado bajo la dirección de las Dras. Rosina López-

Alonso Fandiño y Elena Molina Hernández, a las cuales quiero agradecer la posibilidad que me han brindado de iniciarme en la investigación, trabajar en sus grupos, sus enseñanzas y orientaciones.

Mi agradecimiento y gratitud al Instituto de Fermentaciones Industriales y

al Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, a las directoras de los mismos, las Dras. Lourdes Amigo y Mª Victoria Moreno respectivamente, y a los equipos directivos por poner a mi disposición los medios técnicos y académicos necesarios para la realización de este trabajo. Mi agradecimiento al Dr. Fco Javier Señoráns por aceptar la tutoría de esta tesis y a las Dras. Mercedes Ramos, Mª Victoria Moreno y Nieves Corzo, jefas del Departamento de Caracterización de Alimentos del IFI y de Bioactividad y Análisis del CIAL durante este periodo, por su aceptación y apoyo para trabajar en su departamento.

El trabajo desarrollado ha contado con la ayuda y el suministro de muestras

de Laboratorio Ordesa S.A. También ha sido inestimable la colaboración de Xavier Felipe (y colaboradores) del IRTA.

Quiero agradecer a las Dras. Isidra Recio, Lourdes Amigo, Josefina Belloque,

Encarnación Pueyo y a los Dres. Adolfo Martínez e Iván López su apoyo y sus consejos. Y a Constanza por su constante amistad.

Agradecer de manera especial a mis compañeros de laboratorio su amistad,

sus consejos y por el buen ambiente del laboratorio. Este trabajo se lo dedico a mis padres, mi hermana y Juanma por haberme

ayudado a estar aquí, a seguir adelante y darme cariño aunque sea por teléfono.

ÍNDICE

ÍNDICE

RESUMEN

LISTA DE ABREVIATURAS

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Las proteínas de la leche de vaca……………………………………………………….3

1.1.1. Las proteínas de suero………………………………………………………………3

1.1.2. Las caseínas………………………………………………………………………....6

1.1.3. La micela de caseína………………………………………………………………...8

1.1.3.1. Factores que afectan a la micela de caseína……………………………………...10

1.2. Nuevas técnicas de procesado de alimentos…………………………………………...11

1.2.1. Tratamientos con altas presiones…………………………………………………..12

1.2.1.1. Fundamentos de los tratamientos con alta presión…………………………….13

1.2.1.2. Equipos de alta presión……………………………………………………...…14

1.2.1.2.1. Tipos de equipos de alta presión…………………………………………...16

1.2.1.3. Efecto de la alta presión sobre las proteínas……………………………...……19

1.2.1.3.1. Efecto de la alta presión sobre las proteínas del suero……………………..19

1.2.1.3.2. Efecto de la alta presión sobre las micelas de caseína……………………..23

1.2.1.4. Aplicaciones tecnológicas de los tratamientos con alta presión…………….…28

2. OBJETIVO GENERAL Y PLAN DE TRABAJO……………………………………..35

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Preparación de las muestras y tratamiento aplicado…………………………………...43

3.2. Obtención de fracciones proteicas……………………………………………………..43

3.3. Análisis de las muestras control y de las fracciones proteicas………………………....44

3.3.1. Determinación del contenido en nitrógeno………………………………………...44

3.3.2. PAGE-SDS………………………………………………………………………....44

3.3.3. Electroforesis capilar…………………………………………………………….…45

3.3.4. ELISA tipo sándwich………………………………………………………………46

3.3.5. Medida del tamaño de la micela de caseína………………………………………..47

3.3.6. Determinación del contenido en lactosa y lactulosa………………………….……48

3.3.7. Determinación del contenido en furosina………………………………………….49

3.4. Análisis estadístico……………………………………………………………………..50

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Capitulo I……………………………………………………………………………………..53

I.1. Introducción…………………………………………………………………………….55

I.2. Materiales y Métodos…………………………………………………………………..56

I.2.1. Preparación de las muestras y tratamientos aplicados……………………...…..…..56

I.3. Resultados……………………………………………………………………………....56

I.3.1. Efecto de los tratamientos UHT y con alta presión en las proteínas mayoritarias de la

leche………………………………………………………………………………………58

I.3.2. Efecto de los tratamientos UHT y con alta presión en las proteínas minoritarias del

suero…………………………………………………………………………………..…..63

I.3.3. Efecto del tratamiento UHT y de presión en el avance de la reacción de Maillard y la

isomerización de la lactosa……………………………………………………………….65

I.4. Discusión……………………………………………………………………………….66

I.5. Conclusiones……………………………………………………………………………68

Capítulo II…………………………………………………………………………………….71

II.1. Introducción…………………………………………………………………………....73

II.2. Materiales y Métodos………………………………………………………………….74

II.2.1. Preparación de las muestras……………………………………………………….74

II.2.2. Tratamientos de alta presión………………………………………………………75

II.3. Resultados……………………………………………………………………………..77

II.3.1. Caseínas no sedimentables y proteínas de suero presentes en la fracción soluble de

leche desnatada tratada con altas presiones………………………………………………77

II.3.2. Desnaturalización de las proteínas del suero en leche desnatada tratada por altas

presiones………………………………………………………………………………….82

II.3.3. Proteínas de suero desnaturalizadas y no sedimentables en suero de

ultracentrifugación tratado con altas presiones………………………………...…………86

II.4. Discusión………………………………………………………………………………88

II.4.1. Efecto del tipo de equipo de alta presión y de la velocidad de despresurización en la

liberación de caseínas no sedimentables a la fase soluble de la leche……………………88

II.4.2. Influencia de la desnaturalización de las proteínas de suero………………………91

II.5. Conclusiones…………………………………………………………………………..92

Capítulo III………………………………………………………………………………..…..93

III.1. Introducción…………………………………………………………………………..95

III.2. Materiales y Métodos………………………………………………………………....96

III.2.1. Preparación de las muestras………………………………………………………96

III.2.2. Tratamientos de alta presión……………………………………………………...97

ÍNDICE

III.3. Resultados………………………………………………………………………….....99

III.3.1. Solubilización de caseínas y desnaturalización de proteínas del suero en leche

desnatada tratada por altas presiones…………………………………………………..…99


presurizada en presencia de agentes bloqueantes de grupos sulfhidrilo………………...108

III.4. Discusión…………………………………………………………………………….109

III.5. Conclusiones………………………………………………………………………...111

Capítulo IV…………………………………………………………………………………..113

IV.1. Introducción…………………………………………………………………………115

IV.2. Materiales y Métodos………………………………………………………………..116

IV.2.1. Preparación de las muestras……………………………………………………..117

IV.2.2. Tratamientos de presurización…………………………………………………..117

IV.2.3. Fraccionamiento y análisis………………………………………………………117

IV.3. Resultados………………………………………………………………………...…119

IV.3.1. Efecto de la presión en el tamaño de la micela de caseína……………………...119

IV.3.2. Efecto de la presión en la distribución proteica…………………………………121

IV.4. Discusión……………………………………………………………………………130

IV.5. Conclusiones………………………………………………………………………..134

5. CONCLUSIONES………………………………………………………………………135

6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………..139

Resumen

En la actualidad, la industria alimentaria utiliza proteínas lácteas como

ingredientes en productos alimentarios, por su valor nutricional y, sobre todo, por sus

propiedades funcionales. Entre otros muchos productos, estas proteínas son utilizadas

para la elaboración de fórmulas infantiles. Aunque el mejor alimento para el recién

nacido es la leche materna, no siempre es posible la lactancia y es necesario recurrir a

fórmulas infantiles que sustituyan a la leche humana. Según el Codex Alimentarius, las

fórmulas infantiles deben promover el normal crecimiento y desarrollo del niño y

satisfacer, por sí solas, sus requerimientos nutricionales. Sin embargo, también se

persigue que, en la medida de lo posible, reproduzcan las propiedades beneficiosas que

caracterizan a la leche humana, muchas de las cuales, se deben a la fracción proteica.

Así, una ingesta adecuada de proteínas durante los primeros meses de vida, tanto en lo

que respecta a su contenido como a una elevada relación entre proteínas de suero y

caseínas, evita la ganancia excesivamente rápida de peso, facilita el proceso de digestión

y favorece una mayor colonización del intestino por bacterias probióticas.

En los últimos años el procesado con altas presiones hidrostáticas ha conseguido

un gran desarrollo comercial, ya que permite obtener productos con características

similares a los alimentos frescos, pero con una mayor vida útil. Además, las altas

presiones también modifican la estructura de las proteínas, conduciendo a propiedades

funcionales únicas o muy difíciles de conseguir mediante otros procesos. Estos cambios

dependen de factores tales como el nivel de presión, la duración del tratamiento, la

temperatura, el pH, etc. Actualmente, el efecto de la mayoría de estas variables se

conoce bien, pero rara vez se ha estudiado la influencia de parámetros como el tipo de

equipo de alta presión, la velocidad de despresurización o el empleo de presiones muy

elevadas, superiores a 600 MPa.

Esta tesis doctoral profundiza en la desnaturalización de las proteínas lácteas y

en los cambios en la distribución de proteínas que origina el tratamiento con altas

presiones hidrostáticas. El objetivo era explorar el potencial de las altas presiones para

mantener la calidad nutritiva de las proteínas de la leche y obtener fracciones lácteas de

diferente composición y concentración de proteínas, con aplicabilidad en la elaboración

de nuevas formulas infantiles.

Para desarrollar este estudio se obtuvieron diferentes fracciones lácteas a partir

de leche sometida a presiones comprendidas entre 250 y 900 MPa, en equipos a escalas

piloto e industrial, con diferentes tiempos de presurización y despresurización, y se

estudió su composición proteica mediante Kjeldahl, electroforesis capilar, SDS-PAGE

y ELISA, principalmente. Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que la

distribución de caseínas y seroproteínas en las fracciones estudiadas depende del equipo

utilizado, el nivel de presión y el tiempo de mantenimiento y/o liberación de la presión

aplicada.

Se ha comprobado que la aplicación de tratamientos con alta presión en distintos

equipos y a diferentes escalas, industrial y piloto, da lugar a diferentes distribuciones

proteicas, sobre todo en lo que se refiere a la desintegración micelar, puesto que los

diferentes equipos proporcionan similares grados de desnaturalización de las proteínas

de suero, a niveles de presión equivalentes. Además, la velocidad de despresurización

juega un papel fundamental en la distribución de proteínas entre las fases soluble y

coloidal de la leche presurizada, ya que el contenido en caseína soluble aumenta

significativamente durante la fase de despresurización respecto a la fase de

mantenimiento de la presión. Por su parte, la desnaturalización de la β-lactoglobulina

tiene lugar fundamentalmente durante la fase de mantenimiento de la presión,

produciéndose muy poca desnaturalización durante la fase de despresurización

En comparación con los tratamientos térmicos comúnmente empleados en la

industria, los tratamientos con alta presión no producen isomerización de la lactosa, ni

avance de la reacción de Maillard y conducen a una menor desnaturalización de las

proteínas mayoritarias y minoritarias del suero, por lo que podrían permitir la

estabilización de las fórmulas infantiles sin perjudicar su calidad nutritiva. También es

posible seleccionar las condiciones del tratamiento con alta presión que permitan

producir fracciones proteicas con una concentración de proteína entre el 1.05 y el 1.29

% y una relación de caseínas a proteínas de suero de, aproximadamente, 1.4-1.6, similar

a la de la leche humana, aunque contendrían una apreciable proporción de β-Lg

desnaturalizada soluble.

LISTA DE ABREVIATURAS

α-La: α-lactoalbúmina

β−Lg: β-lactoglobulina

4.6: Fracción soluble a pH 4.6

Arg: Arginina

BSA: Seroalbúmina bovina

Ca: Calcio

CCP: Fosfato cálcico coloidal

CG: Cromatografía de gases

CN: Caseína

Cys: Cisteína

DMF: N, N-Dimetilformamida

DTT: DL-ditiotreitol

EC: Electroforesis capilar

EDTA: Etilendiaminotetraacetato disódico

FITR: Transformada de Fourier

Fu: Furosina

g: Gramos

h: Hora

IgA: Inmunoglobulina A secretora

Igs: Inmunoglobulinas

IR: Tratamiento de presurización en un equipo industrial con despresurización rápida

kDa: Kilodaltons

L: Litro

La: Lactosa

Lf: Lactoferrina

LSD: Test de la menor diferencia significativa

Lu: Lactulosa

Lys: Lisina

Met: Metionina

MHEC: Metilhidroxietil celulosa

min: Minutos

MOPS: Ácido 3-morfolinopropanosulfónico

MPa: Megapascales

NEM: N-Etilmaleimida

NNP: Nitrógeno no proteico

OPD: Ortofenilendiamina

PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida

PAGE-SDS: Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

PCS: Espectroscopía de correlación de fotones

Phe: Fenilalanina

pI: Punto isoeléctrico

PL: Tratamiento de presurización en un equipo piloto con despresurización lenta

PP: Polipropileno

PR: Tratamiento de presurización en un equipo piloto con despresurización rápida

Pro: Prolina

RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa

SD: Desviación estándar

SDS: Dodecil sulfato sódico

Seg: Segundos

SU: Sobrenadante de ultracentrifugación

t: Tiempo

TCA: Ácido tricloroacético

Tris: Tris(hidroximetil)aminometano

1. INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

- 3 -

- 3 -

Las proteínas son componentes fundamentales en la nutrición humana, no sólo por ser

fuente de nutrientes, sino porque su estructura y propiedades funcionales influyen en gran

medida en la calidad de los alimentos. La creciente demanda de productos con mejores

cualidades, tanto por su funcionalidad tecnológica y biológica como por sus características

organolépticas, ha hecho de las proteínas, sobre todo de las lácteas, una de las mejores

herramientas para desarrollar estos nuevos productos tan demandados.

En la actualidad, las proteínas lácteas son utilizadas como ingredientes multi-

funcionales ya que, además de ser solubles en un amplio rango de pH, de mejorar y de

estabilizar geles, emulsiones y espumas, su digestión da lugar a péptidos con actividades

fisiológicas, tales como antihipertensiva, antioxidante, etc (Barth y Schlimme, 1988; Bravo y

col., 2007, Martínez-Maqueda y col., 2012). Las propiedades derivadas de su estructura y de

las interacciones entre proteínas y otros elementos, así como la incidencia de diversos

procesos tecnológicos deben conocerse y estudiarse para aprovechar estas proteínas de la

manera más eficiente, en la mejora de los productos existentes o en el desarrollo de nuevos

productos.

1.1. Las proteínas de la leche de vaca

En la leche podemos identificar 2 clases de proteínas: las proteínas de suero y las

caseínas. Estas proteínas se separan mediante la acidificación de la leche a pH 4.6, el punto

isoeléctrico de las caseínas, que produce su precipitación. Sin embargo, existen otros métodos

para inducir su separación con mayor o menor precisión como la ultracentrifugación, la

centrifugación después de enriquecer con calcio, ultrafiltración y microfiltración a través de

diferentes tamaños de poro, precipitación por etanol o utilizando diferentes sales, etc.

1.1.1. Las proteínas de suero

Las proteínas de suero se encuentran presentes en la fracción soluble de la leche tras

su acidificación a pH 4.6 y representan el 20% de la proteína total. Dentro de esta

denominación se incluyen proteínas como la -Lactoglobulina (-Lg), -Lactoalbúmina (-

La), seroalbúmina bovina (BSA), lactoferrina (Lf) e inmunoglobulinas (Igs). La proteína

mayoritaria es la -Lg (50 % de la fracción proteica del lactosuero) con un masa molecular de

18.3 kDa (Figura 1). Es una proteína globular que posee 162 aminoácidos, de los cuales 5 son

- 4 -

cisteínas (Cys) implicadas en la formación de puentes disulfuro, uno localizado entre Cys66-

Cys160 y otro entre Cys106-Cys119 (Kilara, 2004). La conformación nativa de la proteína

consiste en 9 láminas- antiparalelas, de las cuales 8 forman una cavidad hidrofóbica (Zhai y

col., 2010). El grupo sulfidrilo libre de la Cys121 se encuentra en el interior de la molécula, por

lo que, durante la desnaturalización de la proteína, se expone al exterior, aumentando su

reactividad para formar puentes disulfuro y contribuyendo a la oligomerización de la proteína

(Considine, 2007).

Figura 1. Representación de la estructura tridimensional de la -Lg. Modelo obtenido mediante

el software RASMOL a partir de las coordenadas del Protein Data Bank (PD: 1BEB).

La -Lg puede aparecer en asociaciones diversas dependiendo de la temperatura y del

pH. A pH ácido (< 3.5) la proteína está en forma monomérica, mostrando una gran

estabilidad, aunque podrían formarse algunos dímeros (pH próximo a 3). Entre los pHs 3.5 y

5.2 se forman tetrámeros/octámeros reversibles que no conllevan cambios notables en la

estructura secundaria y aparece como un dímero en solución entre pH 5.2 y 7.5. El cambio de

monómero a dímero en el intervalo de pH entre 4.5 y 6 produce cambios en la compactación

de la proteína, sin embargo, a pH 7 se produce un cambio conformacional entre los residuos

85 y 90 de la proteína, producido posiblemente por una hendidura de los puentes de hidrógeno

entre las cadenas F y G. A este cambio conformacional se le denomina transición de Tanford.

A pHs superiores a 9 se produce una desnaturalización irreversible del monómero (Caessens y

col., 1997; Sakurai y Goto, 2007).

La temperatura es otro parámetro que puede incidir en la estructura y,

consecuentemente, en la funcionalidad de la proteína. La desnaturalización térmica de la -Lg

Lámina

-hélice

Lámina

-hélice

INTRODUCCIÓN

- 5 -

- 5 -

ocurre entre los 50-90ºC, pero es reversible siempre que la temperatura no supere los 65-70ºC

(Bertrand-Harb y col., 2002; Considine, 2007). Se ha propuesto que, a temperaturas entre 30 y

55ºC, la forma dimérica de la -Lg se disocia a monómeros. A temperaturas superiores, la

proteína se despliega incrementando la actividad y oxidación del grupo sulfidrilo (Hambling y

col., 1992) y produciéndose cambios estructurales irreversibles que pueden dar lugar a la

agregación de las moléculas cuando las temperaturas exceden los 70ºC (Bertrand-Harb y col.,

2002). La -Lg resiste en mayor medida la desnaturalización por calor a pH ácido, pero a pH

básico se desnaturaliza fácilmente (Caessens y col., 1997). La presión también afecta a su

estructura, produciéndose cambios reversibles a partir de 50 MPa e irreversibles a partir de

150 MPa (Tanaka y Kunugi, 1996).

La -lactoalbúmina representa el 25% de las proteínas del suero (Figura 2). Es una

molécula con 123 residuos aminoacídicos, cuatro puentes disulfuro y un masa molecular de

14.2 kDa (Considine y col., 2007). A diferencia de la -Lg, al no tener grupos sulfidrilo

libres, no forma homopolímeros (Monahan y col., 1993). Por su escasa estructura secundaria

(30% de -hélice y 9% de lámina-) (Alexandrescu y col, 1993) la molécula tiene una gran

flexibilidad. Sin embargo, la presencia de iones Ca2+ unidos a su estructura y los puentes

disulfuro la mantienen en una compacta estructura helicoidal con una zona interior hidrófoba

(Cayot y Lorient, 1997). La estabilidad en su conformación está relacionada con las

propiedades del puente de Ca2+. A pH <4, el calcio está libre y la -La se vuelve flexible y

puede proteolizarse fácilmente. Es altamente soluble incluso en su punto isoeléctrico (pI) y, ni

la fuerza iónica ni las variaciones de pH, influyen en la solubilidad de esta proteína

(Schlimme y Buchheim, 2002).

Figura 2. Representación de la estructura tridimensional de la -La. Modelo obtenido mediante

el software RASMOL a partir de las coordenadas del Protein Data Bank (PD: 1A4V).

Lámina

-hélice

Lámina

-hélice

Lámina

-hélice

- 6 -

Dentro del grupo de proteínas minoritarias de la leche se encuentran proteínas como

la BSA, Lf, transferrina, fibronectina, las inmunoglobulinas, enzimas, hormonas peptídicas,

etc. Cabe destacar la Lf y la IgA secretora (IgA), que juegan un papel muy importante en la

defensa del tracto gastrointestinal y de la mucosa de los recién nacidos. En concreto, la Lf

influye en la absorción del hierro, en la respuesta inmune y en la proliferación celular

(Lönnerdal, 2009) y la IgA en los mecanismos de defensa gastrointestinal (Bakker-

Zierikzee y col., 2006). La Lf es una glicoproteína fijadora de hierro con una masa

molecular de 82 kDa, que contiene dos lugares de unión para el hierro por cadena

peptídica. Su contenido en la leche es específico y diferente para cada especie y es máximo

en el calostro. La leche humana es, en comparación con la leche de vaca, rica en

lactoferrina. A mitad de la lactación, la leche humana y la de vaca contienen alrededor de

1.5 y 0.5 g/L, respectivamente (Schlimme y Buchheim, 2002). Las inmunoglobulinas

representan al menos el 2 % del total de las proteínas de la leche. Hay 4 tipos de Igs: IgG1,

IgG2, IgA y IgM.,con una estructura básica similar, compuesta por 2 cadenas ligeras con

masas moleculares entre 20-25 kDa, y 2 cadenas pesadas de 50-70 kDa (Kilara, 2004).

1.1.2. Las caseínas

Las caseínas son las proteínas de la leche insolubles a pH 4.6 y representan el 80% del

total de proteínas. Están constituidas por 4 proteínas, denominadas s1, s2, y κ-caseínas

(CN), que representan el 38, 10, 36 y 12% (3: 0.8: 3:1), respectivamente, del total de las

caseínas, con una masa molecular de 20-25 kDa (Schlimme y Buchheim, 2002). En general,

las caseínas tienen bajos niveles de estructura secundaria y terciaria, lo que les confiere gran

flexibilidad y una estructura fácilmente desnaturalizable por agentes como el calor o la urea y

susceptible a la acción de las enzimas. Los residuos hidrofóbicos, polares y cargados no se

distribuyen uniformemente en las moléculas sino que se concentran en zonas hidrofóbicas o

hidrofílicas, confiriendo a sus estructuras un fuerte carácter anfipático y una gran

hidrofobicidad superficial, responsable de sus propiedades espumantes y emulgentes. Estas

proteínas presentan gran heterogeneidad ya que, durante su formación en la glándula

mamaria, sufren cambios en sus estructuras primarias o modificaciones postraduccionales,

como fosforilación o glicosilación. En la leche, además, podemos encontrar fragmentos de las

anteriores producidos por la acción de diferentes enzimas endógenas en la leche, como la

plasmina, que es una serinproteinasa con gran afinidad por las uniones peptídicas de la lisina

INTRODUCCIÓN

- 7 -

- 7 -

(Lys) y, en menor medida, de la arginina (Arg). Todas las caseínas, excepto la -CN, son

sensibles a esta enzima (Fox y Kelly, 2004).

s1-CN

La s1-CN es la caseína mayoritaria de las micelas de caseína. Está compuesta por 199

aminoácidos, de los cuales ocho son residuos de serina fosforilados en las cadenas laterales, y

posee una masa molecular de 23.62 kDa. En cuanto a su estructura espacial, está formada por

un dominio hidrofóbico en el extremo carboxi terminal (100-199), compuesto

mayoritariamente por hoja beta, y por un dominio hidrofílico en el extremo amino terminal

(1-99). Además, precipita en presencia de iones calcio (Schlimme y Buchheim, 2002).

s2-CN

La s2-CN, al igual que la anterior, precipita en presencia deiones Ca2+. Contiene 207

aminoácidos y una masa molecular de 25.23 kDa. Además, tiene 2 moléculas de Cys en las

posiciones 36 y 40 (De Kruif, 2003).

-CN

La caseína está compuesta de 209 aminoácidos, de los que 35 son residuos de

prolina (Pro) distribuidos uniformemente en la molécula. Esta gran cantidad de prolina

previene la formación de -hélice, lamina y giros . También contiene 5 fosfoserinas en el

extremo N-terminal (la fosforilación es variable dependiendo de la variante genética) y

ninguna Cys. Es la caseína más anfipática de todas, con un extremo C-terminal fuertemente

hidrofóbico (Schlimme y Buchheim, 2002).

-CN

La -CN está compuesta por 169 aminoácidos y una masa molecular de 19kDa. En su

estructura tiene 2 Cys y entre 3 y 6 moléculas de galactosa, N-acetilglucosamina y ácido N-

acetilneuramínico unidas mediante enlaces O-glicosídicos a serina (Ser141) o treonina (Thr131, 133, 135 y 142). La región N-terminal es hidrofóbica y la C-terminal, que es hidrofílica, contiene

las variantes genéticas y las variaciones postraduccionales (los oligosacáridos y los grupos

fosfato) y posee una fuerte carga neta negativa (Fox y Kelly, 2004).

- 8 -

Las caseínas sensibles al Ca precipitan a concentraciones de Ca <6mM. Sin embargo,

en la leche se disponen en micelas lo que les permite ser estables a concentraciones 30 mM de

Ca. La principal responsable de la estabilización de la micela de caseína es la -CN que puede

unir de 8 a 10 veces su peso de caseínas sensibles al Ca (Fox y Kelly, 2004; Fox y Brodkord,

2008).

1.1.3. La micela de caseína

En la leche, las caseínas forman asociaciones coloidales llamadas micelas, con un

tamaño comprendido entre 50-300 nm (media 120 nm) y una masa molecular entre 106 y 3 x

109 Da (media 108 Da) (Fox y Kelly, 2004). Las micelas están altamente hidratadas (2-3 g de

H2O/g de proteína) y contienen, aproximadamente, un 6% de materiales inorgánicos

principalmente calcio y fosfato, que se conocen como fosfato cálcico coloidal (CCP) (Lucey y

col., 1996). Estas micelas confieren a la leche una serie de propiedadesmuy importantes

tecnológicamente, como su color, estabilidad al calor y al etanol, aptitud a la coagulación y

acidificación, etc.

A pesar de que las micelas de caseína se han estudiado durante muchos años, aún no

existe total consenso sobre la estructura de la micela. La mayoría de los modelos estructurales

propuestos coinciden en que la -CN está localizada mayoritariamente en la superficie,

jugando un papel esencial en la regulación del tamaño micelar y en el mantenimiento en

suspensión de las caseínas en la leche. La proporción de -CN varía en relación inversa con el

tamaño de la micela, mientras que la de -CN lo hace en forma directa (Riel, 1991; Ferrandini

y col., 2006).

El modelo más apoyado es aquel que define a la micela como una estructura formada

por la agrupación de submicelas más pequeñas, unidas mediante interacciones hidrofóbicas,

puentes de hidrógeno y/o CCP, recubiertas por una fina capa hidrofílica (5-10 nm). Esta capa,

que estaría formada por el extremo C-terminal de la κ-CN, con o sin otros extremos

hidrofílicos de otras caseínas (s1- y -CN) dependiendo del autor a seguir (Morr, 1967;

Waugh, 1971; Slattery, 1976; Schmidt, 1982; Walstra y Jenness, 1984), estabiliza a la micela

por medio del aumento del potencial zeta (-20mV). Además, el CCP también podría

localizarse dentro de la submicela (Figura 3) (Walstra y col., 1999).

INTRODUCCIÓN

- 9 -

- 9 -

Figura 3. Esquema del modelo de estructura de las micelas de caseína propuesto por Walstra

(1999).

Los últimos modelos propuestos retienen dos de las principales características del

modelo de la submicela, como son el papel que juega el CCP en la cementación de la micela y

el de la -CN estabilizando la micela por su localización en la capa superficial, pero difieren,

principalmente, en la composición de la estructura interna de la micela en forma de

submicelas (Visser, 1992; Holt, 1992; Horne 1998, 2002). En concreto, y entre otros, el

modelo propuesto por Visser (1992) presenta a la micela como conglomerados esféricos de

moléculas de caseína agregadas al azar y, el de Holt (1992, 1994), como una enredada red de

moléculas de caseína flexibles formando una estructura parecida a un gel (Figura 4).

Figura 4. Esquema del modelo de estructura de las micelas de caseína propuesto por Holt (1992).

Submicela

Fosfato cálcico

C-terminal de -CN

SubmicelaSubmicela

Fosfato cálcicoFosfato cálcico

C-terminal de -CNC-terminal de -CN

Caseínas

Fosfato cálcico

Caseínas

Fosfato cálcico

- 10 -

1.1.3.1. Factores que afectan a la estabilidad de la micela

Las micelas de caseína no se pueden considerar estructuras estables, sino que se

encuentran más bien en un equilibrio dinámico con el medio acuoso circundante, el suero

lácteo. La estructura y la estabilidad de las micelas de caseína se modifican, por ejemplo, a

consecuencia de las siguientes modificaciones (Fox y Kelly, 2004):

Las variaciones en la proporción entre el fosfato cálcico coloidal y el disuelto en el

suero modifican el tamaño de la micela. Si se acompleja el calcio libre, sin cambiar el

pH, o si se elimina mediante diálisis frente a una disolución libre de calcio, las micelas

se disgregan, y en casos extremos incluso dan lugar a fragmentos micelares.

El almacenamiento de leche cruda en frío durante un tiempo prolongado influye

especialmente en la -CN que, debido al debilitamiento de las interacciones

hidrofóbicas, se disocia de las micelas y pasa al suero lácteo. Sin embargo, este hecho

no conduce a una desestabilización profunda de las micelas y puede revertirse

parcialmente si se recalienta ligeramente la leche.

Al calentar la leche a temperaturas superiores a 70ºC se produce una agregación

creciente de las proteínas del suero, especialmente de la -Lg, con la κ-CN. Estos

complejos de caseína-proteína de suero confieren a las micelas de caseína propiedades

diferentes, por ejemplo en la coagulación por acidificación o por hidrólisis enzimática,

como se explica más adelante. A la particular interacción entre la -Lg y la κ-CN

micelar se le considera una propiedad tecnológica de extraordinaria importancia, ya

que permite esterilizar la leche sin que flocule a pesar de la casi completa

desnaturalización de las proteínas del suero.

La bajada del pH en la leche produce la solubilización del fosfato cálcico coloidal y,

por debajo de pH 5.2, las micelas de caseína empiezan a formar agregados que

precipitan en su pI (pH 4.6). Estos agregados se vuelven a disolver cuando el pH sube

a la neutralidad, aunque las micelas no vuelven a su estado natural. En la estructura de

la micela de caseína de la leche acidificada influye la temperatura, así como los

INTRODUCCIÓN

- 11 -

- 11 -

tratamientos térmicos previos a la acidificación, que producen la deposición de

proteínas séricas desnaturalizadas sobre la superficie de la micela.

Las micelas de caseína también pueden coagular por reacciones enzimáticas. La

quimosina escinde específicamente a la -CN a pH 6.7 en el enlace Phe105-Met106

dando lugar al caseinomacropéptido soluble (región C-terminal) y a la para--CN

insoluble. Cuando se ha escindido la mayor parte de la κ-CN, comienza la coagulación

de las micelas. El proceso de coagulación depende en gran medida de la temperatura y

de la concentración de iones calcio. Un precalentamiento intenso de la leche, que

conduce a la unión de proteínas del suero desnaturalizadas a la -CN que recubre a las

micelas, dificulta o impide el proceso de coagulación enzimática.

El tratamiento de las micelas de caseína a elevadas presiones hidrostáticas (por

ejemplo, 200 MPa, 5 min, 20ºC) produce su descomposición en subunidades o

pequeños agregados, como se explicará posteriormente.

1.2. Nuevas técnicas de procesado de alimentos

La utilización de altas temperaturas durante el procesado de los alimentos produce

daños en los componentes termolábiles como las proteínas, a las que causa desnaturalización

y agregación, además de pérdida de propiedades nutritivas y organolépticas. Sin embargo, el

procesamiento de los alimentos es necesario, ya que proporciona productos

microbiologicamente seguros y con una larga vida útil. Por ello, en los últimos 20 años, tanto

los científicos como la industria alimentaria, se han concentrado en estudiar y desarrollar

nuevas técnicas de procesado de alimentos que produzcan menores efectos en sus cualidades,

con el fin de obtener productos con características cada vez más similares a las de los

productos frescos, aunque con una mayor vida útil.

Estas tecnologías emergentes se pueden dividir en térmicas y no térmicas. El término

de procesado no térmico es utilizado normalmente para denominar aquellas tecnologías que

son efectivas a temperatura ambiente o subletal. Sin embargo, durante el procesado con estas

técnicas se pueden producir aumentos de temperatura, de modo que la eficacia del tratamiento

- 12 -

depende muchas veces de la combinación de ambos factores (Cullen y col., 2012). En la

Tabla 1 se muestran ejemplos de ambos tipos de tecnologías.

Tabla 1. Ejemplos de tecnologías emergentes de procesado y conservación de alimentos.

Tratamientos térmicos Tratamientos no térmicos

Altas presiones hidrostáticas

Pulsos eléctricos de alta intensidad

de campo

Irradiación

Microondas

Radio frecuencia

Calentamiento óhmico

Calentamiento inductivo Ultravioleta

Ultrasonido

Plasma frío

Ozono

Dióxido de carbono

Agua supercrítica

En la actualidad, muchas de estas técnicas ya son utilizadas en la industria alimentaria

como las altas presiones hidrostáticas, la irradiación, el ozono, etc. (Barbosa-Canovas y

Bermúdez-Aguirre, 2010).

1.2.1. Tratamientos con altas presiones

El tratamiento con altas presiones es una tecnología novedosa de procesado, de interés

comercial por su capacidad de aumentar la seguridad y la vida útil de los alimentos, sin

pérdidas indeseables de cualidades sensoriales y nutricionales.Un valor añadido de estos

tratamientos reside en su capacidad de modificar la funcionalidad y mejorar las propiedades

reológicas de éstos. En la actualidad, las altas presiones constituyen la tecnología más

desarrollada comercialmente, dentro de los métodos de conservación alternativos.

La tecnología de alta presión se utilizó originariamente en la producción de cerámicas,

aceros y superaleaciones. A finales del siglo XIX surge la aplicación de las altas presiones a

INTRODUCCIÓN

- 13 -

- 13 -

alimentos con Regnard (1884), Roger (1885) y Hite (1899) que aplicaron con éxito las altas

presiones a leche, carne y alimentos basados en frutas, para estudiar su efecto en la microbiota

de esos productos. No obstante, no fue hasta casi un siglo después cuando se comenzó a

aplicar esta técnica a alimentos a escala industrial, debido a que los problemas tecnológicos

que derivan de la aplicación de tan elevadas presiones supusieron un freno para el desarrollo

de esta técnica. Los primeros productos presurizados fueron mermeladas, salsas para

ensaladas, zumos y diferentes clases de yogures de frutas, que se comercializaron en 1992 en

Japón, probablemente por ser este país el pionero y líder en la fabricación de cámaras de alta

presión (Okpala y col., 2010).

Actualmente, la implantación de los equipos de alta presión en la industria alimentaria es

cada vez mayor (había 132 equipos de alta presión en el 2009 en todo el mundo, Barbosa-

Cánovas y Bermúdez-Aguirre, 2012), al igual que los productos tratados, utilizándose para

destruir microorganismos, inactivar enzimas o modificar proteínas. Además, en algunos

casos, las altas presiones permiten ejecutar y/o reducir el tiempo de algunas tareas, no

posibles o costosas de realizar por otros métodos de procesado, sin pérdidas de sus cualidades

nutricionales o sensoriales, por ejemplo, la abertura de las conchas de ostras u almejas (300

MPa, 1 min). La empresa japonesa Echigo Seika utiliza presiones entre 200-400 MPa para

modificar sin calor las proteínas y el almidón de algunos cereales, además de la velocidad de

penetración del agua en el grano. De esta manera, se obtienen cereales más dulces y

digestivos, que el consumidor prepara en 3 min al microondas, e incluso cereales

hipoalergénicos. Por otro lado, Fonterra comercializa calostro presurizado a 500 MPa

preservando compuestos bioactivos sensibles al calor (Lf, Igs y factores del crecimiento)

(Tonello, 2011).

1.2.1.1. Fundamentos de los tratamientos con alta presión

Se entiende por altas presiones la aplicación de presiones comprendidas entre 100 y

1000 MPa a un líquido en el que se sumergen los productos que van a ser sometidos al

tratamiento (Raventòs, 2005). Generalmente suele utilizarse agua debido a su baja

compresibilidad, de ahí que se le denomine también alta presión hidrostática. Esta técnica se

basa en dos principios (Cheftel 1991):

- 14 -

El primero indica que la presión se trasmite de manera uniforme e instantánea a

través de todo el material biológico, tratándose así de un proceso isostático. Esto

hace que el proceso sea homogéneo, evita la presencia de zonas sobretratadas y la

deformación del producto.

El segundo se refiere al principio de Le Chatelier, que indica que los fenómenos

acompañados de una disminución de volumen (reacciones químicas, modificación

de las conformaciones moleculares) son favorecidos por un aumento de presión y

viceversa. Según este principio la aplicación de alta presión desplaza el equilibrio

de las reacciones hacia el estado que ocupa menos volumen. En principio, en una

macromolécula proteica, la formación de enlaces de hidrógeno, la ruptura de

interacciones hidrofóbicas y de pares de iones se acompañan de una restricción de

volumen y se ven favorecidos por la presión (Cheftel, 1991). Sin embargo, otros

estudios suponen que los puentes de hidrógeno son prácticamente insensibles a la

presión (Mozhaev, 1994).

1.2.1.2. Equipos de alta presión

Los equipos de alta presión están formados por un recipiente donde se aplica la

presión (cámara de presión), un dispositivo de generación de presión, generalmente una

bomba hidráulica, y un sistema manual o automático para el control de las condiciones del

proceso (Zhou y col., 2010). El componente más importante es la cámara de presión y sus

cierres. El espesor de la pared de la cámara determina la presión máxima que puede alcanzar

el equipo, el diámetro del cilindro y el número de ciclos para los que se ha diseñado (Mertens

y Deplace, 1993). La cámara de presurización más simple es la monobloque, formada por un

cilindro de diámetro interno de menos de 15 cm. Generalmente el uso de estas cámaras está

limitado a presiones de trabajo inferiores a 400 MPa, porque su pared es delgada (Ting,

2011). Sin embargo, con el desarrollo de las paredes multicapas, de mayor espesor, se han

construido equipos de laboratorio capaces de alcanzar los 1400 MPa y con capacidad para 35

mL (como los fabricados por Stansted Fluid Power en el Reino Unido), además de equipos a

escala piloto e industriales. De forma general, ya que dependiendo del fabricante las

características de los equipos varían, el diámetro de las cámaras de los equipo piloto es de

unos 100 mm, con capacidad para unos pocos litros y pueden presurizar hasta 900 MPa en un

intervalo de temperatura ente 5 y 100ºC. Los equipos industriales, por otro lado, permiten

INTRODUCCIÓN

- 15 -

- 15 -

presurizar alimentos hasta 600-630 MPa, en el intervalo de temperatura de 5-30ºC. En este

caso, las cámaras tienen un diámetro entre 200 y 380 mm, albergando entre 55 y 420 L. En

los más pequeños (55 L) se ha podido aumentar la temperatura hasta 90ºC (NC Hyperbaric,

España).

Otro de los componentes a destacar es el sistema de cierre, que varía dependiendo de

la aplicación que se desee. Así, los cierres de rosca discontinua o de apertura y cierre rápidos

son idóneos para periodos cortos de presurización, ya que permiten minimizar el tiempo de

apertura y cierre y maximizar la productividad de la cámara (número de ciclos por unidad de

tiempo), lo cual es muy importante para la viabilidad económica del tratamiento de alta

presión. Sin embargo, cuando el tiempo de apertura y cierre de la cámara es despreciable en

comparación con la duración total del ciclo de procesado, se utilizan cierres de rosca continua,

más económicos (Raventòs, 2005).

Durante el tratamiento de presurización, la presión se transmite al alimento por medio

de un fluido transmisor, cuya elección varia dependiendo del material con el que esté

fabricada la cámara, ya que puede corroerla. Si es de acero inoxidable, permite el uso de agua

como medio transmisor. Sin embargo, pueden usarse otros líquidos como aceite de ricino,

aceite de silicona, mezclas de agua y glicol etc. La comprensión producida por la aplicación

de presión en el fluido transmisor y en el alimento produce el aumento de la temperatura

durante el tratamiento, es a lo que se le denomina calentamiento adiabático. El incremento en

la temperatura va a depender de la temperatura de partida y de la composición del alimento o

del fluido transmisor, variando dependiendo de sus características térmicas y físicas. A modo

de ejemplo, el calor de comprensión del agua es de 3ºC por cada 100 MPa, mientras que el del

aceite de silicona es de alrededor 20ºC por cada 100 MPa. La utilización de agua como fluido

transmisor es preferible ya que el comportamiento del calentamiento adiabático del agua es

similar al de la mayoría de los componentes de los alimentos, lo cual permitiría mimetizar el

gradiente térmico entre el fluido transmisor de la presión y el alimento. Además, el agua tiene

bajo coste, no es tóxico y se puede conseguir fácilmente (Nguyen y Balasubraniam, 2011).

- 16 -

1.2.1.2.1. Tipos de equipos de alta presión

Tras introducir el producto a presurizar dentro de la cámara, ésta se cierra y se llena

con el líquido transmisor de la presión. Llegados a este punto, unas bombas generan la

presión deseada y el producto se presuriza. Existen diferentes tipos de equipos de alta presión

dependiendo del producto a tratar: el tipo discontinuo, que se utiliza normalmente para

productos sólidos o líquidos previamente envasados, y el tipo semicontinuo para líquidos no

envasados.

Equipos de alta presión discontinuo

Son los más utilizados y se denominan así porque el producto a tratar, bien líquido o

sólido, está envasado cuando se introduce en la cámara de presión. La generación de la

presión puede hacerse de dos formas:

a) Por compresión directa, de modo que la presión se genera en el medio de trasmisión

por la parte final de un pistón. Este método permite una compresión muy rápida, pero

las limitaciones que impone el cierre dinámico entre el pistón y la superficie interna de

la cámara restringen su uso a diámetros pequeños, típicos de sistemas a escala de

laboratorio o a escala piloto (Figura 5).

b) Por compresión indirecta. Estos equipos utilizan un intensificador de alta presión para

bombear el medio trasmisor de la presión desde un tanque hasta la cámara, ya cerrada,

hasta conseguir la presión deseada. La mayoría de los sistemas industriales de presión

isostática utilizan este método de compresión (Figura 6) (Hogan y col., 2005;

Raventòs, 2005).

Los envases utilizados deben ser flexibles y se han de poder sellar herméticamente.

Algunos de los polímeros utilizados son el polietileno de baja densidad (LDPE), la goma

EVA (etilen vinil acetato), el polipropileno (PP) etc. (Balasubramaniam y col., 2004).

Además, debe evitarse la presencia de aire en el producto envasado, ya que la presencia de

éste puede incrementar el riesgo de ruptura del envase durante el tratamiento.

INTRODUCCIÓN

- 17 -

- 17 -

Figura 5. Esquema del diseño de un equipo de altas presiones con generación de presión por el

método de comprensión directa (adaptado de Raventòs, 2005).

Figura 6. Esquema del diseño de un equipo de altas presiones con generación de presión por el

método de comprensión indirecta (adaptado de Daoudi, 2004).

Tanque del mediode presión

Cierre inferior

Cierre superior

Cámara de presión

Medio de presión

Sistema de refrigeracióno calentamiento

Intensificador

Marco de la prensa


Cierre inferior

Cierre superior

Cámara de presión

Medio de presión


Intensificador

Marco de la prensa

Bomba de baja presión


Cámara de presión

Medio de presión

Pistón

Marco de la prensa

Bomba de baja presión


Cámara de presión

Medio de presión

Pistón

Marco de la prensa

- 18 -

Equipos de tipo semicontinuo

Son utilizados con productos que pueden ser bombeados. En primer lugar, el alimento

se introduce en la cámara de presión, entrando en contacto directo con el acero de la cámara,

que debe ser adecuado para este fin y no experimentar corrosión durante su utilización .

Posteriormente, el alimento es comprimido por el líquido transmisor de la presión que está al

otro lado de un pistón. En estos equipos se utiliza una compresión directa para generar la

presión. Finalmente, el alimento presurizado es evacuado de la cámara a través de una válvula

aséptica de alta presión (Figura 7) (Balasubramaniam y col., 2008). Estos sistemas tienen

mejor rendimiento y mejor aprovechamiento de la energía utilizada, con el inconveniente de

un coste inicial mayor (Ting y Marshall, 2002; Hogan y col., 2005).

Figura 1.7. Esquema del diseño de un equipo de altas presiones de tipo semicontinuo (adaptado de

Daoudi, 2004).

De entre estos dos diseños, los más utilizados son los que presurizan alimentos

previamente envasados, ya que de esta manera se elimina el riesgo de contaminación del

producto con algún componente presente en el medio de presurización en de la maquinaria,

así como la posible contaminación de la cámara con el alimento y la necesidad de limpiarla

después de cada aplicación, disminuyendo, de esta manera, los costes de mantenimiento.


Cierre inferior

Cierre superior

Cámara de presión

Medio de presión


Intensificador

Marco de la prensa

Producto a procesar

Producto procesado

Salida del mediode presión


Cierre inferior

Cierre superior

Cámara de presión

Medio de presión


Intensificador

Marco de la prensa

Producto a procesar

Producto procesado

Salida del mediode presión

INTRODUCCIÓN

- 19 -

- 19 -

1.2.1.3. Efecto de la alta presión sobre las proteínas

Las altas presiones hidrostáticas producen la desnaturalización de las proteínas,

alterando el delicado equilibrio que existe entrelas interacciones que estabilizan la

conformación plegada de las proteínas nativas (Masson, 1992). Las dianas de los tratamientos

con alta presión son las interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, cuya destrucción se

acompaña de una disminución de volumen. La formación de puentes de hidrógeno es casi

insensible a la presión, al igual que los enlaces covalentes que prácticamente no se modifican

hasta los 1000 MPa (Masson, 1992). La aplicación de alta presión induce cambios locales o

globales en la estructura de las proteínas, que pueden conducir a la desnaturalización

(Mozhaev y col., 1996). Presiones de 100-200 MPa son suficientes para provocar la

disociación de las proteínas poliméricas y de complejos multi-proteína (Silva y Weber, 1993),

mientras que las proteínas monoméricas suelen desnaturalizarse entre 400 y 800 MPa

(Heremans, 1982).

La exposición de residuos hidrofóbicos ocultos al agua y su resultante hidratación

durante el desplegamiento causa una disminución del volumen molar parcial de la proteína.

La hidratación de los grupos hidrofóbicos expuestos juega un papel decisivo en la estabilidad

termodinámica de la proteína y puede, además, ser considerada como un importante factor

para entender la modificación de su funcionalidad como resultado de los tratamientos de alta

presión. La disociación en subunidades y los desplegamientos localizados pueden exponer

grupos escondidos, que podrían unirse con otros grupos nuevamente expuestos y así producir

agregación (Masson, 1992).

1.2.1.3.1. Efecto de la alta presión sobre las proteínas de suero

Los estudios realizados sobre la desnaturalización por presión de las proteínas de suero

se centran en las proteínas mayoritarias, sobre todo en la -Lg y -La, ya que éstas son las

principales responsables de las propiedades de interés tecnológico. Los tratamientos con alta

presión producen la desnaturalización de las proteínas del suero. El efecto va a depender de

diferente factores, entre otros, la estructura de la proteína, la presión utilizada, el tiempo de

duración del tratamiento (López-Fandiño y col., 1996; Huppertz y col., 2004 a,b; Hinrichs y

Rademacher, 2004), la temperatura (Gaucheron y col., 1997; López-Fandiño y Olano, 1998;

- 20 -

García-Risco y col., 2000; Hinrichs y Rademacher, 2004; Huppertz y col., 2004b), el pH de la

leche (Arias y col., 2000; Huppertz y col., 2004a), etc.

De las proteínas mayoritarias del suero lácteo, la -Lg es la más sensible a los

tratamientos con alta presión (Patel y col., 2005). Estos tratamientos producen el

desplegamiento de la -Lg como se muestra en la Figura 8.

Figura 8. Cambios en la estructura de la -Lg presurizada (adaptada de Orlien y col., 2007).

A pH 4, la -Lg está en forma de dímero y al aplicarle presiones < 200 MPa se

produce la disociación de éste, lo que conlleva un aumento de la hidratación de la proteína. El

agua penetra en su interior y produce cambios reversibles en su conformación estructural. La

proteína está parcialmente plegada pero sin estructura terciaria específica (Orlien y col.,

2007). Panick y col. (1999) observaron mediante espectroscopía de infrarrojos por

transformada de Fourier (FITR) una disminución de la cantidad de lámina- y -hélice. A

presiones > 200 MPa, la desnaturalización de la proteína aumenta con el nivel de presión, ya

que se hidrata cada vez más, perdiendo su estructura terciaria a 500 MPa (se van rompiendo

los puentes de hidrógeno intramoleculares y se van formando interacciones intermoleculares

entre el agua y los nuevos residuos aminoacídicos expuestos) (Orlien y col., 2007), sin

embargo, la desnaturalización no es completa hasta los 1000 MPa (Panick y col., 1999).

Las altas presiones también pueden producir la agregación de la -Lg, ya que el

desplegamiento de su estructura ocasiona un incremento en la hidrofobicidad de la proteína,

aumentando de esta manera la interacción entre moléculas. Además, durante la presurización

se pueden dar oxidaciones de los grupos sulfidrilo o, más probablemente, reacciones de

intercambio sulfidrilo-disulfuro, en las que juega un papel importante el grupo sulfidrilo libre,

Presión (MPa)

-Lgnativa

-Lgdesnaturalizada

50 200 300 500Presión (MPa)

-Lgnativa

-Lgdesnaturalizada

50 200 300 500

-Lgnativa

-Lgdesnaturalizada

50 200 300 500

INTRODUCCIÓN

- 21 -

- 21 -

de esta proteína expuesto por efecto de la presurización, y que causan la agregación de la -

Lg (López-Fandiño y col., 1996; López-Fandiño, 2006a). Estos puentes disulfuro de nueva

creación son estables una vez que se elimina la presión.

La -La es menos sensible a la presión que la -Lg, debido a que su estructura

molecular es más rígida por la presencia de un mayor número de puentes disulfuro intra-

moleculares (4 frente a 2) y sitios de unión al Ca2+. Esta proteína empieza a desplegarse a

presiones de 200 MPa, aunque estos cambios son reversibles hasta presiones de 400 MPa. A

presiones comprendidas entre 200 y 400 MPa, la -La está en un estado intermedio de

desnaturalización, en la que la proteína mantiene su estructura secundaria, pero tiene una

estructura terciaria muy poco definida. A este estado de desnaturalización de la proteína se le

denomina en inglés molten globule (López-Fandiño, 2006b).

A diferencia de la -Lg, las altas presiones no producen la oligomerización de la -La

por si sola, incluso aunque se le apliquen largos periodos de presión. Sin embargo, en mezclas

de -La y -Lg, y debido al grupo sulfidrilo libre de esta última, la -Lg puede provocar la

oligomerización de la -La, llegando a producir la formación de una gran población de

oligómeros compuestos, presumiblemente, por varios cientos de moléculas de -La y -Lg

(Grinberg y Haertlé, 2000; López-Fandiño, 2006b).

En el caso de la BSA de leche bovina, López-Fandiño y col. (1996) indicaron que esta

proteína no se desnaturaliza a presiones entre 100 y 400 MPa. Esta gran baroestabilidad se

relaciona con el hecho de que la BSA tiene una estructura molecular extremadamente rígida

con 17 puentes disulfuro intramoleculares. Además, estudios realizados a 800 MPa mostraron

que la estructura secundaria de la proteína se ve sustancialmente afectada por esta presión,

aunque los cambios son mayoritariamente reversibles. Sin embargo, a muy altas presiones la

BSA puede también polimerizarse a través de uniones disulfuro mediadas por su grupo

sulfidrilo libre (López-Fandiño, 2006b).

En relación al efecto de las altas presiones sobre otras proteínas minoritarias, como Lf

e inmunoglobulinas, no existen estudios que indiquen el grado de desnaturalización o perdida

de solubilidad de éstas, por lo que queda patente la necesidad de determinar el daño que

pudieran sufrir por estos tratamientos.

- 22 -

Por otro lado, se ha observado que la desnaturalización de las seroproteínas producida

por la presión es mayor cuando se presuriza leche que suero de quesería (Huppertz y col.,

2004b). La presurización de la leche a ≥ 100 MPa, 25ºC produce una progresiva

desnaturalización de la -Lg, estimada mediante la pérdida de solubilidad a pH 4.6, mientras

que la -La y la BSA son resistentes hasta presiones de 400 MPa (López-Fandiño y col.,

1996). A presiones de 200 y 400 MPa, aplicadas a temperatura ambiente durante 15-30 min,

el porcentaje de desnaturalización de la -Lg es de 14-16 y 82-90%, respectivamente

(García-Risco y col., 2003; Huppertz y col., 2004b) mientras que a 600 MPa en las mismas

condiciones solamente se desnaturaliza un 15- 33 % de -La (Needs y col., 2000; Huppertz y

col., 2004b).

Además del nivel de presión, la temperatura es otro de los factores que influyen en el

grado de desnaturalización de las proteínas durante la presurización. López-Fandiño y Olano

(1998a) observaron que un incremento en la temperatura del tratamiento de alta presión hasta

60ºC no desnaturaliza la -Lg a 100 MPa pero, a presiones superiores, la desnaturalización se

incrementa a medida que aumenta la temperatura. También detectaron casi un 60 % de

desnaturalización de la -La tras tratamientos a 400 MPa y 60ºC.

El pH también es otro factor determinante. El pH alcalino favorece considerablemente

la desnaturalización de la -Lg como resultado del tratamiento de alta presión de la leche

debido a que aumenta la reactividad de los grupos sulfidrilo, mientras que el pH ácido reduce

la desnaturalización (Arias y col., 2000; Huppertz y col., 2004a).

Como ya se ha indicado, las proteínas de suero, -Lg y -La, son más susceptibles a la

desnaturalización inducida por la alta presión en la leche que en el suero, probablemente

debido a la ausencia de caseínas y a la menor concentración de calcio de este último (Hinrichs

y Rademacher, 2005; Huppertz y col., 2004b). Se ha sugerido la posibilidad de que la -Lg

desnaturalizada pueda unirse, mediante enlaces disulfuro, a la -CN (López-Fandiño y col.,

1997; Nabhan y col., 2004) y a la αS2-CN y así, formar agregados proteicos (Patel y col.,

2006). Además, el calcio podría facilitar el acercamiento de las proteínas de suero

desplegadas a otras proteínas a través de la neutralización de cargas. De hecho, se ha

observado que la desnaturalización de -Lg y -La inducida por presiones de hasta 800 MPa

INTRODUCCIÓN

- 23 -

- 23 -

se puede prevenir mediante la presencia de agentes bloqueantes de grupos sulfidrilo y reducir

mediante la eliminación de CCP (Huppertz y col., 2004b).

Así, en suero presurizado una importante proporción de las proteínas desnaturalizadas

permanece soluble, puesto que la concentración de caseínas es mínima (Huppertz y col.,

2004a). En la leche, la -Lg desnaturalizada por presión se encuentra asociada a la micela de

caseína, de manera análoga a lo que ocurre tras los tratamientos térmicos (Scollard y col.,

2000), aunque también puede permanecer en solución (García-Risco y col., 2003), ya sea en

forma de agregados formados exclusivamente por proteínas de suero o asociada a partículas

de caseína demasiado pequeñas para ser sedimentadas (López-Fandiño y col., 1998; Huppertz

y col., 2004a). Ye y col. (2004) también observaron algunas moléculas de -La y -Lg

asociadas a la membrana del glóbulo de grasa lácteo.

La asociación de la -Lg con las micelas de caseína inducida por las altas presiones

afecta a varias propiedades tecnológicas de la leche, por ejemplo, dificulta la coagulación

enzimática (Zobrist y col., 2005). Por otra parte, la interacción entre la -La y la -Lg puede

obstaculizar la aglutinación de los glóbulos de grasa inducida por frío y reducir la separación

de la grasa en la leche presurizada (Huppertz y col., 2006).

1.2.1.3.2. Efecto de las altas presiones sobre las micelas de caseína

Los tratamientos con alta presión pueden causar modificaciones sustanciales en las

micelas de caseína. De forma general, estos tratamientos producen la disgregación de la

micela de caseína, la cual se reorganiza en partículas más pequeñas e irregulares, dejando

libres pequeños fragmentos micelares o moléculas individuales de caseínas no

sedimentables,- junto con calcio y fósforo (López-Fandiño y col., 1998). Así, se modifica el

número, el tamaño y la composición de las micelas, lo que da lugar a cambios en las

propiedades ópticas de la leche, como disminución de la turbidez y cambios en la apariencia

visual (Needs y col., 2000a). Estas nuevas micelas generadas por la presión están más

hidratadas que sus predecesoras (Gaucheron y col., 1997; Huppertz y col., 2004c) ya que, por

un lado, la hidratación aumenta con la reducción del tamaño de la micela y es mayor para

partículas amorfas que para esféricas (Huppertz y col., 2006) y, por otro lado, la asociación a

- 24 -

éstas de la -Lg desnaturalizada aumenta la carga negativa y la solvatación micelar

(Huppertz y col., 2004c).

La disgregación micelar es consecuencia del debilitamiento de las interacciones

hidrofóbicas y electroestáticas que existen entre las caseínas (Johnston y col., 1992; Needs y

col., 2000a, b). Además, la ruptura de pares iónicos inducida por la presión altera la red de

CCP que estabiliza a la micela (Schrader y Buchheim, 1998; Huppertz y col 2004a, b). Así,

los tratamientos con altas presiones originan la solubilización del CCP, lo que conduce a un

aumento considerable de la concentración de minerales en la fase sérica (Huppertz y col.,

2006c). Entre 100 y 400 MPa se produce un incremento lineal en los niveles de Ca, P y Mg

(López-Fandiño y col., 1998; Hubbard y col., 2002), lo cual indica una progresiva

solubilización del CCP a medida que aumenta la presión, que conduce a la pérdida de la

integridad micelar. Parámetros como el nivel de presión, el tiempo de presurización, la

velocidad de despresurización, la temperatura y las condiciones del entorno (contenido en

calcio y caseína, pH) influyen en las propiedades de las micelas en la leche presurizada.

El nivel de presión es el parámetro que más influye en los cambios micelares. La

utilización de presiones < 200 MPa, a 20ºC , casi no modifica el tamaño de la micela de

caseína, aunque dependiendo del estudio se han indicado pequeños incrementos o reducciones

en su tamaño medio (Needs y col., 2000b; Huppertz y col., 2004a; Anema, 2008). Sin

embargo, sí se produce disgregación micelar, estimada a través del contenido en caseína no

sedimentable (Garcia-Risco y col., 2003), y aumento del volumen hidrodinámico de la micela.

Además, a partir de los 100 MPa comienza a disminuir la turbidez de la leche (Regnault y

col., 2004).

A partir de los 200 MPa, en tratamientos de 15 min, 20ºC, además de la disgregación

de la micela comienza a aparecer otro fenómeno, la agregación (Regnault y col., 2004). Ésta

se debe a que estas presiones intermedias (entre 250 y 300 MPa) favorecen las interacciones

hidrofóbicas respecto a la solvatación de los residuos hidrofóbicos expuestos. La asociación

se vería promovida, además, por la neutralización de las cargas negativas de las caseínas que

producen los iones calcio disueltos (Huppertz y De Kruif, 2006; Huppertz y col., 2006b), Por

esta razón, algunos autores han observado que el tamaño de la micela de caseína puede

aumentar a 250 MPa, aunque este hecho depende de varios factores, como la duración del

tratamiento, el pH y la temperatura, como se explica más adelante (Huppertz y col., 2004a).

INTRODUCCIÓN

- 25 -

- 25 -

Los tratamientos a presión >300 MPa reducen el tamaño de la micela de caseína, que

alcanza, a 400 MPa, aproximadamente la mitad del tamaño inicial (Gaucheron y col., 1997;

Needs y col., 2000b; Huppertz y col., 2004a, d, e), y no varía con el aumento de presión

(Anema y col., 2005a, Huppertz y col., 2004a), ni con posteriores presurizaciones (Huppertz y

col, 2004a). Estos cambios ocurren rápidamente y se acompañan de un importante aumento

en el nivel de caseínas de la fase sérica, que es máximo a presiones de 250-350 MPa (López-

Fandiño y col., 1998; Huppertz y col., 2004c). Las caseínas son liberadas durante la

disgregación micelar en el orden: -, -> S1-> S2-CN, el cual coincide con el número de

residuos por molécula capaces de unir CCP y, por tanto, de contribuir al mantenimiento de la

estructura micelar (López-Fandiño y col., 1998; Anema y col., 2005a). Medidas in situ han

demostrado que la máxima solubilización del CCP tiene lugar a 400 MPa, lo que coincide con

una disrupción micelar completa e irreversible (Huppertz y De Kruif, 2007a).Por otro lado, el

volumen de las micelas o subunidades resultantes es mayor, aproximadamente un 12%

superior que las micelas nativas (Regnault y col., 2004).

Dependiendo de la duración del tratamiento, los efectos de la alta presión en la micela

de caseína pueden variar. Los tratamientos a 250 MPa durante tiempos 5 min producen la

reducción del tamaño de la micela, aunque, posteriormente, éste va aumentando a medida que

se prolonga el tratamiento hasta los 40 min, momento en el que se alcanza el máximo

crecimiento (un 30% respecto al tamaño de la micela sin tratar), siendo a los 20 min cuando el

tamaño de la micela supera a la micela nativa. A presiones superiores (400 MPa) y tras sólo 1

seg de tratamiento, el tamaño de la micela se reduce (40% a 400 MPa) y tratamientos más

largos no reducen más el tamaño micelar (Huppertz y col., 2004a).

Existen muy pocos estudios que muestren el efecto de la velocidad de

despresurización en la micela de caseína, pero podría tratarse un factor importante, ya que

durante esta fase comenzarían a restablecerse interacciones electrostáticas e hidrofóbicas

destruidas durante el tratamiento con alta presión, originando la reasociación de las caseínas.

Se ha observado que la despresurización rápida de la leche (600 y 200 MPa/min) produce

micelas de caseína de menor tamaño y mayor volumen hidrodinámico que las obtenidas tras

una despresurización lenta (20 MPa/min) o sin tratar (Merel y col., 2007).

Al combinar presión y temperatura también se produce disgregación micelar, pero el

tamaño aumenta progresivamente a medida que aumenta la temperatura de presurización (20-

- 26 -

60ºC), presumiblemente porque ésta limite la ruptura de las interacciones hidrofóbicas o

promueva la agregación de las proteínas tras la descompresión (García-Risco y col., 2000;

Huppertz y col., 2004a). En concreto, en leche presurizada a 400 MPa durante 15 min el

tamaño medio, medido por microscopía electrónica de trasmisión, pasa de 38 a 135 nm al

cambiar la temperatura de presurización de 25 a 60ºC (García-Risco y col., 2000). Sin

embargo, a temperaturas inferiores (9ºC) y tras tratamientos a presiones ≤300 MPa no se

observa agregación, sino simplemente disgregación micelar, que aumenta a medida que sube

la presión, disminuyendo la turbidez de la leche (Regnault y col., 2004), y que conduce a un

tamaño micelar notablemente inferior al de la micela sin tratar (Huppertz y col., 2004). La

desintegración micelar inducida a bajas temperaturas, probablemente se debe a un

debilitamiento sinérgico de las interacciones hidrofóbicas (Regnault y col., 2004; Huppertz y

col., 2004a).

El pH también juega un papel importante en los cambios de tamaño de la micela de

caseína producidos por la alta presión. La aplicación de 250 MPa durante 30 min a leche

desnatada produce un aumento del tamaño de la micela (25 %) cuando el pH de la leche es de

6.7 y 7.0, disminuyendo posteriormente a medida que se incrementa el nivel de presión. Sin

embargo, a pHs de 6.5 no se produce este efecto, sino que el tamaño disminuye. Además, la

disminución del tamaño de la micela que se produce a presiones 300 MPa es mayor a pHs

más bajos (6.7 frente a 7.0) (Huppertz y col., 2004a). El pH bajo favorece la solubilización

del CCP y, por tanto, la destrucción de la estructura coloidal y el incremento en el contenido

de caseínas no sedimentables inducida por las altas presiones (Arias y col., 2000). Por el

contrario, a pH neutro o alcalino, la solubilización de CCP es limitada y ayuda a mantener la

estructura coloidal (Anema y col., 1997; Huppertz y col., 2004a), aunque la cantidad relativa

de todas las caseínas en la fracción del suero aumenta, probablemente a causa del aumento de

la carga negativa y la repulsión electrostática (Arias y col., 2000).

Todos los estudios presentados se han realizado en equipos de laboratorio o a escala

piloto, no existiendo actualmente evidencias del efecto que podría tener la presurización de

leche en equipos industriales. Dado que el diseño de estos últimos, incluyendo los sistemas de

liberación de la presión, termostatización etc., es diferente, no debe descartarse que pudiera

influir en el tamaño y la composición de la micela de caseína resultante o en la

desnaturalización de las proteínas séricas.

INTRODUCCIÓN

- 27 -

- 27 -

Algunos estudios sugieren que las proteínas de suero, desnaturalizadas por la presión,

podrían estar implicadas en los procesos de agregación proteica producidos por los

tratamientos con altas presiones. En concreto, la -Lg, al interaccionar con las micelas de

caseína mediante su unión con la -CN (Schrader y Buchheim, 1998; Huppertz y col., 2004a),

podría proteger a la micela de la disgregación (Kelly y col., 2002) o contribuir a su agregación

(Huppertz y col., 2004d). Sin embargo, estudios posteriores con sistemas de los cuales se

habían eliminado las proteínas de suero, mostraron que éstas influyen muy poco en los

cambios del tamaño de la micela inducidos por la presión, por lo que parece más probable que

el incremento de tamaño sea debido exclusivamente a la formación agregados caseínicos

(Anema y col., 2005a; Huppertz y col., 2007b). En concreto, Huppertz y col. (2007b)

observaron que tratamientos de presión de duración corta (≤10 min), aplicados a suspensiones

de caseínas micelares reconstituidas con adicción de proteínas de suero, producen micelas de

mayor tamaño que las obtenidas en el mismo sistema en ausencia de proteínas de suero. Sin

embargo, tras tratamientos de duración larga se elimina esta diferencia, lo cual apunta a una

influencia menor de las proteínas de suero en los cambios de la micela de caseína inducidos

por la alta presión.

La reversibilidad de los cambios micelares producidos por los tratamientos de alta

presión también ha sido objeto de estudio. Hasta 250 MPa, la mayoría de los cambios son

reversibles, sin embargo, a presiones superiores, su reversión depende del tiempo y la

temperatura de almacenamiento. Huppertz y col. (2004c) observaron que el aumento en el

tamaño micelar medio observado en leche tratada a 250 MPa, disminuye durante el

almacenamiento a 20ºC durante 24-48 h. En cambio, las partículas de pequeño tamaño que se

producen a mayores presiones son estables durante el mantenimiento posterior,

probablemente porque se necesite una estructura mínima que ejerza de núcleo para la

agregación, lo que se ve seriamente comprometido cuando la solubilización del CCP es muy

importante o completa (Huppertz y col., 2004c). En general, no se ha descrito reversibilidad

de los cambios producidos por las altas presiones durante almacenamientos a 5ºC

Gerhardt y col. (2006) explican en detalle como serían los cambios en la estructura

micelar producidos por la alta presión, a partir de sus estudios de espectroscopía de

correlación de fotones (PCS) in situ y microscopía de fuerza atómica (AFM) (Figura 9). A

presiones entre 100-250 MPa la micela se disgrega en mini-micelas, algunas de las cuales,

tienen un alto contenido en CCP, lo que les permite asociarse con otros fragmentos menos

- 28 -

ricos en CCP formando una nueva micela al cesar la presión. Esta nueva micela sería algo

más pequeña, más compacta y homogénea que la nativa, y en ella, las partículas ricas en CCP,

se encontrarían en el interior, mientras que las partículas hidrofóbicas, con menor contenido

en fosfato cálcico, se concentrarían en la superficie. Por lo tanto, el núcleo de esta micela

estaría estabilizado por uniones con el CCP, mientras que la superficie estaría dominada por

uniones hidrofóbicas entre las caseínas. Sin embargo, a presiones superiores a 280 MPa, las

micelas se disocian completamente en monómeros unitarios por la reducción de interacciones

electroestáticas y no-polares y aumenta la concentración de calcio libre y fosfato. Estos

monómeros se pueden reasociar, ya que el alto nivel de calcio libre induce agregación, pero

no se producirían micelas similares a la nativa, ni en tamaño ni en estructura, ya que la

disociación del CCP, necesario para formar la micela, a estas presiones es irreversible.

1.2.1.4. Aplicaciones tecnológicas de los tratamientos con alta presión

En los apartados anteriores se ha explicado que la alta presión reduce el tamaño de la

micela de caseína y produce disgregación micelar, desnaturaliza la estructura de las proteínas

de suero y altera el equilibrio mineral de la leche, en mayor o menor grado, dependiendo del

nivel de presión, el tiempo de tratamiento y el pH, entre otros factores. Estos cambios que se

producen en las proteínas mejoran sus propiedades funcionales y su aptitud tecnológica para

ciertos procesos, como la coagulación enzimática y ácida, por lo que pueden utilizarse en la

industria alimentaria para elaborar productos como quesos y yogures.

Coagulación enzimática y fabricación de quesos

La coagulación enzimática se basa en dos procesos interrelacionados, por un lado en la

hidrólisis específica de la κ-CN produciendo para-κ-CN y caseinmacropéptido y, por otro, en

la agregación de las micelas de caseína modificadas enzimaticamente (López-Fandiño,

2006a). Se ha observado que el tiempo de coagulación disminuye a presiones de hasta 200-

250 MPa, aumentando posteriormente, a medida que aumenta la presión aplicada, hasta

alcanzar tiempos similares a 400 MPa a los de la leche cruda, o superiores (15% más rápido a

600 MPa) (López-Fandiño y col., 1996; Needs y col., 2000b; Zobrist y col., 2005).

Presión normal(0.1 MPa)

Bajo presión(100-250 MPa)

Después de la despresurización(0.1 MPa)

100-200 nm 80-120 nm10-20 nmMicela nativa

100-200 nm 10-20 nm

Presión normal(0.1 MPa)

Bajo presión(280-400 MPa)

Después de la despresurización(0.1 MPa)

Figura 9. Representación esquemática de los cambios estructurales inducidos por la presión basado en el modelo de Walstra (1999) relacionado con los

modelos micelares descritos antes (adaptado de Gebhardt y col., 2006).

- 30 -

La alta presión acelera la coagulación enzimática de la leche debido a varios factores.

Por un lado, la disgregación de la micela libera caseínas a la fase soluble de la leche, entre

ellas la κ-CN, que es muy importante en la estabilidad de la micela. Se reduce así la carga

negativa y la repulsión electroestática en la micela. Además, la reducción de la capa

hidrofílica que recubre las micelas promueve las interacciones hidrofóbicas y la agregación

proteica (Johnston y col., 2002). Sin embargo, estos efectos se ven contrarrestados por la

desnaturalización de la β-Lg inducida por la presión. Esta proteína comienza a

desnaturalizarse a 200 MPa, su estructura comienza a desplegarse y el grupo sulfidrilo libre,

antes oculto en su estructura, se une a proteínas como la κ-CN (Patel y col., 2006), reduciendo

de esta manera la suceptibilidad de la κ-CN a hidrolizarse por la quimosina (López-Fandiño y

col., 1997). Además, la unión de ambas proteínas aumenta la repulsión electroestática, e

interfiere en la agregación micelar a presiones superiores a 250 MPa (López-Fandiño, 2006b).

Zobrist y col. (2005) observaron que el tiempo de coagulación de la leche no aumentó cuando

se presurizó a 400 y 600 MPa sin que hubiera proteínas de suero, o conteniendo KIO3, que

impide la unión de la -Lg a la micela de caseína.

Además de acortar el tiempo de coagulación, dependiendo del balance entre la

disgregación micelar y la desnaturalización de las proteínas de suero, los tratamientos con alta

presión dan lugar a cuajadas más firmes, hecho que se ha asociado a la disminución del

tamaño micelar (López-Fandiño y col., 1996). Las cuajadas con mayor firmeza se obtuvieron

en leches pasteurizadas a 65ºC durante 30 min con posterior tratamiento a 400 MPa, 15 min

(Molina y col., 2000).

En la fabricación de queso es también importante el rendimiento de la cuajada, en el

que influye la cantidad de proteínas desnaturalizadas asociadas a las caseínas y la cantidad de

agua retenida en la cuajada (Huppertz y col., 2004b). En la leche cruda, los tratamientos con

alta presión a 100-400 MPa aumentan el contenido en proteínas y la humedad de la cuajada y

mejoran su firmeza, mientras que se acelera o mantiene el tiempo de coagulación (López-

Fandiño y col., 1996). Ya se ha mencionado que la unión de la -Lg a las caseínas produce un

aumento de la carga neta negativa de la micela, y esto puede llevar asociado un aumento de la

solvatación (Imafidon and Farkye, 1996) y una reducción de la sinéresis (Smith and

McMahon, 1996). Además, la solvatación también aumenta a presiones entre 100 y 600 MPa

debido a la formación de submicelas o agregados de menor tamaño (Gaucheron y col., 1997;

Huppertz y col., 2004c). En cualquier caso, el aumento del rendimiento va estrechamente

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO I

- 31 -

- 31 -

ligado a la desnaturalización de la -Lg: a presiones ≤ 250 MPa, el rendimiento de la cuajada

no varía (Huppertz y col., 2004f), mientras que tras tratamientos a presiones superiores, 300 y

400 MPa (30 min, 20-25ºC), se observaron aumentos del rendimiento del 14% y del 20%

respectivamente (López-Fandiño y col., 1996), que llegan a un 25% en leches presurizadas a

600-800 MPa (Huppertz y col., 2004f).

Algunos autores han estudiado la estructura de quesos elaborados a partir de leche

presurizada. Los quesos Cheddar elaborados a partir de leche presurizada a 586 MPa (3 ciclos

de 1 min) mostraron un contenido de humedad y un rendimiento mayor que los mismos

hechos con leche cruda o pasteurizada, aunque la textura fue pastosa y débil (Drake y col.,

1997). En quesos con bajo contenido en grasa fabricados a partir de leche pasteurizada (65ºC,

30 min) y posteriormente presurizada (400 MPa, 22ºC, 15 min) también se observó un

aumento del rendimiento frente a los elaborados con leche pasteurizada, al igual que una

proteolisis más rápida de las caseínas, lo que contribuyó a un desarrollo más rápido de la

textura, el aroma y el sabor (Molina y col., 2000). Además, el queso Fresco elaborado a partir

de leche presurizada (400 MPa, 20 min, 20ºC) fue más húmedo, menos firme, menos

quebradizo y más pegajoso (Sandra y col., 2004).

Coagulación ácida y fabricación de yogur

Los tratamientos con alta presión también favorecen la coagulación ácida. Factores

como la desintegración micelar, la pérdida de la estabilidad electroestática de la micela de

caseína cerca de pH 5.3 y la mayor frecuencia de colisión de las partículas influyen en la

calidad del coágulo formado por acidificación (Banon y Hardy, 1992; Schwertfeger y

Buchheim, 1998; Huppertz y col., 2002). En leches reconstituidas tratadas con presión, la

gelificación inducida por la acidificación se produce a pHs superiores que la producida en

leches no presurizadas, debido a los cambios inducidos por la presión en la capacidad

tamponadora (Desobry-Banon y col., 1994). Además, en leche bovina presurizada, la

acidificación producida por la inoculación con bacterias acido-lácticas se produce más

rápidamente, probablemente debido a que la rotura de la micela produce un aumento del

nitrógeno accesible a la bacteria (Huppertz y col., 2004g).

Algunos estudios demostraron que las propiedades de los geles formados por

acidificación mejoran al presurizar la leche. Por ejemplo, Johnston y col. (1993, 2002)

- 32 -

obtuvieron geles más rígidos, más fuertes y con mayor resistencia a la sinéresis, lo cual se

correlacionó con un aumento en la hidratación y en la densidad de la malla de proteína. La

agregación de pequeñas partículas micelares daría lugar a agregados compactos de menor

tamaño cuando se alcanza el punto isoeléctrico. Además, el hecho de que en su superficie se

encuentre -lg desnaturalizada contribuye a la firmeza del gel y a la resistencia a la sinéresis

(Harte y col., 2002).

Se ha observado que la firmeza de los yogures elaborados a partir de leche presurizada

aumenta a medida que aumenta la presión (Needs y col., 2000). Los yogures elaborados a

partir de leche presurizada a 55ºC, presentan una gran firmeza sin rotura micelar aparente, lo

cual pone de manifiesto la importancia de la desnaturalización de las proteínas de suero en

este proceso (Ferragut y col., 2000). Además, Harte y col. (2003) observaron que el uso de un

tratamiento térmico (85ºC, 30 min), antes o después de los tratamientos de alta presión, que

produce una amplia desnaturalización de las proteínas de suero, mejora las propiedades

reológicas y reduce la sinéresis. A este respecto debe indicarse que algunos estudios han

puesto de manifiesto que la firmeza optima se obtiene combinando la desnaturalización de las

proteínas de suero con una alta concentración de caseínas micelares disgregadas (Capellas y

Needs 2003).

Gelificación de la leche por la alta presión

Otro de los efectos que producen las altas presiones en la leche es la gelificación de

leche concentrada (66-114 g/ kg de proteína), en concreto, a presiones de 200 y 400 MPa. La

disminución del pH hacia 5.9 y el aumento del contenido proteico contribuyen a la formación

de geles de mayor firmeza (Famelart y col., 1998). Las propiedades relativas a la viscosidad,

viscoelasticidad y textura de los geles fabricados a partir de leche concentrada dependen del

nivel de presión, siendo la disociación micelar un requisito indispensable en la formación del

gel, mientras que la agregación de las proteínas del suero tiene un papel secundario (Keenan y

col., 2001). De hecho, la firmeza de los geles formados a partir de caseínas depende de la

velocidad de descompresión, a diferencia de los geles formados por proteínas de suero (Fertch

y col., 2003). La despresurización rápida produce geles más firmes, con una microestructura

más fina que los elaborados tras despresurizaciones lentas, lo que fue atribuido a que, una vez

que se produce la disociación de la micela de caseína durante la fase de mantenimiento de la

presión, una despresurización lenta favorecería el desarrollo de hiperestructuras caseínicas, al


- 33 -

- 33 -

reformarse los puentes de calcio y las interacciones hidrofóbicas, lo que dificultaría una

gelificación homogénea (Fertsch y col., 2003). Sin embargo, Merel-Rausch y col. (2007), que

también encontraron geles de mayor firmeza a velocidades rápidas de liberación de la presión,

lo correlacionaron con la formación de grandes estructuras flexibles, construidas a partir de

micelas de caseína de menor tamaño.

2. OBJETIVO GENERAL Y

PLAN DE TRABAJO

OBJETIVO GENERAL Y PLAN DE TRABAJO

- 37 -

En la actualidad, la industria alimentaria utiliza frecuentemente proteínas lácteas como

ingredientes para productos alimentarios, por su valor nutricional y, sobre todo, por sus

propiedades funcionales. Entre otros muchos productos, estas proteínas son utilizadas para la

elaboración de fórmulas infantiles. Aunque el mejor alimento para el recién nacido es la leche

materna, no siempre es posible la lactancia y es necesario recurrir a fórmulas infantiles que

sustituyan a la leche humana.

Según el Codex Alimentarius, las fórmulas infantiles deben promover el normal

crecimiento y desarrollo del niño y satisfacer, por sí solas, sus requerimientos nutricionales.

El objetivo principal de los fabricantes no es obtener una fórmula que reproduzca fielmente la

composición de la leche humana, sino que, más bien, imite los efectos funcionales de la leche

materna. El conocimiento cada vez más exhaustivo de la importancia de algunos de sus

componentes, como citoquinas o factores de crecimiento, un adecuado balance de ácidos

grasos poliinsaturados (n-3/n-6) o la presencia de determinadas especies de bacterias

probióticas, a las que los oligosacáridos humanos (de los que se conocen más de 100

estructuras distintas) sirven como sustratos, ha conllevado a importantes avances en el

desarrollo de fórmulas infantiles mejoradas. También es sabido que muchas de las

propiedades beneficiosas de la leche humana se deben a la fracción de proteínas que, además

de proporcionar un aporte adecuado de nutrientes, contribuye a la defensa frente a infecciones

y facilita el óptimo desarrollo de funciones biológicas esenciales para el recién nacido. Sin

embargo, los requerimientos proteicos precisos son un tema controvertido (Lönnerdal, 2010).

Algunos autores señalan la importancia de una ingesta adecuada de proteínas durante

los primeros meses de vida, sobre todo, de la relación entre proteínas de suero/caseínas. La

presencia de caseínas en la leche humana es una de las menores comparada con la de otros

mamíferos. Así, mientras la leche bovina contiene unos 25 g/L, la leche humana contiene sólo

4.6 g/L (Ginger and Grigor, 1999). Un contenido bajo de proteínas y la predominancia de

proteínas de suero, que caracterizan a la leche humana, facilitaría el proceso de digestión e

incluso podría inducir una mayor colonización del intestino por bacterias probióticas. Por otra

parte, una ganancia rápida de peso durante la infancia se asocia con un mayor riesgo de

obesidad. De hecho, comparados con los niños alimentados con leche materna, los

alimentados con fórmulas ganan más peso durante la infancia. Esto se explica por una mayor

ingesta de sustratos metabolizables y, en particular, de proteínas: la ingesta de proteínas por

- 38 -

kg de peso corporal es del 55-80% mayor en los niños alimentados con fórmulas respecto a

los alimentados con leche materna (Koletko y col., 2009).

Durante la manufactura de las fórmulas infantiles, la aplicación de tratamientos

térmicos es imprescindible para garantizar su inocuidad. Sin embargo los procesos

convencionales afectan negativamente sus propiedades químicas y la biodisponibilidad de

nutrientes, incluyendo degradación de vitamina C, peroxidación de lípidos, formación de

agregados de lípidos y proteínas y formación de productos de la reacción de Maillard, que

disminuyen la disponibilidad de la lisina y tienen menor capacidad de unión a magnesio,

cobre, calcio y zinc, inhibiendo su absorción (Sarriá y col., 2001).

En los últimos 30 años se han desarrollado enormemente nuevas tecnologías de

procesado y conservación de alimentos, las llamadas tecnologías emergentes, si bien la alta

presión hidrostática es la única tecnología emergente que ha dado lugar a productos

comerciales, pudiéndose encontrar en los lineales de los supermercados una considerable

variedad de alimentos presurizados. La mayoría de las aplicaciones de la alta presión se basan

en su capacidad de destruir microorganismos sin afectar negativamente a las características

nutricionales de los alimentos. Pero, además, los tratamientos con alta presión pueden

modificar la estructura cuaternaria, terciaria y, en menor medida secundaria, de las proteínas,

conduciendo a propiedades funcionales únicas o muy difíciles de conseguir con otros

procesos. Así, como consecuencia de la desnaturalización de las proteínas de suero y de la

ruptura micelar, se forman nuevas estructuras proteicas, lo que, además de mejorar la aptitud

tecnológica de la leche para ciertos fines, podría permitir la obtención de fracciones con de

interés nutricional. En cualquier caso, la intensidad, la duración y la temperatura de los

tratamientos, así como, el pH y la concentración de proteína influyen en los cambios

originados por las altas presiones Actualmente, el efecto de la mayoría de estas variables se

conoce bien, pero rara vez se ha estudiado la influencia de parámetros como el tipo de equipo

de alta presión, la velocidad de despresurización o el empleo de presiones muy elevadas,

superiores a 600 MPa.

Esta tesis doctoral profundiza en el estudio de la desnaturalización de las proteínas de

suero de la leche, la desintegración micelar de las caseínas y en los cambios en la distribución

de estas proteínas que origina el tratamiento con altas presiones hidrostáticas. El objetivo era

explorar el potencial de las altas presiones para mantener la calidad nutritiva de las proteínas

OBJETIVO GENERAL Y PLAN DE TRABAJO

- 39 -

de la leche y obtener fracciones lácteas de diferente composición y concentración de proteínas

con aplicabilidad en la elaboración de nuevas formulas infantiles. Para desarrollar este

objetivo, nos centramos en los siguientes objetivos parciales:

o Estudio del efecto de las altas presiones hidrostáticas en las propiedades

nutricionales de fórmulas infantiles líquidas.

o Estudio del efecto del tipo de equipo de alta presión y del escalado en la distribución

proteica de diferentes fracciones lácteas.

o Estudio del efecto de la velocidad de despresurización en la distribución proteica de

diferentes fracciones lácteas.

o Estudio del efecto de presiones muy elevadas, entre 700, 800 y 900 MPa, aplicadas a

diferentes fracciones lácteas, sobre su distribución proteica.

Cada uno de los objetivos expuestos constituye un capítulo de la Tesis en el que se discute la

influencia de las distintas variables del tratamiento de alta presión en los cambios

encontrados.

- 40 -

Figura 10. Esquema del plan de trabajo desarrollado.

Mat

eria

pr

ima

Aná

lisis

Capítulo I Capítulo II Capítulo III Capítulo IV

Fórmula Infantil

(con o sin NEM o DMF)

UHT(142ºC, 4.7 seg)

Fact

ores

est

udia

dos

Tra

tam

ient

os a

plic

ados

Alta presión (HP)650 MPa, 15ºC,

5 min

HP0.1, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, 15ºC, 5min con

despresurización instantánea

Tipo de tratamiento: UHT v HP

Equipo utilizado:Industrial vs piloto

t mantenimiento presión:

5, 6, 10 y 15 min

t despresurización:0.07, 1, 5 y 10 min

HP0.1, 250, 450, 550,

700, 800 y 900 MPa, 15ºC, 5min

Nivel de presión:0.1- 650 MPa

t despresurización en equipo piloto:30 seg vs 5 min


HP0.1, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, 15ºC, 5min con

despresurización de 5 min

HP0.1, 250 y 350 MPa, 25ºC, 5 - 15 min con

despresurización en 0.07 min

HP0.1, 250 y 350 MPa,

25ºC, 5 min con despresurización

0.07 -10 min


Nitrógeno total

Furosina

Lactosa y lactulosa

Lactoferrina e IgA

Proteínas mayoritarias solubles en fracciones

Lactoferrina e IgA

Tamaño micela de caseína

Leche cruda desnatada

Mat

eria

pr

ima

Aná

lisis

Capítulo I Capítulo II Capítulo III Capítulo IV

Fórmula Infantil

(con o sin NEM o DMF)

UHT(142ºC, 4.7 seg)

Fact

ores

est

udia

dos

Tra

tam

ient

os a

plic

ados

Alta presión (HP)650 MPa, 15ºC,

5 min

HP0.1, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, 15ºC, 5min con

despresurización instantánea

Tipo de tratamiento: UHT v HP

Equipo utilizado:Industrial vs piloto

t mantenimiento presión:

5, 6, 10 y 15 min

t despresurización:0.07, 1, 5 y 10 min

HP0.1, 250, 450, 550,

700, 800 y 900 MPa, 15ºC, 5min


t despresurización en equipo piloto:30 seg vs 5 min


HP0.1, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, 15ºC, 5min con

despresurización de 5 min

HP0.1, 250 y 350 MPa, 25ºC, 5 - 15 min con

despresurización en 0.07 min

HP0.1, 250 y 350 MPa,

25ºC, 5 min con despresurización

0.07 -10 min


Nitrógeno total

Furosina

Lactosa y lactulosa

Lactoferrina e IgA

Proteínas mayoritarias solubles en fracciones

Lactoferrina e IgA

Tamaño micela de caseína

Leche cruda desnatada

3. MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

- 43 -

3.1. Preparación de las muestras y tratamiento aplicado

El procedimiento llevado a cabo para preparar las muestras (leches y fórmulas

infantiles), los tratamientos de presión o UHT aplicados y los equipos de alta presión

utilizados se explican con detalle en el apartado de Materiales y Métodos de cada capítulo.

3.2. Obtención de fracciones proteicas

Una vez tratadas las muestras, ya sean leche desnatada, leche desnatada con o sin NEM o

DMF, sobrenadantes de ultracentrifugación o fórmulas infantiles, se procedió al

fraccionamiento de las mismas como se indica a continuación:

• Fracción soluble de la ultracentrifugación a 100 000 x g, a 20 ºC durante 1 h. La

separación de las proteínas mediante esta técnica se basa en la diferente velocidad de

sedimentación de las moléculas en función de su peso molecular o del tamaño medio

de un conjunto de partículas. El sobrenadante obtenido se filtró a través de papel de

filtro Whatman nº 41.

• Fracción soluble a pH 4.6 se obtuvieron ajustando el pH de las muestras a 4.6 con HCl

2N, pH en el cual precipitan las caseínas. Las muestras se dejaron reposar durante 20

minutos, y se centrifugaron a 4 000 x g, 20 min, 5 ºC. La fracción soluble se filtró a

través de papel de filtro Whatman nº 40.

Fracción soluble de la precipitación con ácido tricloroacético al 4% (concentración

final). Las muestras se mezclaron con un volumen idéntico de ácido tricloroacético al

8% (v/v), se mantuvieron en reposo durante 1 h y se filtraron por un filtro Whatman nº

40.Eeste fraccionamiento sólo se realizó en las fórmulas infantiles (capitulo I).


- 44 -

3.3. Análisis de las muestras control y de las fracciones proteicas

3.3.1. Determinación del contenido en nitrógeno

Se empleó el método Kjeldahl para determinar el contenido en nitrógeno total

siguiendo el método prescrito en la Norma IDF (FIL-IDF, 1993). El contenido de proteínas se

calculó multiplicando dicho contenido por 6.38. Las muestras se digirieron en un digestor DK

20 (Velp Scientifica Srl., Usmate, Italy) y se destilaron en una unidad de destilación UDK 142

(Velp Scientifica Srl.).

3.3.2. PAGE-SDS

Las leches, las fórmulas infantiles y las fracciones obtenidas según los distintos

procedimientos de ambas se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en

presencia de agentes desnaturalizantes (SDS) y en condiciones reductoras (2-β-

mercaptoetanol). Las leches y fórmulas infantiles se diluyeron 1:9 y las fracciones solubles

1:3 en tampón de la muestra, consistente en 2.5% de SDS, 1 mM EDTA (ácido

dinitrotetraacético) y 5% de 2-β-mercaptoetanol en 10 mM de tampón Tris(hidroxi-

metil)amino metano pH 8. En los geles se incluyó una mezcla de proteínas estándar

compuesta por fosforilasa B (97 kDa), BSA (66 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa

carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (21.5 kDa) y α-La (14.4 kDa) (GE Healthcare,

Uppsala, Suecia). El desarrollo de la electroforesis se llevó a cabo en un equipo automatizado

(PhastSystem, Pharmacia), dotado de una unidad de separación y una de tinción. Se utilizaron

geles Homogeneus 20 y tiras de tampón (PhastGel SDS Strips) comerciales (GE Healthcare).

Se seguieron las condiciones electroforéticas indicadas en el manual del equipo (Pharmacia,

nota de aplicación nº 111, 1987), mostradas en la Tabla 2. Los geles se tiñeron con azul de

coomasie R-350 siguiendo las condiciones que se describen en el manual de instrucciones

(Pharmacia, notas de aplicación nº 200 y nº 210 de 1987, respectivamente).


- 45 -

Tabla 2. Condiciones eléctricas de la separación en PAGE-SDS en PhastSystem

Voltaje

(V)

Intensidad

(mA)

Potencia

(W)

Tª

(ºC) Voltio/h

Preelectroforesis 250 10 3 15 1

Aplicación de la

muestra 250 1 3 15 1

Electroforesis 300 10 3 15 125

3.3.3. Electroforesis Capilar

El contenido en las proteínas individuales mayoritarias de las leches, fórmulas

infantiles y de las fracciones se determinó por electroforesis capilar (EC) en un sistema

Beckman p/ACE 2050, siguiendo el método de Recio y col., (1997). Se utilizó un capilar de

sílice recubierto con TSP (BGB Analytik Vertrieb, Schlossboeckelheim, Alemania) de 57 cm

de longitud total (50 cm de longitud efectiva) y 50 μm de diámetro interno insertado en un

cartucho con una ventana de 100 x 800 μm. La separación se realizó a 45ºC, aplicando un

gradiente lineal de voltaje de 0 a 25 kV en 3 min, seguido de un voltaje constante de 25 kV

durante 47 minutos. El tampón de separación, pH 3, estaba compuesto por 6 mM de urea,

0.05 % (p/v) de metilhidroxieltilcelulosa (MHEC), 20 mM de citrato trisódico dihidratado y

0.32 de ácido cítrico. Para el tampón de la muestra, de pH 8.6, se trató una solución de 10 M

de urea y de 0.083 % (p/v) de MHEC, con 2.5 % (p/v) de resina desionizante, agitando hasta

que su conductividad fue inferior a 2 S/cm y se filtró a través de papel Whatman 41. Una vez

desionizada se añadió 167 mM de Tris(hidroximetil)aminometano, 67 mM de

etilendiaminotetraacetato sódico (EDTA) y 17 mM de DL-ditiotreitol (DTT). Las muestras se

diluyeron 1:2.5 con tampón de la muestra. Antes de cada análisis, el capilar se lavó con

tampón de separación en sentido inverso (del cátodo al ánodo) durante 6 minutos. Las

muestras se inyectaron en el ánodo durante 60 segundos a una presión de nitrógeno de 0.5 psi.

La detección se llevó a cabo midiendo la absorbancia a 214 nm. La identificación individual

de las proteínas lácteas se realizó siguiendo a Recio y col. (1997).


- 46 -

3.3.4. ELISA tipo sandwich

La cuantificación de lactoferrina (Lf) e inmunoglobulina A secretora (IgA) se realizó

mediante esta técnica inmunológica, empleando kits comerciales de cuantificación de Lf e

IgA bovina de Bethyl Laboratories. Inc. (Montgomery, USA). En primer lugar se añadieron

100 μL del anticuerpo anti-lactoferrina bovina (anti-LF) o anti-IgA bovina (anti-IgA) a una

placa multipocillos (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA ) y se incubó durante 60

min a temperatura ambiente. Posteriormente, la placa se lavó 3 veces con un tampón de

lavado (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05 % Tween 20, pH 8) y se bloquearon los pocillos

durante 30 min con 200 μL de tampón de bloqueo (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA, pH

8). Nuevamente, se volvió a lavar la placa 3 veces y, a continuación, se añadieron 100 μL de

las leches y fórmulas infantiles controles y presurizadas y de las fracciones de leche. Tanto las

leches como sus fracciones se diluyeron 1:2000 y 1:1000 dependiendo del tratamiento de

presión aplicado mientras que las fórmulas infantiles se testaron sin diluir. Además, también

se añadieron disoluciones de Lf en 50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA y 0.05% Tween 20 a

pH 8, en el intervalo de 500-7.8 ng/mL, o de IgA en el intervalo de 1000-15.6 ng/mL, con el

objetivo de elaborar una recta patrón. Tras 60 min de incubación a temperatura ambiente, los

pocillos se lavaron 5 veces con el tampón de lavado y se le adicionaron 100 μL del anticuerpo

anti-LF o anti-IgA unido a peroxidasa de rábano (HRP) (dilución 1:50000 en 50 mM Tris,

0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8), incubándose 1 hora. A continuación, se lavó

nuevamente 5 veces y se le adicionaron 100 μL del sustrato de la enzima, ortofenilendiamina

(OPD, Palex Medical SA, San Cugat del Vallés, España), y se dejó actuar durante 8 min en

oscuridad, parándose la reacción mediante la adición de 100 μL de H2SO4 2M. Se midió la

absorbancia a 492 nm con un espectrofotómetro Multiskan Ascent (Thermo Fisher Scientific).

La concentración de Lf en cada una de las muestras se determinó interpolando los valores de

absorbancia en la curva patrón. La ecuación de la curva se obtuvo mediante el programa

estadístico GraphPad Prism 4.0 y se ajustó a: y= ((A-D)/(1+(x/C)^B))+D, siendo: A=

0.01578; B= 1.403; C= 114.8; D= 2.304; R2= 0.9979 en el caso de la Lf (Figura 11) y A= -

0.0002165; B= 1.157; C= 755.2; D= 3.061; R2= 0.9986 para la IgA (Figura 12). Todas la

muestras se ensayaron por duplicado.


- 47 -

1 10 100 10000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Lactoferrina (ng/mL)

A 49

2 nm

Figura 11. Representación de la recta de calibrado de lactoferrina

10 100 10000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Ig A (ng/mL)

A 49

2 nm

Figura 12. Representación de la recta de calibrado de IgA

3.3.5. Medida del tamaño de la micela de caseína

Como medio de observación de la micela de caseína en la leche desnatada control y en

las presurizadas de 250 a 900 MPa (capítulo IV) se utilizó la microscopía electrónica de

transmisión siguiendo el método descrito por García-Risco y col. (2003). Para realizar el

procedimiento fue preciso solidificar la leche. Se mezclaron en una placa Petri 5 mL de leche

con 5 mL de agar estéril al 3 % (Scharlau, Barcelona, Spain) agitándose hasta quedar lo más

homogéneo posible. Una vez solidificada la leche, se cortaron rectángulos de 1 cm x 0.5 cm x

10 mm3 aproximadamente y se sumergieron en una solución de glutaraldehido al 2.5 %


- 48 -

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en PBS (4.5 % NaCl y 3.9 % NaH2PO4) a pH 7,

durante 3 horas a 4ºC en oscuridad para la óptima fijación de las proteínas. Posteriormente,

los rectángulos se lavaron 3 veces con PBS, pH 7 dejándose en dicha solución durante toda la

noche a 4ºC. El siguiente paso consistió en sumergir los rectángulos en una solución de

tetróxido de osmio al 1 % (Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA) durante 1 hora,

impregnándose de esta forma con metal de alto peso molecular, incrementando su densidad

electrónica. La eliminación del tetróxido de osmio se realizó mediante 2 lavados con agua

Milli-Q, seguidos de lavados consecutivos con proporciones crecientes de acetona en agua

(40, 60, 70, 90, 95 y 100%) para deshidratar la muestra. Finalmente, las muestras se fijaron en

resina Epoxi Spurr (Taab Laboratory and Microscopy, Aldermaston, United Kingdom)

mediante la adición de mezclas en proporciones crecientes de acetona-resina desde 2:1 hasta

100 % de resina. Tras cada una de estas adiciones se mantuvieron 1 hora a temperatura

ambiente. Los rectángulos se pusieron en un molde de silicona cubriéndose de 100 % de

resina, manteniéndose 72 h a 65ºC, con lo que la resina se solidificó y fue fácilmente

manipulable. Por último, se cortaron láminas de estas muestras con ultramicrotomo y se

tiñeron con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo Reynolds, ambos productos

proporcionados por Taab Laboratory and Microscopy (Aldermaston, United Kingdom). Una

vez teñidas se examinaron por el microscopio electrónico JEOL sem-1010 (JEOL Ltd., Tokio,

Japan) operando a 80 kV.

La medida del tamaño de las micelas de caseína se realizó mediante el programa

Measure IT (Olympus), midiéndose las caseínas incluidas en un rectángulo de 1.61x 2.16 μm

a partir de las fotografías realizadas con 40000 aumentos (2.89 x 3.6 μm). Se midieron

aproximadamente 100 micelas de caseínas para cada tratamiento a partir de varias fotografías.

3.3.6. Determinación del contenido en lactosa y lactulosa

El contenido en lactosa y lactulosa en las fórmulas infantiles (capítulo 1) se determinó

por cromatografía de gases siguiendo el método descrito por Montilla y col. (2005). Esto

requirió una extracción previa de los carbohidratos con metanol (1:9, v/v, fórmula

infantil/metanol), con objeto de precipitar las proteínas y la grasa que pudieran interferir en

las determinaciones. Tras 1 h de reposo, se recogieron 0.5 mL del sobrenadante, se mezclaron

con 0.5 mL de β-fenil-glucósido (patrón interno) y se procedió a su secado por rotavapor.


- 49 -

Posteriormente, se realizó la derivatización de los carbohidratos, añadiendo 0.1 mL de DMF,

con reposo de 1 h a 65ºC, y 0.1 mL de N-trimetilsililimidazol (TMSI, Sigma-Aldrich),

dejándolo reaccionar 30 min a 65ºC. Finalmente, la reacción se interrumpió por frío y adición

de 0.1 mL de hexano y 0.2 mL de agua y 1 μL de la fracción orgánica se utilizó para su

análisis por cromatografía de gases. Para ello, se utilizó un cromatógrafo HP 6890 equipado

con un detector de ionización de llama (FID) y con una columna de sílice fundida recubierta

con metilfenilsilicona (OV17) de 25 m, 0.32 mm de diámetro interno y 0.5 μm de espesor de

película. Se empleó N2 como gas portador con un flujo inicial de 1.8 ml/min y se realizó la

inyección con una relación de split de 1:40. El gradiente de temperaturas usado fue: 280ºC en

el inyector, 300 C en el detector, el horno se mantuvo a 235ºC durante 10 min y, se programó

un gradiente de 20ºC/ min hasta 270ºC que se mantuvo 5 min y de 20ºC/ min hasta 290ºC y

se mantuvo 2 min. Para la cuantificación se empleó el método de calibración interna,

utilizando β-fenil-glucósido como patrón.

3.3.7. Determinación del contenido en furosina

El análisis de la furosina en las fórmulas infantiles (capitulo I) se realizó del siguiente

modo: 2 mL de la fórmula se mezclaron con 6 mL de HCl 10.6 N en tubos pirex (10.2 x 2 cm)

de hidrólisis. A continuación, se pasó una corriente de helio durante 1 min para crear una

atmósfera inerte y, posteriormente, se realizó la hidrólisis a 110ºC durante 23 horas. Una vez

finalizada la hidrólisis, se filtró el hidrolizado a través de cartuchos C18 (Sep-Pak Plus, Waters

Corporation, Milford, Massachussets, USA), activados previamente con 5 ml de metanol y 10

ml de agua milli-Q. Por último, se pasaron 3 ml de HCl 3 N a través del cartucho C18 para

eluir la furosina retenida en el cartucho.

La determinación cuantitativa de la furosina se realizó por RP-HPLC empleando una

columna C8 específica para el análisis de furosina (Alltech, Lokeren, Bélgica) (250 mm x 4.6

mm d.i) (Resmini y col., 1990). El equipo utilizado estaba provisto de una bomba binaria

modelo 250 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Inc, Waltham, Massachussets, USA),

un inyector manual Rheodyne (modelo 9125), un horno (Kariba Instruments, Cardiff, USA)

para termostatizar la columna, un detector UV (LDC Analytical, SM 4000, Riviera Beach,

FL, USA) y una interfase modelo 406 (Beckman). La adquisición y procesamiento de los

datos se realizó utilizando el programa System Gold versión 711 (Beckman Instruments). Las


- 50 -

condiciones cromatográficas fueron las siguientes: temperatura de la columna, 35 ºC; flujo,

1.2 mL/ min; volumen de inyección, 50 μl; fase móvil, eluyente A: 0.4% ácido acético grado

HPLC (Sharlau Chemie, Barcelona, España) en agua milli-Q (v/v), eluyente B: 0.3% cloruro

potásico en el eluyente A (p/v). La elución se realizó en gradiente lineal tal y como se muestra

en la Tabla 3 y su detección se realizó midiendo la absorbancia a 280 nm.

El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón externo utilizando

disoluciones de furosina patrón (Neosystem Laboratories, Strasbourg, Francia) entre 0.2 y

0.8 mg/L. Los datos se expresaron como mg de furosina/ 100 mg de proteína.

Tabla 3. Gradiente lineal empleado en la determinación de la furosina

Tiempo (min) Eluyente A (%) Eluyente B (%)

0 100 0 12.5 100 0 19.5 50 50

2 50 50 24 100 0 32 100 0

3.4. Análisis estadístico

Los resultados obtenidos en cada estudio, procedentes de dos experimentos

independientes, se expresaron como la media ± la desviación standard o el 95% del intervalo

de confianza y se analizaron mediante un análisis de la varianza de 1 ó 2 vías (ANOVA)

utilizando el test de la menor diferencia significativa (LSD). El análisis de 2 vías se utilizó

para determinar la existencia de interacción entre varios factores como por ejemplo el nivel de

presión y el tipo de equipo de alta presión (capítulo 2). El programa estadístico utilizado para

procesar los datos fue el Statgraphic Plus 5.0 para Windows (Statistical Graphics Corporation,

Washington, USA, www.statgraphics.com).

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CAPÍTULO I

Estudio del efecto de las altas presiones sobre las propiedades

nutricionales de las fórmulas infantiles líquidas


- 55 -

I.1. Introducción

La leche materna es el mejor alimento para el recién nacido, sin embargo, no siempre

es posible su administración. Las fórmulas infantiles, diseñadas para reemplazar a esta leche,

están elaboradas principalmente a base de proteínas lácteas bovinas, aunque se pueden

completar hasta con 60 ingredientes, como aceites vegetales, vitaminas o minerales (Naispour

y col., 2006; Thompkinson y Kharb, 2007), en cantidad necesaria para favorecer el

crecimiento y desarrollo normal del niño, además de prevenir enfermedades (Bosch y col.,

2008). La formulación de estas leches infantiles ha ido cambiando y mejorando a lo largo del

tiempo, si bien el objetivo principal de los fabricantes no es obtener una fórmula que imite la

composición exacta de la leche humana, ya que determinados ingredientes son muy difíciles

de obtener, sino conseguir los efectos funcionales que produce la leche materna, por lo que se

les adicionan, por ejemplo, probióticos o prebióticos. Además, algunos autores señalan la

importancia de una ingesta adecuada de proteínas, sobre todo, de la relación entre

caseínas/proteínas de suero, que es de 40/60 y 80/20 en la leche de humana y de vaca,

respectivamente. La ingestión de un mayor contenido de proteínas de suero facilita el proceso

de digestión (Riordan, 1998) e incluso podría favorecer la colonización del intestino por

bacterias probióticas (Balmer y col., 1989).

Por otro lado, tanto las fórmulas lácteas como los ingredientes que se les añaden se

someten a tratamientos térmicos con el fin de que el producto final sea seguro

microbiológicamente y tenga una vida útil mayor. Además, el producto final normalmente

pasa por torres de secado con el fin de obtener leches infantiles en polvo (Floris y col., 2007).

Los tratamientos térmicos aplicados pueden ser relativamente suaves, como la pasteurización,

que consiste en aplicar 71.7ºC durante 5 seg, mientras que el tratamiento UHT, más severo,

consiste en tratar el producto a 135ºC, aproximadamente, durante unos seg e, incluso, pueden

darse tratamientos de esterilización (110ºC, 10-30 min) (Pischetsrieder y Henle, 2012). Estos

tratamientos térmicos pueden causar importantes daños en la composición de las fórmulas,

como agregación de proteínas desnaturalizadas, degradación de vitamina C, peroxidación de

lípidos, etc. Además, tanto en estos procesos, como durante el posterior almacenamiento de

las fórmulas, se produce la reacción de Maillard, la unión de azúcares reductores como

glucosa, lactosa y maltosa al grupo ε-amino de la lisina (Ferrer y col., 2003), que genera

cambios de color, disminuye la calidad de las proteínas y su digestibilidad (Meade y col.,

- 56 -

2005; Dupont y col., 2010). Esta reacción es bastante frecuente en las fórmulas infantiles, ya

que tienen un alto contenido en proteínas y lactosa (Pischetsrider y Henle, 2012).

Por ello, se intentan buscar nuevas técnicas de procesado de alimentos que minimicen

los efectos secundarios producidos por los tratamientos térmicos. Dentro de las técnicas

alternativas, la alta presión hidrostática es la más utilizada industrialmente, ya que permite

obtener alimentos procesados con mejores cualidades sensoriales y nutricionales, sin

embargo, su aplicación industrial en productos lácteos es aún bastante escasa, puesto que

actualmente solo se comercializan calostros y yogures presurizados. Además, no existen

estudios sobre la aplicación de altas presiones a formulas infantiles.Así, el objetivo de este

estudio fue evaluar y comparar el efecto de un tratamiento UHT y de presión a 650 MPa

durante 5 min a 15ºC en una fórmula infantil. Los parámetros utilizados fueron el grado de

desnaturalización de las proteínas lácteas, y en particular de las proteínas minoritarias del

suero, como lactoferrina e inmunoglobulina A, y la formación de lactulosa y furosina.

I.2. Materiales y Métodos

La Figura 13 resume el procedimiento experimental seguido en este trabajo.

I.2.1. Preparación de las muestras y tratamientos aplicados

Para realizar este estudio se utilizó una fórmula infantil preparada por Ordesa S.A,

siguiendo el procedimiento habitual excepto que no se le aplicó el último tratamiento térmico,

ni se atomizó. Esta fórmula se preparó a partir de leche desnatada y pasteurizada a baja

temperatura, con adición de proteínas de suero. Tras su preparación, la fórmula se dividió en 3

alícuotas. Una se dejó en refrigeración, ya que se utilizó como control, otra se calentó a 142-

146ºC durante 4.7 seg (tratamiento UHT) y, finalmente, la última alícuota se sometió a un

tratamiento de presión a 650 MPa durante 5 min a 15ºC. En este último caso, se utilizó un

equipo de alta presión a escala industrial Wave 6000/120 (NC Hyperbaric, Burgos, España),

con capacidad para 120 L. Este equipo usa agua como fluido transmisor de la presión y tiene

3 bombas para generar la presión hidráulicamente, la cual sube a una velocidad de 3.04 MPa/

seg y se libera en 1.5 seg.

Las fórmulas se atemperaron a 37ºC durante 30 min, se centrifugaron a 3000 x g a 20

ºC durante 30 min y se filtraron por lana de vidrio con el fin de desnatarlas.


- 57 -

Figura 13. Esquema de la preparación, tratamientos térmicos y con alta presión, fraccionamiento y

análisis de las muestras.

- 58 -

I.3. Resultados

I.3.1. Efecto de los tratamientos UHT y con alta presión en las proteínas mayoritarias de

la leche

La Figura 14A, muestra el electroforegrama (EC) de la fórmula infantil control y de

una leche humana cuyas proteínas se han identificado de acuerdo con Manso y col. (2007) (a

y b respectivamente). El perfil electroforético de la fórmula se asemejó más al de una leche de

vaca (Figura 14B), aunque con una mayor relación de proteína de suero a caseína, más

próxima a la de la leche de mujer. En la fórmula, destaca, en la zona de las proteínas de suero,

la aparición de varios picos adyacentes a cada pico principal. Éstos se atribuyeron a distintos

estados de glicosilación de las seroproteínas debido a la reacción de Maillard con la lactosa

presente en la leche. Los tiempos de migración mayores que presentan las formas lactosiladas

de las proteínas de suero se deben a que la unión covalente de la lactosa a la lisina reduce la

carga neta positiva a pH ácido y aumenta el peso molecular (Recio y col., 2001). El hecho de

que aparezcan picos correspondientes a varias formas glicosiladas de cada proteína

posiblemente se deba a la existencia de proteínas con diferentes grados de lactosilación.

La Tabla 4 muestra el contenido en proteína de las fórmulas infantiles, de los

sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) y de las fracciones solubles a pH 4.6, así como el

nitrógeno no proteico (NNP, soluble en TCA al 4%). La concentración de proteína soluble en

los SU fue similar en todas las fórmulas estudiadas, pero el contenido en proteína soluble a

pH 4.6 disminuyó en el orden: fórmula control> fórmula presurizada> fórmula UHT. El

NNP disminuyó en, aproximadamente, un 15% en las fórmulas UHT y presurizada, respecto a

la fórmula control.

Resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio (Manso y col, 2007) han puesto

de manifiesto que el contenido medio en proteína de la leche humana es de aproximadamente

un 0.94%, lo que supone menos de un 30% del contenido de la leche bovina y un 60% del de

la fórmula analizada en este estudio. Además, a lo largo de la lactación tiene lugar una

progresiva disminución, de una media en torno al 1.46% al final de la primera semana, hasta

un 0.66% a la semana 18. Por otra parte, la relación de caseínas a proteínas de suero

recomendada para la elaboración de fórmulas infantiles es 40:60, mientras que, en la fórmula,


- 59 -

considerando como proteínas de suero sólo a las solubles a pH 4.6, la relación sube a 60:40,

aproximadamente.

Figura 14. Electroforegramas de fórmula infantil control (a) y de leche humana (b) (A) y leche

cruda de vaca (B).

Tiempo de migración (min)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0

0.01

0.02

10 15 20 25 30 35 40 45

A21

4nm

a

b

β-Lg

αs2

αs1

αs1

9P

βA2

βA1

βBκ

α-La

LZLf

α-La

αs1

β0P+κβ1P

β2Pβ3P

β5Pβ4P

βA2

0.05

0.10

0.15

10 15 20 25 30 35 40

α-La

β-Lg

A21

4nm


αs2

αs1

αs1

9P

βA1

βB

κ

0

A

BTiempo de migración (min)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0

0.01

0.02

10 15 20 25 30 35 40 45

A21

4nm

a

b

β-Lg

αs2

αs1

αs1

9P

βA2

βA1

βBκ

α-La

LZLf

α-La

αs1

β0P+κβ1P

β2Pβ3P

β5Pβ4P

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0

0.01

0.02

10 15 20 25 30 35 40 45

A21

4nm

a

b

β-Lg

αs2

αs1

αs1

9P

βA2

βA1

βBκ

α-La

LZLf

α-La

αs1

β0P+κβ1P

β2Pβ3P

β5Pβ4P

βA2

0.05

0.10

0.15

10 15 20 25 30 35 40

α-La

β-Lg

A21

4nm


αs2

αs1

αs1

9P

βA1

βB

κ

0

βA2

0.05

0.10

0.15

10 15 20 25 30 35 4010 15 20 25 30 35 40

α-La

β-Lg

A21

4nm


αs2

αs1

αs1

9P

βA1

βB

κ

0

A

B

- 60 -

Tabla 4. Contenido en proteína total, proteína soluble en los sobrenadantes de ultracentrifugación

(SU) y a pH 4.6 (4.6), y nitrógeno no proteico (NNP) de las fórmulas infantiles control, UHT y

presurizada a 650 MPa durante 5 min (%, p/v).

Proteína (%) Tratamiento

Total SU 4.6

NNP

(%)

Control 1.60±0.01 1.04a±0.01 0.66c±0.00 0.05b±0.00

UHT 0.91a±0.01 0.44a±0.00 0.04a±0.00

Presión (650 MPa) 0.99a±0.09 0.54b±0.00 0.04a±0.00 a-d Diferentes superíndices, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tratamiento.

Los análisis mediante PAGE-SDS y EC de estas fracciones (Figuras 15, 16 y 17)

complementaron los resultados anteriores. Como muestra la Figura 15, los sobrenadantes de

ultracentrifugación presentaron, en los tres casos, bandas correspondientes a las principales

caseínas (αS2-, αS1-, β- y κ-) y, tanto en la fórmula presurizada (calle 5) como en la control

(calle 3), bandas de proteínas minoritarias: Lf, BSA e inmunoglobulina, que, probablemente,

se desnaturalizaron parcialmente tras el tratamiento UHT (calle 4). En las fracciones solubles

a pH 4.6 (calles 6, 7, 8) se observó una disminución de la β-Lg y de la α-La solubles en las

fórmulas procesadas (UHT y alta presión) pero, sobre todo, en la fórmula UHT.

Figura 15. PAGE-SDS de las fórmulas infantiles. 1: Marcador de pesos moleculares; 2: fórmula de

partida (control); 3 a 5: sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) de las fórmulas control, UHT y

presurizada; 6 a 8: fracciones solubles a pH 4.6 de las fórmulas control, UHT y presurizada.

1 2 3 4 5 6 7 8

β-CNα-Laβ-Lg

αS2-CN

κ-CN

αS1-CN

LfBSAIg

SU 4.6

UH

TPr

esió

n

Con

trol

UH

TPr

esió

n

Con

trol

1 2 3 4 5 6 7 8

β-CNα-Laβ-Lg

αS2-CN

κ-CN

αS1-CN

LfBSAIg

SU 4.6

UH

TPr

esió

n

Con

trol

UH

TPr

esió

n

Con

trol


- 61 -

Se observó que el tratamiento a 650 MPa de la formula infantil no indujo la

solubilización de caseína micelar, siendo los niveles de caseínas no sedimentables similares

en la fórmula control y en la presurizada, mientras que el tratamiento UHT disminuyó los

niveles de caseína soluble (Figura 16).

Figura 16. Electroforegramas de la fórmula infantil control (a), de los sobrenadantes de

ultracentrifugación (SU) de la misma fórmula (b), y tratada mediante UHT (c) y alta presión (650

MPa, 5 min) (d). 1: α-La; 2: β-Lg; 3:αs2-CN; 4: αs1-CN; 5: αs1-CN 9P; 6: κ-CN; 7: βB-CN; 8:βA1-

CN; 9: βA2-CN.

En el caso de las fracciones solubles a pH 4.6, la modificación en la forma y área de

los picos debida a la glicosilación impidió la correcta cuantificación de las proteínas. Sin

embargo, los electroforegramas mostrados en la Figura 17 indican claramente que ambos

tratamientos, UHT y presión, produjeron una gran desnaturalización de las proteínas

mayoritarias del suero, especialmente en el caso de la fórmula UHT, como ya apuntaban los

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0

0.01

0

0.01

10 15 20 25 30 35 40

0

0.01


A21

4 nm

a

b

c

d

2

3

4

5

9

8

76

1

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0

0.01

0

0.01

10 15 20 25 30 35 40

0

0.01


A21

4 nm

a

b

c

d

a

b

c

d

2

3

4

5

9

8

76

12

3

4

5

9

8

76

1

- 62 -

análisis mediante PAGE-SDS (Figura 15). La comparación de las Figuras 16 y 17 también

reveló que, tanto en la formula UHT como en la presurizada, una importante proporción de

las proteínas desnaturalizadas permaneció soluble en los sobrenadantes de ultracentrifugación.

Figura 17. Electroforegramas la fórmula infantil control (a) y de la fracción soluble a pH 4.6 de la

misma fórmula (b) y tratada mediante UHT (c) y alta presión (650 MPa, 5 min) (d).

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

a

0

0.01

0.02 b

0

0.01

0.02 c

0

0.01

0.02

10 15 20 25 30 35 40

d


A21

4nm

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

a

0

0.01

0.02 b

0

0.01

0.02 c

0

0.01

0.02

10 15 20 25 30 35 40

d


A21

4nm


- 63 -

I.3.2. Efecto de los tratamientos UHT y con alta presión en las proteínas minoritarias del

suero

El contenido en Lf de la fórmula infantil control detectado por ELISA fue de 0.75

mg/100 g de proteína, similar al de la fórmula tratada por presión, con 0.66 mg/100 g de

proteína. Por otro lado, no pudo detectarse Lf por ELISA en la fórmula UHT, a pesar de que

el análisis por PAGE-SDS de las fórmulas completas mostró la presencia de una banda

correspondiente a Lf en las 3 muestras estudiadas (control, presurizada y UHT), como se

muestra en la Figura 18.

1 2 3 4 5 6 7 8

β-CN

α−Laβ-Lgκ-CN

LFBSAIG

αs2-CNαs1-CN

Figura 18. PAGE-SDS de las fórmulas infantiles. 1: Marcador de pesos moleculares; 2: BSA; 3:

Lf; 4: Suero bovino enriquecido en Ig; 5: Fórmula de partida; 6: Fórmula presurizada a 650 MPa, 5

min; 7: Fórmula sometida a tratamiento UHT; 8: Leche cruda de vaca.

Es posible que el tratamiento UHT produjera una desnaturalización importante en la

Lf y, aun observándose la banda correspondiente mediante PAGE-SDS, a lo que podría

contribuir la presencia del detergente y de β-mercaptoetanol en el tampón de la muestra, el

anticuerpo no reconociera los sitios de unión. Los resultados obtenidos sugieren que el

tratamiento con alta presión no cambió su estructura, o por lo menos los sitios de unión con el

anticuerpo, siendo su unión igual de eficaz que en la fórmula sin tratar.

El contenido de IgA observado en las fórmulas infantiles fue de 22.32 y 116.98 ng/mL

en las fórmulas control y presurizada respectivamente. No se pudo detectar IgA en la fórmula

infantil UHT con el método utilizado (Figura 19), al igual que sucedió en el caso de la Lf, lo

que probablemente se debió a la desnaturalización de la proteína o a la alteración de los

puntos de unión con el anticuerpo.

- 64 -

Aunque hay una gran variabilidad en los datos aportados por distintos autores, en

leche humana, la Lf supone aproximadamente el 10-25% y la IgA el 6-16% de la proteína

total (Manso y col., 2007), lo que supone valores muy superiores a los encontrados para la

fórmula en este estudio.

Presión UHTControl

Tratamiento

0

50

100

150

IgA

(ng/

mL

)

a

b

Figura 19. Contenido en IgA de la fórmula control, presurizada a 650 MPa, 5 min y UHT.

Diferentes letras indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tratamiento.

I.3.3. Efecto del tratamiento UHT y de presión en el avance de la reacción de Maillard y

la isomerización de la lactosa

Para evaluar el daño térmico producido por los tratamientos estudiados se estudió el

contenido de lactulosa y furosina. El desarrollo de la reacción de Maillard fue estudiado

mediante la cuantificación de furosina en las fórmulas. El tratamiento con alta presión no

produjo variación del contenido en furosina, pero el tratamiento UHT aumentó éste

significativamente, como se puede observar en la Figura 20.


- 65 -

0

50

100

150

200

Control UHT Presión

Tratamiento

Furo

sina

(mg/

100g

pro

teín

a)a a

b

Figura 20. Contenido en furosina de las fórmulas infantiles control, UHT y presurizada a 650 MPa

durante 5 min. Diferentes letras indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el

tratamiento.

Como era de esperar, el tratamiento UHT favoreció la isomerización de la lactosa y la

formación de lactulosa (Tabla 5). El contenido en lactulosa en la fórmula tratada UHT fue alto

e indicativo de un calentamiento muy intenso. En cambio, el tratamiento con alta presión no

produjo isomerización de la lactosa. El contenido en lactosa en las fórmulas no varió

significativamente debido a los tratamientos aplicados.

Tabla 5. Contenido en lactosa (La) y lactulosa (Lu) en las fórmulas infantiles.

Tratamiento La (g/L) Lu (mg/L)

Control 119.47a±10.13 27.13a±2.13

UHT 103.83a±9.39 616.53b±44.07

Presión (650 MPa) 109.01a±5.33 36.19a±3.41

a-b Diferentes superíndices, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tratamiento.

- 66 -

I.4 Discusión

El uso de un tratamiento UHT para la estabilización final de una formula infantil

basada en distintos ingredientes lácteos produjo una modificación mucho más acusada en sus

componentes proteicos mayoritarios y minoritarios que un tratamiento con alta presión, lo que

puede afectar negativamente a sus propiedades nutricionales.

Se utilizaron los niveles de lactulosa y furosina como índices de daño térmico. La

furosina, indicador de las primeras etapas de la reacción de Maillard, es un aminoácido que se

forma durante la hidrólisis ácida de los compuestos de Amadori, fructosil-lisina, lactulosil-

lisina y maltulosil-lisina (Erbersdobler y Hupe, 1991). La reacción de Maillard se ve

promovida por la temperatura en mayor medida en condiciones de aw intermedia (entre 0.5 y

0.8), que concentra a los reactivos y disminuye su movilidad (Ames, 1990). Es de destacar

que el contenido en furosina de la fórmula de partida fue relativamente elevado (Figura 20), lo

que, de acuerdo con el contenido en proteínas de suero solubles a pH 4.6 (6.6 g/L -Tabla 4-

frente a unos 8 g/L, aproximadamente, de una leche cruda) y su modificación por

lactosilación, tal y como se observa en el análisis por electroforesis capilar (Figura 14),

indicaría que se habría empleado suero y/o leche en polvo en la fabricación de la fórmula

control, puesto que la deshidratación que se produce durante los procesos de atomización, así

como el almacenamiento posterior de los productos en polvo favorecen la reacción de

Maillard. El tratamiento UHT elevó significativamente el contenido en furosina hasta niveles

similares a los observados por otros autores (Guerra-Hernández y col., 2002; Ferrer y col.,

2003; Morales y col., 2004). El contenido en furosina varía dependiendo del tratamiento

térmico utilizado, la concentración azúcares reductores y el tiempo y las condiciones de

almacenamiento, lo que hace que exista un amplio rango en las medidas. Por su parte, el

tratamiento con alta presión no produjo un aumento del contenido en furosina, como se puede

observar en la Figura 20, por lo que no modificó la disponibilidad de la lisina en la fórmula.

La lactulosa es un disacárido producido por la isomerización de la lactosa en

disoluciones alcalinas y durante el tratamiento térmico de la leche, que se forma sobre todo

durante los tratamientos de esterilización y UHT de productos líquidos (Guerra-Hernández,

2002). Este disacárido no está presente en la leche cruda por lo que se le considera un buen

indicador para evaluar el daño térmico (López-Fandiño y Olano, 1999). El contenido en la

fórmula control (aproximadamente 27 mg/L, Tabla 5) se encontró dentro de los márgenes


- 67 -

descritos para leche en polvo comercial (en torno a 23-78 mg/L de producto reconstituido,

Corzo y col., 1994), corroborando el uso de productos en polvo para su elaboración. Como

era de esperar, el tratamiento UHT favoreció la isomerización de la lactosa y la formación de

lactulosa (Tabla 5). El contenido en lactulosa en la fórmula UHT fue indicativo de un

calentamiento muy intenso, bastante superior a los encontrados en la bibliografía para

fórmulas comerciales reconstituidas elaboradas a base de leche o de leche con proteínas de

suero, (29-108 mg/L y 97-132 mg/L, respectivamente, Pereyra-Gonzáles y col., 2003) y más

típico de leche estéril (la Federación Internacional de Lechería propuso en 1992 el límite de

600 mg/L de lactulosa para distinguir la leche esterilizada de la leche UHT).

El tratamiento UHT condujo a una notable desnaturalización de las seroproteínas (el

nitrógeno soluble a pH 4.6 disminuyó en torno al 33% respecto a la fórmula control). En la

fórmula infantil tratada con presión la desnaturalización fue menor (con una disminución de,

aproximadamente, un 18%) (Tabla 4, Figura 5). Los tratamientos térmicos y los tratamientos

con alta presión alteran la estructura de las seroproteínas lácteas. Así, el desplegamiento

producido en la β-Lg tanto por temperatura como por presión produce la exposición del grupo

sulfhidrilo libre, favoreciendo que reaccione inter e intramolecularmente con otros grupos

sulfhidrilo o puentes disulfuro de proteínas como la propia β-Lg, la κ-CN y la αs2-CN,

formando de esta manera agregados, que pueden ser solubles o insolubles (Patel y col., 2006).

En tratamientos térmicos de larga duración (30 min) aplicados a leche reconstituida, también

se ha observado un aumento del contenido de la β-Lg y α-La desnaturalizadas a partir de los

70ºC, aunque la desnaturalización no es completa hasta los 100ºC, aproximadamente (Anema,

2008a). Por otra parte, debe tenerse en cuenta que la glicosilación aumenta la termoestabilidad

de las proteínas de suero y conduce a una menor oligomerización de éstas como consecuencia

de su desnaturalización (Mulsow y col., 2009). En el caso de los tratamientos con presión, en

leche reconstituida se ha observado que la α-La es más resistente a la desnaturalización por

presión que la β-Lg, comenzando a desnaturalizarse a presiones ≤500 MPa (30 min) mientras

que la β-Lg lo hace a presiones ≥200 MPa. A 600 MPa el contenido de β-Lg y α-La

desnaturalizadas es de en torno al 80 y 20%, respectivamente (Anema, 2008a).

El estudio realizado por EC mostró que la solubilización micelar en la fórmula

presurizada (Figura 16) fue diferente a la de una leche cruda presurizada. López-Fandiño y

col. (1998) observaron que la presión induce la liberación de todas las caseínas a la fracción

- 68 -

soluble, debido a la disgregación micelar que produce, siendo el orden de solubilización β-

CN> κ-CN> αs1-CN> αs0-CN> αs2-CN. Sin embargo, en la fórmula presurizada no se observó

solubilización de caseínas por el tratamiento aplicado. Este hecho podría deberse a que se

sometió al tratamiento con alta presión a una fórmula elaborada a partir de productos en polvo

reconstituidos, en la que, como se mencionó en el párrafo anterior ya había proteínas de suero

desnaturalizadas (Figura 17). Kelly y col. (2002) indicaron que la desnaturalización previa, ya

sea por calor o por presión de las proteínas de suero y su consecuente interacción con la κ-CN

podría proteger a la micela de disgregarse por la presión. En el caso de la leche cruda,

probablemente, las proteínas de suero se desnaturalizan bajo la alta presión, interaccionando

con fragmentos micelares, lo que podría limitar su reasociación al liberarse la presión. En el

caso de las fórmulas, las micelas podrían tener ya proteínas desnaturalizadas unidas a su

superficie debido a un tratamiento térmico previo, lo que facilitaría su reagregación (López-

Fandiño, 2006a).

En la actualidad hay una gran tendencia en suplementar a las fórmulas infantiles con

Lf, ya que esta proteína presenta actividad antibacterina, antiviral, y antifúngica y está

implicada en la respuesta inmune y en la regulación y consumo del hierro intestinal (Jenssen y

Hancock, 2009; Tomita y col., 2009). Además, la Lf está en una concentración más elevada

en la leche humana que en la leche de vaca (Fox y McSweeney, 1998). Junto a la IgA,

representa entre el 30 y 40% del contenido en proteínas de la leche humana (Chierici y Vigi,

1994). Indyk y Filonzi (2005) estimaron un contenido de 0.4 mg/100g y 14.8 mg/100g para

formulas no suplementadas y suplementadas con Lf usando el mismo sistema de detección,

aunque su contenido puede variar dependiendo del método de análisis utilizado (Indyk y

Filonzi, 2005) y de la composición de la fórmula. La Lf se desnaturaliza a temperaturas de

pasteurización (Paulsson y col., 1993). Scharcz y col. (2008) aportaron espectros de

discroismo circular a 70ºC que muestran que la estructura secundaria de la Lf cambia drástica

e irreversiblemente cuando la temperatura aumenta gradualmente. Sin embargo, en una

simulación de una pasteurización (72ºC durante 20 seg) no observaron ningún efecto en la

estructura secundaria de la proteína, lo que indica que, si la temperatura, se alcanza en un

breve periodo de tiempo, la Lf no pasa por el mismo estado de desplegamiento observado

cuando el aumento de la temperatura es gradual. Además, se ha observado que la forma apo

de esta proteína es más sensible al calor que la forma holo y, a pH 7, la apo LF se

desnaturaliza entre 60 y 65ºC mientras que la holo forma permanece nativa hasta los 80ºC


- 69 -

(Sreedhara y col., 2010). Por otra parte, cuando la leche se calienta, la Lf establece

interacciones intermoleculares vía puentes disulfuro con las caseínas y otras proteínas séricas

(Brisson y col., 2007), lo que explicaría también la menor detección de Lf por anticuerpos en

leches tratadas por UHT a pesar de que la banda correspondiente a la Lf se resolubilice en el

tampón de la muestra usado en PAGE-SDS.

La IgA es otra proteína importante en la composición de las fórmulas, porque

interviene en los mecanismos de defensa gastrointestinal (Bakker-Zierikzee y col., 2006).

Ford y col. (1977) observaron una reducción del contenido de IgA en leche humana

pasteurizada (56ºC, 30 min) del 10%, pasando al 80% en tratamientos con temperaturas más

elevadas (80ºC, 15 min). Además, Viazis y col. (2007) observaron que la inmunoreactividad y

la concentración de IgA detectada en leche humana presurizada (400 MPa durante 30, 60, 90

y 120 min) fue significativamente mayor (P< 0.05) que en la misma leche pasteurizada. Sin

embargo, estos autores encontraron una menor concentración de IgA en la leche presurizada

que en la leche sin tratar, a diferencia de nuestro estudio, donde la fórmula presurizada

presentó un llamativo aumento del contenido de IgA. Esta diferencia podría deberse al hecho

de que el tiempo de presurización utilizado en nuestro caso fue menor, de 5 min frente a 30

min, lo que generaría menores cambios estructurales, o incluso podría producir un

desplegamiento que facilitase la unión al anticuerpo.

I.5. Conclusiones

Los resultados obtenidos sugieren que la aplicación de un tratamiento con alta presión

a 650 MPa durante 5 min a fórmulas infantiles, sustituyendo el tratamiento térmico final al

que se ven sometidas durante su fabricación, no produce isomerización de la lactosa, ni

avance de la reacción de Maillard y conduce a una menor desnaturalización de las proteínas

de suero, por lo que mejora la calidad nutritiva de las fórmulas. Además, la estructura de las

proteínas minoritarias del suero, lactoferrina e inmunoglobulina A secretora, se ve menos

afectada por el tratamiento con presión que por el tratamiento UHT, medido por su unión a

anticuerpos, por lo que se podrían obtener fórmulas infantiles con mejores actividades

biológicas para los recién nacidos. a pesar de producir menores cambios químicos, la

efectividad de los tratamientos con alta presión está condicionada a la comprobación de que

conducen a productos de aceptable calidad microbiológica.

.

CAPÍTULO II

Tratamientos con alta presión en equipos a escala industrial y piloto.

Efecto de las condiciones del tratamiento en la distribución proteica

en diferentes fracciones lácteas

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO II

- 73 -

II.1. Introducción

La creciente demanda de los consumidores por productos que presenten nuevas o

mejores características sensoriales y nutricionales, junto con una mayor durabilidad, ha retado

a la industria alimentaria a desarrollar técnicas capaces de mantener los alimentos seguros por

más tiempo y de mejorar sus propiedades (Norton y Sun, 2008). En concreto, el procesado

con alta presión, que ha experimentado un enorme crecimiento en los últimos 20 años

llegando a ser una realidad industrial, puede facilitar la elaboración de productos similares a

los alimentos frescos con una mayor vida útil, además de proporcionar nuevos productos con

mejores cualidades, principalmente a través de cambios en la conformación de las proteínas

alimentarias que modifican sus propiedades funcionales (López-Fandiño, 2006b).

La leche fue el primer alimento en someterse a un tratamiento con alta presión (Hite,

1899), sin embargo, hasta el momento, hay solamente unos pocos productos lácteos

presurizados comerciales, como yogurt o calostro (Kelly y Zeece, 2009). Las aplicaciones

industriales de las altas presiones están orientadas principalmente a mejorar la seguridad y la

estabilidad, mientras que otras aplicaciones encaminadas a inducir cambios estructurales que

cambien la funcionalidad de las proteínas lácteas, se han explotado más escasamente. Los

tratamientos con alta presión producen importantes modificaciones en las proteínas y en el

balance mineral de la leche. Como resultado, se produce disgregación y reagregación de las

micelas de caseína, liberación de caseínas solubles y desnaturalización de las proteínas de

suero (Huppertz y col., 2006a; López-Fandiño, 2006a). Como consecuencia de la ruptura

micelar, se forman nuevas estructuras proteicas difíciles de lograr mediante el uso de métodos

convencionales de procesado, las cuales influyen en las propiedades de coagulación

enzimática, favorecen la coagulación ácida y pueden actuar como unidades funcionales para

la encapsulación y liberación de nutrientes en productos lácteos (Orlien y col., 2010). En

cualquier caso, la intensidad, la duración y la temperatura de los tratamientos, así como, del

pH y de la concentración de proteína influyen en los cambios originados por las altas

presiones (Law y col., 1998; López-Fandiño y col., 1998; Arias y col., 2000; Huppertz y col.,

2004b; Anema y col., 2005a; Huppertz y De Kruif, 2006; Anema, 2008b; Orlien y col., 2010).

Actualmente, el efecto de la mayoría de estas variables se conoce bien, pero rara vez se ha

estudiado la influencia del tipo de equipo de alta presión (Anema y col., 2005b).

- 74 -

Los equipos de alta presión están formados por una cámara, que es un cilindro lleno de

un fluido transmisor de la presión, generalmente agua potable o una mezcla de agua y aceite;

una o varias bombas generadoras de la presión; un dispositivo de control de la temperatura y

el sistema de control del equipo (Huppertz y col., 2002). Los equipos de procesado con alta

presión presentan diferentes características como el tamaño (existiendo a escala de

laboratorio, piloto e industrial), la orientación, vertical u horizontal, etc. Las especificaciones

del equipo indican la presión máxima de la cámara, su diámetro interno, la altura o longitud

interior de la cámara, la velocidad de subida y bajada de la presión, el fluido transmisor de la

presión y el rango de temperatura. En la industria alimentaria, se utilizan cámaras de

presurización con cientos de litros de volumen, que trabajan normalmente en el intervalo de

250 a 600 MPa, que se mantienen entre 1-8 minutos con tiempos rápidos de subida y bajada

de la presión, puesto que la duración del ciclo o la velocidad de producción son factores

importantes a controlar. También hay equipos a escala de laboratorio, capaces de alcanzar

presiones de hasta 1400 MPa, con diseños específicos o versátiles (Bermúdez-Aguirre y

Barbosa-Cánovas, 2011).

El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la influencia del tipo de equipo de alta

presión y de la velocidad de despresurización en la distribución de las proteínas lácteas entre

las fases coloidal y soluble de la leche y en la desnaturalización de las proteínas de suero, en

tratamientos de presión entre 250 y 650 MPa. Además, también se presurizaron sobrenadantes

de ultracentrifugación obtenidos de leche desnatada con fines comparativos.

II.2. Materiales y Métodos


II.2.1. Preparación de las muestras

Para llevar a cabo los experimentos de presurización, se utilizó tanto leche desnatada

de vaca como sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) obtenidos a partir de ésta. Tras la

recogida de la leche cruda en una granja local, se procedió a su desnatado, calentándola a

37ºC durante 30 min y centrifugándola a 3000 x g, 20ºC durante 30 min. Finalmente, el

sobrenadante se filtró por lana de vidrio, para así retener los restos de grasa. Por otro lado, los

SU se obtuvieron ultracentrifugando alícuotas de leche desnatada a 100000 x g, 20ºC durante


- 75 -

1 h en una ultracentrífuga Beckman L70 (Beckman Instruments Inc., San Ramón, CA) usando

el rotor 70 Ti (Figura 1). Estos sobrenadantes se guardaron en refrigeración a 4ºC por un

máximo de 18 h antes de los tratamientos con alta presión.

II.2.2. Tratamientos de alta presión

Las muestras (leche desnatada y SU), atemperadas a 15ºC, se presurizaron a 250, 350,

450, 550 y 650 MPa en un equipo industrial y en un equipo piloto (Figura 1). El equipo

industrial estaba formado por una cámara de presurización con capacidad de 120 L, con agua

como fluido transmisor de la presión y 3 bombas para generar la presión hidráulicamente

(Wave 6000/120, NC Hyperbaric, Burgos, España). El equipo piloto utilizado (modelo TE

9000, Thiot Ingenierie, NC Hyperbaric, Bretenoux, France-Burgos, España) tenía una cámara

de presurización de 2 L de capacidad, recubierta por una camisa de agua capaz de regular la

temperatura (5-90ºC), y una bomba que genera la presión mecánicamente. En este caso, el

fluido transmisor de presión fue aceite de silicona. A diferencia del industrial, el equipo piloto

permitió ajustar el tiempo de subida y bajada de la presión.

La presión aumentó a una velocidad de 3.04 y 6 MPa/seg en el industrial y en el piloto

respectivamente, se mantuvo durante 5 min y se liberó en 1.5 seg en el equipo industrial

(tratamientos IR – equipo industrial con despresurización rápida-) y en 30 seg o 5 min en el

equipo piloto (PR- equipo piloto con despresurización rápida y PL- equipo piloto con

despresurización lenta, respectivamente).

La temperatura del fluido transmisor de la presión se registró durante los tratamientos.

La temperatura inicial fue 14 ± 2ºC, la cual aumentó durante la subida de la presión. Así,

durante la fase de mantenimiento de la presión, la temperatura fue de 25.9 y 39.5ºC a 350

MPa o de 32.5 y 46.9ºC a 650 MPa, en los equipos industrial y piloto, respectivamente.

Se realizaron 2 experimentos independientes por cada tratamiento de alta presión en el

mismo día. Tras los tratamientos de alta presión, las muestras se almacenaron toda la noche a

4ºC antes de hacer los fraccionamientos y los análisis.

Figura 21. Esquema de la preparación, tratamientos con alta presión, fraccionamiento y análisis de las muestras

Leche cruda de vaca

Lechedesnatada

NC HyperbaricWave 6000/120

Subida de presión3.04 MPa/seg

Subida de presión6 MPa/seg

Thiot EngineerTE 9000

SobrenadanteUltracentrif.

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada




Ultracentrifugación100000 x g, 20ºC, 1h

Lechedesnatada

Lechedesnatada


Lechedesnatada


LechepresurizadaI. 250 MPa





Sobr. UCpresurizadoI. 250 MPa




Sobr. UCpresurizadoI.650 MPa

Lechepresurizada

PR. 250 MPa

Lechepresurizada

PR. 350 MPa

Lechepresurizada

PR. 450 MPa

Lechepresurizada

PR. 550 MPa

Lechepresurizada

PR. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 550 MPa

Sobr.UCpresurizadoPR.650 MPa

Lechepresurizada

PL. 250 MPa

Lechepresurizada

PL. 350 MPa

Lechepresurizada

PL. 450 MPa

Lechepresurizada

PL. 550 MPa

Lechepresurizada

PL. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 550 MPa

Sobr. UCpresurizadoPL.650 MPa

Lechepresurizada

SobrenadanteUltracentrif.presurizado

SU

SU-P

Fracciones

Precipitacióna pH 4.6


Análisis

Despresurización rápida(R) 30 seg

Despresurización lenta(L) 5 min

Equipo Industrial (I)

Equipo Piloto (P)

Despresurización Instantánea(R) 1.5 seg

4.6Precipitación

a pH 4.6


ELECTROFORESISCAPILAR

NITRÓGENO(KJELDAHL)

PAGE-SDS

15ºC, 5 min

Desnatado y Preparación de las muestras

Tratamiento con alta presión Fraccionamiento Análisis

3000 x g, 20ºC, 30 min

PROTEÍNAS

Aná

lisis

4.6

Leche cruda de vaca

Lechedesnatada

Lechedesnatada

NC HyperbaricWave 6000/120NC HyperbaricWave 6000/120

Subida de presión3.04 MPa/seg

Subida de presión6 MPa/seg



SobrenadanteUltracentrif.SobrenadanteUltracentrif.

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada





Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada



Lechedesnatada

Lechedesnatada










































Lechepresurizada

PR. 250 MPa

Lechepresurizada

PR. 350 MPa

Lechepresurizada

PR. 450 MPa

Lechepresurizada

PR. 550 MPa

Lechepresurizada

PR. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 550 MPa


Lechepresurizada

PR. 250 MPa

Lechepresurizada

PR. 350 MPa

Lechepresurizada

PR. 450 MPa

Lechepresurizada

PR. 550 MPa

Lechepresurizada

PR. 650 MPa

Lechepresurizada

PR. 250 MPa

Lechepresurizada

PR. 250 MPa

Lechepresurizada

PR. 350 MPa

Lechepresurizada

PR. 350 MPa

Lechepresurizada

PR. 450 MPa

Lechepresurizada

PR. 450 MPa

Lechepresurizada

PR. 550 MPa

Lechepresurizada

PR. 550 MPa

Lechepresurizada

PR. 650 MPa

Lechepresurizada

PR. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 550 MPa


Sobr. UCpresurizado

PR. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 550 MPa

Sobr. UCpresurizado

PR. 550 MPa



Lechepresurizada

PL. 250 MPa

Lechepresurizada

PL. 350 MPa

Lechepresurizada

PL. 450 MPa

Lechepresurizada

PL. 550 MPa

Lechepresurizada

PL. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 550 MPa


Lechepresurizada

PL. 250 MPa

Lechepresurizada

PL. 350 MPa

Lechepresurizada

PL. 450 MPa

Lechepresurizada

PL. 550 MPa

Lechepresurizada

PL. 650 MPa

Lechepresurizada

PL. 250 MPa

Lechepresurizada

PL. 250 MPa

Lechepresurizada

PL. 350 MPa

Lechepresurizada

PL. 350 MPa

Lechepresurizada

PL. 450 MPa

Lechepresurizada

PL. 450 MPa

Lechepresurizada

PL. 550 MPa

Lechepresurizada

PL. 550 MPa

Lechepresurizada

PL. 650 MPa

Lechepresurizada

PL. 650 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 550 MPa


Sobr. UCpresurizado

PL. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 250 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 350 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 450 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 550 MPa

Sobr. UCpresurizado

PL. 550 MPa



Lechepresurizada

Lechepresurizada



SU

SU-P

Fracciones



Análisis

Despresurización rápida(R) 30 seg

Despresurización lenta(L) 5 min

Equipo Industrial (I)

Equipo Piloto (P)

Despresurización Instantánea(R) 1.5 seg

4.6Precipitación

a pH 4.6




PAGE-SDS

15ºC, 5 min

Desnatado y Preparación de las muestras

Tratamiento con alta presión Fraccionamiento Análisis

3000 x g, 20ºC, 30 min

PROTEÍNAS

Aná

lisis

4.6


- 77 -

II.3. Resultados

II.3.1. Caseínas no sedimentables y proteínas de suero presentes en la fracción soluble de

leche desnatada tratada con altas presiones

En la Figura 22 se muestra el contenido proteico total de los SU de las muestras de

leche desnatada presurizada. El análisis estadístico reveló que el nivel de presión y el tipo de

equipo (IR, PR y PL) influyeron significativamente (P< 0.01) en la concentración de proteínas

solubles y que existió interacción entre ambos factores.

Los SU de las muestras de leche presurizadas en el equipo piloto (PR y PL) mostraron

mayor contenido en proteína soluble que las tratadas en el equipo industrial (IR) a todos los

niveles de presión estudiados (P< 0.01). Los mayores contenidos en proteínas no

sedimentables se encontraron a 550, 450 y 250 MPa tras los tratamientos IR, PR y PL,

respectivamente.

Figura 22. Contenido proteico (g/L) de los sobrenadantes de ultracentrifugación obtenidos a partir

de leche desnatada control (0.1 MPa) y de leche presurizada a 250, 350, 450, 550 y 650 MPa a 15ºC

durante 5 min, en un equipo industrial (IR) y en un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y

lenta (PL). Las barras representan los intervalos de confianza del 95%.

IR PR PLIR PR PL

Presión (MPa)

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

10

12

14

16

18

20

0.1 250 350 450 550 650

Presión (MPa)

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

10

12

14

16

18

20

0.1 250 350 450 550 650

- 78 -

El estudio de los SU por PAGE-SDS permitió estimar cualitativamente la composición

en proteínas individuales solubles en estas fracciones (Figura 33). Las bandas

correspondientes a las caseínas en los sobrenadantes obtenidos a partir de leche presurizada

(calles 3-7) en ambos equipos presentaron una intensidad mayor de color que el obtenido a

partir de leche sin presurizar (calle 2), lo cual indica que la aplicación de presión hace que sea

mucho mayor la liberación de caseínas a esta fracción. Este hecho corrobora el aumento en el

contenido proteico total de estas muestras. Además, la intensidad de las bandas

correspondientes a las caseínas aumentó ligeramente debido al aumento de la presión en el

equipo industrial y piloto. Sin embargo, no se pudo comparar si este efecto fue similar en los

3 tratamientos IR, PR y PL debido a que la tinción de los geles se realizó en momentos

diferentes y la intensidad del color pudo cambiar.

Figura 23. PAGE-SDS de los sobrenadantes obtenidos por ultracentrifugación de leche presurizada

en un equipo industrial (IR) y en un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL).

Calles: 1: Marcador de pesos moleculares; 2 a 7: tratamiento de 0.1, 250, 350, 450, 550 y

650 MPa.

El análisis de las distintas proteínas individuales se realizó por electroforesis capilar.

La Figura 24 muestra los electroforegramas obtenidos del análisis de los sobrenadantes de

ultracentrifugación por esta técnica. En ellos se puede observar que el tratamiento con el

equipo piloto a todas las presiones estudiadas produjo una mayor solubilización de caseínas

comparado con el equipo industrial (proteínas marcadas como 4-9 en la Figura 24). Además,

si se compara los dos tratamientos realizados en el equipo piloto, se produjo una mayor

solubilización de caseínas con la despresurización lenta (PL) al menos a presiones de 250 y

350 MPa (Figura 24 c y d).

IR PR PL

1 2 3 4 5 6 7

β-CN

α-Laβ-Lgκ-CN

LfBSAIg

αs2-CNαs1-CN

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

IR PR PL

1 2 3 4 5 6 7

β-CNβ-CN

α-Laβ-Lgκ-CN

LfBSAIg

αs2-CNαs1-CN

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Figure 24. Electroforegramas de leche desnatada (a) y sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) de: leche desnatada control (b) y leche presurizada a 250,

350, 450, 550 y 650 MPa (c-g) a 15ºC durante 5 min, en un equipo industrial (IR) y en un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (5 min,

PL). 1: α-La; 2: β-Lg; 3:αs2-CN; 4: αs1-CN; 5: αs1-CN 9P; 6: κ-CN; 7: βB-CN; 8:βA1-CN; 9: βA2-CN.

c

d

e

f

b

10 15 20 25 30 35 40

g


c

d

e

f

10 15 20 25 30 35 40

g

b

a a

10 15 20 25 30 35 40

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

A21

4 nm

PRIR

g

f

e

d

c

b

a

PL

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

c

d

e

f

b

10 15 20 25 30 35 40

g

10 15 20 25 30 35 40

g


cc

dd

ee

ff

10 15 20 25 30 35 40

g

10 15 20 25 30 35 40

g

bb

a a

10 15 20 25 30 35 40

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0.08

0.12

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

0

0.04

A21

4 nm

PRIR

g

f

e

d

c

b

a

PL

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

23

4

5

9

8

61 7

- 80 -

La cuantificación de las proteínas individuales observadas por EC permitió estudiar

con más detalle el efecto de los tratamientos de presión aplicados en la liberación de caseínas

individuales a la fase soluble (Tabla 6). Como ya se había indicado anteriormente, el

tratamiento IR produjo una solubilización significativamente menor de todas las caseínas (P<

0.05) que el tratamiento PR. Los niveles de αS-caseínas solubles (αS1-9P-, αS1- o αS2-CN),

que en la leche control se correspondían con el 12.4-15% del contenido individual de cada

proteína, aumentaron hasta el 17.3-29.6% y 34.1-45.2% después de los tratamientos IR y PR a

250 MPa, respectivamente, mientras que las β-caseínas (βA1-, βA2- o β-CN B) aumentaron

del 10.5-18.4% (control) al 21.8-25.4 (IR) y 35.7-30.3% (PR). A esta presión (250 MPa), la κ-

CN soluble supuso el 28.8 y 50.8% de su contenido en leche después de los tratamientos IR y

PR, respectivamente. A mayores presiones, en términos generales, en el equipo industrial las

caseínas no sedimentables aumentaron ligeramente o se estabilizaron a 350 y 450 MPa,

observándose la máxima solubilización después de los tratamientos a 550 y 650 MPa. Esta

tendencia fue similar en el equipo piloto con despresurización rápida, aunque en este caso, el

contenido de caseínas no sedimentables alcanzó su máximo después de tratamientos de

presión a 450 y 550 MPa.

Las proteínas de suero no sedimentables presentes en los SU, principalmente la β-Lg,

disminuyeron gradualmente con el nivel de presión en ambos equipos (Figura 24 y Tabla 6).

Esto explicaría la reducción del contenido total en proteína soluble observado a las presiones

máximas (principalmente a 550 y 650 MPa después de los tratamientos IR y PR,

respectivamente, Figura 22). Aunque el nivel de β-Lg disminuyó algo más lentamente

después del tratamiento IR que después del PR, las diferencias no fueron significativas

excepto a 350 MPa.


- 81 -

Tabla 6. Proteínas individuales presentes en los sobrenadantes de ultracentrifugación obtenidos a

partir de leche desnatada control (0.1 MPa) y leche presurizada a 250, 350, 450, 550 and 650 MPa, a

15ºC, durante 5 min, en un equipo industrial (IR) y un equipo piloto con despresurización rápida

(PR) (los valores se representan como porcentaje del contenido individual de cada caseína en la

leche cruda desnatada, estimado por EC).

Presión (MPa) Proteínas

Equipo alta

presión 0.1 250 350 450 550 650

SD total

IR A117.7b A116.9b A116.2b B112.8b A109.0ab A94.9a 4.0 α-La

PR A117.7c A107.4b A99.6ab A99.0ab A101.3ab A93.4a 2.9

IR A106.2d A100.8d B91.8c A76.4b A71.1ab A65.48a 2.4 β-Lg

PR A106.2d A93.3c A77.5b A70.3ab A71.3ab A63.6a 2.6

IR A14.4a A17.3a A17.2a A19.8ab A28.4b A29.3b 1.5 αS2-CN

PR A14.4a B34.1b B39.7c B46.2de B50.8e B43.5cd 1.4

IR A12.4a A24.1bc A21.1b A22.7b A27.5c A33.5d 0.8 αS1-CN

PR A12.4a B39.7b B40.5b B42.7b B44.3b B43.6b 1.5

IR A15.0a A29.6c A23.2b A26.2bc A30.3cd A35.0d 2.3 αS1-CN 9P PR A15.0a B45.2b B47.2b B49.1bc B57.4c B46.0bc 2.5

IR A19.0a A28.2bc A24.9b A28.5c A36.4d A39.2d 1.0

κ-CN PR A19.0a B50.8b B51.5b B55.1b B56.3b B55.8b 2.1

IR A18.4a A25.4b A23.6b A23.1b A30.5c A34.2c 1.0

β-CN B PR A18.4a B37.0b B42.1b B42.2b B46.0b A39.3b 2.2

IR A10.5a A21.8b A18.4b A19.6b A27.2c A31.2c 1.0

β A1-CN PR A10.5a B35.7b B37.7b B40.9b B45.2b B46.4b 2.2

IR A13.5a A25.2c A22.6b A22.9b A30.1c A34.9c 1.7

β A2-CN PR A13.5a B39.3b B41.0bc B44.4bc B46.6bc B47.7c 2.0

a-d Diferentes superíndices, a la derecha y en filas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tratamiento de presión. A-B Diferentes superíndices, a la izquierda y en columnas para cada proteína, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el equipo de alta presión. SD total: desviación estándar de los valores obtenidos para cada proteína a todas las presiones.

- 82 -

II.3.2. Desnaturalización de las proteínas del suero en leche desnatada tratada por altas

presiones

Los contenidos proteicos totales de las fracciones solubles a pH 4.6 de la leche

desnatada presurizada se muestran en la Figura 25. En todos los tratamientos, la cantidad de

proteína disminuyó significativamente con el nivel de presión (P< 0.01) debido a la

desnaturalización de las proteínas de suero. Se encontraron diferencias significativas entre

ambos equipos, IR y PR, y el equipo piloto con despresurización lenta, PL, a presiones ≥ 450

MPa. La desnaturalización de proteínas siguió el orden: PL> PR> IR.

Figura 25. Proteína soluble a pH 4.6 (g/L) de leche control (0.1 MPa) y leche presurizada a 250,

350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante 5 min, en un equipo industrial (IR) y un equipo piloto con

despresurización rápida (PR) y lenta (PL). Las barras representan un intervalo de confianza del 95%.

Mediante el análisis de estas fracciones por PAGE-SDS se pudo determinar con mayor

precisión la causa de la disminución del contenido proteico por el aumento de la presión

(Figura 26). En estas fracciones, y como era de esperar, las proteínas predominantes fueron

las del suero. El aumento de la presión de 250 a 650 produjo una progresiva disminución del

contenido de β-Lg soluble (calles 3-7), observado por la disminución de la intensidad de color

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

5

7

Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

8

6

4

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

5

7

Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

8

6

4

IR PR PLIR PR PL


- 83 -

de la banda correspondiente a esta proteína. Lo cual indicó que la proteína se desnaturalizó y

precipitó junto a las caseínas al descender el pH. En el caso de la α-La, la intensidad de la

banda no cambió de forma tan notable, observándose solamente una ligera disminución del

color. Esta proteína fue mucho más resistente a la presión que la β-Lg.

Figura 2.6. PAGE-SDS de las fracciones solubles a pH 4.6 de leche control (0.1 MPa) y leche

presurizada a 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante 5 min, en un equipo industrial (IR) y un

equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL). Calles: 1:Marcador de pesos

moleculares; 2-7: tratamiento de 0.1, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa.

El perfil electroforético de estas fracciones, obtenido por EC, corroboró el hecho de

que la β-Lg fue más sensible a la presión que la α-La, disminuyendo su contenido a medida

que aumentó la presión (Figura 27). Además, en los electroforegramas también fue

claramente visible que el tratamiento IR produjo una menor precipitación de la β-Lg que los

tratamientos PR y PL y la comparación de los dos tratamientos realizados en el equipo piloto

mostró que el contenido de β-Lg fue aún menor cuando se despresurizó de forma lenta (5

min).

1 2 3 4 5 6 7

α−La

β-Lg

IR PR PL

1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7

α−La

β-Lg

IR PR PL

1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7

84

Figura 27. Electroforegramas de las proteínas de suero (fracción soluble a pH 4.6) de leche desnatada y presurizada a 0, 250, 350, 450, 550 y 650 MPa (a-f)

en equipo industrial con despresurización rápida (IR) y en equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL).

A 21

4 nm

0.02

0.04

0.06

0.08

0.02

0

0

0.02

0

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

a

b

c

d

e

f


0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.02

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

0

0

a

b

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0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

a

b

c

d

e

f

α-La

β-Lg

IR PR PL

α-La

β-Lg

α-La

β-Lg

A 21

4 nm

0.02

0.04

0.06

0.08

0.02

0

0

0.02

0

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

a

b

c

d

e

f


0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.02

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

0

0

a

b

c

d

e

f

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

0

0.02

10 15 20 25

a

b

c

d

e

f

α-La

β-Lg

IR PR PL

α-La

β-Lg

α-La

β-Lg


- 85 -

En la Figura 28 se muestra la cuantificación de la pérdida de solubilidad a pH 4.6 de

las proteínas de suero individuales, α-La y β-Lg medida por EC. Aproximadamente el 10% de

la α-La se desnaturalizó después de los tratamientos IR y PR a presiones ≥ 450 MPa,

aumentando al 25% a 650 MPa. La desnaturalización de la α-La fue significativamente mayor

después de los tratamientos PL a similares niveles de presión, alcanzando el 40% a 650 MPa.

La desnaturalización de la β-Lg aumentó progresivamente con el nivel de presión (P< 0.01),

alcanzando, aproximadamente, el 90% a 650 MPa. Se observaron diferencias significativas

entre los tres tipos de tratamientos a presiones ≥ 350 MPa (P< 0.01). La desnaturalización de

la β-Lg, estimada por la pérdida de solubilidad a pH 4.6, se produjo en el orden: PL> PR> IR.

Figura 28. Contenido de α-La y β-Lg solubles a pH 4.6, medido por CE, de leche presurizada a

250, 350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante 5 min en un equipo industrial (IR) y un equipo piloto

con despresurización rápida (PR) y lenta (PL). Las barras representan la desviación estándar. Las

letras mayúsculas indican diferencias significativas (P< 0.05) debido al tipo de tratamiento (unidad

de alta presión o velocidad de despresurización, IR, PR y PL), mientras que las letras minúsculas

indican diferencias significativas (P< 0.05) debido al nivel de presión.

250 MPa 350 MPa 450 MPa 550 MPa 650 MPa250 MPa250 MPa 350 MPa350 MPa 450 MPa450 MPa 550 MPa550 MPa 650 MPa650 MPa

b)a)

0

20

40

60

80

100

IR PR PL

a a a

bb

b

cc

c

d d

d

e ee

β-L

gso

lubl

e (%

)

Equipo HP

0

20

40

60

80

100

IR PR PL

ab

ca

a

b

b

bbbccdccd

dd

α-L

a so

lubl

e (%

)

Equipo HP

A A B A B C

b)a)

0

20

40

60

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100

IR PR PL

a a a

bb

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c

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d

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β-L

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lubl

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0

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dd

α-L

a so

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e (%

)

Equipo HP

A A B A B C

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a a a

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b

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α-L

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)

Equipo HP

0

20

40

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IR PR PL

ab

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b

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α-L

a so

lubl

e (%

)

Equipo HP

A A B A B C

- 86 -

II.3.3. Proteínas de suero desnaturalizadas y no sedimentables en suero de

ultracentrifugación tratado con altas presiones

La Figura 29 muestra el contenido en proteína soluble de los SU presurizados. El tipo

de equipo y la velocidad de despresurización en el equipo piloto no influyeron

significativamente en la solubilidad de las proteínas de suero. En el equipo industrial y en el

piloto, tanto con despresurización rápida como lenta, estos valores permanecieron constantes

hasta 550 MPa, disminuyendo a 650 MPa (P< 0.05). Sin embargo, el contenido proteico de

estas fracciones fue significativamente inferior a la de los sobrenadantes de SU de leche

presurizada (Figura 22).

Figura 29. Contenido proteico (g/L) de los sobrenadantes de ultracentrifugación de leche desnatada,

sin presurizar (0.1 MPa) y presurizados a 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante 5 min en un

equipo industrial (IR) y un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL). Las barras

representan un intervalo de confianza del 95%.

El estudio más detallado de las proteínas integrantes de esta fracción por PAGE-SDS también

mostró que el tratamiento de presión no produjo ningún efecto aparente sobre ninguna de las proteínas

mayoritarias del suero, β-Lg y α-La (Figura 30). Las bandas correspondientes a ambas proteínas no

mostraron cambios en la intensidad del color, al menos, hasta 550 MPa aunque fue difícil de

6

8

10

Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

6

8

10

Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

Con

teni

do p

rote

ico

(g/L

)

IR PR PLIR PR PL


- 87 -

determinar por simple observación. Por otro lado, también cabe indicar el reducido contenido en

caseínas de esta fracción frente al de los SU de leche presurizada, de ahí el menor contenido proteico

total indicado anteriormente.

Figura 30. PAGE-SDS de los sobrenadantes de ultracentrifugación de leche desnatada sin presurizar

y presurizados a 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante 5 min en un equipo industrial (IR) y

en un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL). Calles: 1 a 6: tratamiento de 0.1,

250, 350, 450, 550 y 650 MPa.

Figura 31. Proteínas solubles a pH 4.6 (g/L) de los sobrenadantes de ultracentrifugación de leche

desnatada, sin presurizar (0.1 MPa) y presurizados a 250, 350, 450, 550 y 650 MPa, a 15ºC durante

5 min en un equipo industrial (IR) y un equipo piloto con despresurización rápida (PR) y lenta (PL).

Las barras representan un intervalo de confianza del 95%.

4

6

8

Con

teni

do p

rote

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(g/L

)

Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

5

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(g/L

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Presión (MPa)

0.1 250 350 450 550 650

5

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1 2 3 4 5 6

α-La

β-Lg

LfBSAIg

IR PR PL

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6

α-La

β-Lg

LfBSAIg

IR PR PL

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6

- 88 -

Como se muestra en la Figura 31, el contenido en proteínas solubles a pH 4.6 empezó

a disminuir a presiones ≥350 MPa. Se observaron diferencias significativas entre los dos

equipos (P< 0.05) y la velocidad de despresurización a presiones ≥ 550 MPa (P<0.01),

siguiendo el orden PL> PR> IR.

II.4. Discusión

II.4.1. Efecto del tipo de equipo de alta presión y de la velocidad de despresurización en

la liberación de caseínas no sedimentables a la fase soluble de la leche

Los resultados de este estudio mostraron que el tipo de equipo de alta presión y la

velocidad de despresurización influyeron en la composición de las fracciones coloidales y

solubles de la leche. El contenido en caseínas no sedimentables y la desnaturalización de las

proteínas de suero aumentaron significativamente con el nivel de presión bajo las tres

condiciones experimentales consideradas, aunque se encontraron diferencias entre el equipo

industrial y piloto y entre los dos tiempos de despresurización ensayados.

Durante los tratamientos de leche con alta presión, la micela de caseína se desintegra

debido a la ruptura de las interacciones electrostáticas intermoleculares y a la solubilización

del fosfato cálcico coloidal (CCP) (Huppertz y De Kruif, 2006, 2007a). Medidas in-situ de la

transmisión de la luz muestran que la ruptura de las micelas de caseína comienza a presiones

de 100 MPa, aunque, a 250 y 300 MPa, a la desintegración inicial de las micelas que ocurre

durante los primeros 5 min de tratamiento le sigue una progresiva agregación, debido a que, a

estas presiones intermedias, se potencian las interacciones hidrofóbicas sobre la solvatación

de los residuos hidrofóbicos (Huppertz y De Kruif, 2006; Huppertz y col., 2006b). Las

micelas de caseína resultantes están más hidratadas y, se produce un aumento de las proteínas

no sedimentables, posiblemente debido a la liberación fragmentos caseínicos o caseínas

individuales, a presiones ≥100 MPa, tal y como se observó en este estudio (López-Fandiño y

col., 1998; Huppertz y col., 2004b). Esto implica que el nivel de caseínas no sedimentables

está inversamente correlacionado con el tamaño de la micela de caseína, excepto para las

muestras agregadas a 250 y 300 MPa (Anema y col., 2005a).


- 89 -

En términos generales, observamos niveles de caseína soluble (Figuras 22 y 24)

comparables a los publicados previamente para leche presurizada, con algunas diferencias que

se pueden atribuir al uso de diferentes velocidades de ultracentrifugación (Anema y col.,

2005a; Anema, 2008b). Normalmente, el máximo nivel de caseína soluble, que alcanza el 40

o 50% del total del contenido caseínico, se obtiene tras tratamientos a 300 MPa a 20ºC

durante 30 min (López-Fandiño y col., 1998; Huppertz y col., 2004b; Anema y col., 2005a;

Anema, 2008b). En nuestro estudio, y tras los tratamientos con despresurización rápida -IR y

PR-, los máximos niveles de proteínas no sedimentables se observaron a presiones superiores

a las ya publicadas. Esta diferencia se podría atribuir al corto tiempo de tratamiento utilizado

ya que, aunque la liberación de caseínas a la fase sérica es muy rápida durante los primeros 5

min de tratamiento, ésta continua aumentando gradualmente hasta los 60 min (Anema y col.,

2005a; Anema, 2008b). Por otra parte, cuanto mayor es la presión, más rápida es la ruptura de

la micela de caseína (Huppertz y col., 2006b).

En comparación con el tratamiento a escala piloto, el tratamiento a escala industrial

condujo a un contenido en proteínas no sedimentables significativamente menor y la máxima

liberación de caseínas a la fase soluble tuvo lugar a presiones más altas. Estas diferencias

podrían atribuirse, al menos parcialmente, a las diferentes temperaturas de presurización

alcanzadas en ambos sistemas. Durante la presurización, y asumiendo que la compresión es

uniforme y que no existen pérdidas de calor, se produce un aumento de la temperatura del

medio de presurización, que depende de diversos factores, como: el nivel de presión, el

tiempo de mantenimiento, la composición del líquido transmisor de la presión, los materiales

aislantes utilizados, etc. (Balasubramanian y Balasubramaniam, 2003; Buzrul y col., 2008;

Knoerzer y col., 2010a, b). A medida que sube la presión, la temperatura aumenta por

calentamiento adiabático, equilibrándose durante la fase de mantenimiento. En nuestras

condiciones experimentales, se eligió un tiempo de tratamiento de 5 min para simular

condiciones comerciales donde es muy importante el procesado de la mayor cantidad posible

de producto. Posiblemente, ese tiempo de mantenimiento sea demasiado corto para la

disipación de la temperatura alcanzada durante la etapa de subida de la presión, especialmente

en el equipo a escala industrial con un volumen 150 veces mayor que el equipo a escala piloto

(que a su vez estaba recubierto de una camisa de agua termostatizada a 15ºC). Si bien esto

habría dado lugar a una mayor temperatura efectiva durante los tratamientos a escala

industrial (IR), la temperatura real fue superior en los tratamientos PR y PL. Así, por ejemplo,

- 90 -

se alcanzaron temperaturas aproximadamente unos 14ºC superiores a 350 y 650 MPa,

durante los tratamientos con el equipo piloto. Esto se debió a la utilización de aceite de

silicona como fluido transmisor de la presión, que tiene mayor comprensibilidad y menor

calor específico y conductividad térmica que el agua (Balasubramanian y Balasubramaniam,

2003; Knoerzer y col., 2010a). La mayor temperatura alcanzada en los tratamientos a escala

piloto reduciría la solubilidad del CCP y promovería las uniones hidrofóbicas, estabilizando

las micelas de caseínas frente a la ruptura (Huppertz y col., 2006b). Sin embargo, los

resultados existentes sobre el efecto de la temperatura en la desintegración de la micela de

caseína indican que un aumento de la temperatura del tratamiento en el intervalo de 10 a 40ºC

causa una liberación más rápida de las caseínas al sobrenadante (Anema y col., 2005a). En

cualquier caso, debe tenerse en cuenta que Anema y col. (2005a) observaron diferencias

inferiores al 10%, tras tratamientos a 200-600 MPa durante 5 min, entre temperaturas de 30 y

40ºC. Dado que, en nuestro caso las diferencias son mayores no podría descartarse un efecto

adicional debido al tipo de equipo o al escalado (Tabla 6).

Respecto al efecto de la velocidad de despresurización, debe señalarse que los niveles

de proteínas no sedimentables obtenidos después de los dos tratamientos en el equipo piloto,

PR y PL fueron similares, aunque la liberación máxima de caseínas a la fase soluble se logró a

presiones más bajas en el tratamiento PL (Figure 22). Esto sugiere que una despresurización

lenta podría favorecer la desintegración de la micela. Previamente ya se había observado que,

a presiones superiores a las que causan la liberación máxima de caseínas, el nivel de caseínas

solubles tiende a disminuir, tal y como se ha observado en este estudio (Figura 22, 23 y 24,

Tabla 6) (López-Fandiño y col., 1998; Huppertz y col., 2004b; Anema y col., 2005a). Esto

podría deberse a una reagrupación parcial de las partículas micelares solubilizadas, puesto que

para que se dé una reagrupación total que origine grandes agregados de caseína (como ocurre

a presiones intermedias de 250-300 MPa) es necesario que la ruptura de la micela de caseína

inducida por la presión no sea ni demasiado limitada ni demasiado profunda (Huppertz y De

Kruif, 2006). Por otra parte, la disminución de la cantidad de sólidos solubles a 550 y 650

MPa (Figura 22) podría deberse , al menos en parte, a la pérdida de solubilidad de la β-Lg e

incluso de la α-La (Tabla 6 y Figura 24), explicando así, la reducción del contenido total de

proteína no sedimentable en los SU.


- 91 -

II.4.2 Influencia de la desnaturalización de las proteínas de suero

Los resultados obtenidos en los SU presurizados, que contenían proteínas de suero

prácticamente en ausencia de micelas de caseína, indicaron que la presurización redujo tanto

los niveles de proteínas solubles como los de proteínas nativas a presiones ≥ 550 MPa. Sin

embargo, el examen de las fracciones solubles al pH normal de la leche y a pH 4.6 (Figuras

29, 30 y 31) indicó la existencia de proteínas de suero desnaturalizadas solubles.

Comparativamente, la pérdida de solubilidad de la α-La y de la β-Lg, tanto al pH normal de la

leche como a pH 4.6, fue mucho más importante en la leche desnatada presurizada (Figuras

25, 26, y 27). Estos resultados corroboraron el hecho de que las proteínas de suero son más

sensibles a la presión cuando están presentes en leche que en suero, puesto que, en el primer

caso, estas proteínas podrían asociarse con las caseínas y precipitar con ellas en su punto

isoeléctrico (Huppertz y col., 2004a, b). No obstante, en la leche presurizada, una importante

proporción de las proteínas de suero desnaturalizadas también permaneció soluble al pH

normal de la leche (Tabla 6), como ya habían descrito López-Fandiño y col. (1998) y Anema

(2008b). Esto sugiere que las proteínas de suero desnaturalizadas solubles interaccionan entre

sí o con las partículas de caseínas solubles liberadas durante la disgregación de la micela de

caseína inducida por la presión, y no influyen en los cambios micelares producidos durante

los tratamientos. A este respecto, aunque se ha sugerido que la asociación de las proteínas de

suero desnaturalizadas con las micelas de caseína podría compensar la disminución del

tamaño de la micela inducido por la presión (Huppertz y col., 2004a), experimentos de

presurización de micelas de caseína en ausencia y presencia de proteínas de suero indicaron

que la desnaturalización de las proteínas de suero no interfiere en la disociación o

reasociación micelar (Gaucheron y col., 1997; Anema y col., 2005a; Huppertz y De Kruif,

2007b).

El grado de desnaturalización de las proteínas de suero depende del nivel de presión,

el tiempo del tratamiento, el pH y la temperatura (López-Fandiño, 2006a). Sin embargo, este

estudio también muestra que otros factores, como el tipo de equipo o la velocidad de

despresurización, pueden influir en la desnaturalización de las seroproteínas, aunque sus

efectos sólo fueron significativos a presiones ≥ 350 MPa aplicadas a la leche (Figura 25), o ≥

550 MPa aplicadas a los SU (Figura 29). En el equipo industrial, a pesar de que se alcanzó

una temperatura mayor durante el tratamiento, se observaron las menores desnaturalizaciones.

- 92 -

En el equipo a escala piloto, el tiempo más largo de despresurización (PL) aumentó la

desnaturalización de las proteínas de suero frente al tiempo corto de despresurización (PR),

pero la mayor desnaturalización de las proteínas de suero se produjo durante la fase de

mantenimiento de la presión.

II.5. Conclusiones

Los resultados obtenidos sugieren que los tratamientos con alta presión en los equipos

estudiados, a escala industrial y piloto, producen diferentes distribuciones proteicas, pues

conducen a diferentes grados de desintegración micelar con similares niveles de

desnaturalización de las proteínas de suero. Si bien la presencia de caseína promovió la

desnaturalización de las proteínas del suero, el grado de desnaturalización de las proteínas de

suero no mostró ningún efecto en la ruptura micelar. Así, el equipo industrial condujo a una

menor desintegración micelar que el equipo piloto, pero la mayoría de las proteínas de suero

desnaturalizadas, unidas o no a las partículas de caseína no sedimentables, permanecieron

solubles en ambos sistemas. La influencia de la velocidad de despresurización, descuidada en

la mayoría de los estudios de alta presión, se tratará en más profundidad en el capítulo III.

CAPÍTULO III

Efecto de la velocidad de despresurización en la composición proteica de la

fracción soluble de la leche

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO III

- 95 -

III.1. Introducción

Las micelas de caseína de la leche tratada con alta presión presentan propiedades

diferentes a las de la leche cruda o calentada, relacionadas con su tamaño, número,

composición e hidratación (Huppertz y col., 2006a; López-Fandiño, 2006a). El tratamiento

con alta presión produce la desintegración de las micelas de caseína que, posteriormente,

pueden volver a agregarse bajo ciertas condiciones. El grado de estos cambios depende de

diferentes factores, tales como el nivel de presión, la duración del tratamiento, la

temperatura, el contenido en calcio, el pH, etc (Arias y col., 2000; García-Risco y col., 2000;

Huppertz y col., 2004a). Además, la alta presión también desnaturaliza a las proteínas de

suero, que pueden asociarse con las micelas de caseína o con fragmentos micelares,

existiendo varios estudios que han investigado la interacción de ambos fenómenos (Huppertz

y col., 2004d; Anema y col., 2005a; Huppertz y De Kruif, 2007b).

Si bien se ha indicado que la velocidad de subida de la presión no tiene ningún efecto

en las modificaciones producidas por la presión sobre las caseínas (Merel-Rausch y col.,

2006), el efecto de la velocidad de liberación de la presión se ha ignorado en la mayoría de

los estudios. Así, los resultados mostrados en el capítulo anterior indican que la velocidad de

despresurización podría influir en la desintegración micelar y solubilización de las caseínas,

así como en la desnaturalización de las proteínas de suero. Según Fertsch y col. (2003), la

firmeza de los geles formados a partir de disoluciones de caseína micelar presurizadas a 600

MPa depende de la velocidad de descompresión, ya que las velocidades de despresurización

más rápidas proporcionan geles más firmes y microestructuras más finas. Estos autores

sugieren que, una vez que se produce la disociación de la micela de caseína durante la fase de

mantenimiento de la presión, una despresurización lenta favorece el desarrollo de

hiperestructuras caseínicas, debido a que los puentes de calcio y las interacciones

hidrofóbicas se vuelven a formar, interfiriendo en una gelificación homogénea (Fertsch y

col., 2003). Merel-Rausch y col. (2007) también encontraron geles de menor firmeza a

velocidades lentas de liberación de la presión. En este caso, la viscosidad de disoluciones de

caseína micelar tratadas a 400 y 600 MPa a 20 y 30ºC con velocidades de despresurización

rápidas, aumentó en un 5%, lo que se correlacionó con la formación de grandes estructuras

flexibles, construidas a partir de micelas de caseína de menor tamaño. Así, las

despresurizaciones rápidas (600 MPa/min) tenderían a diámetros hidrodinámicos grandes,

- 96 -

mientras que las lentas (20 MPa/min) disminuirían el diámetro, con respecto al de la leche

control (Merel-Rausch y col., 2006). A este respecto, cabe indicar, además, que todavía no

está clara la influencia de la desnaturalización de las proteínas de suero en la disociación y

reagregación de las caseínas inducida por la presión (Huppertz y col., 2006a; López-Fandiño,

2006a).

A la vista de la importancia que tienen las propiedades fisicoquímicas de las proteínas

de la leche en su aptitud tecnológica; el objetivo de este estudio fue el de profundizar en la

influencia de la velocidad de despresurización sobre la distribución proteica entre las

fracciones solubles y coloidales de la leche tratada con alta presión. Para llevar a cabo este

propósito, se presurizó leche desnatada, con y sin agentes bloqueantes de grupos sulfhidrilo, a

250 y 350 MPa de 5 a 15 min a 25ºC, aplicándole diferentes tiempos de despresurización

entre 0.07 y 10 min. Se evaluó el grado de liberación de caseínas a la fase soluble y la

influencia de la desnaturalización de las proteínas de suero en este proceso.

III.2. Materiales y Métodos


III.2.1. Preparación de las muestras

La leche cruda de vaca se obtuvo de una granja local y se desnató calentándola a 37ºC

durante 30 min y centrifugándola a 3000 x g, 20ºC durante 30 min. Una parte de la leche

desnatada se trató con N-etilmaleimida (NEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),

siguiendo el método descrito por Needs y col. (2000b), con el fin de bloquear los grupos

sufhidrilo de la proteína, implicados en la desnaturalización de las proteínas de suero. El

NEM es insoluble en agua por lo que se disolvió en dimetilformamida (DMF; Lab-Scan,

Gliwice, Poland) a una concentración de 20 mg/mL y se añadió, a la leche desnatada, 16.7

mL/L de esta disolución. Se usaron, como controles, muestras de leche con el mismo volumen

de DMF sin NEM. Tanto las muestras con DMF como con NEM se dejaron a temperatura

ambiente toda la noche antes de los tratamientos con alta presión.


- 97 -

III.2.2. Tratamientos de alta presión

Se realizaron presurizaciones a 250 y 350 MPa, 25ºC durante 5 min de leche

desnatada, leche desnatada con NEM y leche desnatada con DMF. Para ello, las muestras se

dispensaron en botes de polietileno de 70 mL, llenándolos hasta arriba para no dejar espacio

libre en su interior y se introdujeron en un equipo de alta presión ACB 900 HP (Eurotherm

Automation, Lyon, France) el cual utiliza agua como fluido transmisor de la presión.

Para evaluar el efecto de la duración del tratamiento, la presión se elevó a una

velocidad de 2.5 MPa/seg, manteniéndose durante 5, 6, 10 o 15 min, y se liberó en 0.07 min

(4 seg), esto es, a una velocidad de despresurización de 62.5 y 87.5 MPa/seg, para los

tratamientos de 250 y 350 MPa, respectivamente.

Por otro lado, para evaluar el efecto de la despresurización, la presión se elevó a una

velocidad de 2.5 MPa/seg, manteniéndose durante 5 min, y se liberó en 0.07, 1, 5 o 10 min,

esto es, para los tratamientos de 250 MPa, las velocidades de despresurización fueron 62.5,

4.2, 0.8 o 0.4 MPa/seg y, para 350 MPa, 87.5, 5.8, 1.2 o 0.6 MPa/seg, respectivamente

(Figura 32). En adelante, y con el fin de simplificar la presentación de los resultados, se

utilizarán los tiempos de despresurización como indicadores de las diferentes velocidades de

despresurización. Todos los tratamientos con alta presión se realizaron al menos por

duplicado.

Esquema 1. Esquema de la preparación, tratamientos con alta presión, fraccionamiento y análisis de las muestras

250 y 350 MPa, 25ºC, 5 min

Leche cruda de vacaGec AlsthomACB 900 HP

Rampa de subida2.5 MPa/seg

Lechescon y sinpresurizar

SU

4.6

Fracciones



Análisis

Despresurización 0.07 min

Despresurización 1 min



M. Presión6 min

M. Presión10 min

M. Presión15 min

Mantenimientode la presión 5 min, 25 ºC

Despresurización0.07 min

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatada

Reposo 16 h Tª ambiente

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Desnatado Tratamiento con alta presión Fraccionamiento Análisis

3000 x g, 20ºC, 30 min

Aná

lisis

Adición deDMF o NEM



PAGE-SDS

PROTEÍNAS

250 y 350 MPa, 25ºC, 5 min

Leche cruda de vacaGec AlsthomACB 900 HP

Rampa de subida2.5 MPa/seg



SU

4.6

Fracciones



Análisis

Despresurización 0.07 min




M. Presión6 min

M. Presión10 min

M. Presión15 min

Mantenimientode la presión 5 min, 25 ºC

Despresurización0.07 min

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMFLeche

desnatadaLeche

desnatada

DMF NEMLeche

desnatadaLeche

desnatadaLeche

desnatada

Reposo 16 h Tª ambiente

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Lechepresurizada

Lechepresurizada

Lechepresurizada

DMF NEMLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizadaLeche

presurizada

DMF NEM

Desnatado Tratamiento con alta presión Fraccionamiento Análisis

3000 x g, 20ºC, 30 min

Aná

lisis

Adición deDMF o NEM



PAGE-SDS

PROTEÍNAS


- 99 -

III.3. Resultados


desnatada tratada por altas presiones

Se determinó el contenido de proteínas no sedimentables y de proteínas solubles a pH

4.6 de la leche tratada con altas presiones a 250 y 350 MPa. La Tabla 7 muestra el efecto del

tiempo de mantenimiento de la presión con 0.07 min de despresurización y el efecto del

tiempo de despresurización con 5 min de mantenimiento de la presión.

A 250 MPa, los niveles de proteínas no sedimentables encontrados en los SU de leche

presurizada con tiempos de mantenimiento de la presión < 15 min fueron similares a los de la

leche control, mientras que, a 350 MPa, aumentaron significativamente con tiempos de

mantenimiento ≥ 5 min (Tabla 7). Los contenidos en proteínas de suero solubles a pH 4.6

disminuyeron significativamente después de 5 min a 250 y 350 MPa, y el mantenimiento de la

presión a 350 MPa hasta 15 min también los redujo significativamente (P< 0.05).

En comparación con la despresurización más rápida (0.07 min), el aumento del tiempo

de despresurización (de 1 a 10 min) aumentó significativamente los niveles de proteína no

sedimentable a ambos niveles de presión y, especialmente, a 350 MPa (Tabla 7). Los

tratamientos con una duración total de 15 min a 250 MPa y de 10 y 15 min a 350 MPa

produjeron contenidos de proteínas solubles significativamente mayores cuando el tiempo de

mantenimiento de la presión fue de 5 min, con 5 y 10 min de despresurización, que cuando

los tiempos de mantenimiento de la presión fueron de 10 y 15 min, respectivamente, con 0.07

min de despresurización (valores marcados con * en la Tabla 7). Sin embargo, los tiempos de

despresurización y de mantenimiento de la presión ejercieron una influencia similar en los

contenidos de proteínas en la fracción soluble a pH 4.6 después tratamientos a 250 y 350

MPa. Como era de esperar, la presurización durante 5 min, a ambas presiones, produjo una

disminución significativa del contenido proteico de esta fracción (P< 0.05) que fue

disminuyendo ligeramente con el aumento de la duración del tratamiento a ambas presiones

aunque estos cambios no fueron significativamente diferentes. No obstante, el contenido en

proteínas solubles fue menor en todos los tratamientos realizados a 350 MPa respecto a los

mismos a 250 MPa (Tabla 7).

- 100 -

Tabla 7. Contenidos en proteínas (g/L ± desviación estándar) de los sobrenadantes de

unltracentrifugación (SU) y de las fracciones soluble a pH 4.6 (4.6) de la leche desnatada

control (0 min de tiempo de mantenimiento de la presión y de despresurización) y leche

presurizada a 250 y 350 MPa y 25ºC a diferentes tiempos de mantenimiento y

despresurización.

a-d Diferentes superíndices en letras minúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión. A-E Diferentes superíndices en letras mayúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de despresurización. * Indica diferencias significativas (P< 0.05) entre valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento con diferentes combinaciones de tiempo de mantenimiento y de despresurización a cada nivel de presión.

El análisis de los sobrenadantes de ultracentrifugación y de las fracciones solubles a

pH 4.6 por PAGE-SDS se muestran en la Figura 33, el cual reveló que el contenido en

caseínas no sedimentables en los sobrenadantes de ultracentrifugación aumentó con el

aumento del tiempo de despresurización (Figura 33, A y B, calles 5-8). Este hecho justifica el

incremento en el contenido proteico total observado anteriormente (Tabla 7). Además, la

intensidad de las bandas correspondientes a las caseínas en los sobrenadantes de

250 MPa 350 MPa Tiempo de mantenimiento

(min)

Tiempo de despresurización

(min) SU 4.6 SU 4.6

0 0 12.05bD±0.01 8.07aA±0.02 12.05dE±0.01 8.07aA±0.02

5 0.07 12.00bD±0.08 7.79bB±0.06 14.88cD±0.08 7.24bB±0.04

6 0.07 12.83ab±0.10 7.85ab±0.38 15.24b±0.10 7.22b±0.02

10 0.07 12.93ab±0.88 8.06a±0.01 *16.16a±0.01 6.93c±0.11

15 0.07 *13.30a±0.29 8.32a±0.15 *16.24a±0.05 6.86c±0.10

5 1 13.06C±0.20 7.71B±0.08 15.65C±0.10 7.36B±0.10

5 5 14.19 B±0.01 7.65B±0.10 *17.32B±0.31 7.26B±0.11

5 10 *14.62A±0.11 7.41C±0.06 *18.44A±0.30 7.17B±0.06


- 101 -

ultracentifugación (Figura 33 A y B) y de β-Lg en la fracción soluble a pH 4.6 (Figura 33 C y

D) con tratamientos de presión de 6, 10 y 15 min fue menor que las de los tratamientos de

presión de 5 min con despresurización de 1, 5 y 10 min.

Figura 33. PAGE-SDS de los sobrenadantes de ultracentrifugación (A, B) y de las fracciones solubles

a pH 4.6 (C, D) de leche presurizada a 250 (A, C) y 350 MPa (B, D), 25ºC durante diferentes tiempos.

Calles: 1: SU (en A y B) o fracción soluble a pH 4.6 (en C y D) de leche control; 2-4: tratamiento de

presurización de 6, 10 y 15 min con despresurización de 0.07 min. 5-8: tratamiento de presurización

de 5 min con despresurización de 0.07, 1, 5 y 10 min

Las fracciones solubles a pH 4.6 de leche tratada a 250 y 350 MPa también se

analizaron por electroforesis capilar. A modo de ejemplo, en la Figura 34 se muestran los

electroforegramas obtenidos del análisis de las fracciones solubles a pH 4.6 de leche

presurizada a 350 MPa.

1 2 3 4 5 6 7 8

α-Laβ-Lg

LfBSA

Ig

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

B

C D

α−Laβ-Lg

Lf

β-CN

αS2-CN

κ-CN

αS1-CN

A

BSAIg

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8

α-Laβ-Lg

LfBSA

Ig

1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8

B

C D

α−Laβ-Lg

Lf

β-CN

αS2-CN

κ-CN

αS1-CN

A

BSAIg

1 2 3 4 5 6 7 8

- 102 -

Figura 34. Electroforegramas de las fracciones solubles a pH 4.6 de leche desnatada control (a) y

presurizada a 350 MPa y 25ºC dutrante 5 con despresurización en 0.07 min (b). d-e muestran el

efecto del tiempo de mantenimiento de la presión (6, 10 y 15 min seguidos de 0.07 min de

despresurización, respectivamente) y f-i el efecto del tiempo de despresurización (5 minutos de

mantenimiento seguidos de 1, 5 y 10 min de despresurización, respectivamente)

Los contenidos individuales de α-La y β-Lg presentes en estas fracciones (4.6)

mostraron que, tanto a 250 como a 350 MPa, el tiempo de mantenimiento de la presión no

influyó en la desnaturalización de la α-La a ninguna de las presiones estudiadas (Figura 35 a).

Sin embargo, a 350 MPa, el aumento del tiempo de despresurización de 0.07 a 1 min produjo

una disminución del ---- en el contenido soluble de esta proteína aunque no disminuyó más

por efecto de la prolongación de la despresurización hasta los 10 min.

25

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0

0.02

0

0.02

0.04

0

0.02

0.04

10 15 20

0.04 b

c

d

e

aα-La

β-Lg

10 15 20 25

α-La

β-Lg

b

g

h

i

a

A 21

4 nm

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0

0.02

0

0.02

0.04

0

0.02

0.04

0.04

25

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0

0.02

0

0.02

0.04

0

0.02

0.04

10 15 20

0.04 b

c

d

e

aα-La

β-Lg

10 15 20 25

α-La

β-Lg

b

g

h

i

a

A 21

4 nm

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0

0.02

0

0.02

0.04

0

0.02

0.04

0.04

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0

0.02

0

0.02

0.04

0

0.02

0.04

0.04


- 103 -

Figura 35. Contenido en α-La soluble a pH 4.6, medido por EC, de leche presurizada a 250 ( ) y

350 MPa ( ). Las barras representan la desviación estándar. Diferentes letras en el mismo color

indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión

(a) o de despresurización (b) a 250 y 350 MPa. * Indica diferencias significativas (P< 0.05), entre

valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento, entre las figuras a y b.

En el caso de la β-Lg, el tiempo de mantenimiento de la presión sí contribuyó a la

desnaturalización de esta proteína, especialmente a 350 MPa (Figura 36a). Además, la

desnaturalización de la β-Lg fue significativamente mayor (P< 0.05) después de tiempos de

mantenimiento de 6, 10 o 15 min, seguidos por una despresurización de 0.07 min, que

α-L

a so

lubl

e (%

)

t de mantenimiento (min)5 6 10 15

02040

6080

100120

a aaaa a

aa

α-L

a so

lubl

e (%

)

t de despresurización (min)

02040

6080

100120

0.07 1 5 10

a a aa

ab b

c

b)

a)

α-L

a so

lubl

e (%

)


02040

6080

100120

a aaaa a

aa

α-L

a so

lubl

e (%

)


02040

6080

100120

0.07 1 5 10

a a aa

ab b

c

α-L

a so

lubl

e (%

)


02040

6080

100120

02040

6080

100120

a aaaa a

aa

α-L

a so

lubl

e (%

)


02040

6080

100120

02040

6080

100120

0.07 1 5 10

a a aa

ab b

c

b)

a)

- 104 -

después de tiempos de mantenimiento de la presión de 5 min seguidos por despresurizaciones

de 1, 5 o 10 min (Figura 36 a y b).

Figura 36. Contenido en β-Lg soluble a pH 4.6, medido por EC, de leche presurizada a 250 ( ) y

350 MPa ( ). Las barras representan la desviación estándar. Diferentes letras en el mismo color

indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión

(a) o de despresurización (b) a 250 y 350 MPa. * Indica diferencias significativas (P< 0.05), entre

valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento, entre las figuras a y b.

También se analizaron los sobrenadantes de ultracentrifugación por EC, mostrándose a

modo de ejemplo en la Figura 37 los electroforegramas de los SU de leche presurizada a 350

MPa. A tiempos de tratamiento totales equivalentes, los niveles individuales de todas la

b)

a)

020406080

100120

β-L

gso

lubl

e (%

)

5 6 10 15t de mantenimiento (min)

aab b b

ccba *

* *

020406080

100120

β-L

gso

lubl

e (%

)

0.07 1 5 10t de despresurización (min)

a a ab b

a aab

b* * *

b)

a)

020406080

100120

β-L

gso

lubl

e (%

)

5 6 10 15t de mantenimiento (min)

aab b b

ccba *

* *

020406080

100120

β-L

gso

lubl

e (%

)

0.07 1 5 10t de despresurización (min)

a a ab b

a aab

b* * *a a ab b

a aab

b* * *


- 105 -

mayoría de lass caseínas fueron significativamente (P< 0.05) superiores tras tratamientos de 5

min a 250 y 350 MPa seguidos por una despresurización de 5 y 10 min que cuando la leche se

sometió a cada nivel de presión durante 10 y 15 min, pero no se observaron diferencias entre

los niveles de α-La o β-Lg ( Tabla 8 y 9, Figura 37).

Figura 37. Electroforegramas de leche desnatada control (a) y sobrenadantes de ultracentrifugación

de: leche desnatada control (b) y leche presurizada a 350 MPa y 25ºC durante 5 min con

despresurización en 0.07 min (c). d-f muestran el efecto del tiempo de mantenimiento de la presión

(6, 10 y 15 min seguidos de 0.07 min de despresurización, respectivamente) y g-i el efecto del

tiempo de despresurización (5 minutos de mantenimiento seguidos de 1, 5 y 10 min de

despresurización, respectivamente) 1: α-La; 2: β-Lg; 3: αs2-CN; 4: αs1-CN; 5: αs1-CN 9P; 6: κ-CN;

7: βB-CN; 8: βA1-CN; 9: βA2-CN.


4

10 15 20 25 30 35 40

00.040.080.120.16

0

0.04

0.040

A 21

4 nm

b

c

a12

3

5

98

76

10 15 20 25 30 35 40

00.04

00.04

00.04

d

e

f

0.06


A 21

4 nm

A 21

4 nm

10 15 20 25 30 35 40

g

h

i

0.06

00.04

00.04

00.04


41

2

35

8

769

4

12

35

8

76 9


4

10 15 20 25 30 35 40

00.040.080.120.16

0

0.04

0.040

A 21

4 nm

b

c

a12

3

5

98

76

4

10 15 20 25 30 35 40

00.040.080.120.16

0

0.04

0.040

A 21

4 nm

b

c

a12

3

5

98

76

10 15 20 25 30 35 40

00.04

00.04

00.04

d

e

f

0.06


A 21

4 nm

A 21

4 nm

10 15 20 25 30 35 40

g

h

i

0.06

00.04

00.04

00.04


41

2

35

8

769

4

12

35

8

76 9

10 15 20 25 30 35 40

00.04

00.04

00.04

d

e

f

0.06


A 21

4 nm

A 21

4 nm

10 15 20 25 30 35 40

g

h

i

0.06

00.04

00.04

00.04


41

2

35

8

769

4

12

35

8

76 9

Tabla 8. Proteínas individuales presentes en los sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) obtenidos a partir de leche desnatada control (0 min de tiempo

de mantenimiento de la presión y de despresurización) y leche presurizada a 250 MPa, a 25ºC, durante 5 min, (los valores se representan como porcentaje

del contenido individual de cada caseína en la leche cruda desnatada, estimado por EC).

a-c Diferentes superíndices en letras minúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión. A-E Diferentes superíndices en letras mayúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de despresurización. * Indica diferencias significativas (P< 0.05) entre valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento, con diferentes combinaciones de tiempo de mantenimiento y de despresurización a cada nivel de presión. 1 SD total de los valores correspondientes a los SU de leche control y leche presurizada durante 5, 6, 10 y 15 min y despresurizada en 0.07 min. 2 SD total de los valores correspondientes a los SU de leche control y leche presurizada durante 5 min y despresurizada en 0.07, 1, 5 y 10 min.

Tiempo de mantenimiento

(min)


(min) α-La β-Lg αS2-CN αS1-CN αS0-CN κ-CN β-CN B β A1-CN β A2-CN

0 0 107.93aA 101.34aA 15.05aB 13.30cD 14.96cD 23.19aC 28.88aC 16.98bD 21.39bD

5 0.07 108.47aA 96.24aA 15.78aB 17.09bCD 20.70abC 26.57aBC 23.16aC 17.15bD 19.20cE

6 0.07 102.96a 93.93a 17.41a 20.00a 22.49a 30.12a 32.72a 21.82a 23.99a

10 0.07 105.97a 93.74a 18.24a *17.74b *19.28b *28.91a 30.54a *19.37ab *23.59a

15 0.07 98.91a 90.72a 21.52a *16.57b *17.74bc *27.51a 25.43a *18.52b *21.14b

5 1 96.59A 91.00A 18.77AB 18.38C 20.91C 31.93B 27.45BC 20.17C 23.05C

5 5 96.91A 93.05A 19.45AB *24.11B *26.62B *37.96A 33.26AB *24.65B *27.99B

5 10 109.36A 101.56A 26.01A *29.31A *33.10A *46.62A 35.23A *30.71A *31.23A

1 SD total 3.65 3.28 2.34 0.57 0.86 2.51 3.18 0.71 0.33 2SD total 3.52 3.46 2.66 1.18 1.22 1.54 1.66 0.60 0.29

Tabla 9. Proteínas individuales presentes en los sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) obtenidos a partir de leche desnatada control (0 min de tiempo

de mantenimiento de la presión y de despresurización) y leche presurizada a 350 MPa, a 25ºC, durante 5 min, (los valores se representan como porcentaje

del contenido individual de cada caseína en la leche cruda desnatada, estimado por EC).

a-c Diferentes superíndices en letras minúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión. A-D Diferentes superíndices en letras mayúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de despresurización. * Indica diferencias significativas (P< 0.05) entre valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento, con diferentes combinaciones de tiempo de mantenimiento y de despresurización a cada nivel de presión. 1 SD total de los valores correspondientes a los SU de leche control y leche presurizada durante 5, 6, 10 y 15 min y despresurizada en 0.07 min. 2 SD total de los valores correspondientes a los SU de leche control y leche presurizada durante 5 min y despresurizada en 0.07, 1, 5 y 10 min.

Tiempo de mantenimiento

(min)


(min) α-La β-Lg αS2-CN αS1-CN αS0-CN κ-CN β-CN B β A1-CN β A2-CN

0 0 107.93aA 101.34aB 15.05bB 13.30dD 14.96bD 23.19cD 24.88bC 16.98cD 21.39cC

5 0.07 102.61aA 90.57abA 29.18aA 25.34cC 27.19aC 33.89bCD 35.91aB 25.93bC 29.75bB

6 0.07 100.53a 88.61bc 27.66a 26.88bc 29.57a 37.94ab 37.76a 26.82b 29.58b

10 0.07 95.85a 78.33c 29.75a 29.64ab 26.86a 40.51a *34.66a *29.66a *32.56ab

15 0.07 91.26a 79.73bc 32.17a *30.29a *30.72a *40.97a *37.45a *31.19a *36.07a

5 1 97.93A 88.62A 30.73A 28.52BC 29.56BC 38.64 BC 37.48B 30.01C 35.07B

5 5 100.77A 88.41A 31.24A 32.51B 33.92AB 49.35 AB *45.97A *37.70B *43.06A

5 10 99.89A 88.00A 35.33A *37.91A *39.31A *53.49A *49.00A *44.18A *48.18A

1SD total 4.65 3.13 2.17 0.87 2.17 1.76 2.38 0.46 1.42 2SD total 3.79 1.82 2.30 1.23 1.31 3.14 2.22 1.20 1.90

- 108 -


presurizada en presencia de agentes bloqueantes de grupos sulfihidrilo

Como muestra la Tabla 10, el empleo de NEM para dificultar las reacciones de

intercambio tiol-disulfuro no influyó en la solubilización de caseínas inducida por la alta

presión, que tuvo lugar en mayor grado después de tiempos largos de despresurización en

comparación con tiempos equivalentes de mantenimiento de la presión seguidos

despresurización rápida (0.07 min).

Tabla 10. Contenido en proteínas (expresado como porcentaje de las proteínas totales de la leche ±

desviación estándar) de los sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) y de la fracción soluble a pH

4.6 de la leche desnatada control con NEM y DMF (0 min de tiempo de mantenimiento de la presión

y de despresurización) y de la leche presurizada con NEM y DMF, a 350 MPa y 25ºC a diferentes

tiempos de mantenimiento de la presión y de despresurización.

a-c Diferentes superíndices en letras minúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de mantenimiento de la presión. A-C Diferentes superíndices en letras mayúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tiempo de despresurización. * Indica diferencias significativas (P< 0.05) entre valores correspondientes al mismo tiempo total de tratamiento, con diferentes combinaciones de tiempo de mantenimiento y de despresurización a cada nivel de presión.

SU 4.6 Tiempo de mantenimiento

(min)


(min) NEM DMF NEM DMF

0 0 32.41bC±2.47 32.41cC±0.96 21.08aA±4.1 24.85aA±0.67

5 0.07 40.07aB±0.35 38.24bB±0.84 19.31aA±0.94 22.61bB±0.94

10 0.07 *38.74a±3.33 *39.57b±2.60 20.86a±3.50 21.00b±0.71

15 0.07 *39.03a±0.18 * 44.76a±0.18 20.64a±0.71 21.00b±0.47

5 5 * 50.78A±1.80 *51.62A ±0.82 20.64A±0.39 22.30B±0.90

5 10 *52.10A±0.70 *53.95A ±1.26 20.58A±1.21 23.00AB±0.63


- 109 -

Por otro lado, como se esperaba, la adición de NEM a la leche previno la

desnaturalización de las proteínas de suero a 350 MPa. Los experimentos en los que se añadió

DMF, en la que se disolvió el NEM, a la leche también sugirieron una mayor incidencia del

tiempo de mantenimiento de la presión que del tiempo de despresurización en la

desnaturalización de las proteínas del suero, aunque no hubo diferencias significativas entre

los efectos de ambos.

III.4. Discusión

De acuerdo con los resultados obtenidos, a 250 MPa y, especialmente, a 350 MPa se

produjo la liberación de caseínas no sedimenables a la fase sérica, influyendo de manera más

importante el tiempo de despresurización que el de mantenimiento de la presión en este

proceso (Tablas 7-9, Figura 33 A y B, Figura 37). Se ha descrito que, a presiones superiores a

100 MPa, tiene lugar la solubilización de las caseínas como resultado de la ruptura micelar

(López-Fandiño y col., 1998; Huppertz y col., 2004c; Anema, 2008b). Sin embargo, a

presiones de 250 y 300 MPa, si bien se desintegra la micela de caseína durante los primeros 5-

10 min de tratamiento durante tratamientos más prolongados se produce agregación de las

proteínas debido a un aumento de las interacciones hidrofóbicas a esas presiones intermedias,

aunque tratamientos a 250 MPa de 5 a 15 min, como los usados en este estudio, son

demasiados cortos para inducir agregación micelar (Huppertz y col., 2006b; Huppertz y De

Kruif, 2006, 2007b). Por otra parte, otros autores también han observado agregación de

partículas micelares, debido al restablecimiento de los enlaces hidrofóbicos tras la liberación

de la presión, siempre y cuando estas micelas mantengan un cierto grado de integridad y parte

de la estructura del CCP intacto (Huppertz y col., 2006b; Orlien y col., 2006; Anema, 2008b).

A pesar de que la presión rompe los enlaces electrostáticos e hidrofóbicos éstos

podrían empezar a formarse de nuevo durante la despresurización. Sin embargo, nuestros

resultados mostraron claramente que durante la fase de despresurización se produce un

aumento significativamente mayor del contenido de caseínas no sedimentables que el que

tiene lugar durante la fase de mantenimiento de la presión. Según Merel-Rausch y col. (2006;

2007), a presiones superiores a 200 MPa, la velocidad de despresurización juega un papel

importante en la modificación de las caseínas, ya que, la despresurización lenta favorecería la

reasociación de las caseínas, mientras que la rápida perturbaría a los mecanismos de

- 110 -

asociación, formándose estructuras o agregados completamente nuevos. Teniendo en cuenta

las observaciones de Merl-Rausch y col. (2006; 2007), nuestros resultados indican que es

posible que tenga lugar una importante disociación micelar, que aumente las caseínas no

sedimentables, bajo condiciones que también promuevan la reagregación micelar. De hecho,

en muestras de leche sometidas a presiones de 250-300 MPa, en las que se ha producido

agregación micelar, se encuentran altos niveles de caseínas no sedimentables (Anema y col.,

2005a). Esto sugiere que la agregación micelar es un fenómeno independiente de la

disgregación micelar, aún cuando parece necesario un nivel mínimo de ruptura micelar para

que se produzca, posteriormente, agregación (Huppertz y De Kruif, 2006; Anema, 2008b).

Los resultados obtenidos apoyaron estudios previos que indican que la β-Lg se

desnaturaliza a presiones superiores de 100 MPa en función del nivel de presión y la duración

del tratamiento (López-Fandiño y col., 1996; Anema y col., 2005b). El desplegamiento

reversible de la β-Lg inducido por la presión (exposición de regiones hidrofóbicas y del grupo

sulfhidrilo libre) va seguido de una desnaturalización irreversible, por autoagregación o

asociación a otras proteínas de suero, o a la κ-CN (López-Fandiño y col., 1997; Needs y col.,

2000b; Patel y col. 2006). Al igual que nosotros, otros autores también han observado que la

mayoría de la β-Lg desnaturalizada permanece soluble en leche presurizada a 250 y 350 MPa,

al pH normal de la leche (Tablas 2 y 3, Figuras 36 y 33) (López-Fandiño y col., 1998; Anema,

1998), lo que sugiere que las moléculas de β-Lg interaccionan preferentemente entre ellas o

con partículas de caseína no sedimentable. Además, nuestros resultados (Tabla 7, Figuras 34 y

36) pusieron de manifiesto que la β-Lg se desnaturalizó principalmente durante la fase de

mantenimiento de la presión, bajo condiciones de alta solubilidad del fosfato cálcico e

inhibición de las interacciones hidrofóbicas, produciéndose muy poca desnaturalización

adicional durante la fase de despresurización. Esto apoya la hipótesis de que las reacciones de

intercambio -SH-S-S se dan principalmente durante el tratamiento de presión (Belloque y col.,

2000) y sugiere que las uniones hidrofóbicas que se restablecen durante la fase de liberación

de la presión no participan de manera importante en la desnaturalización de la β-Lg.

Nuestros resultados también sugirieron que la desnaturalización de las proteínas de

suero no ejerce una influencia apreciable en el aumento del contenido de caseína no

sedimentable producido durante la fase de despresurización, ya que dicho aumento no se

acompañó de cambios importantes en los niveles de proteínas de suero presentes en los SU


- 111 -

(Tablas 2 y 3, Figuras 33 A,B y 37), ni de un aumento en la desnaturalización de las proteínas

de suero, determinado por la pérdida de solubilidad a pH 4.6 (Tabla 7, Figuras 33 C, D y 36).

Como era de esperar, la adición de NEM previno la formación de enlaces disulfuro, evitando

la en gran medida la desnaturalización de las proteínas de suero y su asociación con las

caseínas (Huppertz y col., 2004b), pero no ejerció ningún efecto en la liberación de caseínas a

la fase soluble de la leche que tuvo lugar durante la fase de despresurización (Tabla 10). De

modo similar, es probable que los cambios en el tamaño micelar inducidos por la presión sean

independientes de las proteínas de suero, ya que se encuentran tamaños micelares similares en

leche presurizada tanto con la adición de NEM como sin él (Huppertz y col., 2004d).

Igualmente la disgregación micelar y la reagregación que tienen lugar a 250 y 300 MPa son

similares en presencia y en ausencia de proteínas de suero (Anema y col., 2005a; Huppertz y

De Kruif, 2007b).

III.5. Conclusiones

Este trabajo muestra el efecto de la velocidad de despresurización en la distribución de

proteínas entre las fases soluble y coloidal de la leche presurizada. El contenido en caseína

soluble aumentó significativamente durante la fase de despresurización respecto a la fase de

mantenimiento de la presión, mientras que la desnaturalización de la β-Lg tuvo lugar,

mediante enlaces disulfuro, fundamentalmente durante la fase de mantenimiento. Estos

resultados corroboran los recogidos en el capítulo anterior, demostrando que la

desnaturalización de las proteínas de suero no influye en la ruptura micelar y en la

subsiguiente solubilización de caseínas que tiene lugar en la leche presurizada y evidencian la

importancia de la fase de despresurización en este proceso, de modo que cuanto más lenta sea

la velocidad de despresurización, mayor es el nivel de caseína soluble.

CAPITULO IV

Estudio de la distribución proteica en muestras tratadas

con altas presiones entre 700 y 900 MPa

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: CAPÍTULO IV

- 115 -

IV.1. Introducción

En las últimas tres décadas, el conocimiento sobre el efecto de las altas presiones en

los alimentos se ha ampliado enormemente sobre todo, en la leche y sus proteínas,

encontrándonos varios trabajos en la bibliografía que resumen estos efectos (Huppertz y col.,

2002; López-Fandiño, 2006a; Huppertz y col., 2006a; Considine y col., 2007). Este gran

conocimiento ha permitido el desarrollo de esta técnica como medio para la conservación de

los alimentos, aumentado la implantación de equipos de alta presión, capaces de alcanzar los

650 MPa, en las industrias alimentarias. En concreto, en el 2009 los equipos industriales

instalados fueron 132 en todo el mundo, existiendo una gran variedad de productos

comerciales presurizados como calostros, zumos, guacamole, fiambre, arroz, etc (Barbosa-

Cánovas y Bermúdez-Aguirre, 2011; Tonello, 2011). Sin embargo, la tecnología continua

avanzando y actualmente podemos encontrar equipos a escala piloto que pueden llegar hasta

los 900 MPa e incluso hasta 1800 MPa en equipos de laboratorio (Bermúdez-Aguirre y

Barbosa-Cánovas, 2011). Lo que hace necesario continuar investigando en los efectos de las

muy altas presiones (> 650 MPa) en los alimentos.

En la leche, las altas presiones reducen sus propiedades de dispersión de la luz,

disminuyen su turbidez y cambian su apariencia visual, debido a la desintegración de la

micela de caseína en estructuras más pequeñas (Needs y col., 2000b; Considine y col., 2007).

Tanto las micelas de caseínas de la leche presurizada como las de leche sin presurizar se

mantienen primariamente por la interacciones hidrofóbicas e uniones con el CCP (Huppertz y

col., 2006a) aunque también juega un papel muy importante en su estabilidad la κ-CN (Fox y

Brodkorb, 2008). La desintegración de la micela inducida por la presión, se produce por la

solubilización del CCP que forma parte de las micelas (López-Fandiño y col., 1998; Huppertz

y De Kruif, 2007a) y por la ruptura de las interacciones hidrofóbicas, de hidrogeno y de van

der Waals (López-Fandiño, 2006a).

Como consecuencia de la desintegración de la micela inducida por la presión, el

tamaño medio de la micela cambia y el grado de su modificación variará dependiendo de

varios factores como la duración del tratamiento, la temperatura, la presencia de proteínas de

suero, el pH de la leche, la aplicación de varios ciclos de presión, etc (Huppertz y col., 2006a).

Por ejemplo, el tamaño de la micela en leche tratada a 250-300 MPa puede ser mayor o menor

que los de la leche sin tratar dependiendo de la duración y la temperatura del tratamiento

- 116 -

(Huppertz y col., 2004a; Regnault y col., 2004; Anema y col., 2005a). Sin embargo, los

tratamientos a presiones ≥400 MPa reducen considerablemente el tamaño micelar (Needs y

col., 2000b; Huppertz y col., 2004a; Anema y col., 2005a). Gebhardt y col. (2006) observaron

por microscopía de fuerza atómica ex-situ que las micelas nativas (170 nm) empiezan a

descomponerse a presiones bajas (>40 MPa) formando pequeñas partículas de entre 10 y 20

nm. Sin embargo, para una completa descomposición en monómeros es necesario presiones

superiores a 280 MPa.

Otro de los efectos de las altas presiones en la leche es que produce desnaturalización

de las proteínas del suero ya que produce el desplegamiento de estas proteínas. Sin embargo,

la estabilidad de las proteínas séricas a la presión varia dependiendo de su estructura, de

hecho la β-Lg es la más sensible y la α-La la más resistente a la presión (López-Fandiño,

2006a). Las altas presiones producen el desplegamiento de la estructura de la β-Lg

exponiendo el grupo sulfidrilo libre, que puede reaccionar con otras proteínas formando como

la κ-CN, αs2-CN, α-La o β-Lg (Huppertz y col., 2004b; Patel y col., 2006). La β-Lg empieza

a desnaturalizarse a partir de los 200 MPa, Anema (2008a) observó un ∼30% de

desnaturalización en tratamientos de 30 min que fue incrementando con el aumento de la

presión, llegando a una desnaturalización del 90% a 800 MPa. En cambio la desnaturalización

de la α-La no se produce hasta los 400-500 MPa (Anema y col., 2005b; Hinrichs y

Rademacher, 2005; Anema, 2008a) observándose desnaturalizaciones de en torno al 30-40%

a 800 MPa (Huppertz y col. 2004b; Anema, 2008a)

A pesar de que ya existen algunos estudios sobre el efecto de presiones hasta 800 MPa

en el tamaño micelar y la desnaturalización de las proteínas mayoritarias del suero aún se

necesita profundizar en el efecto de estas presiones en la disgregación micelar.

Así, el objetivo propuesto para este estudio fue investigar el efecto de la aplicación de

muy altas presiones (700, 800 y 900 MPa) a la leche, en la distribución proteica de diferentes

fracciones lácteas, profundizando en el estudio del tamaño de la micela de caseína y la

desnaturalización de las proteínas minoritarias del suero, entre otros aspectos.

IV.2. Materiales y métodos La Figura 38 resume el procedimiento experimental seguido en este trabajo.


- 117 -

IV.2.1. Preparación de las muestras

Para realizar este estudio se utilizó leche cruda de vaca procedente de una granja local. La leche se atemperó a 37ºC y se procedió a su desnatado.

IV.2.2. Tratamientos de presurización

Tras el desnatado de la leche, se llevaron a cabo los tratamientos con alta presión a

250, 350, 450, 550, 700, 800 y 900 MPa, a 15ºC durante 5 min. Para ello, la leche,

atemperada a 15ºC, se dispensó en bolsas selladas térmicamente que se introdujeron en un

equipo de alta presión TE 9000 (Thiot Ingenierie, NC Hyperbaric, Bretenoux, France-Burgos,

España). Este equipo es capaz de alcanzar 900 MPa a una velocidad de 6 MPa/seg, tiene una

cámara de presurización de 2 L de capacidad, y utiliza aceite de silicona como fluido

transmisor, como se ha explicado en detalle en el capítulo II, apartado II.2.2. Los tratamientos

se hicieron por duplicado.

IV.2.3. Fraccionamiento y análisis

Posteriormente, las muestras de leche presurizada se fraccionaron y se analizaron

como se indica en el apartadode Materiales y Métodos generales.(pag. 43-50).

- 118 -

Figura 38. Esquema de la preparación, tratamientos con alta presión, fraccionamiento y análisis de

las muestras

Lechedesnatada

Leche cruda de vaca

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

3000

x g

, 20º

C,

30 m

in15

ºC, 5

min


LechePresurizada250 MPa

Lechepresurizada

350 MPa

Lechepresurizada

450 MPa

Lechepresurizada550 MPa




Lechedesnatada0.1 MPa



NITRÓGENO(Kjeldahl)


PAGE-SDS

PROTEÍNAS

MICELA DE CASEÍNA

(Microscopía electrónica)

Lf e IgA(ELISA)

Análisis

Des

nata

doTr

atam

ient

o co

n al

ta p

resi

ónFr

acci

onam

ient

oA

nális

is

Filtrar por Whatman nº 41

HCl2 N

Reposar 20 min,Centrifugar (4000 x g, 5ºC, 20 min)Filtrar

SU 4.6

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Leche cruda de vacaLeche cruda de vaca

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

Lechedesnatada

3000

x g

, 20º

C,

30 m

in15

ºC, 5

min





Lechepresurizada

350 MPa

Lechepresurizada

350 MPa

Lechepresurizada

450 MPa

Lechepresurizada

450 MPa













NITRÓGENO(Kjeldahl)


PAGE-SDS

PROTEÍNAS

MICELA DE CASEÍNA

(Microscopía electrónica)

Lf e IgA(ELISA)

Análisis

Des

nata

doTr

atam

ient

o co

n al

ta p

resi

ónFr

acci

onam

ient

oA

nális

is

Filtrar por Whatman nº 41

HCl2 N

Reposar 20 min,Centrifugar (4000 x g, 5ºC, 20 min)Filtrar

SU 4.6


- 119 -

IV.3. Resultados

IV.3.1. Efecto de la presión en el tamaño de la micela de caseína

Las fotografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión de la leche

sometida a altas presiones se presentan en la Figura 39. La medida del tamaño de las micelas

mostró que en la leche control presentaban una gran dispersión en el tamaño, desde 255 nm a

17 nm, que fue acortándose por efecto de la presión (Tabla 11, Figura 39). La aplicación de

presión provocó la ruptura de las micelas de caseína y disminuyó el número de micelas de

gran tamaño (Figura 39, Figura 40). A 250 MPa, todavía eran visibles algunas micelas

grandes (231 nm) que desaparecieron a presiones superiores. A partir de 450 MPa, las micelas

mayores medían entre 100 y115 nm, y estaban presentes en bajo número y a todas las

presiones (Tabla 11, Figura 40). Este hecho provocó el aumento del número de micelas de

tamaño comprendido entre 20 y 60 nm que predominantes a presiones ≤ 450 MPa (Figura 40).

Tabla 11. Tamaño de las micelas de caseína (nm) observadas por microscopía electrónica de

trasmisión de leche desnatada control (0.1 MPa) y leche sometida a diferentes presiones durante 5

min.

Tamaño de las micelas de caseína (nm)

Media SD Mínimo Máximo Nº micelas

medidas

0.1 83.82 44.45 16.86 254.89 157

250 56.49 38.39 21.94 234.38 187

450 45.97 15.32 18.84 105.30 179

550 48.10 17.40 14.05 114.63 149

700 52.69 15.34 22.47 103.60 182

800 51.86 15.77 19.86 112.44 164

900 53.65 16.89 19.86 106.90 170

SD indica desviación estándar.

- 120 -

Figura 39. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de leche desnatada control (a) y

leche presurizada a 250, 450, 700, 800 y 900 MPa, 15ºC durante 5 min.

a

b

c

d

e

f

a

b

c

d

e

f


- 121 -

300

250

200

150

100

50

0Tam

año

mic

ela

de c

aseí

na (n

m)

0.1 250 450 550 700 800 900

Presión (MPa)

300

250

200

150

100

50

0Tam

año

mic

ela

de c

aseí

na (n

m)

0.1 250 450 550 700 800 900

Presión (MPa)

Figura 40. Representación en diagrama de caja de los tamaños de las micelas de caseína observados

en leche sin presurizar (0.1 MPa) y presurizada a 250, 450, 550, 700, 800 y 900 MPa, 15ºC durante

5 min a partir de fotografías de microscopía electrónica.

IV.3.2. Efecto de la presión en la distribución proteica

El contenido de proteínas no sedimentables y de proteínas solubles a pH 4.6 de la

leche tratada con altas presiones de 250 a 900 MPa se muestran en la Tabla 12. A 250 MPa se

produjo un incremento significativo (P< 0.05) del contenido proteico de los sobrenadantes de

ultracentrifugación (SU) debido al tratamiento de presión respecto al de la leche sin

presurizar. Sin embargo, a partir de 450 MPa y hasta los 900 MPa, disminuyó dicho contenido

aunque no se observaron diferencias significativas.

Por otro lado, el efecto de la presión se observó de manera notable en las fracciones

solubles a pH 4.6 (Tabla 12). Los contenidos proteicos de estas fracciones disminuyeron

significativamente (P> 0.05) con el aumento del nivel de presión a partir de 250 MPa hasta s

800 MPa, donde esta disminución gradual se estabilizó.

- 122 -

Tabla 12. Contenido proteico (g/L ± desviación estándar) de los sobrenadantes de

unltracentrifugación (SU) y de las fracciones solubles a pH 4.6 (4.6) de la leche desnatada control

(0.1 MPa) y leche presurizada de 250 a 900 MPa, a15ºC durante 5 min.

Presión (MPa) SU 4.6

0.1 10.51b ± 0.07 8.52a ± 0.01

250 12.92a ± 0.04 8.54a ± 0.00

450 11.50ab ± 0.09 6.40 ± 0.00b

550 11.37b ± 0.04 5.82c ± 0.01

700 10.68b ± 0.07 4.87d ± 0.00

800 10.54b ± 0.07 4.34e ± 0.02

900 10.20b ± 0.07 4.24e ± 0.01

a-e Las letras en minúsculas, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el nivel de presión.

El análisis de las fracciones por PAGE-SDS permitió determinar la composición

proteica de las mismas. En los sobrenadantes de ultracentrifugación se observan las bandas

correspondientes a las principales proteínas de la leche (Figura 41a). La intensidad de las

bandas de las caseínas mayoritarias (αS2-, αS1-, β- y κ-CN) aumentó debido a los tratamientos

de presión hasta los 550 MPa (calle 5), indicando un mayor contenido en caseínas no

sedimentables. Sin embargo, el aumento del nivel de presión entre 700 y 900 MPa no produjo

una mayor solubilización de las caseínas. En relación a las proteínas de suero presentes en

estas fracciones, el aumento de la presión hasta 900 MPa produjo la precipitación de la β-Lg y

de las proteínas minoritarias, Lf, Ig y BSA, efecto que fue más perceptible a mayores

presiones y que fue responsable de la disminución observada del contenido en nitrógeno de

las SU (Tabla 12).

En la fracción soluble a pH 4.6, la concentración de proteínas de suero solubles

disminuyó de modo más drástico que en los sobrenadantes de ultracentrifugación (Figura

41b). En este caso, las bandas correspondientes a todas las principales proteínas del suero


- 123 -

disminuyeron de intensidad a medida que se incrementó el nivel de presión y, en el caso de

las proteínas Lf, Ig y BSA, las bandas dejaron de ser perceptibles a presiones > 700 MPa. Esta

severa disminución en el contenido de proteínas solubles justifica la reducción observada

anteriormente en el contenido proteico total de las fracciones solubles a pH 4.6, que llega al

50% tras tratamientos a 900 MPa. (Tabla 12).

Figura 41. PAGE-SDS de los sobrenadantes de ultracentrifugación (a) y de las fracciones solubles a

pH 4.6 (b) de leche desnatada control y presurizada a 250-900 MPa y 15ºC durante 5 min. Calles: 1.

Leche desnatada; 2-8: tratamientos con presión a 250, 450, 550, 700, 800 y 900 MPa.

En la Figura 42 se muestran los electroforegramas de los sobrenadantes de

ultracentrifugación de leche sometida a las mayores presiones ensayadas, comprendidas entre

700 y 900 MPa. Los electroforegramas mostraron que se produjo un incremento en el

contenido de todas las caseínas solubles en los sobrenadantes de ultracentrifugación respecto

al contenido de los sobrenadantes de leche control, al igual que habíamos observado

anteriormente (análisis por SDS-PAGE), que fue máximo a presiones comprendidas entre 250

y 550 MPa. Sin embargo, la utilización de presiones de 700, 800 y 900 MPa no solubilizó más

caseínas, permaneciendo constante su contenido (Tabla 13).

En esta fracción también se observaron proteínas de suero. Las utilización de

presiones ≥ 700 MPa redujo la solubilidad de la β-Lg al pH normal de la leche en un 37%,

aproximadamente, a 900 MPa. En cambio, en la α-La, dichas presiones no produjeron

significativas pérdidas de solubilidad (Figura 42, Tabla 13).

α-Laβ-Lg

LfBSAIg

1 2 3 4 5 6 7 8

β-CN

αs2-CN

κ-CN

αs1-CN

1 2 3 4 5 6 7 8

a) b)

α-Laβ-Lg

LfBSAIg

1 2 3 4 5 6 7 8

β-CN

αs2-CN

κ-CN

αs1-CN

1 2 3 4 5 6 7 8

a) b)

- 124 -

Tabla 13. Proteínas individuales presentes en los sobrenadantes de ultracentrifugación (SU)

obtenidos a partir de leche desnatada control (0.1 MPa) y leche presurizada a 700, 800 y 900 MPa, a

15ºC, durante 5 min (los valores se representan como porcentaje del contenido individual de cada

caseína en la leche cruda desnatada, estimado por EC).

Presión

(MPa) α-La β-Lg αs2- αs1- αs1- 9P Κ-CN βA1- βA2-

0.1 99.48a 101.94a n.d. 7.37b 7.54b 9.11b 9.24b 8.43b

700 97.23a 80.03b 18.23a 20.50a 27.50a 31.97a 20.83a 22.79a

800 89.36a 59.44c 21.67a 22.55a 23.51a 30.83a 19.03a 21.47a

900 90.65a 62.95c 22.21a 20.53a 22.78a 30.91a 18.59a 21.99a

SD 12.51 2.90 1.35 2.58 2.25 2.58 2.17 1.67

a-d Diferentes superíndices, en columnas, indican diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el tratamiento de presión. SD indica la desviación estándar.


- 125 -

Figura 42. Electroforegramas de leche desnatada control (a) y sobrenadantes de ultracentrifugación

de: leche desnatada control (b) y leche presurizada a 700, 800 y 900 MPa y 25ºC (c-e). 1: α-La; 2:

β-Lg; 3: αs2-CN; 4: αs1-CN; 5: αs1-CN 9P; 6: κ-CN; 7: βB-CN; 8: βA1-CN; 9: βA2-CN.

a

4

1

23

5

98

7

6


A 21

4 nm

0

0.04

0

0.04

0

0.04

10 15 20 25 30 35 40

d

e

0.08

0.12

0.14

0

0.04

b

c

0

0.04

a

4

1

23

5

98

7

6

a

4

1

23

5

98

7

6


A 21

4 nm

0

0.04

0

0.04

0

0.04

10 15 20 25 30 35 40

d

e

0.08

0.12

0.14

0

0.04

b

c

0

0.04


A 21

4 nm

0

0.04

0

0.04

0

0.04

10 15 20 25 30 35 40

d

e

0.08

0.12

0.14

0

0.04

bbb

c

0

0.04

- 126 -

La Tabla 14 muestra que, a medida que aumenta la presión, aumenta la relación

caseínas/proteínas de suero en los SU procedentes de la leche presurizada respecto al SU de la

leche control, al aumentar progresivamente el contenido en caseína soluble. Debido a la

desnaturalización de la β-Lg, también aumenta, sobre todo a partir de 550 MPa, la proporción

de α-La respecto a la suma α-La+ β-Lg.

Tabla 14. Suma de las áreas de los picos correspondientes a la fracción de proteínas de suero y a la

fracción de caseínas obtenidos por electroforesis capilar (en unidades arbitrarias) de la leche cruda

de vaca y de los sobrenadantes de ultracentrifugación (SU) obtenidos a partir de leche desnatada

control (0.1 MPa) y leche presurizada a 250, 450, 550, 700, 800 y 900 MPa, a 15ºC, durante 5 min.

Entre paréntesis se muestra el porcentaje que supone cada fracción. También se indica el porcentaje

de α-La respecto de la suma de α-La y β-Lg.

Presión

(MPa)

Área de las

proteínas de

suero (%)

Área de las

caseínas (%)

Relación

caseínas/pro-

teínas de suero

% α-La

respecto de la

suma α-La +β-

Lg.

leche 26.35 (12.65) 182.04 (87,35) 6.9 21.82

0.1 26.72 (64.84) 14.49 (35.17) 0.54 21.41

250 28.44 (43.60) 36.78 (56.40) 1.29 21.52

450 27.06 (42.10) 37.20 (57.90) 1.37 21.95

550 24.27 (28.69) 38.45 (61.30) 1.58 25.79

700 22.08 (34.89) 41.20 (65.11) 1.86 25.32

800 18.10 (31.47) 39.41 (68.53) 2.17 28.34

900 15.18 (27.67) 39.68 (72.33) 2.61 34.32

Los electroforegramas (EC) de la fracción soluble a pH 4.6 corroboraron claramente la

desnaturalización de las proteínas de suero tratadas con altas presiones. Como era de esperar,

la β-Lg fue más sensible a la presión que la α-La (Figura 43). La β-Lg comienza a

desnaturalizarse a 250 MPa (12%), y la desnaturalización aumenta progresivamente con el

aumento de la presión hasta los 800 MPa. A presiones ≥ 800 MPa solamente un 13-16% de

esta proteína permanece soluble a pH 4.6 (Figura 43, Figura 44). Sin embargo, la α-La


- 127 -

permanece prácticamente invariable hasta los 550 MPa, alcanzando una desnaturalización del

42% a 900 MPa (Figura 43).

Figura 43. Contenido en α- La ( ) y β-Lg ( ) de la fracción soluble a pH 4.6, medido por EC,

de leche control (0.1 MPa) y presurizada a 700, 800 y 900 MPa. Las barras representan la desviación

estándar. Las letras en minúsculas con el mismo color indican diferencias significativas (P< 0.05)

producidas por el nivel de presión.

0

20

40

60

80

100

120

0.1 700 800 900

Presión (MPa)

Prot

eína

s de

suer

oso

lubl

es (%

)a

b bcc

a

b c c

0

20

40

60

80

100

120

0.1 700 800 900

Presión (MPa)

Prot

eína

s de

suer

oso

lubl

es (%

)a

b bcc

a

b c c

- 128 -

Figura 44. Electroforegramas de la fracción soluble a pH 4.6 de leche desnatada control (a) y de

leche presurizada a 250, 450, 550, 700, 800 y 900 MPa, 15ºC durante 5 min (b-g).

10 15 20 25

A 21

4 nm


b

c

d

e

f

aα-La

β-Lg

g

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0.02

0.04

0

0.02

0.02

0.04

0.04

0

0.04

0

0.02

0

0.04

0.02

010 15 20 25

A 21

4 nm


b

c

d

e

f

aα-La

β-Lg

g

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0.02

0.04

0

0.02

0.02

0.04

0.04

0

0.04

0

0.02

0

0.04

0.02

0

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0

0.02

0.04

0.02

0.04

0

0.02

0.02

0.04

0.04

0

0.04

0

0.02

0

0.04

0.02

0


- 129 -

En este estudio también se evaluó el efecto de las altas presiones (250-900 MPa) sobre

las proteínas minoritarias del suero de interés nutricional, en concreto Lf e IgA. Los

contenidos en Lf de la leche presurizada hasta 900 MPa y de sus fracciones se muestran en la

Figura 45. La leche desnatada control presentó un contenido de 0.14 mg/mL que fue

disminuyendo por efecto de la presión hasta los 900 MPa, hasta alcanzar 0.0035 mg/mL. En

general, las fracciones solubles a pH 4.6 presentaron el mismo contenido en Lf que la leche de

la que procedían, mientras que, en los sobrenadantes de ultracentrifugación, el nivel de Lf

observado fue significativamente inferior a todas las presiones estudiadas. En cualquier caso,

todas las fracciones presentaron el mismo comportamiento frente a la presión: a partir de 550

hasta 800 MPa, el contenido de Lf se redujo significativamente (P< 0.05). A 900 MPa

también disminuyó, pero las diferencias no fueron significativas.

Figura 45. Contenido en lactoferrina de: leche desnatada control (0.1 MPa) y presurizada de 250 a

900 MPa ( ), los sobrenadantes de ultracentrifugación ( ) y las fracciones solubles a pH 4.6 ( ).

Las barras representan la desviación estándar. Las letras en minúscula indican diferencias

significativas (P< 0.05) producidas por el nivel de presión en cada fracción (indicada con el mismo

color). * indica diferencias significativas (P< 0.05) de los sobrenadantes de ultracentrifugación

respecto a las otras 2 muestras a la presión indicada y * indica diferencias significativas entre la

leche y la fracción soluble a pH 4.6 a la presión indicada.

El contenido de IgA en la leche control (0.24 mg/mL) fue similar en las tres muestras

estudiadas (Figura 46). Al aplicar alta presión, este contenido disminuyó progresivamente

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.1 250 450 550 700 800 900

Tratamiento de presión (MPa)

Lf(

mg/

mL

)

ba*

c

d

ef* g*

aabb

cd

e e

a*b* b*

c* d*e* e*

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.1 250 450 550 700 800 900


Lf(

mg/

mL

)

ba*

c

d

ef* g*

aabb

cd

e e

a*b* b*

c* d*e* e*

- 130 -

hasta los 700 MPa, tanto en la leche como en los sobrenadantes de ultracentrifugación y las

fracciones solubles a pH 4.6, llegando a detectarse solamente 0.0079 mg/mL a 700 MPa. A

presiones superiores también se observaron reducciones de su contenido, pero las diferencias

no fueron significativas (se detectaron 0.0035 y 0.00011 mg/mL de IgA en leche presurizada

a 800 y 900 MPa, respectivamente).

Figura 46. Contenido en inmunoglobulina A de leche desnatada control (0.1 MPa) y presurizada de

250 a 900 MPa ( ), de los sobrenadantes de ultracentrifugación ( ) y de las fracciones solubles a pH

4.6 ( ). Las barras representan la desviación estándar. Las letras en el mismo color indican

diferencias significativas (P< 0.05) producidas por el nivel de presión en cada fracción. * indica

diferencias significativas (P< 0.05) de los sobrenadantes de ultracentrifugación respecto a las otras

dos muestras a la presión indicada y * indica diferencias significativas entre la leche y la fracción

soluble a pH 4.6 a la presión indicada.

IV.4. Discusión

Los resultados obtenidos indican que el tratamiento de leche a presiones muy

elevadas, en torno a 700-900 MPa, no disminuyó el tamaño micelar ni indujo mayor

solubilización de caseínas respecto a tratamientos a presiones inferiores de 450-550 MPa. Sin

embargo, estos tratamientos produjeron una severa desnaturalización de las proteínas del

suero, sobre todo de la β-Lg y de las proteínas minoritarias, Lf e IgA.

0

0.1

0.2

0.3

0.1 250 450 550 700 800 900


IgA

(mg/

mL

)

ab*

c

d*

e* e* e

b

aa

c

d d d

a a

b

c*

d* d* d

0

0.1

0.2

0.3

0.1 250 450 550 700 800 900


IgA

(mg/

mL

)

ab*

c

d*

e* e* e

b

aa

c

d d d

a a

b

c*

d* d* d


- 131 -

Hasta el momento no existían estudios sobre el efecto de presiones muy elevadas

(700-900 MPa) en las propiedades de las micelas de caseína o en la distribución proteica de la

leche. En general, y como ya se ha mencionado anteriormente, el tamaño micelar medio de la

leche tratada a 100-200 MPa a temperatura ambiente se considera comparable al de la leche

sin tratar; las micelas en la leche presurizada a 250 MPa durante periodos superiores a 15 min

presentan mayor tamaño; mientras que en la leche presurizada a más de 300 MPa se han

observado reducciones de tamaño de hasta el 50% (Huppertz y col., 2004a; Anema y col.,

2005a) y se mantienen así durante el posterior almacenamiento de la leche presurizada

(Huppertz y col., 2004a).

La observación de la micela de caseína por microscopía electrónica de transmisión nos

permitió evaluar el efecto de la presión en el tamaño micelar (Figura 39). Los tratamientos

con alta presión redujeron el diámetro medio de la micela de caseína hasta los 450 MPa,

presión a la cual se alcanzó un plateau. García-Risco y col. (2000) observaron, con esta

misma técnica, que a 300 y 400 MPa, (20ºC, 15 min) disminuía el diámetro de la micela de

caseína de 150-300 nm, en la leche sin presurizar, a 40 nm en la presurizada y que la

distribución de tamaño se hacía más homogénea. Por lo general, se considera que, en torno a

los 300 MPa en tratamientos de 15 min a temperatura ambiente, se produce la máxima

disgregación (Scollard y col., 2000; García-Risco y col., 2003; Anema, 2008a) no observando

modificaciones adicionales en el tamaño hasta los 800 MPa. En nuestro estudio el menor

tamaño se encontró a 450 MPa, aunque no se pudo comprobar si, efectivamente, era similar a

300 MPa como afirman otros autores (Figura 40, Tabla 11). De acuerdo con García-Risco y

col (2003), a 250 MPa se observaron micelas de gran tamaño, similares a las presentes en la

leche sin presurizar (en torno a 200 nm), sin embargo, a presiones ≥ 450 MPa todas las

micelas fueron inferiores a 115 nm, corroborando las observaciones hechas por Needs y col.

(2000b) a 400 y 600 MPa, y un 50 % de las micelas estuvieron comprendidas entre 20 y 60

nm.

La disgregación de las micelas de caseína se debe a la solubilización del CCP y a la

ruptura de las interacciones hidrofóbicas y electroestáticas intramicelares (Schrader y col.,

1997). De hecho, medidas in situ, han demostrado que la solubilización del CCP es

proporcional a la presión aplicada y es completa a 400 MPa, presión a la que la disrupción

- 132 -

micelar también es completa e irreversible (Huppertz y De Kruif, 2007a). Tal disgregación es

responsable de que, además de disminuir el tamaño micelar, aumente el número de micelas de

caseína y el contenido en proteína no sedimentable por ultracentrifugación, como ya se

explicó en los capítulos II y III. En este estudio, los cambios observados en el tamaño micelar

fueron concordantes con los niveles de caseína soluble en los sobrenadantes de

ultracentrifugación a presiones de 700-900, puesto que no se detectó un incremento

significativo en el contenido de caseínas no sedimentables respecto a los observados a

menores presiones (250-550 MPa) (Tablas 12, 13 y Figura 42). Así, Anema y col. (2005a)

indicaron que el nivel de caseínas no sedimentables está inversamente correlacionado con el

tamaño de la micela de caseína, excepto para las muestras agregadas a 250 y 300 MPa.

Los tratamientos a presiones muy elevadas produjeron cambios en las proteínas de

suero solubles a pH 4.6 (Figura 41, 43, 44). Se observó una severa desnaturalización de la β-

Lg a presiones ≥ 700 MPa, en torno al 77%. Garcia-Risco y col. (2000) ya habían observado

este grado de desnaturalización a presiones inferiores (400 MPa, 30 min) probablemente

debido a la mayor duración del tratamiento. Esta proteína comienza a desnaturalizarse a 100

MPa, aunque la desnaturalización depende del nivel de presión, de la temperatura (López-

Fandiño y col., 1996; Huppertz y col., 2002; Anema y col., 2005b) y, como se muestra en el

capítulo anterior, de la duración del tratamiento A partir de 200 MPa durante 30 min, Anema

(2008a) observó, aproximadamente, un 30% de desnaturalización de la β-Lg, que se fue

incrementando con el aumento de la presión, llegando al 90% a 800 MPa.

La α-La se desnaturaliza por alta presión notablemente menos que la β-Lg (Huppertz

y col., 2004b); Patel y col., 2006), debido al mayor número de puentes disulfuro que presenta

la molécula (4 frente a 2 de la β-Lg) y a la ausencia de grupos sulfidrilo libres que pudieran

interaccionar con otras proteínas (Hinrichs y col., 1996). Esta proteína permanece estable

hasta los 400-500 MPa (Anema y col., 2005b; Hinrichs y Rademacher, 2005), sin embargo, a

mayores presiones se hace patente la desnaturalización de la α-La (Figura 41, 43, 44), como

ya se indicó en el Capítulo II. Tras tratamientos a 800MPa, a 20ºC durante 30 min, se han

observado desnaturalizaciones de, aproximadamente el 35% (Huppertz y col., 2004b, Anema

y col. (2008a), similares a las obtenidas en nuestro estudio.


- 133 -

La solubilización de caseínas producida por la alta presión, junto con el hecho de que

la desnaturalización de la β-Lg se produzca en mayor medida que la de la α-La, hace posible

seleccionar las condiciones que proporcionan sobrenadantes de ultracentrifugación de leche

presurizada de vaca que simulen la composición de la leche de mujer. Como se muestra en la

Tabla 14, presiones en torno a 450 o 550 MPa proporcionan, en los sobrenadantes de

ultracentrifugación, relaciones de caseínas a proteínas de suero de, aproximadamente, 1.4-1.6,

que se asemejan a la relación recomendada en las fórmulas infantiles de 1.5 (60:40

caseínas:seroproteínas). La relación en la leche de partida fue de 6.9, superior a la descrita

normalmente para una leche de vaca (4), posiblemente porque, con nuestro método, sólo

cuantificamos β-Lg y α-La, con lo que no se tiene en cuenta la contribución de otras proteínas

minoritarias del suero como la BSA, etc. Cabría esperar, entonces, que las relaciones fueran

ligeramente superiores a las que se muestran en la Tabla 14. Por otra parte, el contenido en

proteína soluble de los sobrenadantes de ultracentrifugación de las muestras empleadas en

este estudio (comprendido entre el 1.05 y el 1.29 %. Tabla 12) también resultó similar al de la

leche humana (aproximadamente 0.94% de media, Manso et al. 2007). Finalmente, debe

tenerse en cuenta que la leche humana no contiene β-Lg, por lo que la α-La supone

aproximadamente el 30% del total de proteínas. Presiones ≥ 700 MPa desnaturalizan más β-

Lg y aumentan la proporción de α-La dentro del total de las proteínas de suero (Tabla x.3),

pero también incrementan el contenido en caseína soluble sin reducir considerablemente el de

β-Lg. Además, presiones en torno a 450 o 550 MPa mantendrían en mayor medida los niveles

de proteínas minoritarias, Lf e IgA, nativas, respecto a presiones más elevadas.

Los efectos de la alta presión en estas proteínas minoritarias han sido bastante

ignorados. El contenido de Lf en la leche bovina puede variar entre 0.02 y 0.2 mg/mL según

el periodo de lactación (Steijns y Van Hooijdonk, 2000). El contenido en Lf determinado en

la leche control antes del fraccionamiento fue de 0.14 mg/mL y disminuye al aumentar la

presión hasta llegar a 0,00011 mg/mL a 900 MPa (Figura 45), debido probablemente a la

desnaturalización de la Lf. Los niveles de Lf encontrados en la fracción soluble a pH 4.6

fueron similares a los de la leche antes de fraccionar (0.14 a 0.0026 mg/mL), pues la

recuperación de Lf en suero de leche cruda sin calentar es prácticamente completa y sólo se

reduce a medida que se incrementa la desnaturalización (Brisson y col., 2007). Sin embargo,

el contenido fue considerablemente menor en el sobrenadante obtenido por

ultracentrifugación (0.09 a 0.0015), probablemente debido a que una parte de la Lf

- 134 -

desnaturalizada pueda estar unida a fragmentos caseínicos no sedimentables (Figura 45). La

Lf establece interacciones intermoleculares vía puentes disulfuro con las caseínas y otras

proteínas séricas durante el calentamiento de la leche (Brisson y col., 2007) por lo que durante

los tratamientos de alta presión también podrían formarse estas uniones.

Nuestros resultados indican que la IgA se desnaturaliza a presiones comprendidas

entre 250-450 MPa (Figura 46) y su contenido va disminuyendo a medida que se incrementa

el nivel de presión, hasta niveles muy bajos a presiones ≥ 700 MPa. En leche humana,

también se ha observado la desnaturalización de la IgA a presiones ≥ 400 MPa, aumentando

con la aplicación de presiones crecientes durante 5 min. Sin embargo, Viazis y col. (2007)

observaron que la inmunoreactividad y la concentración de IgA en leche humana presurizada

(400 MPa durante 30, 60, 90 y 120 min) fue significativamente mayor (P< 0.05) que en la

misma leche pasteurizada.

IV.5. Conclusiones

El tratamiento de leche a presiones muy elevadas, en torno a 700-900 MPa, no

disminuyó el tamaño micelar ni indujo mayor solubilización de caseínas respecto a

tratamientos a presiones inferiores de 450-550 MPa. Sin embargo, estos tratamientos

produjeron una severa desnaturalización de las proteínas del suero, sobre todo de la β-Lg y de

las proteínas minoritarias, Lf e IgA, aunque también condujeron a una apreciable

desnaturalización de la α-La. Por ello, el mejor compromiso para producir fracciones

proteicas con una concentración de proteína y una relación de caseínas a proteínas de suero

similar a la de la leche humana, seria utilizar presiones de 450-550 MPa aplicadas durante 5

min. Estos tratamientos proporcionan, sobrenadantes de ultracentrifugación, con contenidos

en proteína entre el 1.05 y el 1.29 % y relaciones de caseínas a proteínas de suero de,

aproximadamente, 1.4-1.6, aunque contienen una apreciable proporción de β-Lg

desnaturalizada soluble.

5. CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

- 137 -

1. Los tratamientos con alta presión a 650 MPa durante 5 min, aplicados a fórmulas infantiles,

no producen isomerización de la lactosa, ni avance de la reacción de Maillard y, comparados

con tratamientos UHT, conducen a una menor desnaturalización de las proteínas mayoritarias

y minoritarias (lactoferrina e inmunoglobulina A secretora) del suero, por lo que mejoran la

calidad nutritiva de las fórmulas.

2. La aplicación de tratamientos con alta presión en distintos equipos y a diferentes escalas,

industrial y piloto, da lugar a diferentes distribuciones proteicas, sobre todo en lo que se

refiere a la desintegración micelar. Los diferentes equipos proporcionan grados de

desnaturalización de las proteínas de suero más homogéneos, a niveles de presión

equivalentes.

3. La velocidad de despresurización juega un papel fundamental en la distribución de

proteínas entre las fases soluble y coloidal de la leche presurizada, puesto que el contenido en

caseína soluble aumenta significativamente durante la fase de despresurización respecto a la

fase de mantenimiento de la presión. Cuanto más lenta es la velocidad de despresurización,

mayor es el nivel de caseína soluble.

4. La desnaturalización de la β-Lg tiene lugar, mediante enlaces disulfuro, fundamentalmente

durante la fase de mantenimiento de la presión, produciéndose muy poca desnaturalización

durante la fase de despresurización. La mayoría de las proteínas de suero desnaturalizadas,

unidas o no a las partículas de caseína no sedimentables, permanecen solubles al pH normal

de la leche.

5. La presencia de caseína promueve la desnaturalización de las proteínas del suero, pero el

grado de desnaturalización de las proteínas de suero no influye en la ruptura micelar y en la

subsiguiente solubilización de caseínas que tiene lugar en la leche presurizada.

6. El tratamiento de leche a presiones muy elevadas, en torno a 700-900 MPa, no disminuye

el tamaño micelar ni induce mayor solubilización de caseínas respecto a tratamientos a

presiones inferiores de 450-550 MPa. Sin embargo, estos tratamientos producen una severa

desnaturalización de las proteínas del suero, sobre todo de la β-Lg y de las proteínas

minoritarias, Lf e IgA.

- 138 -

7. Presiones de 450-550 MPa aplicadas durante 5 min permiten producir fracciones proteicas

con una concentración de proteína entre el 1.05 y el 1.29 % y una relación de caseínas a

proteínas de suero de, aproximadamente, 1.4-1.6, similar a la de la leche humana, aunque

contienen una apreciable proporción de β-Lg desnaturalizada soluble.

6. BIBLIOGRAFÍA

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