Biologa de

las clulas

nerviosas

Tema 1: Introduccin a la biologa de las clulas nerviosas

Referencias anatmicas

Existen 3 planos de referencia:

-Eje anteroposterior o rostro caudal

-Eje Dorso-ventral

-Eje Medio-lateral

Existen estructuras ipsolaterales u homolaterales, y estas estructuras se encuentran en el mismo lado

respecto a la lnea media. Si se encuentran a ambos lados, son estructuras contralaterales.

Estos ejes dan lugar a tres tipos de cortes:

-Sagital: a lo largo de eje antero-posterior y medio-lateral.

-Horizontal o longitudinal: a lo largo del eje antero-posterior,

pero dorsal y ventral.

-Coronal o transversal: a lo largo del eje dorso-ventral.

Organizacin del SN

SNC

Tenemos una serie de protecciones, hueso, meninges y lquido cefalorraqudeo. El hueso conforma el

crneo y la columna vertebral y conforma la primera defensa. A continuacin encontramos las

meninges, formadas por tres capas, duramadre, aracnoides y piamadre. Entre estas capas

encontramos el espacio subdural, que suele estar vaco, y el espacio subaracnoideo, lleno de lquido

cefalorraqudeo. Los vasos entran por medio de la piamadre y salen por la duramadre, y as irrigan el

cerebro. El lquido cefalorraqudeo se crea en los ventrculos y se drena para que circule por el

espacio subaracnoideo. Es una doble proteccin, fsica porque amortigua los golpes gracias al flotar

en l el encfalo y adems la presin sobre vasos y nervios es menor, y qumica porque permite la

limpieza y renovacin del lquido intersticial gracias a un intercambio con el lquido cefalorraqudeo.

Otra barrera de proteccin es la hematoenceflica, una barrera entre la sangre y el encfalo, lo que

evita que muchas sustancias que van en sangre como los frmacos afecten a las neuronas. Estos

capilares estn muy pegados unos a otros y dan lugar a una seleccin muy selectiva, por tanto van a

ser necesarios distintos transportadores para transportar las diferentes sustancias esenciales como la

glucosa a travs de la barrera hematoenfeflica. Las sustancias liposolubles y/o pequeas atraviesan

libremente la membrana. Aun as, existen zonas donde no existe la barrera hematoenceflica, como

son la hipfisis exterior (produce y secreta hormonas a la sangre) y centro del vmito en el bulbo.

-La Mdula espinal tiene tres funciones: controla los

movimientos corporales, regula las funciones

viscerales y procesa la informacin sensorial. Las

lesiones son muy tiles para estudiar las funciones de

la mdula espinal. Una seccin a un determinado nivel

de la mdula, no har posible que se puedan recibir

sensaciones de la parte seccionada, ni que se puedan

emitir rdenes para realizar una accin. En cuanto a la

estructura de la mdula espinal, con un corte

transversal se encuentra la sustancia blanca al exterior

(axones) y en forma de mariposa en el interior la

sustancia gris (somas). Encontramos dos astas dorsales

y dos astas ventrales, las dorsales reciben la

informacin sensorial y en las ventrales se encuentran

las motoneuronas que llevan la informacin motora hasta msculos, glndulas o vsceras.

La mdula se divide en cuatro segmentos, torcica, lumbar, cervical y sacra. Por cada escotadura de

las vrtebras salen un par de nervios espinales mixtos, con informacin sensorial (raz dorsal, con un

engrosamiento llamado ganglio de la raz dorsal donde se encuentran los somas de las neuronas

sensoriales) y motora (raz ventral, cuyas neuronas conectan con interneuronas). Se organizan de tal

manera que los nervios sensoriales vierten la informacin al asta dorsal, y de aqu se pueden

informar al encfalo o integrar la informacin y dar una respuesta. Cualquiera de los dos caminos

conecta con el asta ventral y transmite la informacin de las motoneuronas que darn la informacin

para ejecutar una accin motora.

La sustancia blanca son axones mielinizados, llevan informacin tanto aferente (informacin

sensorial, de la mdula al encfalo) como eferente (desde el encfalo hacia la mdula espinal, son

haces descendente). Cuando los haces terminan en espinal, significa que terminan en la mdula.

Tiene que existir un cruce de informacin que sucede en la mdula, pero generalmente en el ncleo.

-Encfalo, tambin encontramos SG y SB cuya organizacin es contraria a la mdula espinal. Cuando

se hablan de grupos de somas se denominan ncleos y en el caso de los axones tractos. El encfalo

se divide en varias partes, a simple vista se aprecia el cerebro, cerebelo y bulbo y las que no se

pueden apreciar a simple vista son diencfalo, msencfalo y protuberancia.

-Cerebro: o telencfalo, la parte de mayor

tamao con dos hemisferios cerebrales,

separadas por la fisura sagital, pero no es una

separacin total, pues existe coordinacin a

travs de las fibras, como las que se

encuentran en el cuerpo calloso y la comisura

anterior. El cerebro no es plano, presenta

circunvoluciones y surcos o cisuras, lo que

produce un mayor aprovechamiento del

espacio, y nos indican el grado de

procesamiento del cerebro. Existen cuatro

lbulos, occipital (visin), temporal (audicin), parietal (sensaciones somestsicas, tacto,

presin temperatura y dolor) y frontal (control movimientos). Algunos investigadores hablan

de un quinto lbulo, nsula, que le dan funciones como control de la memoria e integracin

de informacin sensorial y motora. La corteza el cerebro de pocos milmetros de espesor.

Sobre ella existe un mapa corporal, representade manera inversa el cuerpo. Adems, hay

zonas ms representadas que otras (homnculo somatosensorial), y son aquellas ms

inervadas o que reciben ms informacin. Las neuronas se organizan en capas y columnas.

Encontramos el rea motora (corteza motora, que se encarga de los movimientos finos,

premotora, que se encarga de los movimientos cordinados y rea de broca, que se encarga

del lenguaje, y slo se encuentra en el hemisferio izquierdo), el rea de las sensaciones

somestsicas (primaria, que integra la informacin y secundaria que emite una orden), el

rea de la visin (primaria y secundaria), el rea de la audicin (primaria y secundaria), el

rea de Wernicke (que es la que le da sentido al lenguaje, la que hace que digamos cosas

lgicas) y el rea de la memoria reciente.

-Ganglios basales: control del movimiento voluntario, emociones y cognicin.

-Sistema lmbico: rodea al tronco del encfalo, y es una de las zonas ms primitivas. Contiene

el giro circular, que presenta la emocin, la memoria y coordina la respuesta ante el estrs; la

amgdala, el control del comportamiento y el centro del miedo; el hipocampo, aprendizaje y

memoria.

-Cerebelo: se encarga de procesar informacin sensitiva, coordina la ejecucin del

movimiento, mantiene la postura y el equilibrio, determina la secuencia temporal. Le llega

informacin sensitiva, por parte de la mdula espinal y motora, a travs del cerebro. No

existe decusacin, la parte izquierda del cerebelo controla laparte izquierda del cuerpo.

Encontramos la vermis y dos hemisferios cerebelos os. La sustancia blanca se encuentra en el

interior, e inmersos en ella se encuentran los ncleos profundos, que son la salida del

cerebelo.

-Diencfalo: tlamo (zona de relevo por excelencia, la informacin llega al tlamo y eva la

informacin a la corteza, pero tambin es un centro integrador que puede integrar y

procesar la informacin que le llega), hipotlamo (controla muchas funciones, hambre,

sexuales, diferentes respuestas, y secrecin de hormonas a la hipfisis), hipfisis

(adenohipfisis, endocrina y neurohipfisis, que libera las hormonas producidas por el

hipotlamo) y glndula pineal (marca los ritmos circadianos, produce melatonina).

-Tronco del encfalo: la estructura ms importante, ya que presenta centros muy

importantes como el respiratorio, adems, es el origen de 10 de los 12 pares craneales.

Mesencfalo (control de movimientos oculares y reflejos auditivos y visuales), que presenta

el tectum (con los colculos superiores, visin, e inferiores, audicin), protuberancia (regula la

respiracin junto con el bulbo) y el bulbo (se produce la decusacin de las fibras de un lado a

otro en una zona llamada las pirmides del bulbo. Presenta varios centros, como el del

vmito o el centro generador del ritmo respiratorio).

SNP

-Somtico (piel, msculo, articulaciones) y visceral o autnomo. Neuronas aferentes y eferentes.

Pares craneales, doce pares. Olfativo, ptico, oculo-motor, troclear, trigmino, abducens o

motoocular externo, facial, coclear, glosofarngeo, vago, espinal accesorio e hipogloso.

Tema 2: Clulas nerviosas I, neuronas.

Las neuronas son clulas excitables, clulas que ante un estmulo producen una respuesta, en este

caso elctrica. Son clulas nerviosas al igual que las clulas gliales. Antes de la teora celular de

Santiago Ramn y Cajal, se pensaba que las neuronas estaban unidas fsicamente unas con otras, la

denominada teora reticular. Con el uso de la tincin de Golgi, se descubri que no exista esa

continuidad fsica.

Otras definiciones de neurona:

-Reciben un estmulo y transmiten potenciales de accin

-Envan seales elctricas constantes a larga distancia

-Procesan y almacenan informacin

Partes de la neurona

-Soma: centro metablico de la clula donde se encuentran mayoritariamente los orgnulos y es el

lugar donde se sintetizan las protenas.

-Dendritas: se encargan de recibir la informacin entrante, y se ramifican en forma de rbol. En su

superficie se encuentran las espinas dendrticas, unas prolongaciones que aumentan la superficie de

contacto. A este nivel NO se producen PAs, pero s se producen potenciales locales.

-Axn y cono axnico: tiene siempre el mismo dimetro. Puede ramificarse y dar lugar a colaterales

axnicas, y al final se encuentran los terminales axnicos, donde sucede la sinapsis. La funcin es la

conduccin del potencial de accin y la sinapsis con la siguiente neurona. Pueden existir "botones en

passant", unas protuberancias a lo largo del axn. El cono axnico se diferencia fcilmente del axn

gracias a la gran cantidad de mitocondrias, las vesculas sinpticas, y la gran cantidad de protenas en

la membrana.

Clasificacin

-Funcin

-Estructura

-Polares

-Bipolares

-Multipolares

-Anaxnicas

-Distribucin de las dendritas (estrelladas y piramidales)

-Longitud del axn (clulas de Golgi tipo I o de proyeccin y de tipo II o de circuito local)

-Neurotransmisores

Tema 3: Potenciales de accin, locales y de membrana.

Potencial de membrana

Potencial de membrana: diferencia de cargas entre el interior y exterior de la membrana. En el

interior encontramos en mayor proporcin potasio y aniones, y en el exterior sodio, cloro y calcio.

Con un electrodo en el interior de la clula conectado a un voltmetro, y como toma de tierra en el

exterior de la clula, encontramos un potencial de membrana de -65 mV, lo que indica que el interior

est cargado negativamente respecto al exterior.

Para calcular el potencial de membrana en reposo se utiliza la ecuacin de Goldman.

En algunos casos se incluye tambin el cloro, pero como tiene carga negativa se invierten los factores

para ste. Vemos que el potasio es ms permeable que el sodio, por eso el potencial de equilibrio de

la membrana es ms parecido al potencial de equilibrio del potasio. El potencial de equilibrio de

membrana tambin depende de la bomba Na-K, salen 3Na por cada 2K que mete. Tambin participa

la bomba de calcio. Potencial de equilibrio, potencial de membrana en el que un ion se encuentra en

equilibrio, sale y entra en la misma cantidad.

-Despolarizacin: se habla de este trmino cuando el potencial de membrana se hace ms positivo.

-Hiperpolarizacin: se habla de este trmino cuando el potencial de membrana se hace ms

negativo. En este caso el tope es el mismo que el potencial de equilibrio del K.

Potencial local

Se define como un cambio del potencial de membrana en respuesta a corrientes sub-umbrales.

Cuando los estmulos son sub-umbrales, se habla de

potencial local, y cuando son superiores al umbral, se

habla de potencial de accin.

-Constante de tiempo: tiempo que tarda en alcanzar

2/3 del valor final de cambio de voltaje, por ejemplo,

de -65 a -55 mV, el valor final es 10. Cuanto mayor es

la constante de tiempo, cuanto ms tarda la clula en

cambiar el voltaje, mayor es la probabilidad de que

se sumen los estmulos.

-Constante de espacio: espacio que tiene que recorrer

el potencial local para hacerse 2/3 de su valor inicial. El

potencial local se caracteriza porque se propaga en

decremento. Cuanto mayor es la constante de espacio,

ms probable es que se produzca la sumacin.

Los potenciales locales son respuestas graduadas,

cuando mayor es el estmulo mayor es la respuesta y se

propagan con decremento. En las membranas post-

sinpticas slo se pueden registrar potenciales locales,

que pueden sumarse y dar lugar a potenciales de

accin, pero no se reciben como potenciales de accin tal cuales, la suma de los locales en la

membrana del soma o de las dendritas puede dar lugar a un potencial local. Cmo da lugar a un PA?

gracias a la sumacin temporal y espacial.

-Sumacin temporal: requiere de la sumacin de estmulos cercanos en el tiempo. Los estmulos

pueden ser excitadores o inhibidores. Hay que tener en cuenta la constante de tiempo, si es mayor,

beneficia a la sumacin temporal.

-Sumacin espacial: requiere de la sumacin de estmulos cercanos entre s. Tambin hay que tener

en cuenta la constante de espacio.

Un potencial local despolarizante es excitatorio porque, aumenta la probabilidad de que ocurra el

potencial de accin

Un potencial local hiperpolarizante es inhibidor ya que disminuye la probabilidad de que ocurra el

potencial de accin.

Potencial de accin

Grandes despolarizaciones

frente a estmulos

supraumbrales. Se pasan de

-65mV a unos +30 mV. La

intensidad es constante, es

decir, no afecta a la

amplitud del PA. Los PAs

viajan a larga distancia y sin

decremento, y adems es

un fenmeno de todo o

nada. Dura

aproximadamente unos 2

ms.

Fases del potencial de

accin

-Apertura de los canales de

Na, lo que hace que el Na

entre al interior.

-Una vez alcanzado el umbral, se abren canales de Na voltaje-dependientes, slo responden ante un

cambio de potencial de membrana, en este caso superar el umbral, y esto produce que entre ms

sodio, un feedback positivo. El tope es el potencial de equilibrio del Na, pero no sucede as por:

-Los canales de Na dependientes de voltaje se inactivan y adems se abren canales de K voltaje

dependiente, lo que hace que salga el K, sus cargas se irn al exterior y se volver al potencial de

membrana en reposo, hasta hiperpolarizar la clula, porque los canales de K tardan mucho en

cerrarse y aun no se ha llegado a su potencial de equilibrio.

La intensidad del potencial de accin es siempre la misma, entonces, para poder responder a

estmulos ms potentes, aumenta la frecuencia, estando el tope establecido por los periodos

refractarios. 2 tipos:

-Absoluto: la clula no puede dar lugar a un potencial de accin por muy intenso que sea el estmulo.

-Relativo: la clula puede volver a disparar si recibe un estmulo ms intenso.

Canales inicos

Los hay siempre abiertos (fuga) o de tipo compuerta (abiertos o cerrados). Hay canales para los

distintos iones, y pueden ser especficos o no. Pueden ser:

-Compuerta mecnica: se abren frente a estiramientos o presiones

-Compuerta qumica: una sustancia qumica intra/extracelular se une a ellos y permite la apertura.

-Voltaje-dependientes, como el de Na y K.

-Canal de Na: selectivo, slo permite la entrada de Na y presentan dos compuertas, la M (en

medio) y la H (arriba). En reposo M est cerrada y H abierta. En el umbral se abre M y entra

Na, a la misma vez ese estmulo hace que se cierre la H, que es muy lenta, por eso hay un

espacio de tiempo en el que sigue entrando Na. El canal est inactivo con M abierta y H

cerrada. De inactivo se pasa de nuevo a cerrado gracias a la repolarizacin de la clula, hasta

que llegue a su potencial de membrana, y el periodo refractario sucede pues cuando los

canales estn inactivos. La tetodotroxina bloquea los canales de sodio voltaje-dependientes.

-Canales de K: slo tienen la puerta M, pueden estar abiertos y cerrados. El estmulo que

hace que se abran tambin es el supraumbral, pero son muy lentos, por eso tardan mucho en

abrirse, y tambin en cerrarse, por eso se produce la posthiperpolarizacin, de ah el periodo

refractario relativo.

Conduccin del potencial de accin

Transmisin unidireccional a una velocidad de 10m/s. Los iones sodio que entran en un punto dado

de la membrana, difunden a zonas vecinas haciendo que se abran nuevos canales de sodio y

producen la propagacin del potencial de accin, es el mismo potencial que se est regenerando por

eso no presenta decremento. Es slo unidireccional porque en la parte trasera los canales de sodio

voltaje dependientes estn inactivados y abiertos los canales de potasio voltaje dependientes. En

algunas clulas, los potenciales de accin producidos en el cono pueden viajar de forma retrgrada

hacia las dendritas, siendo una forma de informar a las zonas donde entra la informacin, dendritas,

de lo que sucede en la zona de salida.

La conduccin del potencial de accin se puede ver afectada por dos factores:

-Dimetro del axn: a mayor dimetro, menor resistencia del axoplasma y mayor la velocidad. Pero

no se puede crecer siempre en tamao, por eso hay que tener en cuenta la resistencia de la

membrana.

-Resistencia de la membrana del axn, aumentarla para evitar que se pierda corriente, y para ello se

envuelve el axn con determinadas clulas gliales, formando las vainas de mielina separadas entre s

por zonas descubiertas llamadas nodos de Ranvier. La conduccin se vuelve saltatoria.

Sinapsis

Comunicacin entre una clula presinptica (neurona) y postsinptica (neurona, msculo, glndula).

Hay dos tipos:

-Elctrica: acoplamiento de las clulas gracias a uniones GAP, comunicacin bidireccional, donde

ambas clulas estn comunicadas electrotnicamente. Se encuentran en clulas gliales, hepticas,

cardiacas. No son tpicas en el SN nervioso maduro, pero s durante su desarrollo.

-Qumica: principalmente en el SN maduro. La seal elctrica se traduce a una seal qumica, los

neurotransmisores. Estos neurotransmisores se pueden almacenar en vesculas (neurotransmisores

pequeos) o grnulos de secrecin (neurotransmisores grande). Las sinapsis pueden ser axo-

dendrticas, axo-somticas y axo-axnicas.

Cmo se produce? Cuando llega el PA, se abren canales de Ca que hacen que ste aumente en el

interior de la clula. Las vesculas se anclan a la membrana gracias al aumento de calcio y terminan

fundiendo liberando los NT a la hendidura. All, reconoce a unos determinados receptores y en un

breve tiempo se separa, produciendo diferentes cambios en los canales, pudindose producir un

potencial sinptico excitador o inhibidor. En la membrana presinptica tambin se pueden encontrar

receptores del NT, cuya funcin principal es sensar la cantidad de NT para controlar su cantidad.

Los NT pueden ser recaptados, pueden difundir o ser degradados en la propia hendidura.

Para considerarse un NT, debe ser producido por la propia neurona, debe ser liberado por el terminal

sinptico cuando recibe una seal y producir una seal en la neurona postsinptica.

Existen siete categoras: acetilcolina, aminocidos, aminas, purinas, gases, lpidos y pptidos, y en el

NSP slo aparecen la acetilcolina, adrenalina y noradrenalina.

-Acetilcolina, sintetizada por la ChAT (colintransferasa) a partir de colina y acetil-coA. Se rompe por

la acetil colinesterasa y el limitante es la colina.

-Aminas: derivados de aminocidos.

-Tirosina: de ella se produce dopamina, noradrenalina y adrenalina sucesivamente. Son

recaptados por el terminal y se degradan por la MAO. La primera enzima de la ruta y la ms

importante es la tirosina hidroxilasa (TH).

-Triptfano: da lugar a serotonina, se recapta y tambin se degrada por la MAO

-Histidina: de la histamina

-Aminocidos: glutamato, aspartato, GABA y glicina.

-Pptidos: sustancia P y pptidos opioides (encefalinas y endorfinas), CCK, vasopresina y pptido

natriurtico auricular.

-Purinas: adenosina, AMP y ATP (liberacin dependiente de calcio). ATP: similar al glutamato

-Gases: xido ntrico y monxido de carbono

-Lpidos: eicosanoides

Una misma neurona puede producir varios NT, y los vierte segn la intensidad de la seal, segn la

frecuencia de estimulacin. Si entra poco calcio porque la seal es baja, se libera en contenido de las

vesculas en la zona activa, si es de alta tanto las vesculas como los grnulos de secrecin.

Receptores y efectores

-Ionotrpicos: canales inicos formados por cinco subunidades. Si los receptores son canales de Na o

Ca, se producen potenciales postsinpticos excitadores, la clula se despolariza (Ach y glutamato). Si

los receptores son canales de calcio o cloro, se producen potenciales postsinpticos inhibidores

(GABA y glicina).

-Metabotrpicos: ms complejos, de acciones ms lentas y variadas. Compuesto por siete alfa

hlices, a una zona en el exterior en el NT y en una interior una zona de unin a una protena G (que

amplifica muchsimo la seal), de unin a GTP, con las subunidades alfa, beta y gamma, siendo la alfa

la que en reposo se une a GDP (inactiva). Cuando el NT se une al receptor, se activa la protena G al

cambiar el GDP por GTP, lo que produce que alfa se separe de beta-gamma. Una vez activada puede

activar a un canal o a una ruta con segundos mensajeros. Los segundos mensajeros ms importantes

son el AMPc e IP3. Ambos pueden ser tanto excitadores como inhibidores. Es necesario un

equilibrio entre quinasas y fosfatasas para que la clula pueda volver al estado normal.

Tema 4: tcnicas de estudio neuronal

Debido al pequeo tamao y a la consistencia blanda del cerebro, el estudio de las neuronas fue

difcil hasta que se desarrollaron tcnicas de fijacin con formaldehdo para endurecer los tejidos y se

us el microtomos para obtener trozos finos. Pero adems de eso, las neuronas no tienen color, por

lo que fue necesario dar lugar a las diferentes tinciones para su visualizacin al microscopio ptico. La

primera tincin fue la de Nilss, donde se utilizaban componentes bsicos que unen a los compuestos

cidos de la clula, pero slo permite la visualizacin del soma. Otra tincin es la de Golgi, con nitrato

de plata, que une a las protenas del citoplasma, permitiendo la visualizacin de neuronas completas.

Mtodo de registro de potenciales de accin

Los registros con electrodos pueden ser intracelulares y extracelulares, se puede registrar de ambas

maneras pero la apariencia es diferente, ya que el interior y el exterior no estn cargados de la

misma manera. En el caso de las extracelulares, en reposo la diferencia entre los dos electrodos es

cero, pues se encuentran ambos electrodos en el exterior. Cuando comienza el potencial de accin,

las cargas positivas entran, por lo que el exterior se hace ms negativo, cuando vuelven a salir cargar

positivas, el exterior se hace ms positivo.

Mtodo Patch-clamp

Se utilizan electrodos de punta muy fina que

se sitan sobre la membrana de la neurona.

Uno de las ms utilizadas es la de vaco, se

succiona la parte de la membrana con la que

est en contacto el electrodo y en el caso de

aplicar ms vaco, rompe la membrana de la

clula y permite registrar lo que sucede en el

interior. En otras configuraciones se extraen

parches de membrana con canales aislados,

lo que permite el estudio de estos canales,

tanto de su parte externa como de la parte

interna.

Tcnicas de marcaje antergrado y

retrgrado

-Retrgrado: se inyecta una sustancia en un

ncleo que se caracteriza por transportarse

desde el terminal hacia el soma, hacia atrs,

utilizando la maquinaria de transporte celular. De esta manera, se pueden averiguar que regiones

proyectan a la zona inyectada. Aferencias

-Antergrados: eferentes, se inyecta una sustancia en una zona, y se pretende ver cules son los

ncleos. Transporta de soma a axn.

Hay marcadores tanto antergrados como retrgrados, como sucede con la BDA

Tcnica inmunohistoqumica

Se basa en la reaccin Ag-Ab, y para ello se utilizan las inmunoglobulinas, en este caso la G. Se

determina qu Ag se quiere identificar, se purifica y se inyecta en un animal, en este caso un conejo,

esperando un tiempo para que produzca Ab. Hay que marcar esos marcajes para poder visualizarlos y

saber qu clulas tienen los Ag. Hay dos tipos de Ab:

-Policlonales: ms inespecficos, unen a varios eptopos

-Monoclonales: se unen a un nico eptopo, muy especficos, cuyo origen es de un nico linfocito B

que se fusiona con una clula tumoral (hibridoma), y se inoculan generalmente en ratones.

La inmunohistoqumica puede ser:

-Directa: se marca el ab primario. Sus ventaja principal es la de incubar todos los ab que queramos,

pero el problema es que el marcaje puede ser ms bajo.

-Indirecta: se usa un ab secundario que es el que est marcado, lo que permite una amplificacin de

la seal.

Las sustancias reveladoras pueden ser fluorocromos, o tambin un ab unido a HRP. Esta peroxidasa

de rbano rompe el agua oxigenada, por lo que se puede aprovechar esta actividad aadiendo un

cromforo, la diaminobencidina (DAB) que se oxida en presencia del oxgeno formado.

Como sucede con la peroxidasa de rbano (HRP). Acta muy bien como marcador retrgrado, pero

no florece ni tiene calor, por tanto se aprovechar su accin enzimtica. Se le aaden a los cortes

cerebrales agua oxigenada y DAB (diaminobencidina) que es un cromgeno, pero en ese estado

soluble e inocoloro. El perxido de hidrgeno en presencia de HRP se desoxigena, oxidndose DAB,

que ya no es soluble y precipita vindose un color marrn oscuro.

H2O2 + DAB DABox +H2O + 1/2 O2

Las neuronas no tienen esa actividad peroxidasa de por s sola.

La mayora de los marcadores antergrados no fluorescentes son derivados de la biotina. El

marcador une la biotina, y sta permite la visualizacin mediante una reaccin para hacerla visible.

Se incuba el tejido con el Kit ABC, que

tiene dos reactivos, A y b.

-A es avidina, una protena tetramrica

con cuatro zonas de unin para la

biotina.

-B es peroxidasa de rbano

biotiminada.

Se mezcla A y B, y en los sitios de A se

une la biotina de la peroxidasa,

llenando 3 de los 4 huecos. El hueco

vaco se llenar de la biotina que hay

en las neuronas. Se aade DAB y H2O2

sucediendo la reaccin cromgena.

Protocolo general de un experimento de inmunohistoqumica

-Anestesiamos y perfundimos, tratando con un fijador paraformaldehdo.

-Decapitamos

-Sacamos el cerebro cortando el crneo

-Secciones cerebrales de 20-50 micras

-Preincubaciones y lavados: Aumentar la penetracin del Ac y disminuir marcaje inespecfico

-Permeabilizacin del tejido: Tritn X-100 (0.05-0.2%). Rotura membranas

-Bloqueo de uniones inespecficas (BSA, suero preinmune (tiene que ser del suero del animal del que

se ha obtenido el ab secundario, porque el segundo ab no va atacar, unir al suero del que proviene),

suero bovino fetal, leche desnatada en polvo)

-Inactivacin peroxidasa endgena: solucin metanol + H2O2

-Incubacin en anticuerpo primario: 24-48 h

-Lavados

-Incuvacin anticuerpo secundario

-Aadimos H2O2 y DAB

-Deshidratamos

-DPX

-MO

Hay que tener en cuenta las reacciones cruzadas, ya que los ab policlonales son muy inespecficos, y

tener en cuenta tambin el marcaje de fondo. Hay que llevar tambin controles positivos y negativos.

Los positivos tendrn en Ag sabido de antemano, y si no sale en tu muestra, es que algo se ha hecho

mal. En el caso de los negativos, no existe el Ag, por lo que si en tu muestra existe marcaje, y en el

negativo tambin, algo se ha hecho mal.

Tcnica de hibridacin in situ

Se construye una sonda complementaria al RNA que se quiere determinar. Esta sonda de marca de

manera radiactiva o con fluorescencia para poder ver al RNA al que marcan.

Tema 5: Biologa de las clulas gliales

Las clulas gliales son las clulas del sistema nervioso que no son ni neuronas, ni clulas sanguneas

ni clulas del endotelio capilar.

Introduccin histrica

La primera persona en hablar de clulas nerviosas no neuronas fue Rudolf Virchow. El describi a

unas clulas muy prximas a las neuronas, cuya funcin poda ser de sostn, una especie de

conectivo a cuyas clulas llam neurogla (nerve glue).

A raz de estos estudios, en el siglo XIX se hicieron grandes avances en histologa, gracias a las

tcnicas de tincin y los microscopios, cientficos como Otto Deiter, Jacob Henle, Camillo Golgi o

Gustav Retzius. Golgi identific y describi morfolgicamente los astrocitos. Por otro lado, Ramn y

Cajal tambin hizo descripciones de clulas gliales, de astrocitos "abrazando" neuronas, se aventur

incluso a darles funciones.

Estos cientficos tambin saban que existan otras clulas que con las tcnicas histolgicas de la

poca no podan identificar, por lo que las llamaban "el tercer elemento". El primer cientfico en

describir este "tercer elemento" fue Po del Ro Ortega gracias al desarrollo de tcnicas de tincin

especficas, identificando en realidad dos elementos, la microgla y los oligodendrocitos. Adems de

describirlos morfolgicamente, pensaba que las clulas de la microgla tenan un origen

mesodrmico, distinto al origen de las neuronas y los astrocitos. Adems, describi que las clulas de

la microgla tenan diferente morfologa dependiendo del estado del cerebro. Tambin fueel primero

en describir los oligodendrocitos, y aunque no lo pudo demostrar, les atribuy la funcin de la

sntesis de mielina.

Tipos de clulas gliales

1. Macrogla (85-90%). Origen ectodrmico

-Astrocitos

-Otras clulas de estirpe astrogrial:

-Glia radial

-Gla envolvente del bulbo olfatorio

-Clulas ependimarias

-Oligodendrocitos

-Clulas de Schwann

-Gla positiva a NG-2

2. Microgla (10-15%). Origen mesodrmico

Desarrollo de las clulas gliales

Durante los primeros estadios del desarrollo se originan las tres capas de tejido: ectodermo,

mesodermo y endodermo. En un determinado momento, se desarrolla el tubo neural, que posee

unas clulas madre pluripotentes neurales llamadas clulas neuroepiteliales, que cuando se dividen

se regeneran y dan lugar a las diferentes clulas neuronales. A partir de las clulas neuroepiteliales se

origina la gla radial, tambin clulas madre neurales. Se nombran as porque presentan unos radios a

lo largo del tubo neural para poder dirigir a los neuroblastos a su localizacin definitiva donde se

volvern neuronas. Las clulas de la macrogla adems posteriormente dan lugar a las clulas de la

macrogla. Hay dos zonas en el cerebro adulto que an tienen clulas madres neurales, la zona

subventricular (adyacentes a los ventrculos laterales) cuyas neuronas migran al bulbo olfatorio, y el

hipocampo, y las clulas madre son astrocitos con funciones de gla radial.

Evolucin filogentica de las clulas gliales

Existen en todos los animales con tejido nervioso, pero en animales ms primitivos el % es muy bajo.

En mamferos es bastante ms alto, sobre todo en el humano, casi todas las clulas son gla. Adems,

la morfologa de las clulas de la gla entre humanos y otros animales son muy diferentes, los

astrocitos de ratas tienen muchas menos prolongaciones que los astrocitos humanos. Eso produce

que sus funciones sean superiores. Se concluye que en la evolucin se han producido cambios ms

evidentes en las clulas gliales que en las neuronas. Implantando astrocitos humanos en ratones,

estos vean muy aumentadas sus capacidades cognitivas.

Hay unos astrocitos, los interlaminares, presentes en la capa 1 de la corteza humana, y los

polarizados en la capa 6, slo presentes en la corteza celular de humanos. Hay cerebros con muchos

astrocitos interlaminares, en personas con mucha inteligencia, y cerebros con deficiencias de estos

astrocitos, que presentaban cierto retraso.

Astrocitos

Son las clulas gliales ms numerosas y ms grandes en tamao. Su cuerpo celular es pequeo, pero

tienen muchas prolongaciones celulares con unos gliofilamentos exclusivos. Presentan muchas

mitocondrias y una gran cantidad de grnulos de glucgeno. Algunas de las prolongaciones terminan

en una estructura llamada pie terminal, y contactan tanto con neuronas, como con los vasos

sanguneos y la piamadre. La parte interna de la piamadre se reviste de pies terminales, y esta capa

se denomina glia limitans. Existen dos tipos segn localizacin y morfologa:

-Fibrosos: en la sustancia blanca, junto a los axones y abundantes gliofilamentos, el ms abundante

es GFAP (glia fibrillary acidic protein)

-Protoplsmicos: en la sustancias gris, junto a los somas, con prolongaciones ms cortas pero ms

abundates y menos gliofilamentos.

Gla radial

Presente en el adulto en dos zonas.

-Gla de Mller: se encuentra en la retina, y su morfologa tan caracterstica le permite estar en

contacto con todas las clulas de la retina. Tiene forma radial, con muchas prolongaciones.

-Gla de Bergman: se encuentra en el cerebelo, abrazando a las clulas de Purkinje. Tiene tambin

forma radial, pero sus proyecciones slo proyectan hacia las ramificaciones de las clulas de Purkinje.

Clulas ependimarias

Capa monoestratificada de ependimocitos, encargadas de revestir los distintos ventrculos

cerebrales. Conforman una capa que asla las clulas nerviosas, evitando que entren en contacto

directo con el lquido cefalorraqudeo.

Gla envolvente del bulbo olfatorio

En el epitelio olfatorio, las clulas receptoras olfatorias son de tipo I, es decir, son neuronas

sensoriales que reciben informacin qumica del entorno, trasducen esta seal a una seal qumica, y

mandan la informacin ellas mismas directamente al cerebro concretamente al bulbo olfatorio. Los

axones de estas neuronas se encuentran revestidos por un tipo de clulas, la gla envolvente del

bulbo olfatorio, exclusivas nicamente en este lugar y tienen la peculiaridad de poder regenerar por

completo aquellos axones que se han roto.

Oligodendrocitos

No tienen filamentos, presentan pocas prolongaciones celulares y son las principales productoras de

mielina. Un mismo astrocito puede envolver axones de diferentes neuronas.

Clulas de Schwann

De morfologa diferente a las clulas de Schwann. Su peculiaridad principal es que una nica clula

envuelve a un nico axn.

Gla positiva a NG-2: sinantocitos

El NG-2 es un proteogliacno de condroitnsulfato, y sloest presente en esta gla. Tienen un soma

pequeo con procesos orientados de forma radial, y su morfologa es parecida a la de un astrocito,

pero no presentan sus tpicos marcadores, ni los de oligodendrocitos, pero s presentan marcadores

de precursores de oligodendrocitos, por lo que pueden dar lugar a ellos. Son las nicas clulas gliales

con canales de Na dependientes de voltaje, pero no producen potenciales de accin.

Microgla

Las clulas gliales ms pequeas, y son de origen mesodrmico. Presentan muchos lisosomas y

distintas morfologas segn el estado del cerebro. Una morfologa estrellada (microgla en reposo)

est presente en el estado sano, y cuando entra un virus o una bacteria, cambia de forma a un

estado ameboide, cambiando totalmente su funcin. Son muy abundantes en el hipocampo, ganglios

basales y la sustancia nigra. Adems, expresan los mismos marcadores que los macrfagos de la

sangre.

Fisiologa general de las clulas gliales

La gla no produce potenciales de accin, pero s son excitables, pues modifican sus potenciales de

membrana segn los eventos. Presentan un potencial en reposo de -80 mV, muy cercano al del K,

pues este in es muy permeable.

Las clulas gliales tambin presentan receptores para NT. Los astrocitos presentan todo tipo de

receptores ionotrpicos y metabotrpicos variando segn la regin cerebral y las neuronas

circundantes. El ATP a da de hoy tambin se considera un NT, ya que cumple todos los requisitos

para serlo y adems tienen receptores posinpticos llamados purinrgicos. Los hay de dos tipos, P1

(adenosinas) y P2 (ADP y ATP) y a su vez estos ltimos pueden ser P2X (ionotrpicos) y P2Y

(metabotrpicos). En los astrocitos los receptores purinrgicos son muy abundantes.

Los oligodendrocitos tambin expresan receptores, con menos variedad, pero presentan muchos

receptores P2Y que sensan ATP.

Las clulas de schwann son muy parecidas en cuanto a receptores a los oligodendrocitos, y tambin

otros como receptores de endotelina y NK-1.

La microgla es ms selecta y presenta menos tipos de receptores, para glutamato, GAA, colinrgicos

y purinrgicos, sobre todo P2X7 y otros receptores de trombinas y citoquinas.

Las clulas gliales tambin liberan neurotransmisores al exterior que en este caso se llaman

gliotransmisores. En el caso de los astrocitos, liberan aspartato, ATP, glutamato y D-serina (tiles

para activar los receptores de NMDA). Tambin presentan molculas recaptadoras de NT,

transportadores de NT, ms presentes que en las neuronas y para glutamato, GABA, dopamina,

noradrenalina y serotonina.

Los astrocitos, oligodendrocitos y microgla liberan otras molculas, los neuropptidos como el NPY,

opioides, etc. Tambin son capaces de producir factores de crecimiento, molculas que intervienen

mucho durante el desarrollo embrionario. Se producen tambin en el estado adulto y sus funciones

son de reparacin celular, de mantenimiento. El primero en descubrirse y ms famoso es el NGF, NT-

3 (neurotrofina 3) o BDNF (factor neurotrfico derivado del cerebro).

Tema 6: funciones de las clulas gliales

Funcin neurognica de los astrocitos

Proceso de neurognesis y gliognesis. Los astrocitos de la zona subventricular de mamferos adultos

y del hipocampo presentan clulas madre. Ante determinadas seales, los astrocitos se reprograman

para da lugar a una clula madre que se dividir y dar lugar a una neurona y por el otro lado se

regenerar.

Sinaptognesis o remodelado sinptico

Procesos relacionados con el aprendizaje y la plasticidad cerebral. Los astrocitos juegan un papel muy

importante en el remodelado sinptico, en la formacin y eliminacin de sinapsis. Los astrocitos

producen y liberan molculas que intervienen en el remodelado sinptico, algunas de ellas el

colesterol (fundamental en un sinapsis nueva, pero no se sabe por qu), la agrina (interviene en el

agrupamiento de receptores posinpticos colinrgicos. En una sinapsis nueva, un paso fundamental

es que los receptores se agrupen en distintas zonas de la membrana, y exactamente ah intervienen

los astrocitos), el TNF-alfa (interviene en el agrupamiento de receptores de glutamato), el ADNF

(interviene en el agrupamiento de receptores posinpticos de glutamato tipo NMDA) o las

trombospondinas (protenas de la matriz extracelular que intervienen en las interacciones clula-

clula y clula-matriz para dar la solidez necesaria a la sinapsis. En cuanto a las sinapsis ya sin uso, los

astrocitos vierten enzimas hidrolticas para romper las interacciones lo que debilita la sinapsis y al

final la desarmar.

Funciones de los astrocitos en la barrera hematoenceflica

Barrera fsica formada por tres componentes: clulas del endotelio

capilar (autntica barrera), la lmina basal del endotelio y los pies

terminales de los astrocitos. Todos estos elementos en conjunto

evitan que cualquier sustancia entre al cerebro, sobre todo la

ausencia de fenestraciones del epitelio capilar, gracias a las tight

junction. Slo pueden pasar sustancias pequeas, apolares y aquellas

que tienen sus propios transportadores especficos, como sucede con la glucosa, tirosina o

triptfano. Los pies de los astrocitos no suponen una barrera fsica, sino actan como filtro de

sustancias que despus pasarn a las neuronas.

Regulacin de la microcirculacin cerebral

Una neurona glutamatrgica vierte glutamato en una sinapsis. Se produce una entrada de calcio

intracelular que produce la formacin de NO y cido araquidnico, dando este ltimo

prostaglandinas cuya funcin es vasodilatadora. Cuando estas neuronas estn tan activas, necesitan

mucho ATP y como slo lo obtienen de la glucosa, tambin requieren mucha cantidad de sta. Como

se produce glutamato en estas sinapsis, el astrocito lo sensa y se produce en ste un aumento de

calcio intracelular, se forma tambin ms cido araquidnico y por tanto ms prostaglandinas y eso

se traduce en una vasodilatacin para mayor aporte nutricional.

En algunos casos median respuestas vasocontrictoras (zonas daadas) y aqu intervienen los pericitos

y astrocitos. En este caso el cido araquidnico es tomado por el msculo liso arteriolar y se

transforma en 20-HETE, que es una molcula vasoconstrictora. Cmo se diferencia entre el cido

araquidnico de vasodilatacin y vasoconstriccin no se sabe.

Astrocitos en el control del microambiente del SNC

-Suministro de sustratos a las neuronas: las neuronas slo usan glucosa como fuente de energa.

Presentan el transportador de glucosa GLUT3 y as la internalizan. Los astrocitos presentan el GLUT1

y pueden cedrselo a las neuronas o acumular glucgeno.

En las neuronas, la glucosa se oxida a piruvato, pasa al ciclo de Krebs y despus a la cadena

respiratoria. En el caso de los astrocitos, tambin se forma piruvato que puede ser utilizado como

fuente de energa, pero tambin puede destinarse para formar lactato, que sale y se recapta por la

neurona, que la transforma inmediatamente como piruvato para utilizarlo rpidamente para

producir energa. Esto sucede cuando la neurona necesita urgentemente energa.

-Recaptacin de K y tamponamiento: fruto de la actividad neuronal sale mucho potasio, si no se

retira, aumenta mucho la [K] y eso producira que las neurinas no pudieran producir nuevos Pas, y

para ello retiran los astrocitos los iones K gracias a la presencia de canales de K. Como la entrada

masiva de K en un astrocito producira la entrada de agua masiva por smosis, este K se tampona, se

diluye por uniones GAP. El K suele liberarse a los capilares cuando es muy abundante.

-Homeostais del agua en el cerebro: cuando hay un exceso de K extracelular y se recapta por los

astrocitos, por smosis, el agua entra a los astrocitos por acuoporinas. El exceso de agua puede

eliminarse de la misma manera a los capilares. En caso de un edema o lesin donde se excede el

agua extracelular, se puede utilizar el mismo mecanismo sin tener en cuenta el K.

-Control del pH extracelular: debe ser de 74. Neuronas muy activas producen muchos protones y

pueden modificar el pH celular. Los astrocitos tienen intercambiadores Na-H y Cl-HCO3 para producir

un intercambio y liberar H y HCO3 a los vasos por los pies terminales.

-Regulan los niveles extracelulares de glutamato: es necesario retirar el exceso de glutamato, lo que

no une inmediatamente a los receptores. Para ello, necesitamos transportadores de glutamato, que

se encuentran en un 80% en los astrocitos. Los astrocitos son los nicos en expresar la glutamina

sintetasa, para transformar el glutamato en glutamina. Esta glutamina se pasa a las neuronas que

sintetizan de nuevo glutamato. En algunas enfermedades como el ELA, se piensa que no se puede

recaptar el glutamato y eso es lo que produce la muerte de las neuronas.

-Regulan los niveles extracelulares de GABA: los astrocitos tambin presentan transportadores de

GABA para evitar que el exceso acta. Este GABA recaptado se metaboliza por el astrocito.

Funcin de sealizacin intracelular

Muchos astrocitos estn unidos entre s mediante uniones GAP. Cada unin GAP la forman dos

hemicanales, donde uno de cada clula interviene en la unin. Cada hemicanal est formado por seis

protenas llamadas conexinas, de distintas isoformas. Se nombran como Cx y un nmero que indica

su isoforma. Los astrocitos expresan sobre todo la forma Cx43 y los oligodendrocitos (que tambin

pueden acoplarse mediante uniones GAP) por la conexina Cx32.

En las clulas de schwann sucede lo mismo que en los oligodendrocitos. En el caso de la microgla, en

estado de reposo no expresa ningn tipo de conexina pero activada s pueden expresarlas y conectar

con otras clulas.

Influencias elctricas de las neuronas sobre la gla

En los astrocitos el Ca intracelular es muy bajo, y se encuentra en reservorios como es el RE. Este Ca

sale por dos tipos de canales:

-Sensibles a IP3: cuando aumenta esta molcula, activa a los canales sensibles y permite la salida de

calcio al citosol

-Sensibles a rianodinas: son sensibles a Ca, y se abren precisamente en presencia de ste.

Cualquier seal que produzca un aumento del IP3 va a desencadenar la salida de calcio, que a su vez

da lugar a muchos procesos, como es uno de ellos la fusin de las vesculas con gliotransmisores a la

membrana que permite la liberacin de

gliotransmisores al exterior. El aumento de ATP

lo produce la unin de algn tipo de NT a su

receptor.

Esta seal de calcio se transmite como si fuera

una ola a los astrocitos circundantes. En

experimentos en cultivos, la estimulacin de un

astrocito produce una oleada de calcio que

transmite al resto de astrocitos que no han

sido estimulados directamente. Esta ola es

posible gracias a las uniones GAP entre los

astrocitos, aunque tambin pueden influir

otras rutas como:

-La unin de un NT produce en el interior del

astrocito la produccin de IP3, que a su vez

produce el aumento de calcio. Este aumento

de calcio hace que las vesculas viertas los NT

como ATP, que se une a receptores en otras

clulas y vuelve a repetir lo mismo.

-Parecido al anterior pero el ATP puede difundir de manera ms lejana a otros astrocitos.

La sinapsis tripartita

Sinapsis qumica donde intervienen tres elementos, la neurona presinptica, la posinptica y los

astrocitos que rodean a esa sinapsis. Los astrocitos tambin pueden sensar el NT liberado gracias a la

presencia de receptores en la membrana y adems responden a la sealizacin del NT. En la neurona

posinptica el efecto es siempre el de modificar el potencial de membrana que desencadenar en

una despolarizacin o una hiperpolarizacin, y en el caso de los astrocitos tambin se producen

cambios en el potencial de membrana que producen la entrada de calcio a los astrocitos que hacen

que stos liberen gliotrasmisores. Encontramos pues en la hendidura sinptica adems de los NT

tambin GT, que afectarn tambin a la neurona posinptica.

Funcin de la gla envolvente del bulbo olfatorio

Envuelven los axones de las neuronas olfatorias en todo el trayecto y adems permite que los axones

regeneren en caso de lesin.

En el SNP, cuando hay una lesin y un axn se rompe, es capaz de regenerar de nuevo. En el caso del

dao en el SNC, cuando un axn se secciona, la neurona no muere pero no puede regenerar ese axn

y se pierden conexiones e informacin. En el caso de la transicin entre SNP y SNP, cuando sucede

una lesin, siempre regenera la parte del perifrico pero no del central, a excepcin de las neuronas

olfatorias y el bulbo olfatorio, y es gracias a la gla envolvente.

Funcin de la gla de Mller

Gla de aspecto radial presente en la retina. El ojo tiene una capa de clulas, de las cuales las ms

profundas son los fotoreceptores, y las ms superficiales las ganglionares, que derivan la informacin

al nervio ptico. La gla de Mllerabarca todas estas clulas y tiene funciones de astrocito como

eliminar el exceso de K, eliminar exceso de glutamato y GABA, son fuentes de factores de

crecimiento, de molculas con accin antioxidante y otras propiedades nuevas como:

-Clula madre neural: es capaz de dar lugar a fotorreceptores. Estas clulas gliales sufriran una

desdiferenciacin para dar lugar a nuevos fotorreceptores.

-Transmisin de la luz desde la superficie de la retina hasta los fotorreceptores actuando como una

"fibra ptica", absorbe la luz y evita que sta se distorsione.

Funciones de las clulas ependimarias

Siempre se les ha atribuido la funcin de barrera, pero no es del todo real. Las clulas ependimarias

presentan unos cilios que son capaces de mover el lquido cefalorraqudeo.

Funciones de los oligodendrocitos y las clulas de schwann

Ambos tipos de clulas sintetizan la mielina que recubren los axones. Los primeros producen la

mielina en el SNC y pueden recubrir varios axones, mientas que los segundos la producen en el SNP y

slo recubren un axn por clula. La mielina es una sustancia que forma capas y se encuentra en

constante renovacin.

La mielina del SNC y SNP son parecidas pero presentan algunas diferencias. Es una estructura

glucoproteica, con un 70% de lpidos, que son los que le dan la caracterstica de aislante, apareciendo

colesterol y galactocerebrrsido. EL 30% restante son protenas que se encargan de estabilizar las

distintas capas, y difiere segn el SNC y el SNP. En el central se encuentra sobre todo protena bsica

de la mielina (MBP) y protena proteolpida (PLP), glucoprotena asociada a mielina (MAG) y NOGO,

que es la que evita cuando se libera la regeneracin axonal. En el caso del SNP, abundan ms las

glucorpotenas y no se encuentra la protena NOGO.

Funciones de la gla positiva a NG-2.

Contacta con neuronas, astrocitos y con nodos de ranvier. Existen evidencias de sinapsis elctricas

entre neuronas y gla NG2 en el hipocampo y en el cerebelo. Una seal elctrica en una neurona

produce un cambio de voltaje en esta gla, lo que le permite cambiar y as poder modular la actividad

de estas neuronas.

Respuesta inmune en el SNC, funcin de la microgla

En reposo, la microgla tiene aspecto estrellado y cuando aparece un dao se liberan sustancias

quimioatrayentes que cambian el estado de la microgla y la activan. Adquiere una apariencia

ameboide y cambia su funcionalidad, ejerciendo nuevas actividades como es la de reparacin. Otras

funciones tambin son las de eliminar neuronas apoptticas y eliminar sinapsis dbiles.

La microgla puede sensar seales quimioatrayantes (FIND-ME), seales para comer a las neuronas

(EAT-ME) y para digerir las clulas fagocitadas (DIGEST-ME). Estas clulas tienen mucha capacidad a

la hora de sensar distintas molculas, y pueden identificar y sensar muchas ms molculas que

cualquier otra clula del SN. La gla participa en otras funciones como la neurognesis y en procesos

de plasticidad sinptica. Hay autores que hablan incluso de sinapsis tetrapartitas donde participan

sensando esa sinapsis.

Respuesta de las clulas gliales a la lesin

-Una lesin anisomrfica es la que produce un cambio apreciable en la forma del sistema nervioso, y

estas lesiones suelen estar producidas por cambios mecnicos, como accidentes o cirugas. En estos

casos la respuesta ms inmediata de las clulas gliales es debida a los astrocitos, que comenzarn a

proliferar en esa zona y a liberar factores neurotrticos. Tambin proliferar la gla NG2 y se activar

la microgla. La lesin producir la liberacin de sustanciasinhibidoras del crecimiento axonal por

parte de la mielina de los axones daados. Todas estas clulas gliales que han proliferado

circundarn o limitarn la zona, formarn un tejido cicatrizal que en cierto modo va a evitar la

regeneracin del SNC. Los objetivos son aislar el rea daada del resto del tejido cerebral, reconstruir

la barrera hematoenceflica y facilitar el remodelado de circuitos en las zonas alrededor de la lesin.

-Una lesin isomrfica es la que produce un cambio no apreciable en la forma de sistema nervioso, y

estas lesiones suelen estar producidas por bacterias, virus o priones. En este tipo de lesiones la

protagonista es la microgla, capaces de sensar los cuerpos extraos que han entrado al cerebro.

Pueden fagocitar o producir molculas que ayuden a evitar el dao.

En el caso de una lesin axnica en el SNP, llamado degeneracin Walleriana, el extremo distal del

axn tiene que desaparecer por el sistema inmune, y a continuacin, las clulas de Schwann forman

una especie de tnel en la zona distal del axn que crea un entorno permisivo donde pudiese crecer

el axn.

Una lesin axnica en el SNC, ocurre de manera diferente, acuden astrocitos, NG2 y microgla, donde

esta ltima fagocita los restos celulares y las dos primeras forman la cicatriz glial, un entorno hostil a

la regeneracin.

Prcticas

Inmunohistoqumica de neuronas y astrocitos. Para identificar astrocitos se emplean ab contra el ag

GFAP, y para identificar neuronas se emplean ab contra el ag betaIII tubulina.

Las muestras, rodajas de 50 micras de cerebro de rata. Deteccin con un mtodo indirecto de

inmunohistoqumica, se emplea un ab 1 que une a los ag clulares y no est marcado con nada y

despus un ab 2 que une a la regin constante del ab 1, estando marcado, ya sea por un

fluorocromo, HRP o biotina. En el caso de la fluorescencia se puede ver en un microscopio de

fluorescencia, y en el caso de la biotina y HRP, se aade un fluorocromo.

En el caso del ab 1 para los astrocitos: es un ab obtenido en conejo contra el ag GFAP de rata. Es una

IgG de conejo policlonal. Para las neuronas, se utiliza un ab 1 de ratn contra los ag betaIII tubulina

de rata. Es una IgG de ratn y policlonal.

Los ab secundarios estn marcados con fluorforos. Para los astrocitos, ab anti-rabbit producidos por

burro con un fluorforo en la zona constante. En el caso de las neuronas, ab anti-ratn producidos

por un conejo y tambin se encuentran conjugados con un fluorforo.

Fluorforos

Una molcula presenta fluorescencia cuando al incidir una luz con una energa determinada (energa

de excitacin) se desestabiliza absorbiendo esa energa y hacindose ms inestables para

posteriormente volver a su estado de reposo produciendo una emisin de energa, menor que la de

excitacin. A menor energa, mayor es la longitud de onda. Para poder ser visibles al ojo humano,

debe de estar en un rango de longitud de onda de 400-700 nm, y ese es el caso de nuestros

fluorforos. Algunos de ellos: AMCA, FITC, Cy3, Cy5, etc. Para poder ver nuestra muestra, primero

hay que excitar y para ello se utiliza un microscopio de fluorescencia.

Protocolo

Muestra de una rodaja de cerebro en tampn TFS.

-Lavados de 51 con TFS

-Incubar con solucin de bloqueo (BSA 2'5% EN TFS): 30 min. La albmina une a protenas de la clula

de manera electrosttica para evitar ruido de fondo y as evitar falsos positivos.

-Incubar con los ab primarios toda la noche en diluciones concretas.

-Rabbit antiGFAP 1:500

-Mouse anti-beta III 1:500

-Lavados con TFS de 10 min

-Incubar con los anticuerpos secundarios: 30 min

-Anti-rabbit-FITC 1:200

-Anti-mouse-Cy3 1:200

-Lavados

Los astrocitos se vern en verde y las neuronas en rojo.

Doble inmunohistoqumica

Deteccin simultnea de dos ag, es posible hacerla incluso de tres. Por ejemplo, deteccin de GFAP y

betaIII-tubulina. Hay que tener dos cosas fundamentales en cuenta:

-El ab primario tiene que estar hecho en especies animales diferentes, porque a la hora de utilizar el

secundario, si fuera el primario del mismo animal, este secundario se unira a los dos y entonces no

podras diferenciar los dos ag.

-Emplea ab secundarios especficos para cada primario con fluorforos diferentes. Podran ser ab del

mismo animal, ya que en un caso se le ha puesto el ag de un ab 1 y en el otro el ag del otro ab 1.

Los fluorforos deben ser diferentes para que no permitan fluorescencia ambos a la misma luz.