ESTUDI ULTRASTRUCTURAL DE LES FORMES

CRISTALLINES PRESENTS A LA ZONA GLOMERULOSA

DE LA GLANDULA ADRENAL DE LA RATA ESTIMULADA

AMB DIETES AMB CONTINGUT DE SODI BAIX *

per

GABRIEL PALACIOS

Department d'Histologia . Facultat de Medicina.Nova Universitat Autdnoma de Barcelona ( Bellaterra).

0 Accc'ssit al Premi Leandre Cervera, 1977.

INrRODUCCIO

Les cellules de 1'escorca adrenal, a la zona glomerulosa i fasciculada,

contenen cristalls birefringents. Aixo ha estat demostrat en nombrosos29.treballs duts a ternie amb el microscopi de hum

Estudis ultrastructurals han demostrat la presencia d'aquesttes for-

mes cristallines associades a vacuols lipidics, principalment a la zona fas-

ciculada, d'animals normals i en situacions experimentals que actuin

estiinulant o inhibint 1'esteroideogenesi 17, 18, 19, 22, M. 27.

Aquests cristalls es relacionen, tant en els treballs optics coin en els

submicroscopics, amb el colesterol i principalment els sous esters com-

postos, que, coin ha estat demostrat, es localitzen sobretot a nivell dels

vacuols lipidics de les adrena l s ', 8, 16 , 2 0 , 2 1 , 2 6

Formes cristallines d'aquest tipus tambe han estat observades en altres

cellules secretores d'esteroides, coin es ara les cellules intersticials i les

del cos luti2, 4, 13.

En el nostre treball pretenem de demostrar la presencia d'aquestes

formes cristallines a la zona glomerulosa de ]a rata normal i el seu aug-

ment despres d'un estimul de dietes de baix contingut de sodi.

1\1ATERIAI. I D11iTODES

L'estudi fou dut a Icrme sobrc no total de r)o rantes wistar, mascles,

dun pes entre 25o i 300 g.

Els animals foren dividits en 2 grups:

Un primer grup de 36 rates que fou processat segons els metodes de

inicroscopia electronica.

Un segon grup de 14 rates que fou utilitzat per a manifestar l'activi-

tat enziinatica de les fosfatases acides.

El primer grup es dividi en els subgrups segfients:

Un primer subgrup de sis rates rebe una dieta d'estabulari normal

i servi com a control.

Un segon grup de 24 rates fou sotmes a una dieta de baix contingut

en sodi durant sis setmanes, segons una pauta semblant a la de HARTROFT

21

I GABRIEL PALACIOS

i Eis srLiN''. D'aquest subgrup foren sacrificats quatre animals cadasetmana de 1'experiment.

Un tercer subgrup de sis rates tambe ser6 corn a control, que rebcdurant sis setmanes la mateixa dieta del subgrup anterior pero amb unaquantitat equilibrada de sodi. Els animals foren sacrificats la darrerasetmana. Tots els animals, tret dels del primer subgrup, bcgueren aiguadestillada i desionitzada. Els animals foren anestesiats and) una injeccidintraperitoneal d'hidrat de cloral (300 mg/kg de pes corporal). El tr raxfou obcrt i fare abrtic canulat per tal de procedir a la perfusio. Inicial-ment horn va perfondre serum ringer durant un minut i a continuaciola solucio fixadora feta de glutaraldehid al 3 % en buffer fosfat o,12 Mi pH 7,4 durant 15 minuts. Les glandules adrenals foren extirpades, sec-cionadcs en fines lanrines d'un mm de gruix, submergides en el mateixfixador durant dues hores i finalment postfixades en tetroxid d'osmi al'1 °J, en el mateix buffer.

Els 14 animals del segon grup utilitzat per a 1'estudi histoenzimaticforen afegits als subgrups anteriors, reberen el mateix tractament i forendistribuits de la forma segiient:

2 animals en el primer subgrup.12 animals en el se-on subgrup, del qual foren processats dos animals

cada setmana.Aquests animals foren anestesiats i operats de la mateixa forma que

els del grup anterior i se'ls perfongue una solucio fixadora de glutaral-dehid al 2,5 % en buffer cacodilat o,1 M, pH 7,3 durant 15 minuts. Lesglandules adrenals foren postfixades en el mateix fixador durant dueshores. Horn feu sections en criostat dunes 50 a loo micres, que forenincubaren en el medi de GonloRl `0 de mitja hora a unit hora. Les sec-tions incubades foren postfixades en tetroxid d'osmi a I'i % en el mateixbuffer cacodilat.

Els blocs obtinguts d'ambdos grups foren deshidratats en concentra-cious creixents d'acetona i inclosos en Durcupan (Fluka). Sections semi-fines d'una a dues micres tenyides amb blau de tolu'fdina, serviren pera control topografic per a la localitzacio de les diferents zones de laglandula adrenal. Sections ultrafines foren tenyides amb citrat de plomsegons VEN,ARLE i COGGESHALL 28 i examinades amb un microscopi elec-tronic Hitachi HU-12.

RESULT.A1 S

En cls animals controls del primer subgrup i del tercer, la zona glo-merulosa ocupava una estreta franja subcapsular, i les cbllules es disposa-

22

oms

a

.t

A

Ftc. t. - A) Animals controls: microfotografia elecirunica d'un grup de cell sites de la ionaglonrerulosa cn disposiciu pericapildar. Mont hi ohseria una ccllula endotclial (E), i la paretcapillar ntostra alguns porus (asteris(s). I.es cellulcs glandulars presentee on nucli (N) i enIlur citoplasma apareixen alguns vacuols lipidics (v), nritocuudrids (m) i membranes de reticleHis (r) X 1o.ooo. 11) Animals controls: Un <grup de ccllulcs de la zona glonrcrulosa amb elsmateixos components estructurals ja assenvalats. Horn pot apreciar una forma (ristallina (K)en el citoplasma d'una de Ics cellulcs. X 6.ooo. C) Animals experimcntals: ccllula de la zonaglomerulosa amb tres estructures cristallines en hue citoplasma (K). Podem score alguns cos-

sos densos (sagetes) prop dell cristalls. X ig.ooo.

1 1(" --,. - - I-ol Ill C^ ( r i'lal-lilles no associddes a % ilcu'' I, I i p i d it" A ) Cl i I it I 1 1111,11 . \ I-!. A )(A ).

B) D( I it I I pcI it ^, I i( dc I In it Ic I\ ( I-iN1 it I I Illo,tnint I it SeN it c^l I I I( I I I I it I it III ill it r, \ I I. ollo. C) Cris-

tall ( wilpty'l : Ili p(MICIII ^cllrc ms^o, <Icllsos p(.1-iti'l it , (sagc1cs). X i E) Cris(alls

(onlimsto, alub ("IIII(Illics hIllillill-S illICII)CS. X 27.()()(), X

FOR.IIES CRIST_IL-LINES .l L I iO.A I I M

ven formant cordons i agrupacions al voltant dels capil•lars (fig. i A).

L'estructura de les seves cellules era la propia d'una cellula secretora

d'esteroides, amb nuclis arrodonits o ovalats, i 1'heterocrontatina formava

masses enganxades a la membrana nuclear amb predomini de 1'eucroma-

tina. Hom podia veure-hi un nuclool o -quai mai- dos. En el citoplas-

uia honi podia observar mitocondries molt poliformes pel que fa a

l'estructura de les crestes, un aparell de Golgi paranuclear i el reticle

endoplasmitic His bastant desenvolupat. Les gotes lipidiques es disposa-

ven formant tipics vacuols de contingut clar. Associades a aquests va-

cuols pogueren esser vistes, ocasionalment, algunes formes cristallines

(fig. i B).

En els animals sotmesos a la dieta de baix contingut en soli. hom

pogue apreciar des de la segona setmana una hipertrofia i hiperplasia

global de la zona glomerulosa que, a nivell submicroscopic, corresponia

a un augment real dels organoides Ines irnplicats en la esteroideogenesi,

coin cs ara les mitocondries, el reticle endoplasmatic His i els vacuols li-

pidics. Les formes cristallines objecte d'aquest estudi es posaren mes de

manifest en aquests animals experimentals (fig. i C). Principalment hom

hi pogue veure dos tipus d'estructures cristallines:

Uu tipus format per cristalls allargats i angulars que no guardaven

cap relaci6 amb els vacuols lipidics de les cellules adrenals i solien pre-

sentar-se sols o agrupats (figs. 2 A, B, C). Caracterfsticament, en alguns

d'aquells cristalls hon podia veure restes d'estructures laminars paral•leles

molt (lenses i estratificades collocades principalment als voltants del cris-

tall i emmarcant una zona realment buida (figs. 2 A, B).

Dins aquest mateix grup tambe hi havia cristalls grans que presenta-

ven un contingut laminar format per membranes denses paral•leles i

desoTganitzades (figs. 2 D, E).

Un altre tipus d'estructures cristallines estava en intima associaci6

amb les gotes lipidiques; el contingut d'aquestes tiltimes tenia mes den-

sitat electronica que la resta de vacuols lipidics, probablement a causa de

la preservaci6 en la preparaci6 del teixit (figs. t C; 3 A, B, C). Els

cristalls ajuntats a aquestes gotes lipidiques presentaven estructures an-

gulars diverses. Hom hi pogue observar formes diferents; des de les

grans gotes lipidiques amb petits cristalls, fins a cristalls de grans dimen-

sions que nomes mantenien relaci6 amb sobres de gotes lipidiques, com

si la transformaci6 hagues estat gradual dels vacuols a les formes cristal-

lines i a I'inreves. Totes aquestes formes cristallines associades o no a

vacuols lipidics solien esser envoltades d'una coberta amb un material

molt electrodens (figs. i C; 3 A, B, C, D, E, F). No pogue esser demos-

trat clarament l'origen d'aquest material del voltant. Algunes vegades

foren trobats lisosomes a les proximitats dels cristalls (figs. 2 C; 3 B, F, G)

2'

6 G.IBHII:L P.1L:ICIOS

i el material dens dona positiva la reaccio de les fosfatases acides(fig. 3 F).

Discussro

En el nostre treball, ha estat assenyalada l'aparicio esporadica d'estruc-tures cristallines a la zona glomerulosa de la gl'Indula adrenal de la rata,en animals en situations funcionals considerades normal,,-,. El fet queaquestes formations hagin estat trobades tambe en cellules d'altres partsde la glandula &1 i en altres glnndules secretores d'esteroides-1, pot donarforca a la hipotesi segons la qual son organoides torrents, he que nohabituals d'aquestes cellules. Tanmateix, 1'aparici6 d'aquestes estructu-res es flies frequent en situations d'estimulacio o inhibicio de la sintesiesteroidal de la glandula''• 18•'-. 24.5c, 2' En aquest sentit, ha estat sufi-cienment provat que les dietes prolongades de baix contingut de sodiactuen estiniulant especfficament la zona glomerulosa 2.1.11, 11.22 Aquestestimul podria explicar la nostra troballa (a les cellules citades) d'unafregiiencia mes gran d'aparicio d'aquestes formes cristallines.

En el present estudi no han estat emprades tecniques especifiquesper a la preservacio dels lipids', 1. 12, i conseguentment apareixen dissoltsen els vacuols lipidics. La persistencia de testes larninars en alguns cris-talls, n'indicaria una consistencia sblida i un despreniment per l'acciodel tall, o be, en part, una dissolucio despres del proces de fixacio i d'in-clusio.

Si aquests vacuols lipidics, segons es despren de forca proves '- 16, 20, 21

emmagatzemen colesterol i principalinent els seus esters. seria logic depensar que cls cristalls relacionats amb ells representen reserves d'aquestscompostos precursors de 1'esteroideogenesi i serien utilitzats per a la cel-lula adrenal en moments de demanda funcional mes gran. Una altrapossibilitat seria la de servir corn a magatzern d'un exces de colesterollliure o els seus esters en moments depressius intercalats o terminals d'unperfode hiperfuncional.

D'altra part, les formes cristal•lines de forma laminar descrites en Clnostre estudi i independentment dels vacuols lipidics, poden esser inter-

pretades corn una altra variant relacionada amb 1'aprofitament de laresta de membranes procedents d'organoides en fase de destruccio, fre-giient en tota cellula exposada it un intens intercanvi dell SCUS compo-nents. Se sap clue el contingut en colesterol de les membranes de icscellules esteroYdals es important-. Aquest compost podria esser emma-gatzemat en aquells cristalls d'origen membranari per a la reutilitzacioi formacio de novel membranes o esteroideogenesi.

El material electrodens que envolta moltes d'aquestes formes cristal-

24

FOR,III:S CRIST.4L.LL'S'E.S A LA ?OVA GL.OAIERULO.S.I 7

lines, ha fet positiva la reacci6 de les fosfatases acides. Aquest fet, que

ja fou assenvalat per SZAB6 3.1, podria induir-nos a pensar que aquest

material es d'origen lisosomaI, tenint en compte, a mes, la frequent re-

1aci6 d'aquestes estructures cristal•lines am]) alguns cossos densos. La

composici6 en enzims hidrolitics d'aquestes cobertes denses explicaria

la desintegraci6 dels cristalls coin una possible forma d'evoluci6.

BIBLIOGRAFIA

i. APPELGREN, L.-E.: Sites of steroid formation. Autoradiographic studies using labelled

precursors. (Acta physiol. Scand.)), Suppl. 301: i-io8 (1967).2. BOURNEVA, V. : Feinstruktur der Luteinzellen des Aleerschweincheneierstochs wiih-

rend der Schwangerschaft and des Zyklus. ((Z. Zellforsch.)), 542: 525-537 (1973).3. DostoTO, D. T., BOYD, J. E., MULROW, P. J., i KASHG.ARIAN, M.: The ultrastructure

of the adrenal zona glomerulosa of rats on potassium-suplemented or sodium-

depleted diets. ((Amer. J. Pathol.), 72: 433-446 (1973).4. FAWCET, D. W. i BURGOS, M. H.: Studies on the fine structure of the mammalian

testis. II. The human interstitial tissue. (Amer. J. Anat.)), 107: 24;1-270 (1960).

5. FAWCET, D. W., LONG, J. i JONES, A. L.: Ultrastructure of the endocrine glands.

(,Recent. Progr. Hormone Res.)), 25: 315-380 (1969).

6. FROHLING, J., i CLAUDE, A.: Preservation of lipids and ultrastructures in cells of

the adrenal cortex of the rat. ((Fourth Europ. Reg. Conf. Electr. Micr., Rome.

(BOCCIARELLI, D. S., ed.))), II: 17-18 (1868).

7. FRi1IILING, J. PENASSE, W. SAND, G., i CLAUDE, A.: Preservation du cholesterol

daps la corticosurrenale du rat an cours de la preparation des tissus pour lamicroscopic electronique. ((J. Microscopic)), 8: 957-982 (1969).

8. FRUHLING, J., SAND, G., PENA5SI., W. PECHEUX, F., 1 CLAUDE, A.: Correlation entre

la morphologic et le contenu lipidique des corticosurrenales du cobaye, durat et do boeuf. (J. Ultrastruc. Res.)), 44: 113-133 ('973)•

9. GiscONIE.LLI, F., WEINER, J., i SPIRO, D.: Cytological alterations related to stimu-

lation of tile zona glomerulosa of the adrenal gland. ((J. Cell Biol.)), 26: 499-

521 (19(i5).

1o. GOSIORI, G. W.: Microscopic Histochemistry. Principles and Practice. Universityof Chicago Press, Chicago (1952).

11. HARTROrr, 1. M., i EISENSTEIN, A. B.: Alterations in the adrenal cortex of the ratinduced by sodium deficiency: correlation of histologic changes with steroidhormone secretion. ((Endocrinology)), 6o: 641-651 (1957).

12. IDELSIAN, S.: Modification de la technique de Luft en vue dc la conservation deslipides en microscopic electronique. J. Microscopic,, 3: 715-718 (1964).

13. LENNEI, E. W., i MADDEN, L. M.: Electron microscopic observations on the invo-lution of the human corpus luteutn of menstruation. (Z. Zellforsch.)), 66:

365-380 (1965).14. LEVER, J. D.: Cytological studies on the hypophysectomized rat adrenal cortex:

The alterations of its fine structure following ACTH administration andlowering the Na/K ratio. ((Endocrinology)), 58: 163-18o (19516).

15. LONG, J. A. i JONES, A. L.: Alterations in fine structure of the opossum adrenalcortex following sodium deprivation. (Anat. Rcc.o, 166: 1-26 (1970).

16. MOSrs, H. I.., DAVIS, IV. W., RosENIHAL, A. S. i GARREN, L. D.: Adrenal choles-

terol: Localization by electron microscope autoradiography. (Science,, 563:

1203-1205 (1969)'17. PENNEY, D. P. i AVERILL, K.: Effects of chronic administration Of SU-4885 and

recovery on the rat adrenal cortex. (Anat. Rec.), 169: 398 (1971).

25

8 G.ABRIEL PALACIOS

18. PENNEY, D. P., OisoN, J. i AvERILL, K.: Fine structural studies of rat adrenalcortices following prostaglandin administration. ((Z. Zellforsch.)), r46: 297-307(1973).

19. RHODIN, J. A. G.: The ultrastructure of the adrenal cortex of the rat undernormal and experimental conditions. ((J. Ultrastruct. Res.)), 34: 23-71 (1971).

20. SAND, G., FRi)HLING, J., PE:NASSE, W. i C1.si ni:, A.: Distribution du cholesteroldans la corticosurrenale du rat. Analyse morphologigue et chimique des frac-tions subcellulaires, isolees par centrifugation differentielle. (J. Microscopic)),15: 41-66 (1972).

21. SAND, G., FRU11L1NG, J. i PLATrEN-GODFROID, C.: Contribution a l'etude de l'ullras-

tructure de la corticosurrenale de cobaye. (1 J. Microscopic)), 17: 283-298 (1973).22. SHARAWAY, M., DIRKSEN, T. R. i PENNFY, D. P.: Effects of a steroidogenic

inhibitor (U-8113) on adrenal lipids. ((Fed. Proc.)), 31: 293 (Abs.) (1072).23. SHELTON, J. H. i JONES, A. L.: The fine structure of the mouse adrenal cortex

and the ultrastructural changes in the zona glomerulosa with low and highsodium diets. (Anat. Rec.)), 170: 147-181 (1971).

24. SZABo, D.: Ultrastructural localization of a crystalline substance in the adrenalzona fasciculata of the rat. (Acta morph. Acad. Sci. hung.)), 16: 121-128 (1968).

25. SZABO, D., DzsINICH, Cs. i OKROS, I.: Ultrastructural localization of adrenal cho-lesterol by autoradiography and digitonin reaction after cyclohexilnide-inducedinhibition of corticosterone synthesis. d-Iistochemics, 27: 43-49 (1971).

26. SZABO, D., GLAZ, E. i KELEAMEN, J.: Subcellular localization of adrenal cholesterolby autoradiography and digitonin reaction after aminoglutethimide-includedinhibition of corticosterone synthesis. sHistochemistrya, 38: 213-221 (1974).

27. SZABO, D., STARK, E., POSALAKY, Z. i VARGA, B.: Electron-microscopic studies ofthe adrenal cortex of the rat in various functional conditions. (1Acta ph)siol.Acad. Sci. hung.)), 29: 380-381 (1966).

28. VENABI.E, J. H. i COGGFSHAI.e, R,: A simplified lead citrate stain for use in electronmicroscopy. (J. Cell Biol.)), 25: 407-408 (10651).

29. YOFFEY, J. M. i BARTER, J. S.: The formation of birefringent crystals in the su-prarenal cortex. (J. Anat.)) (Lond), 81: 335-342 (1947).

26