Estudi multi-isotòpic i d’indicadors microbians de les aigües subterrànies per determinar l’origen de la

contaminació per nitrats a Menorca

Encarregat per:

Departament de Medi Ambient i Reserva de la Biosfera. Consell Insular de Menorca.

Data: 15/10/2019

Escrit per Revisat per Validat per

Neus Otero

Elisenda Ballesté

Raul Carrey

Anicet Blanch

Sara Herrero

Anicet Blanch

Grup MAiMA Departament de Mineralogia, Petrologia i Geologia Aplicada

Facultat de Ciències de la Terra. Universitat de Barcelona C/ Martí i Franqués s/n 08028 Barcelona

Tel. 93 402 13 45; Fax: 93 402 13 40 http://www.ub.edu/maima/

Grup MARS

Departament de Genètica, Microbiologia i Estadística Facultat de Biologia. Universitat de Barcelona

Avda. Diagonal 643, 08028 Barcelona Tel. 93 402 90 12; Fax: 93 403 90 47

http://www.ub.edu/mars

2

Aquest pàgina s’ha deixat en blanc intencionadament

3

ÍNDEX

1. INTRODUCCIÓ ........................................................................................................................................ 4

2. OBJECTIUS .............................................................................................................................................. 4

3. BASES CONCEPTUALS ............................................................................................................................ 4

3.1. Compostos nitrogenats ................................................................................................................... 4

3.2. Aigua ............................................................................................................................................... 5

3.3. Indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen. ............................................... 7

4. MOSTREIG I ANÀLISI .............................................................................................................................. 9

4.1. Mostreig i anàlisis isotòpic .............................................................................................................. 9

4.1.1. Garantia de qualitat analítica MAiMA: .................................................................................... 9

4.2. Mostreig i anàlisis d’indicadors microbians i marcadors MST ...................................................... 10

4.1.2. Garantia de qualitat analítica MARS: ..................................................................................... 10

5. RESULTATS ........................................................................................................................................... 11

6. CONCLUSIONS ..................................................................................................................................... 21

7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................................... 21

4

1. INTRODUCCIÓ

En aquest document es presenten els resultats l’estudi de l’origen de la contaminació per nitrats a Menorca. L’origen dels nitrats pot estar relacionat amb les activitats agrícoles, professionals i/o d’oci o amb pèrdues de xarxes de clavegueram i/o fosses sèptiques. Per determinar l’origen de la contaminació s’ha realitzat un anàlisi multi-isotòpic, que juntament amb els resultats de la hidrogeologia i la caracterització geoquímica, i en mostres puntuals l’anàlisi de d’indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen pot permetre discernir l’origen d’aquest contaminant.

S’ha analitzat la composició isotòpica de N i O dels nitrats dissolts a l’aigua (δ15N-NO3-, δ18O-NO3

-), que permet diferenciar fonts de contaminació inorgàniques, com els fertilitzants, de fonts orgàniques, ja siguin lligades a activitats ramaderes i/o a xarxes de sanejament urbà. Malgrat tot, la composició́́ isotòpica de N i O del nitrat dissolt no permet diferenciar entre fonts ramaderes i aigües residuals urbanes, i per discriminar entre aquestes dues s’ha realitzat en mostres puntuals l’anàlisi d’indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen, que poden permetre identificar entre aquestes dues fonts. La composició isotòpica de l'aigua (δ2H i d δ18O), s’utilitzarà per identificar barreges d’aigües, i per ajudar a la interpretació de l'origen dels nitrats. S'utilitzaran també́ els resultats de l’anàlisi hidroquímic bàsic de les aigües (pH, conductivitat, alcalinitat, i anions (incloent nitrat) i cations majoritaris) i les dades hidrogeològiques, que han estat proporcionats per l'empresa Geoservei.

2. OBJECTIUS

Determinar l’origen de la contaminació́ a diferents pous de Menorca, utilitzant una aproximació multi-isotòpica combinada amb els indicadors i marcadors microbians, dades hidrogeològiques i geoquímiques.

3. BASES CONCEPTUALS

La composició isotòpica permet discriminar l’origen de determinats compostos, tot i que un determinat compost químic presenta una formulació concreta, des d’un punt de vista isotòpic un mateix compost pot presentar una composició isotòpica diferent segons el seu procés de fabricació o formació, així com segons els processos soferts posteriorment. Per tant la composició isotòpica permet diferenciar compostos d’idèntica formulació.

3.1. Compostos nitrogenats

La contaminació per compostos nitrogenats està relacionada principalment amb les pèrdues de xarxes de sanejament, lixiviats d'abocadors urbans, i amb el ús de fertilitzants sintètics, i/o residus ramaders. L’anàlisi de la composició isotòpica de nitrogen de l’amoni (δ 15N-NH4

+) o de nitrogen δ 18O i oxigen del

5

nitrat (δ15N-NO3-, δ18O-NO3

-) dissolt en les aigües permet determinar l’origen dels compostos nitrogenats. Els fertilitzants presenten valors de δ15N-NH4

+ i δ15N-NO3- que varien entre +5‰ i -5‰ i

valors de δ18O-NO3- al voltant de +23‰. El nitrogen procedent d'efluents ramaders o de fosses

sèptiques o xarxes de clavegueram, presenta valors de δ15N-NH4+ i δ15N-NO3

- més elevats, generalment compresos entre +10‰ i +20‰. (Vitòria et al. 2004). La δ18O-NO3

- d’aquests efluents de residus orgànics, sol presentar valors compresos entre 0 i +7 ‰, inferiors a els valors dels fertilitzants, ja que generalment procedeix dels compostos amoniacals nitrificats a partir de l'oxigen de l'aigua i l'atmosfèric a la zona no saturada (Vitòria et al. 2004), per tant en un diagrama δ15N vs. δ18O-NO3

- podem discriminar entre fonts de contaminació agràries, ramaderes i de xarxes de sanejament urbà (Fig. 1).

Fig. 1. Gràfic δ15N vs. δ18O-NO3- mostrant les caixes composicionals de diferents fonts de

compostos de nitrogen (Laura Vitòria et al. 2004).

3.2. Aigua

L’aigua de pluja constitueix una de les principals fonts de les aigües subterrànies. La composició isotòpica d'oxigen i deuteri de l'aigua de pluja mostra una tendència covariant, ja que dos isòtops estan associats a la mateixa molècula, i els processos com l’evaporació i la precipitació afecten a tot dos isòtops. Això fa que totes les aigües de pluja projectin sobre una recta. Craig (1961) a partir de

6

mostres d'aigua de pluja de tot el món, va posar de manifest que la dispersió de la major part dels valors no era molt gran i que se situaven al llarg d’una recta:

δ 2H = 8* δ 18O + 10

Aquesta recta s’anomena recta meteòrica mundial (GMWL de l’anglès). La pluja a cada lloc concret del món segueix una equació similar a la GMWL anomenada Recta Meteòrica Local, (LMWL de l’anglès):

δ 2H = 8* δ 18O + d

a la qual el terme independent d, és conegut com excés de deuteri, i té un valor característic en funció de la humitat i la temperatura ambient del lloc on s'han format els núvols que generen la pluja local. Per exemple, en el cas de Barcelona, la recta calculada a partir de les dades del programa “Global Network of Isotopes in Precipitation” (GNIP) de la IAEA, per les estacions 0818001 i 0818002 de Barcelona (International Atomic Energy Agency, 2013) dóna la següent equació:

δ 2H = 7.29* δ 18O + 7.32

La relació entre δ 2H i δ18O de l'aigua de pluja, pot modificar-se per diferents processos, de manera que els punts projectaran fora de la recta meteòrica. Segons la posició dels nous punts en relació amb la recta meteòrica podem conèixer quin és el procés modificador (Fig. 2):

- les barreges d'aigua de pluja amb aigua de mar originen una composició isotòpica que es troba a la recta que uneix els dos extrems.

- en el cas d'aigües que abans d'infiltrar-se han patit evaporació a partir d’una superfície lliure (llac, embassament, etc.) projecten en rectes de pendent 6 i 4, en funció de la humitat relativa. Quan l’evaporació es produeixen des del terreny (per evaporació directa durant la infiltració a la zona no saturada o per evaporació freàtica a través de la vegetació) les mostres es desvien de la recta amb una pendent menor de 4, no solen presentar cap tipus d’alineació al no existir un efecte reservori (llac, embasament, etc.).

- quan es produeix intercanvi d'oxigen entre l'aigua subterrània i els minerals del terreny (minerals amb molt oxigen en la seva xarxa cristal·lina, com el guix), l'aigua es va enriquint progressivament en d18O mentre que el δ 2H no varia. Les aigües resultants es disposen sobre una recta paral·lela a l’eix d'abscisses i es desplacen en sentit dels valors creixents. Aquest procés només té lloc a temperatures relativament elevades.

- si hi ha CO2 magmàtic en el terreny es produeix un intercanvi isotòpic amb l'aigua que empobreix aquesta en δ18O mentre que el δ 2H no varia. Les aigües modificades se situen sobre una recta paral·lela a l’eix d'abscisses desplaçant-se a valors decreixents. Aquest procés pot tenir lloc a temperatures baixes.

- la hidròlisi de silicats provoca intercanvi amb l'aigua tant de δ18O com de δ 2H, i les aigües resultants se situen a una recta de pendent negativa a l'esquerra de la recta meteorològica. Aquest procés també sol donar-se a temperatures relativament elevades.

7

- si es produeix un intercanvi amb hidrogen de l'H2S o CH4 augmenta el contingut en δ 2H de l'aigua, i les aigües s'ubiquen sobre rectes paral·leles a l'eix d'ordenades. Aquest procés pot tenir lloc a temperatures ambientals i seria el cas que trobaríem en aigües que han interaccionat amb residus d’un abocador.

Fig. 2. Processos que modifiquen la relació 2H – 18O en l’aigua subterrània respecte a una determinada pluja de recarrega.

Finalment, en processos de barreja d'aigües, si aquestes presenten diferent composició isotòpica, les aigües producte d’una barreja projectaran sobre una recta de barreja teòrica, permetent quantificar fàcilment els balanços d'aigua aportats per cada una d’elles. Aquesta aplicació serà especialment útil quan s’integrin les dades hidro-químiques i les isotòpiques per a l'elaboració del model conceptual, ja que la composició isotòpica l'aigua, a diferència de la composició hidroquímica de les aigües, no està afectada per: processos de dilució, dispersió per transport o sorció.

3.3. Indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen.

Els indicadors microbians de qualitat de l’aigua: Escherichia coli, enterococs, colífags somàtics i espores de clostridis permeten detectar la possible contaminació fecal recent o més llunyana al medi. Aquests indicadors microbians tradicionals només ens indiquen la presència de contaminació fecal ja que són general (es troben sobretot en mamífers i aus) en l’aigua però no poden indicar-nos l’origen de l’hoste de les poblacions microbianes causant de la contaminació fecal. De fet, aquests indicadors s’inclouen en varies normatives per a avaluar la qualitat de l’aigua (BOE, 2003; European Comission 2006).

8

Per altra banda durant les darreres dècades s’han desenvolupat uns altres indicadors (específics d’hostes) que permeten determinar l’origen de la contaminació fecal (Microbial Source Tracking, MST en anglès) i que en combinació amb els indicadors generals ens permeten fer una millor gestió de l’aigua i mitigar la contaminació en origen. Aquests indicadors estan associats als hostes que poden ser l’origen de la contaminació fecal (humà, boví, porcí, aviram) i poden detectar virus o bacteris mitjançant mètodes de cultiu o moleculars . La majoria d’aquests mètodes s’han desenvolupat utilitzant tècniques moleculars quantitatives basades en marcadors microbiològics específics de MST permeten diferenciar els orígens de la contaminació fecal (humana versus animal, o diferents espècies animals). Els marcadors microbians es fonamenten normalment en l’ús de seqüències de DNA (fragments del 16S rRNA bacterià o fragments de genoma víric en el cas dels bacteriòfags) de poblacions comensals presents en l’intestí i que s’han associat a un hoste en concret (humà, porcí, boví, aviram). L’avantatge de l’ús de marcadors MST basats en poblacions comensals intestinals respecte l’ús de marcadors MST basats amb patògens, és que els marcadors de comensals no depenen de l’estat epidemiològic de les poblacions respecte les infeccions del patogen. Tot i que alguns patògens (humans o animals) poden resultar operatius en algunes circumstàncies, s’ha demostrat (Blanch, et al, 2016) que poden generar falsos negatius en territoris on el patogen no és endèmic i per tant absent. L’ús combinat de marcadors MST específics de diferents orígens resulta necessari i imprescindible per a una predicció més acurada sobretot en mostres complexes que reuneixen barregen i processos d’inactivació natural o artificial (Ballesté et al. 2010; Belanche 2011; Blanch et al. 2016). Recentment, el grup de recerca MARS ha desenvolupat un nou marcador molecular específic per humans basat en una seqüència d’un bacteriòfag (virus que infecta bacteris) d’origen intestinal que té com a cèl·lula hoste soques de Bacteroides habituals en l’intestí humà (Ballesté et al. 2019).

Cal també destacar que resulten molt útils els marcadors MST cultivables relacionats en bacteriòfags de Bacteroides associats a hostes específics. El grup de recerca MARS ha desenvolupat i lidera la recerca sobre aquests marcadors i ha posat en els darrers anys marcadors d’aquests tipus associats a diferents hostes (Jofre et al. 2014). Entre aquests marcadors destacarem els bacteriòfags de Bacteroides associats a humans d’hoste (GA17) que es proposen en aquest estudi.

Atenent a les possibilitats que permeten l’ús combinat dels indicadors microbians tradicionals i els marcadors de MST, es consideren per aquests estudi els següents:

- Marcador cultivable d’origen humà: s’utilitzarà la soca hoste associada a humans GA17 de Bacteroides thetaiotaomicron.

- Marcador d’origen humà: s’utilitzarà el marcador crAssphage basat en un bacteriòfag de Bacteroides associat a l’intestí humà o alternativament un marcador específic per humans basat una seqüència específica del gen del 16S rRNA de Bifidobacterium spp.

- Marcador boví: s’utilitzarà el marcador CWBif específic per bovins basat una seqüència específica del gen del 16S rRNA de Bifidobacterium spp.

- Marcador porcí: s’utilitzarà el marcador Pig2Bac específic per porcins basat una seqüència específica del gen del 16S rRNA de Bacteroides/Prevotella.

9

La determinació de l’origen fecal de la contaminació en aigües pot obtenir-se de manera directa amb els resultats dels marcadors moleculars microbians en aquelles aigües amb una càrrega microbiana elevada (aigües superficials de rius amb contribucions continuades d’aigües residuals depurades o sortides de tractaments secundaris). No obstant, quan les carreges microbianes en l’aigua són menors degut a efectes de dilució o envelliment de la contaminació es necessari l’ús d’una anàlisi estadística basada en models desenvolupats amb l’aproximació metodològica proposada que utilitza diferents isòtops i els indicadors i marcadors microbians.

4. MOSTREIG I ANÀLISI

4.1. Mostreig i anàlisis isotòpic

El mostreig per les anàlisis isotòpiques s’ha realitzat amb el suport de Geoservei. S’han proveït un total de 17 mostres d’aigües subterrànies. Les dades dels paràmetres químics han estat proporcionades per Geoservei, a partir de les anàlisis realitzades al laboratori PIMELAB - Centro Tecnológico de Ciutadella.

El mostreig isotòpic de les aigües subterrànies, totes elles provinents de captacions d’abastament públic, es va realitzar la setmana del 10 al 14 de Juny de 2019. Un cop obtinguts els primers resultats de les anàlisis isotòpiques, es va programar el mostreig de 5 mostres per determinar els indicadors microbians, que es va realitzar el 2 de Setembre de 2019.

- Anàlisi isotòpica de compostos nitrogenats:

L’anàlisi de δ15N i δ18O en nitrats i δ15N en amoni s’ha realitzat mitjançant un preconcentrador automàtic (Pre-Amb, Thermo Scientific) acoblat a un IRMS (Finnigan MAT-253, Thermo Scientific). Els resultats s'expressen referenciats respecte a l'estàndard internacional N-atmosfèric per a la δ15N y a V-SMOW per a la δ18O.

- Anàlisi isotòpica de la molècula de l'aigua:

La composició isotòpica de l'oxigen de l'aigua (δ18O) s'ha analitzat mitjançant espectròmetre de masses de relacions isotòpiques (IRMS, Matt Delta S) acoblat a una línia automàtica d'equilibri entre l'oxigen de l'aigua i CO2 gas. Els resultats s'expressaran referenciats respecte a l'estàndard internacional Vienna Standard Mean Ocean Water (V-SMOW). La composició isotòpica de l'hidrogen de l'aigua (δ2H) s'ha analitzat en un pirolitzador acoblat a un IRMS (TC/EA-IRMS Finnigan Delta C). Els resultats s'expressen referenciats respecte a l'estàndard internacional V-SMOW.

4.1.1. Garantia de qualitat analítica MAiMA

MAiMA ha aconseguit l'acreditació TECNIO, que concedeix la Generalitat de Catalunya. L'acreditació garanteix l'excel·lència científica del grup de recerca i la implementació d'un sistema de gestió de la

10

qualitat d'acord amb els requisits de la norma ISO 9001: 2015. Per garantir la qualitat dels resultats analítics es seguiran els estàndards internacionals de qualitat en anàlisi d'isòtops estables (Coplen 2011; Werner and Brand 2001).

Per a cada element s’han utilitzat patrons internacionals o interns del laboratori, de la mateixa naturalesa que les mostres que englobin composicionalment a les mateixes. Aquests patrons s’han analitzat intercalats cada 6-10 mostres en funció del isòtop, per garantir el correcte funcionament de l'equip, i per calcular la recta de calibratge i la correcció de deriva (si escau). Aquells resultats que han presentat una desviació estàndard (STDEV) superior a la desviació instrumental s’han repetit.

4.2. Mostreig i anàlisis d’indicadors microbians i marcadors MST

- Anàlisi dels indicadors microbians i marcadors MST

Els indicadors microbians de qualitat de l’aigua tradicionals s’han analitzat seguint les tècniques estandarditzades per cadascun d’ells. Els marcadors moleculars de MST es basen tots ells en una detecció quantitativa per qPCR. Per tant, es precisa d’un concentració adient de DNA que determina la necessitat de concentració de volums de mostra suficient per aconseguir una concentració suficient de marcadors en les mostres. Les mostres de baixa càrrega microbiana (<103 E.coli CFU/100 mL com valor de referència) es concentren per filtració a través de filtres d’una mida de porus de 0.22 µm (SO-PAK, Millipore, Germany). Posteriorment es procedeix a l’extracció del DNA de la mostra col·locant prèviament els filtres en 0.5 mL de bufer GITC (5 M guanidine thiocyanate, 100 mM EDTA [pH 8.0], 0.5% Sarkosyl) i congelant-los a -20ºC en el tampó de lisis per a una extracció de DNA en lots de mostres. L’extracció del DNA dels filtres es realitza amb el QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) amb algunes modificacions menors prèviament descrites per Gourmelon et al., 2007). El DNA extret es conserva a -20ºC per a la seva anàlisi posterior amb les qPCR específiques de cadascun dels marcadors. Els protocols estandarditzats d’aquest procediments específics es detallen posteriorment.

La sensibilitat de les tècniques qPCR per marcadors microbians estan establertes en un nombre molt baix de dianes (al voltant d’unes 5 seqüències corresponents al marcador) per tub d’assaig de la qPCR. No obstant, els límits de detecció dels marcadors moleculars respecte la mostra ambiental estan entre 1-10 dianes/mL. Aquesta limitació de les tècniques moleculars implica que s’hagin de concentrar volums de mostra adients quan l’aigua analitzada presenta una baixa càrrega microbiana. Els marcadors moleculars de MST ja s’han aplicat en mostres ambientals a diferents concentracions (altes, aigües depurades; mitjanes, aigües de rius catalans; i baixes, aigües de qualitat de bany del Delta de l’Ebre) amb aquest procediments en estudis realitzats pel grup MARS a Catalunya (Casanovas-Massana et al. 2015), amb un estudi MST a Irlanda amb col·laboració d’un membre del grup MARS la Environmental Protection Agency del govern d’Irlanda (Ballesté, 2015), i en cinc països europeus en el projecte Aquavalens (Ballesté et al. 2015).

4.1.2. Garantia de qualitat analítica MARS

11

El grup MARS de la UB no disposa d’acreditacions per agències reguladores. No obstant, si que participa en projectes nacionals i internacionals on hi ha exercicis d’intercalibració o interlaboratori, i en grups d’experts d’agències d’estandardització (AENOR, ISO, CEN). El grup de recerca UB MARS ha participat i participa de manera habitual en exercicis de inter-laboratori a nivell nacional i internacional. Cal destacar, la seva participació i organització dels estudis inter-laboratori i preparació de materials de control en els dos projectes europeus realitzats fins al moment sobre MST. El grup MARS ha organitzar tant en el projecte europeu TOFPSW (Tracking of the Origin of Faecal Pollution in Surface Water, 2001-2003) com en el recent projecte europeu Aquavalens en el paquet de treball 5 (MST: Combining cultivation-dependent and molecular techniques. Protecting the health of Europeans by improving methods for the detection of pathogens in drinking water and water used in food preparation, 2014 – 2019) les sessions de formació i entrenament del analistes i els posteriors exercicis interlaboratoris per a l’establiment i consolidació dels protocols estandarditzats (SOP: Standard Operating Protocols). El grup MARS també participa en el desenvolupament de procediments estandarditzats ISO/CEN tant en els estudis previs per a l’establiment dels protocols com en els exercicis d’interlaboratori. Membres del grup MARS han estat consultats o col·laboradors per estudis de MST per les agències US-EPA i EPA-Irland, així com avaluadors de projectes de recerca d’organismes nacionals i internacionals (Govern Espanyol, Generalitat, Comissió Europea, Universitats nord-americanes, governs d’altres països, EFSA, entre d’altres).

5. RESULTATS

5.1. Resultats isotòpics 5.1.1. Fonts de nitrat i processos

La Figura 5.1 mostra els valors bibliogràfics de les diferents fonts de nitrats. Els fertilitzants inorgànics tenen en δ15N-NO3

- valors propers a 0 ‰, el nitrat de la matèria orgànica del sòl mostra valors que oscil·len entre + 3 ‰ i + 9 ‰, aproximadament, i el nitrat de matèria orgànica (dejecció animal i aigües residuals urbanes) mostren valors que van des de +7 ‰ a + 20 ‰. Els valors δ18O-NO3

- dels fertilitzants (en forma de NO3

- ) són propers a + 23 ‰. Els nitrats derivats de la nitrificació, ja sigui de fertilitzants inorgànics d’amoni, de nitrogen orgànic del sòl, fems o de fosses sèptiques i xarxes d’aigües residuals, tindran una característica δ18O-NO3

-, que es basarà en δ18O-H2O d’aigües subterrànies locals i δ18O-O2 d’oxigen dissolt a l’aigua (Mayer et al. 2001):

δ18ONO3 = 1/3 δ18OO2 + 2/3 δ18OH2O (Eq. 1)

El valor de la δ18O-O2 es + 23 ‰ i els valors de δ18O-H2O són variables i depenen de l’àrea d’estudi. A la figura 5.1 es representen les caixes compositives calculades amb els valors mínims i màxims de δ18O-H2O d’aigües subterrànies d’influència mediterrània (Araguás-Araguás and Diaz Teijeiro 2005).

A més, a l’hora d’interpretar dades isotòpiques de compostos nitrogenats, també cal tenir en compte que la composició isotòpica es pot veure afectada per diversos processos físics, químics i biològics, com volatilització, desnitrificació, barreja, etc. L’amoni (NH4

+), un component principal dels fertilitzants inorgànics, els fems de bestiar i les aigües residuals, està afectat per processos de

12

volatilització. La volatilització produirà un augment de la δ15N-NH4+ (Mariotti et al. 1981). Aquest

procés es representa a la figura 5.1 amb una fletxa horitzontal.

Un dels processos que poden modificar significativament la composició isotòpica N i O del nitrat dissolt és la desnitrificació. La desnitrificació és una reacció redox produïda per microorganismes que redueixen el NO3

- a N2 en tot el seu cicle, actuant com a procés de descontaminació de nitrats (atenuació natural). Aquesta reacció es produeix a través de diferents etapes intermèdies.

NO3- (aq) à NO2

- (aq) à NXO (g) à N2 (g) (Eq. 2)

Aquest procés redox actua en condicions anaeròbiques on els bacteris obtenen energia a partir de la reducció de NO3

- i de l’oxidació de matèria orgànica o compostos inorgànics com els sulfurs (Rivett et al. 2008). Durant la reducció de NO3

- hi ha un fraccionament isotòpic que augmenta la composició isotòpica, tant en δ15N-NO3

- com en δ18O-NO3- del nitrat romanent amb un pendent característic

(Böttcher et al. 1990; Fukada et al. 2003), (veure Figure 5.1). Per tant, l’ús d’isòtops estables és una eina molt útil per a determinar l’existència de processos de desnitrificació ja que el nitrat afectat per la desnitrificació presentarà una composició isotòpica que es projectarà en el camp teòric emmarcat entre aquestes dues pendents bibliogràfiques. La variabilitat d’ambdós pendents genera una zona de solapament o incertesa on l’origen del nitrat no es pot assignar de forma unívoca (Fig. 5.1).

Figura 5.1 δ15N-NO3- i δ18O-NO3

- mostrant les caixes composicionals segons l’origen del nitrat.

Les dades de fertilitzants químics són de Vitòria et al. (2004). Els dades d’adobs orgànics i aigües residuals, provenen de Widory et al. (2004). Les dades de nitrats del sòl provenen de Mengis et al. (2001). La δ18O-NO3

- de la nitrificació es va calcular mitjançant els valors màxims i mínims de δ18O-H2O a l’àrea estudiada (Eq. 1). Les fletxes indiquen una evolució teòrica durant la volatilització i el MIT. Les

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35

d18 O

(‰)

d15N (‰)

Manure/ SewageSoil NO3-

Fert. NH4

+

Fert.NO3

-

Volatilization

MIT

Desnitrification

13

àrees de desnitrificació teòrica es van calcular mitjançant les relacions publicades εN: εO de 2: 1 (Böttcher et al. 1990), i 1.3: 1 (Fukada et al. 2003).

En certes condicions els fertilitzants aplicats en forma de NO3- també es poden reciclar al sòl, en un

procés abreujat com MIT (de l’anglès Mineralitzation - Immobilitzation - Tunover). Aquest procés implica primer immobilitzar el nitrat aplicat per incorporació microbiana, el nitrat s'incorporaria llavors com a "matèria orgànica del sòl (SOM)". Aquest SOM pot ser re-mineralitzat posteriorment en forma de NH4

+ i nitrificat de nou. Durant aquest procés, la composició isotòpica de N és aproximadament constant, però la δ18O-NO3

- perd el seu senyal isotòpic característic de +23 ‰ i tindrà el mateix valor de δ18O-NO3

- que els fertilitzants d'amoni nitrificats (Mengis et al. 2001). Aquest procés es produeix només en sòls on l’activitat microbiana és elevada (principalment a l’estiu) i on el temps de residència a la zona insaturada és suficient. El canvi isotòpic provocat per MIT s’ha representat al gràfic amb una fletxa vertical. Per contra, en sòls amb baixa activitat microbiana, o zones amb fluxos preferents i temps de residència baix a la zona no saturada, els fertilitzants aplicats en forma de NO3

- conservaran la seva característica composició isotòpica. A efectes pràctics, en llocs on es troben senyals isotòpics característics dels fertilitzants amoniacals nitrificats, no es pot concloure inequívocament que no hi hagi aportacions de fertilitzants aplicats en forma de nitrats.

Finalment, una barreja entre dues (o més) fonts diferents es reflectirà en un diagrama δ15N-NO3- vs.

δ18O-NO3- seguint una línia (o àrea) de mescla entre les fonts.

5.1.2 Origen del nitrat

Els resultats dels paràmetres químics figuren a la Taula 5.1 i han estat proporcionats per Geoservei. Els resultats isotòpics de les mostres analitzades figuren a la Taula 5.2.

Taula 5.1. Dades químiques de els mostres (proporcionades per Geoservei). Resultats en mg/L.

Mostra pH u pH

Cond μS

HCO3-

mg/L Cl-

mg/L NO3

-

mg/L SO4

2-

mg/L Ca

mg/L Mg

mg/L Na

mg/L K

mg/L M1 7.5 1175.0 370.0 184.0 62.0 44.5 94.0 42.5 118.0 12.3

M2 7.7 1016.0 288.0 151.0 93.0 56.0 93.0 35.0 85.0 3.2

M3 7.7 1153.0 315.0 197.0 84.0 57.0 95.0 39.9 112.0 9.5

M4 7.4 924.0 310.0 135.0 58.0 27.4 88.0 30.6 73.0 3.5

M5 7.6 939.0 315.0 148.0 41.2 31.7 74.0 33.1 95.0 2.8

M6 7.1 1163.0 519.0 147.0 27.4 75.0 110.0 64.0 103.0 4.0

M7 7.1 1376.0 542.0 148.0 25.8 193.0 141.0 82.0 77.0 2.8

M8 7.6 1014.0 316.0 171.0 26.2 47.9 93.0 25.3 103.0 4.3

M9 7.4 1095.0 328.0 199.0 33.1 48.6 93.0 28.2 115.0 3.7

M10 7.4 1197.0 290.0 218.0 108.0 35.2 95.0 37.4 106.0 13.7

M11 7.5 1112.0 340.0 188.0 71.0 37.7 96.0 34.8 100.0 7.6

M12 7.4 1043.0 374.0 158.0 70.0 38.2 87.0 38.4 88.0 7.6

14

M13 7.3 1178.0 342.0 218.0 52.0 41.0 90.0 45.7 109.0 4.9

M14 7.5 1427.0 293.0 293.0 88.0 84.0 104.0 42.8 150.0 11.6

M15 7.4 1896.0 289.0 456.0 93.0 80.0 140.0 40.4 217.0 8.7

M16 7.4 2400.0 298.0 635.0 78.0 103.0 139.0 52.0 323.0 11.0

M17 7.3 1321.0 305.0 260.0 99.0 53.0 121.0 32.1 136.0 5.6

Taula 5.2. Dades isotòpiques de les mostres analitzades.

Mostra δ15N-NO3- (‰)

SD δ18O-NO3- (‰)

SD δ2H-H2O (‰)

SD δ18O-H2O (‰)

SD

M1 +6.8 0.1 +4.4 0.7 n.d

n.d

M2 +5.9 0.3 +6.5 0.5 -32.6 0.1 -5.9 0.1

M3 +5.9 0.1 +1.0 1.2 n.d

n.d

M4 +7.2 0.0 +3.5 0.3 n.d

n.d

M5 +4.7 0.1 +2.9 0.2 n.d

n.d

M6 +4.6 0.2 +3.6 0.5 n.d

n.d

M7 +3.4 0.4 +5.2 0.6 n.d

n.d

M8 +6.8 0.6 +5.9 0.2 -36.0 0.5 -6.4 0.1

M9 +4.4 0.4 +3.9 0.5 n.d

n.d

M10 +6.9 0.6 +3.6 0.1 n.d

n.d

M11 +6.9 0.6 +4.2 0.4 -33.9 0.1 -6.0 0.1

M12 +6.6 0.2 +2.4 0.2 n.d

n.d

M13 +4.3 0.0 +3.6 0.7 n.d

n.d

M14 +7.6 0.8 +4.3 0.4 n.d

n.d

M15 +7.7 0.3 +3.1 0.1 n.d

n.d

M16 +7.4 0.8 +5.1 0.6 -33.1 0.1 -5.7 0.1

M17 +7.4 0.4 +5.8 0.2 n.d

n.d

n.d. = no determinat, SD = desviació estàndard

La δ2H de les mostres d’aigua subterrània analitzades varia entre -32.6 i -36,0 ‰, i la δ18O-H2O varia entre-5,7 i -6,4 ‰. S’ha consultat la base de dades GNIP (Global Network of isotopes in Precipitation) de la IAEA (IAEA/WMO 2019) i l’estació d’anàlisi d’isòtops de l’aigua de pluja més propera a la zona d’estudi és la situada a Palma de Mallorca (830101). Es disposa de dades de la composició isotòpica de hidrogen i oxigen en l’aigua de pluja en el període 2000-2015. Amb aquestes dades i excloent els episodis de pluja amb volum inferior a 20 mm s’ha calculat la recta meteòrica local i el valor de la pluja ponderada. La Figura 5.2 mostra les dades de la IAEA, conjuntament amb la recta calculada, la pluja ponderada i les mostres d’aigua subterrània analitzades a la zona d’estudi. Les mostres d’aigua subterrània analitzades segueixen la línia meteòrica local i estan situades molt a prop del valor de la pluja ponderada.

15

Com s’ha explicat en la secció anterior en el procés de nitrificació l’oxigen del nitrat deriva en part de l’oxigen l’aigua i en part de l’oxigen atmosfèric. Per a realitzar el càlcul de la composició isotòpica teòrica del nitrat produït per nitrificació a la zona d’estudi s’ha considerat el rang de variabilitat estacional de δ18O de l’aigua de pluja (-8,2 a -3,4 ‰), descartant els valors superiors e inferiors (Figura 5.3). El rang de valors teòrics de δ18O-NO3

- degut a nitrificació calculats amb l’equació varia entre +2,2 i +5,4 ‰. Aquest és el rang que s’ha representat a les figures en el nitrat derivat de la nitrificació.

Figura 5.2. Dades de pluja de l’estació 830101 de Palma de Mallorca, s’ha representat la recta

meteòrica local, la pluja ponderada i les mostres d’aigua subterrània analitzades.

y = 7,554x + 7,981R² = 0,9514

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40-15 -10 -05 00 05

δ2 H (0 /

00)

δ18O (0/00)

Pluja

Pluja ponderada

Dades Menorca

16

Figura 5.3 Histograma de la δ18O de l’aigua de pluja a l’estació 830101 de Palma de Mallorca, en blau

es mostra la variabilitat total, en taronja l’interval que s’ha considerat pel càlcul teòric de la δ18O-NO3

- produït per nitrificació seguint la Ec. 1.

La δ15N-NO3- de les mostres d’aigua subterrània analitzades varia entre +3,4 i +7,7 ‰, i la δ18O-NO3

- entre +1 i +6,5 ‰. La Figura 5.4 mostra les caixes composicionals de les possibles fonts de nitrat junt amb la composició isotòpica de N i O del nitrat dissolt a les mostres d’aigües subterrànies analitzades. La Figura 5.5 mostra el mateix diagrama a una escala més petita i amb les mostres identificades amb el seu codi. Totes les mostres estan a la caixa composicional del nitrat del sòl, malgrat això, les elevades concentracions en nitrat detectades (entre 25 i 100 mg/L amb un valor mitjà de 65 mg/L) descarten el nitrat del sòl com a principal font de nitrat. Les mostres M5, M6, M7, M9 i M13 estan a la caixa composicional dels fertilitzants amoniacals nitrificats, l’origen d’aquestes mostres estaria lligat principalment a la influència de fertilitzants químics, poden ser fertilitzants amoniacals nitrificats o fertilitzants aplicats en forma de nitrat i que s’han reciclat en el sòl.

Per a la resta de les mostres, els valors de δ15N varien entre +6 i +8 ‰, valors lleugerament superiors als fertilitzants. No obstant, no es pot descartar la contribució de fertilitzants en aquestes mostres, ja que processos de volatilització en el sòl dels fertilitzants amoniacals o aplicats com urea, poden incrementar la δ15N. De fet, estudis previs realitzats una zona del Maresme per (Vitòria L., Soler A., Aravena R. 2005) amb cultius intensius en hivernacles, i on només s’utilitza fertilitzant químic mostres un rang de variació de δ15N entre +6 ‰ i +9 ‰. Per tant la composició isotòpica d’aquestes mostres es podria explicar també per una contribució principal de fertilitzants, que han volatilitzat i nitrificat.

[-13,

0, -1

1,4]

(-11,

4, -9

,8]

(-9,8

, -8,

2](-8

,2, -

6,6]

(-6,6

, -5,

0](-5

,0, -

3,4]

(-3,4

, -1,

8](-1

,8, -

0,2]

(-0,2

, 1,4

](1

,4, 3

,0]

δ18O

(0 /00

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

17

Figura 5.4. δ15N-NO3- i δ18O-NO3

- mostrant les caixes composicionals de la Fig. 5.1 i les mostres d’aigües subterrànies analitzades.

Figura 5.5. δ15N-NO3- i δ18O-NO3

- mostrant les caixes composicionals de la Fig. 5.4 i les mostres d’aigües subterrànies analitzades.

Aquestes mostres però també es podrien explicar per una barreja entre nitrat procedent de fertilitzants químics i nitrat procedent de fertilitzants orgànics i/o aigües residuals. Pel que fa a les possibles fonts orgàniques, segons els resultats bibliogràfics (Vitòria et al. 2008; Widory et al. 2004) els fems de porcí tenen una composició isotòpica de N entre +10 i +30 ‰, ja que durant el temps que acostumen a estar emmagatzemats en basses abans d’aplicar-los en el camp, estan afectats per

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35

d18 O

(‰)

d15N (‰)

Fert. Org. / Aigües Sòl NO3-

Fert. NH4

+

Fert.NO3

-

Volatilització

MIT

Desnitrificació

-9.6

M1

M2

M3

M4M5

M6

M7

M8

M9

M10

M11

M12M13

M14

M15

M16M17

0

3

6

9

12

15

0 2 4 6 8 10 12 14

d18 O

(‰)

d15N (‰)

Fert. Org. / Aigües residuals

Sòl NO3-

Fert. NH4

+

18

processos de volatilització, per tant aquesta font es pot descartar, ja que no s’han trobat composicions isotòpiques elevades. Per contra els fems de vaca, acostumen a presentar valors entre +5 ‰ i +12 ‰ i les aigües residuals presenten un rang ampli, entre +6 i +22%. Per a confirmar o descartar si el nitrat de les mostres estudiades pot tenir en part un origen lligat a fertilitzants orgànics i/o aigües residuals, s’ha realitzat la caracterització d’indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen en les mostres amb δ15N més elevada (M14, M15; M16 i M17) així com en una mostra de la zona de Maó (mostra SC-1) que en un informe previ (MAIMA 2018) tenia prop de 200 mg/L de nitrat i una composició isotòpica de N i O del nitrat dissolt clarament en el camp dels fertilitzants orgànics i/o les aigües residuals.

5.1.2 Atenuació natural de la contaminació.

La composició isotòpica de N i O del nitrat dissolt permet també identificar si a la zona estudiada s’estan produint processos de atenuació natural del nitrat o desnitrificació. En general a les mostres estudiades no s’observen les tendències esperades, d’increment de la δ15N-NO3

- acoblat a un increment de la δ18O-NO3

- amb un pendent característic. Els valors lleugerament més elevat que els teòrics per la δ18O-NO3

- d’algunes mostres (M2, M8 i M 17) es poden explicar o bé per variacions lligades al procés de nitrificació, que tot i generalment compleix la Eq. 1, pot mostrar més variabilitat (Snider et al. 2010), o bé per barreja amb fertilitzants aplicats com a NO3

-.

5.2. Resultats d’indicadors microbians i marcadors moleculars específics d’origen.

Cinc de les mostres s’han analitzat mitjançant indicadors microbians. La presència d’indicadors ha estat en general baixa. En cap de les mostres s’ha detectat, Enterococs i colífags somàtics, mentre que la mostra M15 ha resultat positiva per E. coli amb 1 UFC (Unitats Formadores de Colònies) en 100 ml. Per altra banda s’ha detectat espores de clostridis sulfit-reductors en les mostres M15, M17 i SC1 (Taula 5.3) el que indica una contaminació remota en el temps o en l’espai en aquestes mostres.

Taula 5.3. Abundància d’indicadors microbiològics generals en UFC per 100 ml en el cas d’E. coli, enterococs i espores de clostridis sulfit-reductors i PFU (unitats formadores de calves: Plaque Forming Units) per 100 ml en el cas de colífags somàtics.

Mostra E. coli Enterococs Espores de clostridis

sulfit-reductors Colífags somàtics

M14 < 1 < 1 < 1 < 1 M15 1.00E+00 < 1 9.40E+01 < 1

M16 < 1 < 1 < 1 < 1 M17 < 1 < 1 1.50E+02 < 1 SC1 < 1 < 1 1.10E+01 < 1

19

Per altra banda pel que fa els resultats d’indicadors de l’origen de la contaminació fecal a l’aigua (Taula 5.4) totes les 5 mostres han donat per sota el límit de detecció, pel que serien negatives. Tot i així no es pot descartar la presència de l’indicador de contaminació fecal humana (HMBif) en la mostra M16 i l’indicador porcí (Pig2Bac) en la mostra M15.

Taula 5.4. Abundància d’indicadors de l’origen de contaminació fecal en PFU per 100 ml pel bacteriòfags que infecten la soca de Bacteroides thetaiotaomicron específica d’humans GA17 (GA17PH) i en CG (còpies gèniques) per 100 ml en el cas dels indicadors bacterians específics d’humans (HMBif), boví (CWBif) i porcí (Pig2Bac). Ind: S’ha detectat senyal per sota el límit de detecció de la tècnica.

Mostra GA17PH HMBif CWBif Pig2Bac M14 < 1 <30 <30 <30 M15 < 1 <30 <30 Ind M16 < 1 Ind <30 <30 M17 < 1 <30 <30 <30 SC1 < 1 <30 <30 <30

5.3. Integració dels resultats isotòpics i els indicadors microbians i marcadors moleculars.

Els resultats dels marcadors microbians confirmen l’origen majoritàriament lligat a fertilitzants químics apuntat pels resultat isotòpics. De les quatre mostres amb una composició isotòpica més elevada (M14, 15, 16, 17), que podrien suggerir una influència orgànica, només les mostres M15 i M16 han mostrat valors dels indicadors microbians que indicarien contaminació fecal o porcina, però els valors estan per sota del límit de detecció de la tècnica. En totes dues mostres però s’han detectat espores de clostridis sulfit-reductors que indicarien una contaminació remota en el temps o en l’espai. Els resultats concorden també amb els usos del sol que son majoritàriament agrícoles per tots els punts de mostreig, excepte el punt M14, on hi ha també nuclis de població, i el punt M16, on, a banda de un ús agrícola intensiu hi també una estació depuradora d’aigües residuals.

Pel que fa a la mostra SC-1, que en una campanya anterior s’havia analitzat i havia donat resultats isotòpics compatibles amb un origen orgànic, no s’observen en aquest mostreig indicadors de l’origen de contaminació fecal, i si s’observa també presència d’espores de clostridis sulfit-reductors que indicarien una contaminació remota en el temps o en l’espai. Cal destacar que aquesta comparativa no és directa, ja que totes les mostres analitzades per marcadors corresponen a un mostreig temporalment diferent del mostreig químic i isotòpic. Per les mostres M14, 15, 16 i 17 el mostreig químic i isotòpic es va realitzar entre els dies 10 i el 14 de Juny de 2019 i per la mostra SC-1 el mostreig isotòpic es va realitzar amb anterioritat, el 29 de novembre de 2017. El mostreig per determinar els indicadors microbians es va realitzar el 2 de Setembre de 2019.

20

Es presenten en format taula resum els possibles orígens de les fonts de nitrat de les aigües subterrànies (Taula 5.5).

Taula 5.5. Resum de la identificació dels orígens de les fonts de nitrat per a cada un dels punts d’aigües subterrànies mostrejats. NC: no contaminació fecal. CR: contaminació fecal recent. CA: possible contaminació fecal antiga. NA: no analitzat. ND: origen fecal no detectat. DSC: detectat sota límit de detecció confirmativa

Mostra Topònim Municipi NO3- (mg/L) Origen per isòtops

Origen per microbiologia

M1 Malbúger 3 Maó 62 Fertilitzants químics NA M2 Son Vilar 2 Es Castell 93 Fertilitzants químics NA M3 Ses Escoles 2 Es Castell 84 Fertilitzants químics NA M4 Trebalúger 1 Es Castell 58 Fertilitzants químics NA M5 Cala en Porter 1 Alaior 41,2 Fertilitzants químics NA M6 Es Plans 3 Alaior 27,4 Fertilitzants químics NA M7 Binifabini 2 Es Mercadal 25,8 Fertilitzants químics NA M8 Son Xua 1 Es Migjorn 26,2 Fertilitzants químics NA M9 Calafi Nou Ferreries 33,1 Fertilitzants químics NA

M10 Punta Prima nord Sant Lluís 108 Fertilitzants químics NA

M11 Camí de ses

Vinyes 3 Sant Lluís 71 Fertilitzants químics NA

M12 Sant Lluís Nord Sant Lluís 70 Fertilitzants químics NA M13 Ses Arenes 1 Ciutadella 52 Fertilitzants químics NA

M14 Cala Morell 2 Ciutadella 88 Fertilitzants químics

amb possible influència orgànica

NC

M15 Ses Truqueries Ciutadella 93 Fertilitzants químics

amb possible influència orgànica

CR, DSC porcí

M16 Tanca de Sa Creu 2 Ciutadella 78

Fertilitzants químics amb possible influència

orgànica NC, DSC humana

M17 Son Ganxo 2 Ciutadella 99 Fertilitzants químics

amb possible influència orgànica

CA, ND

SC1 Sant Climent Maó 199

Origen organic en el mosteig previ. No s’ha

analitzat en aquest mostreig

CA, ND

21

6. CONCLUSIONS

La composició isotòpica de N i O del nitrat dissolt indica que l’origen del nitrat a les mostres estudiades està principalment lligat a l’aplicació de fertilitzants químics, si be una proporció de les mostres també es podria explicar com una barreja entre fertilitzants químics i una font orgànica.

Els anàlisis microbiològics mostren que no hi ha contaminació fecal recent a les mostres però si llunyana amb el temps o l’espai. Les mostres M15 i M16 podrien haver estat afectades per una contaminació fecal porcina i humana respectivament, però en l’anàlisi realitzat no presenten un resultat amb significació per estar en els límits de detecció de la tècnica molecular utilitzada.

En la zona estudiada no es produeixen processos d’atenuació natural de la contaminació per nitrats.

7. BIBLIOGRAFIA

BOE, 2003. “Real Decreto 140/2003, de 7 de Febrero, Por El Que Se Establecen Los Criterios Sanitarios de La Calidad Del Agua de Consumo Humano.” Boletin Oficial del Estado 45: 179–90.

Araguás-Araguás, Luis, and M. Diaz Teijeiro. 2005. “Isotope Composition of Precipitation and Water Vapour in The Iberian Peninsula. First Results of the Spanish Network of Isotopes in Precipitation.” In Isotopic Composition of Precipitation in the Mediterranean Basin in Relation to Air Circulation Patterns and Climate., IAEA-TECDOC-1453, IAEA, 173–90.

Ballesté, E.; Pascual-Benito, M.;Martín-Díaz, J.; Blanch, A.R.; Lucena, F.; Muniesa, M, Jofre, J.; García-Aljaro, C. 2019. “Dynamics of CrAssphage as a Human Source Tracking Marker in Potentially Faecally Polluted Environments.” Water Research 155: 233–44.

Ballesté E, Belanche Ll, Olano D, Tiehm A, Farnleitner AH, Santos R, Oristo S, Blanch AR. “Developing Predictive Models to Overcome the Pitfalls of Microbial Source Tracking Techniques.” In Watermicro 2015. 18th International Symposium on Health-Related Water Microbiology – IWA,.

Ballesté E, Meijer WG. 2015. “Identifying the Biological and Geographical Origing of Faecal Contamination.” In EPA Research Report No 153. 2008-EH-MS-1-SE.,.

Ballesté, Elisenda, Xavier Bonjoch, Lluís A Belanche, and Anicet R Blanch. 2010. “Molecular Indicators Used in the Development of Predictive Models for Microbial Source Tracking.” Applied and environmental microbiology 76(6): 1789–95.

Belanche, L. A. and A. R. Blanch. 2011. “Statistical Approaches for Modeling in Microbial Source Tracking.” In Microbial Source Tracking: Methods, Applications, and Case Studies, ed. Springer. New York, 207–27.

Blanch, A. R., E. Ballesté, J. Weidhaas, J. Santo Domingo, and H. Ryu. 2016. “Methods of Targeting Animal Sources of Fecal Pollution in Water.” In Manual of Environmental Microbiology. . Fourth Edition, ed. and S. Pillai M. Yates, C. Nakatsu, R. Miller. American Society of Microbiology.

Blanch AR, Ballesté E, Muniesa M, Stange C, Tiehm A, Schuster N, Farnleitner AH, Sommer R, Lindner G, Nunes-Monteiro SP, Santos R, Oristo S, Maunula L, Lucena F. 2015. “Selection of Workable Combinations of Microbial Source Tracking Markers to Distinguish Faecal Pollution from More

22

than Two Origins: An Ongoing EU Project.” In Watermicro 2015. 18th International Symposium on Health-Related Water Microbiology – IWA. Lisbon,.

Böttcher, J., O. Strebel, Susanne Voerkelius, and H. L. Schmidt. 1990. “Using Isotope Fractionation of Nitrate-Nitrogen and Nitrate-Oxygen for Evaluation of Microbial Denitrification in a Sandy Aquifer.” Journal of Hydrology 114(3–4): 413–24.

Coplen, Tyler B. 2011. “Guidelines and Recommended Terms for Expression of Stable-Isotope-Ratio and Gas-Ratio Measurement Results.” Rapid Communications in Mass Spectrometry 25(17): 2538–60. http://doi.wiley.com/10.1002/rcm.5129.

Craig, Harmon. 1961. “Isotopic Variations in Meteoric Waters.” Science 133(3465): 1702–3.

European Comission. 2006. “Directive 2006/7/EC of the European Parliament and of the Council of 15 February 2006 Concerning the Management of Bathing Water Quality and Repealing Directive 76/160/EEC.” Official Journal of the European Union (64): 37–51.

Fukada, Teppei, Kevin M. Hiscock, Paul F. Dennis, and Thomas Grischek. 2003. “A Dual Isotope Approach to Identify Denitrification in Groundwater at a River-Bank Infiltration Site.” Water Research 37(13): 3070–78.

IAEA/WMO. 2015. “Global Network of Isotopes in Precipitation. The GNIP Database. Avaialble via. Https://Nucleus.Iaea.Org/Wiser.” http://isohis.iaea.org.

International Atomic Energy Agency. 2013. “Global Network of Isotopes in Precipitation.” Water Resources Programme.

Jofre, Joan, Anicet R Blanch, Francisco Lucena, and Maite Muniesa. 2014. “Bacteriophages Infecting Bacteroides as a Marker for Microbial Source Tracking.” Water Research 55: 1–11.

MAIMA. 2018. Estudi Multi-Isotòpic de Les Aigües Subterrànies per Determinar l’origen de La Contaminació per Nitrats Al Terme Municipal de Maó.

Mariotti, A. et al. 1981. “Experimental Determination of Nitrogen Kinetic Isotope Fractionation: Some Principles; Illustration for the Denitrification and Nitrification Processes.” Plant and Soil 62(3): 413–30.

Mayer, Bernhard et al. 2001. “The Oxygen Isotope Composition of Nitrate Generated by Nitrification in Acid Forest Floors.” Geochimica et Cosmochimica Acta 65(16): 2743–56.

Mengis, Martin, Ulrich Walther, Stefano M. Bernasconi, and Bernhard Wehrli. 2001. “Limitations of Using D18O for the Source Identification of Nitrate in Agricultural Soils.” Environmental Science and Technology 35(9): 1840–44.

Rivett, Michael O. et al. 2008. “Nitrate Attenuation in Groundwater: A Review of Biogeochemical Controlling Processes.” Water Research 42(16): 4215–32.

Snider, David M., John Spoelstra, Sherry L. Schiff, and Jason J. Venkiteswaran. 2010. “Stable Oxygen Isotope Ratios of Nitrate Produced from Nitrification: 18 O-Labeled Water Incubations of Agricultural and Temperate Forest Soils.” Environmental Science & Technology 44(14): 100615134113072. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/es1002567.

Vitòria L., Soler A., Aravena R., Canals À. 2005. “Multi-Isotopic Approach (15N, 13C, 34S, 18O and D) for

23

Tracing Agriculture Contamination in Groundwater.” In Environmental Chemistry., ed. Robert D. (eds) Lichtfouse E., Schwarzbauer J. Berlin, Heidelberg: Springer, 43–56.

Vitòria, L., A. Soler, A. Canals, and N. Otero. 2008. “Environmental Isotopes (N, S, C, O, D) to Determine Natural Attenuation Processes in Nitrate Contaminated Waters: Example of Osona (NE Spain).” Applied Geochemistry 23(12).

Vitòria, Laura, Neus Otero, Albert Soler, and Angels Canals. 2004. “Fertilizer Characterization: Isotopic Data (N, S, O, C, and Sr).” Environmental science & technology 38(12): 3254–62.

Werner, Roland A, and Willi A Brand. 2001. “Referencing Strategies and Techniques in Stable Isotope Ratio Analysis.” Rapid Communications in Mass Spectrometry 15(7): 501–19. http://doi.wiley.com/10.1002/rcm.258.

Widory, David et al. 2004. “Nitrate in Groundwater: An Isotopic Multi-Tracer Approach.” Journal of Contaminant Hydrology 72(1–4): 165–88.

Werner, R. A., Brand W. A., 2001. Referencing strategies and tecniques in stable isotope ratio analysis. Rapid Comunications in Mass Spectrometry. 15, 501-519.