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ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL NUEVO MILENIO.DEL GENOMA A LA TERAPIA GÉNICA

PEDRO GARCÍA BARRENOReal Academia de Ciencias

INTRODUCCIÓN

La demostración del papel de los microorganismos enlas enfermedades infecciosas por los trabajos de Louis Pas-teur (1822-1895) y de Robert Koch (1843-1910) sentólasbases para el desarrollo de la terapia antimicrobiana; pri-mero las sulfamidas (Gerhard Domagk, 1895-1964) y,por fin, los antibióticos (Alexander Fleming, 1881-1955).Por otro lado, la aproximación moderna a las bases bio-químicas de la enfermedad fue planteada por ArchibaldE. Garrod en sus estudios sobre los «errores congénitos delmetabolismo», que hizo públicos en 1908. Garrod desa-rrolló dos conceptos fundamentales: el primero, que cier-tas enfermedades que se manifiestan durante la vida deun individuo tienen su origen en la alteración de una en-zima determinada que controla un paso específico del me-tabolismo -malformación química-; el segundo, que «acada estructura corresponde una función». En este con-texto, al trabajo seminal de Garrod siguieron los de GeorgeW. Beadle y Edward L. Tatum, quienes, en 1941, esta-blecieron el principio de «un gen —» una enzima», y el deLinus C. Pauling, quien introdujo, en 1943, el conceptode «enfermedad molecular», aquella debida a la expresióndefectuosa de un gen determinado.

La eclosión molecular ocurrida en el decenio 1960-1970incidiría rápidamente en la aproximación bioquímica deGarrod, que orientaba la terapéutica hacia el control me-tabólico de la enfermedad. Se hizo patente la insuficien-cia de tal estrategia y emergió el concepto de dirigir di-rectamente la terapéutica al defecto génico causal. Conlas herramientas del ADN recombinante, la ruta hacia eseobjetivo pasaba por encontrar agentes de transferencia gé-nica capaces de introducir copias normales del gen invo-lucrado en la enfermedad y de expresar el producto géni-co deficitario. Renato Dulbecco demostró, mediante laintroducción de material génico viral en el genoma celu-lar, que una familia de virus tumorales (poliomavirus)transformaba el fenotipo celular normal en otro tumoral.Aunque el efecto de esa incorporación génica va obvia-mente en detrimento de la célula huésped que se canee-

riza, la eficacia del fenómeno de transferencia génica rea-lizado por virus naturales sugirió la posibilidad de queesos u otros virus, previamente modificados génicamen-te, podrían transferir genes no deletéreos a cualquier tipocelular, con la finalidad de corregir diversos defectos gé-nicos, congénitos o adquiridos.

Una aproximación rudimentaria a la transferencia génicamediada por virus la sugirió Stanfield Rogers, quien, enun trabajo sobre plantas infectadas con virus del mosaicodel tabaco (MTV) publicado en 1968, indicó que «el pasosiguiente es integrar una secuencia nucleotídica predeter-minada en un virus ARN o ADN, replicar el virus modi-ficado en cuantía suficiente y utilizar el virus para trans-mitir la información». En el año 1972 era obvia lapotencialidad de los virus como agentes de transferenciagénica y, a pesar de los fallos conceptuales y técnicos, exis-tía la certeza de que lo que era posible con el MTV debíaserlo también con virus de mamíferos; se habían abiertolas puertas a una nueva estrategia terapéutica que tiene alos genes como objetivo. La terapia génica sería, a partirde ese momento, una realidad imparable. Con todo el ri-gor -científico, técnico y ético- que exige cualquier in-novación conceptual, se aprobó el primer protocolo enclínica humana en septiembre de 1990. Desde entoncesse han aprobado más de 350 protocolos que han inclui-do más de 3 500 pacientes en todo el mundo. La terapiagénica es, todavía, una terapéutica en fase experimental yconceptualmente revolucionaria, por lo que está someti-da a un amplio debate científico y social.

GENÓMICA

Antecedentes

Pocas dudas pueden albergarse respecto a que los pri-meros humanos ponderasen las semejanzas entre padres ehijos, y que tales observaciones debieron aplicarlas, en subeneficio, a los organismos que iban domesticando (fi-gura 1). Sin embargo, la genética moderna, basada en la

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PI-DRO GARCÍA BARRENO

Fig. 1 . - Uno de los protocolos de investigación genética más anti-guos, procedente de excavaciones en Ur, Mesopotamia. La estelafue grabada hace 5.000 años. Las cabezas de caballos se disponenen hileras horizontales, presentando tres tipos de crines (erizadas, caí-das y ausentes). Se desconoce el significado de los diferentes dibu-jos y símbolos, a excepción de S (cuadrante inferior-izquierdo), quese utiliza, hoy, para designar el gender (tomado de W. Amschler,

/ Hered. 26: 233, 1935).

«teoría genética de la herencia», comenzó con el trabajo deGregor Johann Mendel (figura 2). Mendel no fue el pri-mero en realizar experimentos de hibridación, pero síquien interpretó los resultados en términos de rasgos in-dividuales. Su trabajo seminal (Experimentos con plantas hí-

Fig. 2 . - Gregor Johann Mendel (1822-1884). Llamado originalmenteJohann, ingresó en 1843 en el monasterio de Kónigskloster, cerca deBrünn (hoy Brno), en Moravia, donde adoptó el nombre de Gregory fue ordenado sacerdote -agust ino- en 1847. Estudió en la Uni-versidad deViena (1851-1853) y fue profesor en Brünn, hasta que en1868 fue nombrado abad del monasterio. Sus estudios se prolongarondurante los años 1856-1868 (Retrato en el Museo de Moravia, en Brno).

bridas), llevado a cabo en el reducido espacio del jardín deun monasterio y dado a conocer a la Sociedad de Histo-ria Natural de Brünn en 1865, fue el resultado del dise-ño —de acuerdo con el método científico— de numerososexperimentos, de la comparación de los resultados conmodelos matemáticos y de la formulación de una hipótesispara explicar las diferencias observadas. Aunque Mendelconcibió un patrón matemático preciso para la transmi-sión de los rasgos hereditarios, desconoció el mecanismobiológico subyacente. Si bien cualquier estudiante de nues-tros días conoce la figura de Gregor Mendel, su trabajo pasódesapercibido a la comunidad científica durante treintay cinco años. En 1900, la monografía de Mendel, publi-cada en 1866, fue «descubierta» por tres botánicos: Hugode Vries, en Holanda; Cari Correns, en Alemania, y Ericvon Tschermak-Seysenegg, en Austria.

Experimentos con plantas híbridas, donde se describecómo se transmiten los rasgos hereditarios, representa hoydía una de las referencias más influyentes e imperecede-ras de la historia de la ciencia. Los experimentos demos-traron que los rasgos hereditarios se transmiten median-te pares de factores discretos; los miembros (alelos) decada par (gen) proceden uno del padre y otro de la madre.Los conceptos más importantes inferidos de los experi-mentos de Mendel son el principio de segregación -pro-ceso por el que los alelos se separan para producir game-tos haploides- y el principio de combinación independientede los diferentes pares de alelos. Desde entonces, varios hansido los mojones que han jalonado el camino de la tera-pia génica; camino que, en su mayor parte, es el del de-sarrollo de la biología o genética molecular (tabla I).

Tabla I. El camino hada la terapia génica

1866. Mendel => transmisión de los rasgos hereditarios mediante pares defactores discretos.

1877. Flemming => cromosomas.1902. Sutton => genes.1908. Garrod => errores innatos del metabolismo.1911. Morgan => ligamiento génico.1941. Beadle & Tatum =s un gen = una enzima.1949. Pauling => enfermedad molecular.1952. Hershey => material genético = ADN.

Cori & Cor! => déficit G6-Pasa = enfermedad de Von Gierke.1953. Watson & Crick => estructura AND.1970. Arber / Nathans & Smith => endonucleasas de restricción.1972. Berg / Boyer & Cohén => ADN recombinante.1978. Collins => cósmidos (incorporan hasta 40 000 pb).1979. Cline & Salser => afer protocolo talasemia B.1985. Sinsheimer/ DeLisi => propuesta proyecto genoma humano.1989. Blaese & Anderson => protocolo SCID-ADA.1999. Univ. Pennsylvania => afer muerte Jesse Gelsinger (biotech death).2000. HUGO & Celera => borrador de trabajo del genoma humano.

En 1877, Walter Flemming (1843-1905) describió loscromosomas; estructuras que Wilhelm Roux postuló, en1883, como transportadores de los factores hereditarios.En 1902, Theodore Boveri y Walter S. Sutton confirmaronque un gen es parte de un cromosoma. La palabra gen —úl-tima sílaba del téxm'mo pangen utilizado por Darwin— fue

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GENES, CÉLULAS Y TEJIDOS: ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL NUEVO MILENIO...

Fig. 3.-Thomas H. Morgan (1866-1945)-izquierda-recibió el pre-mio Nobel de Fisiología o Medicina de 1933 «por sus descubrimientosreferentes al papel jugado por los cromosomas en la herencia». Os-wald T. Avery (1877-1955) descubrió que el principio transformante,

el gen, es ácido desoxirribonucleico (ADN).

empleada por Wilhelm Johannsen (1 857-1927) para refe-rirse a los factores mendelianos, aunque el concepto estabaimplícito en la visualizadon de Mendel de un elemento fí-sico o factor (anlage) que actúa como fundamento para eldesarrollo de un rasgo. La teoría del gen como una unidaddiscreta de un cromosoma fue desarrollada porThomas H.Morgan (figura 3). Por su parte, William Bateson (1861-1926) denominó genética (de la raíz griega yrv, 'generar') ala incipiente ciencia de la herencia; el Primer Congreso In-ternacional de Genética (Londres, 1899) se anunció comoConferencia Internacional sobre Hibridación.

Cuando el trabajo de Mendel era descubierto en 1900,Archibald E. Garrod estudiaba enfermedades metabólicascongénitas humanas; una de ellas, la alcaptonuria, está cau-sada por el bloqueo en el catabolismo del aminoácido fe-nilalanina. Garrod sostuvo que tiene su origen en un gendefectuoso que produce una enzima anormal causante delbloqueo metabólico. El concepto de Garrod de «un gen

Fig. 4.- Edward L. Tatum (1909-1975) -izquierda- y George W. Beadle(1903-1989) compartieron la mitad del premio Nobel de Fisiología oMedicina (PNFM) en 1958 «por su descubrimiento de que los genesactúan regulando acontecimientos químicos definidos». La otra mi-tad del premio correspondió a Joshua Lederberg (véase la fig. 37).

imitado —> un bloqueo metabólico» fue ignorado —comohabía pasado con el trabajo de Mendel- durante treintaaños. En 1941, George W. Beadle y Edward L. Tatum (fi-gura 4) redescubrieron tal concepto; establecieron, utilizandoun hongo como material de experimentación, que cadamutación del organismo estudiado se acompañaba de la al-teración de una determinada vía metabólica. Dado que seconocía que las vías metabólicas estaban gobernadas por en-zimas, la conclusión de tales experimentos fue que cadagen determinaba la estructura de una enzima: hipótesis«un gen —> una enzima», replanteada más tarde como «ungen —> un polipéptido». En 1944, en colaboración conColín M. MacLeod y Maclyn McCarthy, OswaldT. Avery(figura 3) descubrió que el principio transformante, el gen,es ácido desoxirribonucleico (ADN).

El abecé de la biología molecular

La estructura del ADN se definió en 1953, año en quedos jóvenes y desconocidos científicos, James Watson yFrancis Crick (figura 5), pusieron en marcha una revolu-

Fig. 5.-James D. Watson (1928-) -izquierda-, Francis H. C. Crick(1916-) -derecha- y Maurice H. F. Wilkins (1916-) recibieron, con-juntamente, el PNFM del año 1962 «por sus descubrimientos refe-rentes a la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su signifi-cado en la transferencia de información en la materia viva».

ción en las ciencias de la vida: «Deseamos sugerir unaestructura para el ADN. Esa estructura tiene hechos ori-ginales que son de considerable interés biológico» (figu-ra 6). Su observación ha tenido extraordinarias conse-cuencias y representa uno de los logros capitales de laciencia del siglo XX. La biotecnología, la medicina mo-lecular, la terapia génica o el Proyecto Genoma Humanoson fruto de aquel trabajo.

Una molécula de ADN es una larguísima hebra de cua-tro subunidades diferentes denominadas bases: adenina,citosina, guanina y timina (A, C, G y T). Esas bases estánunidas entre sí a modo de las cuentas de un collar, medianteun mecanismo de engarce formado por moléculas de azú-car (desoxirribosa) y fosfato. El ADN en el núcleo celu-lar se dispone en dos hebras o bandas paralelas enrolladas

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PEDRO GARCÍA BARRENO

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Fig. 6 . - «La figura es meramente esquemática. Las dos cintas re-presentan las dos cadenas de azúcar-fosfato, y las barras horizontaleslos pares de bases que mantienen unida la estructura». (Modificada

de J. D. Watson y F. Crick, A/ature 25 abril de 1953).

entre sí, y que forman una superestructura llamada «do-ble hélice» a modo de una escalera de caracol. Las bases decada una de las bandas interaccionan entre sí formando pa-res de bases que semejan los escalones de la escalera; por

su parte, las moléculas de azúcar y los grupos fosfato decada banda forman los largueros de esa escalera. Además,si una determinada posición en una de las bandas estáocupada por la base A, el otro miembro del par, corres-pondiente a la otra banda, será T, y viceversa. De mane-ra similar, a C corresponderá G, y viceversa. En otras pa-labras, A es complementaria de T, y C de G. Estacomplementariedad se denomina «regla de Chargaff», enhonor a su descubridor, Erwin Chargaff (n. en 1905).

Consecuencia de esta complementariedad estricta entrebases en la doble hélice de ADN es que, si se conoce la se-cuencia de bases de una de las bandas, puede deducirse au-tomáticamente la secuencia de bases de la banda opues-ta. En otras palabras, cada banda de ADN contiene todala información necesaria para recrear la otra banda. En lacélebre publicación sobre la estructura del ADN, Watsony Crick escribieron: «No se nos escapa que el apareamientoespecífico de bases propuesto sugiere, inmediatamente,un posible mecanismo de copia para el material genético».Ello garantiza un mecanismo de copia fiable cuando lacélula se divide; y para formar un organismo complejo, quecontiene miles y miles de millones de células formadas apartir de una célula fecundada, se requieren numerososciclos de división celular.

En términos generales, el mecanismo de replicación delADN es sencillo; primero, las dos bandas complementa-rias de ADN se desenrollan y se separan la una de la otra.Luego se copian dos nuevas hebras a partir de cada una delas dos bandas por separado y usando la regla A:T/C:G.Dado que cada banda independiente de ADN dirige lasíntesis de su complementaria, el resultado de la replica-ción es la síntesis de dos moléculas de doble banda deADN idénticas. La pieza principal de la máquina copia-dora, responsable de la replicación del ADN, es una mo-lécula denominada ADN polimerasa (figura 7).

¿Cómo accede la célula a la información génica alma-cenada en su ADN? El programa genético completo de unorganismo se denomina genoma. El genoma puede ima-

Doble banda nueva 1'

ACGTACCGATGCATCGGATGCATGGCTACGTAGCCT

Banda original 1

Banda nueval'

ADN polimerasa

Banda nueva 2'

Banda original 2 ACGTACCGATGCATCGGATGCATGGCTACGTAGCCT

Doble banda nueva 2'

Fig. 7.- La replicación del ADNes un proceso semiconserva-tivo en el que cada banda pa-rental sirve de molde para lasíntesis de una nueva bandahija complementaria. La piezaclave de la compleja maquinacopiadora es la ADN polime-rasa, que cataliza el engarcesecuencial de los nucieotidospara formar la hebra hija en

crecimiento.

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GENES, CÉLULAS Y TEJIDOS: ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL NUEVO MILENIO.

Nucleosomas10 nm fibra de cromatina

Doble hélice de ADN

Solenoide helicoidal30 nm fibra de cromatina

brazo - p

brazo - q

Cromatina superenrollada200 nm fibra de cromatina

I— Telómero

Centrómero

— Telómero

Fig. 8.- La cromatina es un complejo de ADN y proteínas. El ADN se enrolla, de manera ordenada alrededor de histonas y de otras proteínasno histonas, para formar nucleosomas. Los nucleosomas se organizan en estructuras de orden superior; primero en solenoides helicoida-les, luego en cromatina superenrollada y, finalmente, se disponen en cromosomas, p: brazo corto; q: brazo largo. (Modificado de S. H. Elsa

y P. I. Patel; en J. L. Jameson, 1998, pág. 4).

ginarse como una secuencia de pares de bases (pb = A:T,C:G, G:C oT:A); de 100 millones a 3 000 millones de pa-res según el organismo. Si una base se representa por unaletra impresa en páginas similares a las que acogen el pre-sente artículo, el genoma humano corresponde a una en-ciclopedia de un millón de páginas. El ADN en el núcleode una célula en reposo (interfase) forma, enrollado sobreun eje de proteínas (histonas), una larga hebra continuade cromatina. Cuando se inicia la división celular (mito-sis), la cromatina se condensa y dispone en estructurasdiscretas o cromosomas (figura 8). El número de cromo-somas varía entre las diferentes especies, desde un par enuna lombriz (Ascaris lumbricoides) hasta más de cien en al-gunas mariposas y crustáceos; la especie humana tiene23 pares de cromosomas (figura 9).

Hay varias clases de ADN en el genoma humano. Engeneral, las secuencias codificantes representan menos del5 % del genoma; son secuencias representadas una solavez por genoma haploide y ubicadas en una cromatina la-xamente empaquetada denominada eucromatina. Por suparte, secuencias iterativas -denominadas ADN basura—representan el 60 % del genoma y se localizan en una cro-matina densamente condensada llamada heterocromatina.

Un gen típico puede subdividirse en dos componentesindependientes pero funcionalmente interrelacionados;uno de ellos, la región codificante, contiene la informaciónnecesaria para sintetizar una proteína que ejecutará la fun-ción génica correspondiente. Sin embargo, la mayoría delos genes contienen, en su región codificante, cortas se-cuencias que se expresan (exones que codifican, aproxi-

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Fig. 9,- Las células humanas se categorizan en dos tipos: gametoso células sexuales (espermatozoides y óvulos) y células somáticas (elresto). El núcleo de cada célula somática contiene 46 cromosomasagrupados en 23 pares (células diploides); un miembro de cada parprocede de la madre del individuo, y el otro del padre. Los gametosson células haploides, sólo tienen 23 cromosomas. En 22 de los 23pares de cromosomas, los dos miembros de cada par son virtual-mente idénticos y se denominan homólogos; esos 22 pares de cro-mosomas son homólogos en hombre y en mujeres y se denominanautosomas. El par de cromosomas remanente-cromosomas sexua-les- consta de dos cromosomas X homólogos en las mujeres, y dedos cromosomas no homólogos, X e Y, en los hombres. Se denominacariotipo a la representación ordenada de los cromosomas. La figu-ra muestra (arriba) los cromosomas de un hombre normal, y (abajo)

su ordenación cariotípica.

madamente, 50 codones) interrumpidas por otras largassecuencias (10 kb) silentes (intrones, «basura»): genes dis-continuos. Ello significa que los genes transcriben exonese intrones en un pre-ARN mensajero (pre-mARN), queserá procesado —en términos generales excluyendo los in-trones— en un ARN mensajero (mARN) que, a su vez,traducirá, en la maquinaria ribosómica citoplasmática, lacorrespondiente proteína. Richard J. Roberts y Phillip A.Sharp (figura 10) recibieron el premio Nobel de Fisiolo-gía o Medicina de 1993 por su descubrimiento de genesdiscontinuos. Tanto la transcripción como el procesa-miento del transcripto (pre-mARN) son tareas flexiblesque permiten lecturas y procesamientos alternativos (fi-gura 11).

La otra parte del gen, denominada región reguladora ode control —que no es codificante—, es un interruptor de

«encendido-apagado» que determina si la región codificanteha de expresarse o no. Junto a genes codificantes de pro-teínas, existen otros muchos genes que transcriben ARNsno codificantes (ncARNs) como producto final. TalesncARNs incluyen: ARNs de transferencia que, adaptán-dose a los tripletes del ARN mensajero, colocan uno trasotro los aminoácidos que construyen una cadena peptídica;ARN ribosómicos (rARNs) involucrados en la estructu-ra de los ribosomas; pequeños ARNs nucleolares requeri-dos en el procesamiento de los rARNs, y pequeños ARNsnucleares que son componentes críticos de los espliceo-somas -macrocomplejos ribonucleoproteicos-, encargadosde procesar en el núcleo los pre-mARNs en mARNs quetraducen proteínas. Por su parte, ARNs de pequeño tamañoadquieren protagonismo como ARNs de interferencia(ARNi) que, actuando en épocas precoces y específicas dela morfogénesis, regulan la expresión génica silenciandogenes específicos en etapas determinadas del desarrolloembrionario.

Una primera característica del genoma es la existenciade regiones ricas y pobres en el dinucleotido GC; regionesque pudieran tener funciones biológicas diferentes: den-sidad génica, composición de secuencias iterativas o co-rrespondencia con el patrón de bandas cromosómicas y conla tasa de recombinación. Otro hecho distintivo es la dis-tribución de las llamadas islas CpG, dinucleotido singu-lar debido a su escasez en el genoma humano. Por su par-te, se desconoce el papel que desempeña en la célula elADN iterativo aunque representa una extraordinaria fuentede información, todavía de difícil acceso, sobre los procesosbiológicos. Las repeticiones constituyen un rico registro pa-leontológico en el que se esconden claves evolutivas. Comomarcadores pasivos, proporcionan apuntes para estudiarprocesos de mutación y selección; es posible reconocercohortes de iteraciones nacidas al unísono y seguir susdestinos en diferentes regiones del genoma o en especiesdiferentes. Como marcadores o agentes activos, las itera-ciones han reestructurado el genoma al provocar reorde-namientos ectópicos, crear por entero nuevos genes yremodelar genes existentes; y también arrojan luz sobre

Fig. 10.- Phillip A. Sharp (1944-) -izquierda- y Richard J. Roberts(1943-).

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rARNs

tARNs pARN nucleolares

> ^ pARN nucleares

Núcleo

Citoplasma

1 Transcripción 1

Proceso delpre-mARN

AAAAA

Proteína

Fig. 11 . - Estructura de los genes eucarióticos. La mayoría de estosgenes contienen secuencias codificantes (exones) interrumpidas porotras no codificantes (¡ntrones). Ambos, exones e ¡ntrones, son trans-critos en una molécula ARN inicial, inmadura (preARN heteronuclear,hnARN). Los ¡ntrones serán posteriormente eliminados (procesa-miento o maduración, splicing) para formar un ARN mensajero,maduro, que traducirá la proteína correspondiente a la secuenciacodificante expresada. ncARN: ARN no codificante; pARN: ARN depequeño tamaño; rARNs: ARN ribosómicos; tARNs: ARNs de trans-ferencia. (Modificado de S. H. Elsa y P. I. Patel; en J. L. Jameson,

1998, pág. 5).

la estructura y dinámica cromosómica, y proporcionanherramientas útiles para estudios de genética médica y depoblaciones.

El ADN iterativo puede concentrarse en aglomerados(cluster) —satélites— o dispersarse —transposones—. Con-glomerados de secuencias repetidas o iterativas represen-tan el 10-15 % del genoma y comprenden despliegues decortas repeticiones dispuestas en un orden cabeza-cola.Tales repeticiones en tándem, sin relación entre ellas, se de-nominan, colectivamente, satélites deADN, y sus longitudesvarían desde unos pocos nucleotidos hasta varios millones.Su localización también es muy heterogénea; algunas re-peticiones se encuentran sólo en las heterocromatinas pe-ricentromérica o telomérica, y otras, sólo en un determi-nado cromosoma. Las secuencias simples iterativas (simplesequence repeats, SSRs) son estructuras repetidas muy fre-cuentes en el genoma humano; se trata de repeticiones entándem de una unidad particular. Las SSRs de una uni-dad repetida corta (n = 1-13 bases) se denominan micro-

satélites; aquellas con unidades repetidas mayores (n = 14-500 bases) se denominan minisatélites. Las SSRs com-prenden, aproximadamente, el 3 % del genoma, regis-trándose una SSR cada 2 kb y siendo el componenteprincipal repeticiones dinucleotídicas. Las SSRs desem-peñan un importante papel en estudios de genética humanapor mostrar un extraordinario grado de polimorfismo delongitud en las poblaciones humanas (véase pág. 69).

Otra clase de secuencias iterativas de pares de bases in-cluye familias de secuencias dispersas por todo el geno-ma, a veces incluso dentro de los genes, y que represen-tan el 45% del ADN total. Estas secuencias tienen laspropiedades de los elementos transponibles. La mayor par-te de la genética clásica se centró en la localización de losgenes en los cromosomas; cada gen, o más precisamentecada alelo, ocupa un lugar fijo (loáis) en un determinadocromosoma, con lo que la estructura de un determina-do mapa genético es prácticamente invariable. Sin embargo,a comienzos de la década de 1940 los investigadores en-contraron que algunas secuencias de ADN pueden cam-biar de posición. Tales secuencias móviles se denominanelementos génicos transponibles o, simplemente, trans-posones. Los transposones fueron descubiertos por BarbaraMcClintock a raíz de sus estudios sobre la inestabilidad ge-nética del maíz (figura 12).

Fig. 12.- Brirb.iid MÍ I. Iniori . 1902-1992). PNFM de 1983 «por sudescubrimiento de elementos genéticos móviles».

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Los transposones son elementos móviles que puedenmudarse, por ellos mismos, desde una posición a otra enuna molécula de ADN. La mayoría de las secuencias re-petidas en el genoma humano derivan de elementos trans-ponibles. La mayoría del remanente del genoma, consti-tuido por secuencias únicas de ADN, debe haber derivado,también, de transposones ancestrales irreconocibles en laactualidad; en los mamíferos, la casi totalidad de los trans-posones pertenecen a cuatro tipos (tabla II). Tres de ellos

Tabla II. Secuencias iterativas dispersas en el genoma humano(transposones)

clase

LINEs

SINEs

LTRs

ADNs

longitud

6-8 kb

100-300 pb

6-11 kb

80 pb-3 kb

n. ° copias

850 000

1 500 000

450 000

300 000

% genoma

21 %

13%

8%

3%

se mudan de una localización a otra a través de un ARNintermediario utilizando su autocapacidad de transcriptasainversa (retrotransposones o elementos móviles homólo-gos a la forma integrada de retrovirus): SINEs (secuen-cias cortas dispersas, short interspersedsequences), LINEs (se-cuencias largas dispersas, long interspersed sequences) y LTRs(retrotransposones flanqueados por largas secuencias re-petidas terminales homologas a las que flanquean los re-trovirus, long terminal repeats). El cuarto tipo lo repre-sentan varias familias de transposones ADN, similares alos transposones bacterianos.

Sobre la base de experimentos iniciados a finales de ladécada de 1950, Howard Temin propuso, en 1964, la hi-pótesis del provirus de ADN, que establecía que el geno-ma de los virus tumorales ARN se copiaba en ADN en lacélula infectada; una propuesta que iba directamente encontra del dogma central de la biología universalmenteaceptado. En 1970, Temin y David Baltimore (figura 13)descubrieron, de forma independiente, una enzima viral—transcriptasa inversa— que sintetiza ADN a partir de unmolde ARN. Temin concluyó su publicación de 1970 conla aseveración de que sus resultados «constituyen una prue-ba relevante de que la hipótesis del provirus de ADN es

Fig. 13.-Howard Martín Temin (1934-1994)-derecha-y David Bal-timore (1938-) obtuvieron, junto con Renato Dulbecco (1914-) -iz-quierda-, el PNFM en 1975 «por sus descubrimientos relacionadoscon la interacción entre virus tumorales y el material genético de la

célula infectada».

correcta, y de que los virus tumorales ARN tienen un ge-noma ADN cuando están en las células y un genoma ARNcuando están como viriones (partículas virales libres). Es-tos resultados tendrán implicaciones importantes en lasteorías de carcinogénesis viral y, posiblemente, en las teo-rías de transferencia de información en otros sistemas bio-lógicos». Como predijo Temin, el descubrimiento de lasíntesis de ADN dirigida por ARN —transcripción inver-sa- condujo a avances importantes en la comprensión delcáncer, de los retrovirus humanos y de los reordenamientosgénicos. La transcriptasa inversa ha sido una herramientacrítica en la clonación de ADN y, con ello, ha impactadoen todas las áreas de la biología celular y molecular con-temporáneas.

Si la replicación del ADN garantiza la continuidad dela información génica de padres a hijos, la transcripciónregula la expresión de esa información en cada célula; latranscripción dicta lo que cada célula es. La ARN poli-merasa transcribe porciones determinadas —genes— de unade las bandas de la doble hélice de ADN en un polímerolineal similar de bases, el ácido ribonucleico (ARN, que con-tiene el azúcar ribosa en vez de desoxirribosa, y las basesA, C, G, y U -uridina- en vez de T). El premio Nobel deFisiología o Medicina de 1959 recayó en Severo Ochoa yArthur Kornberg (figura 14) por sus descubrimientos delos mecanismos de biosíntesis del ARN y del ADN, res-pectivamente.

Fig. 14.-Severo Ochoa (1905-1993)-izquierda-y Arthur Kornberg(1918-).

La transcripción sigue un principio de complementa-riedad similar al indicado para la replicación del ADN,con la salvedad de que a una A en la banda de lectura delADN le corresponderá una U en el ARN complementa-rio, y a una T en el ADN le corresponderá una A en elARN. Esto es, a la secuencia de bases ATCG en el ADNle corresponde la secuencia de bases UAGC en el ARN.La banda de ADN que es transcrita se denomina bandacodificante. Una vez que ha sido completada la síntesisdel ARN complementario a un gen determinado, se li-bera como una molécula lineal sencilla: pre ARN mensa-jero. Este ARN será procesado y convertido en ARN men-

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Transcripción

Cadena polipeptidicaen crecimiento

Banda transcritao codificante

Fig. 15.- Esquema de la maquinaria genética. La transcripción, en el núcleo celular, produce una copia de un ácido nucleico comple-mentario (mARN, en color rojo) a partir de una de las bandas de ADN (banda transcrita o codificante). El mARN abandona el núcleo diri-giéndose hacia los ribosomas, en el citoplasma, donde es traducido en una cadena polipeptidica (recuadro inferior derecho). ARNs de trans-ferencia (en color violeta) alinean los correspondientes aminoácidos (en color azul) a lo largo del mARN; para ello, los tARNs utilizan los tripleteso codones del código genético para traducir la secuencia de bases en el mARN en una secuencia de aminoácidos en la cadena polipeptidica.

(Modificado de New Eng J Med, 1994 ).

sajero que dirigirá la síntesis de la proteína codificada enel correspondiente gen, en un proceso denominado tra-ducción (figura 1 5).

La traducción refleja el hecho de que un lenguaje mo-lecular se traduce a otro. El primer lenguaje, el del ADNy ARN, se escribe mediante el orden de las cuatro bases yobedece, esencialmente, a las mismas reglas de comple-men tari edad; ADN y ARN son dialectos de un mismolenguaje. El lenguaje de proteína es muy diferente al delADN/ARN y requiere una traducción compleja que con-vierte la secuencia de bases en los ácidos nucleicos en unasecuencia de aminoácidos en las proteínas. Los aminoácidosson completamente diferentes de las bases. Frente a lascuatro bases, son veinte los aminoácidos que formanlas proteínas. Dada la gran diferencia estructural entreaminoácidos y bases, no debe extrañar que se requiera unacompleja maquinaria de traducción para convertir la se-cuencia de bases de un gen en otra gramaticalmente co-rrecta de aminoácidos en la correspondiente proteína.

¿Cómo una secuencia de sólo cuatro bases en un gen di-rige la síntesis de una proteína formada por una secuen-cia de 20 aminoácidos? La solución a este problema decodificación es que cada aminoácido está especificado poruna combinación de tres bases contiguas. El código que

relaciona la secuencia de bases en el ARN con la secuen-cia de aminoácidos en una proteína se denomina código ge-nético (figura 16). El código genético asigna cada uno delos 20 aminoácidos a un determinado grupo contiguode tres bases, tripletes o codones en el ARN. Existen 64 com-binaciones posibles de cuatro bases agrupadas en tripletes(43). La correspondencia se asegura, primero, porque al-gunos aminoácidos están especificados por más de un tri-plete (degeneración o redundancia del código) y, segun-do, porque algunos tripletes no codifican aminoácidossino que se utilizan como señales de terminación del pro-ceso de traducción. El premio Nobel de Fisiología o Me-dicina de 1 968 se concedió a Robert W. Holley, HarG. Khorana y Marshall Niremberg (figura 17) por su in-terpretación del código genético y su función en la síntesisde proteínas.

Finalmente, debe apuntarse un hecho importante res-pecto a las diferencias estructurales entre el ADN y lasproteínas. Mientras que la secuencia de bases apenas in-fluye en la estructura en doble hélice del ADN, la se-cuencia de aminoácidos tiene enormes consecuencias so-bre la estructura de la proteína. Siguiendo el dictado de lasecuencia lineal de aminoácidos (estructura primaria dela proteína), cada proteína se pliega (estructura secundaria)

57


Punieraposición

U

cA

G

UPhe

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

lie

lie

líe

Met

Val

Val

Val

Val

Segunda po

CSer

Ser

Ser

Ser

Pro

Pro

Pro

Pro

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

rain

ATyr

Tyr

STOP

STOP

His

Hls

GIn

Gln

Asn

Asn

Lys

Lys

Asp

Asp

Glu

Glu

GCys

Cys

STOP

Trp

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Ser

Arg

Arg

Gly

Gly

Gly

Gly

posición

ucA

G

U

C

A

G

U

cA

G

U

cA

G

Fig. 16.- El código genético está compuesto de 64 codones o tripletescuyas secuencias en el ARN mensajero pueden leerse en esta tabla.La columna de la izquierda indica el nucleotido situado en la pri-mera posición del codón; la fila superior indica el nucleotido queocupa la segunda posición, y la columna de la derecha el nucleoti-do en la tercera posición. Así, el triplete CAG codifica glutamina(Gln), y GGU codifica glicocola (Gly). El codón AUG especifica me-tionina (Met) y también se utiliza para iniciar la síntesis peptídica.STOP indica un codón de terminación. Diferentes codones que es-pecifican el mismo aminoácido se denominan codones sinónimos. Estadegeneración del código genético minimiza el efecto de mutaciones,pues el cambio de un solo nucleotido resulta, a menudo, en un

nuevo triple que sigue codificando el mismo aminoácido.

y adopta, finalmente, una estructura tridimensional (es-tructura terciana), compleja y distintiva; y esta gran di-versidad estructural permite a las diferentes proteínas de-sarrollar funciones celulares específicas (figura 18). Ellosignifica que mientras que posibles cambios de una basepor otra (polimorfismo o mutación) no alteran la estabi-lidad del ADN, la sustitución de un aminoácido por otropuede tener graves consecuencias: enfermedad molecular.

Una mutación es una alteración en la secuencia de ba-ses de un gen. En general, el cambio de base sucede en laregión codificante del gen, aunque existen mutacionesque alteran la región reguladora; así, algunas formas decáncer resultan de mutaciones reguladoras que activan ge-nes involucrados en promover crecimiento celular de ma-

l>Fig. 17.- Har G. Khorana (1922-) -izquierda-, Robert W. Holley

(1922-1993) y Marshall Niremberg (1927-)-derecha.

ñera incontrolada. Las mutaciones codificantes alteran lasecuencia de bases en un gen de varias formas; el tipo mássimple de mutación consiste en el cambio de una basepor otra, mutación puntual que puede tener graves re-percusiones en la estructura tridimensional funcional delproducto de su expresión. Otras mutaciones afectan a unmayor número de bases, tanto por delección como porinserción. Las mutaciones de uno u otro tipo pueden serespontáneas y consecuencia de errores durante la replica-ción del ADN, o inducidas por la acción de diversos me-canismos mutagénicos. Los agentes mutágenos puedenser físicos, como, por ejemplo, la radiación ultravioleta, oquímicos, como diferentes sustancias mutagénicas; en am-bos casos, los mutágenos reaccionan con las bases delADN cambiando una base en otra, o reducen la fideli-dad de la replicación del ADN. Una característica comúna todos los agentes mutagénicos es que son altamente car-cinogénicos.

Pero no todas las mutaciones son deletéreas. El códigogenético es universal para todas las formas de vida cono-cidas. Una de las principales implicaciones de esta uni-versalidad es que toda la vida existente en la Tierra deri-va de una común forma de vida ancestral, en la que sedesarrolló el código genético que hoy utilizan todos sus des-cendientes. Esta evidencia incontrovertible de un ances-tro común de todas las formas de vida confirma una de laspredicciones más destacadas de Charles R. Darwin (figu-ra 19). En Sobre el origen de las especies por medio de la se-lección natural, Darwin concluyó que «probablemente to-dos los seres orgánicos que han vivido sobre la tierradescienden de alguna forma primordial en la que se ori-ginó la vida». Dado que, en tiempos de Darwin, el cono-cimiento de las bases genéticas o moleculares de la vida eraescaso, tal hipótesis intuitiva representa uno de los logros,en biología, de mayor alcance intelectual. La evoluciónes una de las ideas unificadoras en biología.

Para explicar esa evolución a partir de un ancestro común,Darwin invocó un mecanismo que denominó selección na-tural. De acuerdo con ello, no todos los organismos tie-nen las mismas posibilidades de sobrevivir y reproducir-se. Los mejor adaptados tendrán mayor descendencia ysus características se perpetuarán y expandirán en la po-blación. Sin embargo, la teoría de Darwin no explica sa-tisfactoriamente la herencia. Aunque Darwin y Mendelfueron contemporáneos, no tuvieron conocimiento el unodel otro; fue necesario que los seguidores de Darwin in-corporaran los descubrimientos de Mendel a la teoría dela selección natural. La teoría sintética de la evolución ex-plica la transformación de una especie mediante selecciónnatural (especiación). La evolución es un proceso de cam-bio; a nivel molecular este proceso implica la inserción,delección o sustitución de bases (mutaciones) en el ADN.Si esas mutaciones ofrecen alguna ventaja se irán acumu-lando hasta dar lugar a una serie de caracteres bastantediferentes a los originales que, a lo largo de millones deaños, irán desembocando en especies diferentes. En ello,los transposones han desempeñado un papel decisivo.

58

GENES, CÉLULAS Y TEJIDOS: ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL NUEVO MILENIO.,

(a) Estructura primaria

- Ala - Glu - Val - Thr - Asp - Pro - Gly -

(b) Estructura secundaria

Hélice a

Lámina

(c) Estructura terciaria (d) Estructura cuaternaria

Fig. 18.- (a) La secuencia lineal de aminoácidos define la estructura primaria de una proteína, (b) La estructura secundaria consiste en re-giones de conformaciones repetidas regularmente en la cadena peptídica (<10 aminoácidos), como hélices a y láminas (3. (c) La estructu-ra terciaria refiere el plegamiento de una cadena polipeptídica (>10 aminoácidos) en su conformación globular compacta, (d) La estructuracuaternaria define la agrupación de dos o más cadenas polipeptídicas en una molécula multimérica. (Véase: Ángel Martín Municio, «Pro-

teómica. ¿Qué son y para qué sirven las proteínas?», págs. 89-117).

Herramientas

Establecidas las bases de la biología o genética molecu-lar, y aunque las técnicas de la genética clásica se habíandemostrado eficaces en el análisis de los genes y de loscromosomas, hubo que esperar algunos años hasta que sedispuso de herramientas eficaces para manipular la es-tructura genética. El avance más significativo fue el desa-rrollo, en los años setenta del siglo XX, del ADN recombi-nante (véase Martín Munido, A., «Presente y futuro de labiotecnología», en Horizontes culturales. Las fronteras dela ciencia, Real Academia de Ciencias, Madrid, 1999,págs. 3-15); una técnica mediante la que un fragmentode ADN puede ser seccionado y separado de un genomadonante, e insertado, trasplantado o recombinado en otrogenoma receptor (figura 20). Werner Arber, Paul Berg,Daniel Nathans y Hamilron Smith fueron los protago-nistas (figura 21).

El primer paso en el desarrollo de la tecnología del ADNrecombinante fue la caracterización de las endonucleasasde restricción: enzimas que seccionan el ADN en se-cuencias específicas de bases. Tales enzimas se identifica-ron en bacterias, donde proporcionan un mecanismo dedefensa contra la entrada de ADN extraño (por ejemplo,virus infectivos o bacteriófagos) en la bacteria. Las bacte-rias disponen de una amplia variedad de endonucleasas

Fig. 19.-Charles R. Darwin (1809-1882). Estudió Medicina en Edim-burgo y Teología en Cambridge. Los años 1831-1836 formó parte,como naturalista, de la expedición del Beagle, mandada por el ca-pitán Robert Fitzroy; durante ella hizo una serie de observacionesque fueron la base de su obra posterior. El 1 de julio de 1858 pre-sentó en la Sociedad Linneana de Londres un artículo conjunto conAlfred R. Wallace. El 24 de noviembre de 1859 apareció su obracumbre: El origen de las especies por medio de la selección natural.

59


Fig. 20.- Esquema básico del ADN recombinante.

Fig. 21 . - Werner Arber (1929-) -superior izquierda-, Daniel Nat-hans (1928-)-superior derecha-y Hamilton Smith (1931-)-inferiorderecha-recibieron, conjuntamente, el PNFM de 1978 «por su des-cubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación a problemasde genética molecular». A Paul Berg (1926-) le otorgaron la mitad(la otra mitad fue concedida a W. Gilbert y F. Sanger: véase la fig. 32)del PN de Química de 1980 «por sus estudios fundamentales de labioquímica de los ácidos nucleicos, en especial del ADN-recombi-

nante».

de restricción que escinden el ADN en más de cien sitiosdistintos de reconocimiento; lugares que constan de se-cuencias específicas de cuatro a ocho pares de bases dis-puestas simétricamente, característica por la que tales se-cuencias se denominan palíndromos. El término«palíndromo» —del griego JiáXiv, 'de nuevo', y 6pó¡.ioc;,'carrera'- define una palabra o expresión que resulta lomismo leída en un sentido que en otro, como «anilina»;también un número capicúa es un palíndromo. En gené-tica se refiere a un fragmento de ADN en el que una se-cuencia de pares de bases se lee de igual manera en uno uotro sentido a partir de un eje de simetría. Tales secuen-cias representan el sustrato de las enzimas de restricciónque rompen la molécula en el entorno del eje de simetríade las secuencias y en las dos cadenas.

Como las endonucleasas de restricción seccionan elADN sobre secuencias específicas, tales enzimas puedenutilizarse para romper una molécula de ADN en trozos dis-tintivos. Por ejemplo, una determinada enzima de res-tricción (£roRI, aislada de la bacteria Eschericbitt coli, uncomensal normal de nuestro intestino grueso) reconoce unasecuencia característica de seis pares de bases (GAATTC).Esta secuencia se repite cinco veces en el genoma de un cier-to virus bacteriano (bacteriófago A., cuya célula diana esE. coli); de este modo, la enzima de restricción rompe elADN del bacteriófago en seis fragmentos de diferente ta-maño. Estos fragmentos pueden separarse según su ta-maño utilizando una técnica denominada electroforesisen gel, que separa diferentes moléculas sobre la base desu velocidad de migración en un campo eléctrico y en elque el gel actúa como un tamiz retardando, selectiva-mente, el movimiento de las moléculas de mayor tamaño(figura 22). La localización de los sitios de reconocimientode múltiples y diferentes endonucleasas de restricción seutiliza para generar detallados mapas de restricción demoléculas de ADN, tal como genomas virales. Tras la se-paración electroforética de los distintos trozos de ADNde restricción, éstos pueden recogerse para estudios pos-teriores, en especial la determinación de las secuencias debases (secuenciación del ADN) que forman los genomasvirales.

Sin embargo, la digestión por endonucleasas de restric-ción no proporciona la suficiente resolución para analizarmoléculas de ADN de mayor tamaño, tal como el geno-ma humano. Por ejemplo, la enzima £M>RI señalada rom-pe la molécula de ADN con una frecuencia estadística de-terminada (1/4'1 pares de bases). Ello significa que unamolécula de ADN algo mayor que el genoma del bacte-riófago señalado será rota en diez fragmentos; segmentosde ADN que podrán ser separados e identificados satis-factoriamente con la técnica de electroforesis en gel. Perola misma enzima originaría más de 500 000 fragmentosal actuar sobre una molécula de ADN humano; es impo-sible separar con nitidez tal cantidad de fragmentos me-diante la técnica apuntada, que proporcionaría una man-cha continua más que un patrón discreto de fragmentosde ADN reconocibles. En este caso, la obtención de frag-

60


I 1 I I Ia. ADN

21.2 kb

48.5 kb

I digestión EcoRI

7.5 kb

5.7 kb

4.9 kb

5.6 kb

I.5.6 kb

Eiectroforesis en gel

electrodo (-)

Migraciónde ADN

21.2 kb

7.5 kb

5.7 kb5.6 kb4.9 kb

i 6 kb

electrodo (+)

Foto del gel

Fig. 22.- Separación de fragmentos de ADN mediante eiectroforesis en gel. FcoRI secciona X en cinco sitios (1) dando lugar a seis trozos deADN; fragmentos que pueden separarse por electroforesis sobre un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN migran hacia el polo positivo

del campo eléctrico, moviéndose más rápido los trozos más pequeños (kb = kilobase = mil pares de bases).

mentos puros de ADN se consigue mediante la técnicade la clonación molecular.

La estrategia básica en la clonación molecular es insertarun fragmento de ADN de interés en una molécula ADNreceptora (vector) capaz de replicarse de manera inde-pendiente en una célula hospedadora. El resultado seráuna molécula recombinante (ADN recombinante) quecontendrá el ADN insertado junto a las secuencias delvector. Ello permite obtener grandes cantidades del ADNdonante insertado. Por ejemplo, puede clonarse un de-terminado fragmento de ADN humano en un vector bac-teriófago X. Tal molécula recombinante puede introdu-cirse en la bacteria Escherichía coli, hospedador habitual del

bacteriófago X, dónele se replica eficazmente originandouna progenie de millones de fagos que contienen el in-serto de ADN humano. Ese ADN recombinante puede di-gerirse con la misma endonucleasa de restricción utiliza-da para obtener el inserto inicial y recuperar los millonesde copias producidas de ese inserto (ADN donante, uti-lizando terminología de trasplante). Ello proporciona lacantidad suficiente del fragmento de ADN humano puropara su posterior análisis y manipulación.

También pueden clonarse secuencias ARN. Aquí, el pri-mer paso es sintetizar una copia ADN a partir del moldeoriginal ARN, utilizando transcriptasa inversa. El pro-ducto, denominado ADN complementario (ADNc, por-

61


que es complementario al ARN utilizado como molde),puede ser insertado en un vector ADN siguiendo el es-quema descrito en el párrafo anterior. Dada la compleji-dad de los genes eucarióticos, la posibilidad de clonarADNc ha sido crítica para comprender la estructura yfunción de tales genes.

Proyecto Genoma Humano

Su objetivo es, una vez conseguida la secuencia com-pleta del ADN, identificar todos los genes y su función.Ello ha de constituir un broche de oro al «conócete a ti mis-mo» y la llave de la medicina molecular. El Proyecto Ge-noma Humano tiene su origen en las iniciativas de RobertL. Sinsheimer (1920) y de Charles DeLisi (1941), amediados de la década de 1980. DeLisi -físico y jefe debiomatemáticas de los Institutos Nacionales de Saludde Estados Unidos- fue director de la Oficina de Salud yMedio Ambiente del Departamento de Energía, en Was-hington D. C. El departamento -cuyas raíces alcanzan elProyecto Manhattan y que había financiado la investiga-ción sobre los efectos biológicos de la radicación, en especiallos referentes a mutaciones génicas— mantenía una Divi-sión cié Ciencias de la Vida en el Laboratorio Nacionalde Los Alamos, Nuevo México; aquí, en 1983, se esta-bleció una base de datos —Genbank— para la informatiza-ción de las secuencias de ADN que iban analizándose.DeLisi estaba interesado en aprovechar esos datos paracomprender las bases genéticas de las enfermedades hu-manas. Sinsheimer —biólogo molecular— había declarado,en 1969, que la biología molecular abría nuevas e ilimi-tadas posibilidades para la humanidad: «Es la primera vez-afirmó- que una criatura viva conoce su origen y puedediseñar su futuro». En 1977 fue nombrado rector del cam-pus de Santa Cruz de la Universidad de California y, en1984, estableció en dicha universidad un proyecto enca-minado a determinar los detalles del genoma humano.

En junio de 1985 en Santa Cruz (California) y en marzode 1986 en Santa Fe (Nuevo México), hubo sendas reu-niones, independientes, lideradas por Sinsheimer y porDeLisi, respectivamente, para discutir los aspectos técni-cos de un proyecto para descifrar el genoma humano. Díasdespués de la reunión convocada por DeLisi, Renato Dul-becco, presidente del Instituto Salk (California), declaró(Editorial, Science, 7 marzo 1986) que la ciencia había al-canzado un punto crucial en la investigación del cáncer yque cualquier avance en tal sentido pasaba por la secuen-ciación completa del ADN del genoma humano. La rela-ción entre el mapeo génico humano y la biología del cán-cer había sido apuntada por M. Siniscalco en 1979.Dulbecco, que no había participado en las conferencias deSanta Cruz y Santa Fe, proclamó que Estados Unidosdebía afrontar la secuencia del genoma humano comouna empresa comparable en esfuerzo y en espíritu al pro-grama que había conducido a la conquista del espacio.

Los acontecimientos se sucedieron a una velocidad ver-tiginosa. En junio de 1986, Walter Gilbert y Paul Berg

copresidieron una sesión sobre el genoma humano, en unsimposio organizado en Cold Spring Harbor sobre la bio-logía molecular del Homo sapiens; uno de ellos, Gilbert, de-nominó la secuencia completa del genoma humano el«santo grial» de la biología. A esta reunión siguieron otrasimportantes: en septiembre de 1986, una del ConsejoNacional de Investigación de Estados Unidos (NationalResearch Council, NRC), que nominó un Comité para elMapeo y la Secuenciación del Genoma Humano (Com-mittee on Mapping and Sequencing the Human Genome,CMSHM); una segunda, convocada por la FundaciónInstituto de Medicina Howard Hughes, tuvo lugar enagosto de 1987, y en octubre de ese mismo año los Insti-tutos Nacionales de Salud de Estados Unidos se planteabansu papel en el futuro proyecto. Tras varias reuniones a lolargo del año 1987, el CMSHM-NCR emitió, en febrerode 1988, un informe: Mapeo y secuenciación del genoma hu-mano (Mapping and Sequencing the Human Genome).

A continuación se recoge una traducción de párrafosseleccionados del Executive summary:

Los humanos llevan tiempo intrigados por las fuerzasque dan forma a ellos y a otros organismos. ¿Qué códigodicta el color de los ojos, del pelo o la forma de una flor?Hace más de 100 años Gregor Mendel descubrió que talesrasgos hereditarios están controlados por unidades celula-res que, posteriormente, se conocieron como genes. Enaños recientes, la comprensión de esos genes ha crecidoconsiderablemente tras el conocimiento de la biología mo-lecular del ADN, la molécula gigante de la que están for-mados los genes. Ahora es posible obtener la descripción úl-tima de los genes y del ADN; ello, desde el reciente desarrollode las técnicas que permiten mapear (localizar) los genesen el ADN de cualquier organismo y luego secuenciar (or-denar) cada una de las unidades de ADN, conocidas comonucleotidos, que constituyen los genes.

Cuantos más de nuestros genes estén mapeados y susADNs secuenciados, dispondremos de una fuente cada vezmás útil, una base de datos esencial que facilitará la inves-tigación en bioquímica, fisiología, biología celular y me-dicina. Esta base de datos tendrá su mayor impacto sobreel cuidado de la salud y la prevención de la enfermedad,así como sobre nuestro conocimiento de las células y losorganismos. La concepción de organizar un gran proyectopara mapear y secuenciar el ADN en los genes y en las re-giones intergénicas que los conectan (el ADN completo ogenoma humano) recibe cada vez más atención en el mun-do. Varios países han expresado su interés en apoyar talproyecto. Para evaluar lo que los Estados Unidos de Nor-teamérica deberían hacer en esta área, el NRC estableció elCMSHM, cuyas conclusiones se recogen en este docu-mento, y en donde el comité explora cómo, cuándo y poi-qué debemos mapear y secuenciar el ADN en el genoma hu-mano. Para llevar a cabo esos objetivos, el comité alcanzólas siguientes conclusiones:

- Conseguir un mapa, una secuencia y un conocimien-to cada vez mayores del genoma humano exige unaacción especial que deberá organizarse y establecersepara ese propósito. Tal esfuerzo especial en las próxi-

62


mas dos décadas potenciará significativamente el pro-greso en biología y medicina humanas.

- Los problemas técnicos asociados con el mapeo y la se-cuenciación de los genomas humano y de otros orga-nismos son lo suficientemente grandes para que unprograma científico como éste requiera un esfuerzodiversificado y sostenido para mejorar nuestras posi-bilidades en el análisis de las complejas moléculas deADN. Aunque las capacidades necesarias no existen to-davía, la manera en que deben desarrollarse parece evi-dente. Las tecnologías avanzadas requeridas emergeránde un esfuerzo común que recalque proyectos pilotoy desarrollo tecnológico. Una vez establecidas, estastecnologías no sólo harán factible completar el análi-sis del genoma humano y otros, sino que también ha-rán contribuciones importantes a muchas otras áreasde la biología básica y la biotecnología.

— Los objetivos iniciales más importantes serán adqui-rir un mapa de alta resolución de ligamiento génico delgenoma humano, una colección de clones ordenadosde ADN y una serie de mapas físicos complementa-rios de resolución progresivamente creciente. El obje-tivo último será obtener la secuencia nucleotídica com-pleta del genoma humano, comenzando a partir delmaterial de la colección de clones ordenados de ADN.La consecución de este objetivo requerirá mayores(pero alcanzables) avances en el manejo y en la tec-nología de secuenciación del ADN.

— Un estudio genético comparativo es esencial para in-terpretar la información en el genoma humano. Másaún, deberán llevarse a cabo en paralelo estudios in-tensivos de aquellos organismos que proporcionenmodelos particularmente útiles para comprender laestructura, función y evolución gémea humana.

- El esfuerzo para mapear y secuenciar comenzará comouna serie de programas encaminados a mejorar el de-sarrollo tecnológico, competitivos y revisados por pa-res. Los fondos deben incluir tanto ayudas individua-les como a grupos mterdisciplinares de científicos eingenieros de mediano tamaño.

- El proyecto genoma humano deberá diferir de la mar-cha de la investigación actual en cuanto que los sub-proyectos deben incrementar en un factor de 5 a 10sus eficacias de mapeo, secuenciación, análisis o in-terpretación de la información.

— Los progresos hacia los objetivos antes expuestos re-querirán el establecimiento de instalaciones centrali-zadas bien dotadas, incluyendo un banco central paralos fragmentos de ADN clonados generados en el es-fuerzo de mapeo y secuenciación y un centro de da-tos para la colección computarizada y la distribuciónde grandes cantidades de información de las secuen-cias de ADN. El comité sugiere que los grupos quesoporten tales servicios sean seleccionados medianteconcurso abierto.

Sobre la base de esas conclusiones y en vista de la im-portancia y magnitud de la tarea, el comité recomiendaunos fondos adicionales de 200 millones de dólares anua-les, que no deberán retrotraerse del presupuesto federal ac-tual para investigación en ciencias biomédicas. Por su par-te, la mayoría del comité recomienda que tina agencia federal

única lidere el proyecto. Esta agencia deberá recibir y ad-ministrar los fondos para el proyecto y deberá ser respon-sable de las operaciones del banco central y del centro dedatos, así como administrar el sistema de revisión por pa-res utilizado para determinar los beneficiarios de los fondos.Deberá trabajar en estrecha colaboración con un ConsejoAsesor Científico (Scientific Advisory Board, SAB) para de-sarrollar e implementar un alto estándar en la revisión porpares. El SAB, compuesto en principio por expertos cien-tíficos de renombre en campos relevantes, deberá asesorarno sólo en cuanto a la revisión por pares, sino también so-bre el control de calidad, la cooperación internacional y lacoordinación de esfuerzos entre los laboratorios y las ope-raciones del banco central y los centros de datos.

El Executive summary concluye:

El comité cree firmemente que debe emprenderse unproyecto para mapear y secuenciar el genoma humano. Sonevidentes las implicaciones éticas, sociales y legales de tal es-fuerzo, pero está convencido de que pueden afrontarse ade-cuadamente. El proyecto incrementaría enormemente nues-tro conocimiento y comprensión de la biología humana ypermitiría un rápido progreso para incidir en el diagnósti-co y, finalmente, en el control de muchas enfermedadeshumanas. Puede vislumbrarse que el proyecto conduciría,también, al desarrollo de nuevas tecnologías y a la produc-ción de mapas y de secuencias de diversos organismos, loque proporcionaría información relevante de la mayor im-portancia para mejorar nuestro conocimiento de toda labiología.

En octubre de 1988 se creaba la Oficina para la Inves-tigación del Genoma Humano de los Institutos Nacio-nales de Salud, bajo la presidencia de James Watson y conel mandato de llevar a cabo el Proyecto Genoma Huma-no. Watson, conocido como Mr. DNA, movilizó voca-ciones y recursos en Estados Unidos, Europa y Japón, lo-grando el establecimiento de un consorcio internacionalpara el desarrollo del proyecto.

«Como primer proyecto de Gran Ciencia en biología-comentaba DeLisi- el mapeo y desciframiento de la se-cuencia completa del ADN humano estimulará la inves-tigación en muy diversos campos, desde la tecnología delas computadoras a la química teórica». Escudriñar el ge-noma humano —en el caso del consorcio internacional unmosaico de material genético correspondiente a linfocitosy espermatozoides de seis a diez individuos anónimos-representa una colosal empresa que, sobre la informaciónproporcionada por los cariotipos de las diferentes cromo-somopatías, aberraciones cromosómicas o anatomía mór-bida cromosómica (figuras 23 y 24), se ha abordado com-binando tres estrategias sucesivas que, a la vez, se solapanentre sí: mapas genéticos, mapas físicos y secuenciación (fi-gura 25).

Los cromosomas pueden teñirse y examinarse micros-cópicamente, revelando patrones distintivos de bandasclaras y oscuras (mapa cromosómico, figura 26). Por ejem-plo, la tinción de cromosomas metafásicos con el colo-

63

PI-DRO GARCÍA BARRENO

a)

i—ll—ll -j:-i¡r-!<-i|

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14

c)

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Fig. 23.- Anatomía mórbida del genoma. Las diferentes técnicas de cariotipaje permiten identificar diferentes aberraciones cromosómicas.(a) Cariotipo de un recién nacido con síndrome de cri-du-chat asociado a delección de parte del brazo corto del cromosoma 5 y caracteri-zado por microcefalia y llanto parecido al maullido del gato, (b) Cariotipo a partir de una biopsia de médula ósea de un paciente con leu-cemia mieloide crónica, caracterizada por la presencia de cromosoma Philadelphia: translocación de parte del brazo largo del cromosoma22 a otro cromosoma, usualmente al cromosoma 9. (c) Cariotípo correspondiente a un síndrome de Down o mongolismo tipificado por

una trisomía del par 21. (d) Cariotipo de un joven con síndrome de Klinefelter que muestra un cromosoma X extra.

rante Giemsa (bandeo G) muestra bandas claras que con-tienen genes constitutivos y específicos de tejidos, SINEsy regiones de ADN ricas en GC, y bandas más oscurasque contienen menos genes, más LINEs y menor conte-nido en GC. Las aberraciones cromosómicas contribu-yen de manera significativa a malformaciones congénitas,siendo responsables de más del 50% de todos los abortosespontáneos. Además, el 0.7% de los neonatos -y el 2%de los nacidos vivos en mujeres mayores de 35 años— pre-sentan anomalías cromosómicas significativas. Tambiénnumerosos cánceres resultan de este tipo de anomalías. Elanálisis citogenético de los cromosomas en linfocitos pe-riféricos ha facilitado la identificación de numerosas ano-malías cromosómicas. En tales análisis, los cromosomas sondetenidos en metafase y teñidos con Giemsa. El bandeoG proporciona 350-550 bandas por genoma haploide;una banda corresponde a 5-10 millones bp y acoge entreuno y varios genes.

La morfología cromosómica básica se representa en lafigura 8. El brazo corto se denomina/), depetite, y el bra-zo largo q. Los cromosomas son acrocéntricos si el cen-trómero se sitúa cerca del final del cromosoma; metacén-tricos, si lo hace en posición central, y submetacéntricos,

si el centrómero se ubica entre el centro y el extremo cro-mosómicos. La numeración de las bandas de cadacromosoma procede del centrómero al telómero de cadauno de los brazos. Los cromosomas se ordenan —carioti-po— por pares y de acuerdo con su tamaño, a la vez quepueden identificarse por su patrón de bandeo. Los cario-tipos pueden revelar delecciones, duplicaciones y reorga-nizaciones cromosómicas, y pueden ayudar a localizar laregión de ADN responsable de una enfermedad génica.A parte de tales aberraciones, en ocasiones pueden detec-tarse, a través del microscopio, una serie de variacionescromosómicas; sirvan de ejemplo el aspecto desenrolladodel brazo largo del cromosoma 1, los cromosomas en ani-llo, las piezas cromosómicas extra o los mosaicismos.

Las preparaciones de cromosomas intactos pueden uti-lizarse, también, para el diagnóstico genético molecular,el análisis de delecciones y duplicaciones génicas y el ma-peo de genes en el genoma. La hibridación in situ fluo-rescente (FISH) utiliza sondas de cADN marcadas consustancias fluorescentes, con lo que bajo el microscopio defluorescencia puede determinarse la localización relativa deuna secuencia particular de ADN; ello permite la locali-zación de la sonda cADN en regiones subcromosómicas

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que la técnica de bandeo cromosómico no puede deter-minar (figura 27). El análisis estándar por FISH propor-ciona resoluciones de 5-10 Mb y sirve de puente entre elanálisis citogenético estándar y el estudio molecular de-tallado utilizando ADN purificado. Utilizando sondasmulticolor y cromosomas interfásicos, en los que el ADNes menos compacto, puede obtenerse una panorámica conuna resolución de 100 kb.

Por otro lado, en ocasiones puede cuantificarse la can-tidad o dosis de una enzima codificada por un determi-nado gen (dosis génica). Es posible mostrar, ante la de-lección de una porción cromosómica, que la cuantía de una

determinada enzima es, sólo, la mitad de la cuantificadaen controles, o ante una duplicación cromosómica, que losniveles son el 150% de los controles. De esta manera selocalizaron los genes de la fosfatasa acida (c2), el adenila-to quinasa (c9) o el superóxido dismutasa (c21). Sin em-bargo, uno de los descubrimientos más sorprendentes hasido que células somáticas de especies diferentes, cuandocrecen en el mismo medio de cultivo y en presencia deciertos promotores, funden produciendo células híbridas(figura 28). Sobre la base de que las células híbridas pier-den progresivamente y durante las sucesivas divisiones ce-lulares cromosomas de una de las especies, es posible ad-

Liquidoamniótíco

Liquidosobrenadante

Feto

Cromosomas

Fig. 24.- Cualquier anomalía cromosómica puede ser detectada prenatalmente mediante el procedimiento denominado amniocentesis. Al-rededor de la 16.a semana de gestación puede obtenerse una pequeña cantidad de líquido amniótico (2-10 mi). Este líquido contiene abun-dante cantidad de fibroblastos procedentes de la piel del feto; células que pueden aislarse, cultivarse y cariotiparse, con lo que pueden de-tectarse anomalías cromosómicas. También pueden detectarse otros trastornos por este procedimiento; anomalías que incluyen defectosde desarrollo del tubo neural, que provocan un incremento significativo de determinados marcadores específicos (ot-fetoproteína) en el lí-quido amniótico, y, de manera análoga, más de cien enfermedades causadas por mutaciones. El procedimiento implica cierto riesgo (0.5-1 % ) de pérdida del feto; por ello, la amniocentesis sólo está recomendada en embarazos con riesgo elevado de enfermedad genética. Unode los problemas del diagnóstico prenatal mediante amniocentesis es que a las 16 semanas de gestación hay que sumar otras dos o tressemanas de cultivo y estudio de los fibroblastos obtenidos, lo que lleva a las cercanías de la 20.a semana de gestación. El aborto de un fetoafectado en tan avanzado estado gestacional plantea serios dilemas éticos y emocionales y cierto riesgo médico. Las nuevas técnicas de biop-sia coriónica, practicable a la 8.a semana, y el análisis celular ex vivo a partir de la masa celular preembrionaria tras fertilización ¡n vitro,

evitan aquellos problemas.

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PEDRO GARCÍA BARRKNO

X YMAPACROMOSOMICO

MAPA5 cM I 2 cM | 4 cM I ' LIGAMIENTO

MAPARESTRICCIÓN

YACsSOLAPANTES

COSMIDOSSOLAPANTES

SECUENCIA DNAiTGCTATTTCGA

Fig. 25.- Mapa genético, mapa físico y secuenciación. El objetivodel Proyecto Genoma Humano es determinar la secuencia de paresde bases (pb) en cada uno de los cromosomas. La secuencia de ADNserá el mapa más detallado del genoma, aunque desde principios delsiglo xx se han construido mapas menos detallados. Los mapas ge-néticos son representaciones de rasgos fenotípicos y de polimorfis-mos aleatorios; representaciones que pueden asignarse a un cro-mosoma particular y mapearse sobre lugares cromosómicos concretos.La figura muestra el patrón de bandeo característico de un cromo-soma. Dos sondas de ADNc (X, Y) localizan sitios específicos mediantehibridación in situ fluorescente en la parte proximal del brazo largodel cromosoma. Los sitios mapeados distan, aproximadamente,11 cM en el mapa de ligamiento génico. Además, otras dos sondasADNc (A, B) mapean entre X e Y tras análisis de ligamiento. Un mapade restricción revela la localización de varios sitios de restricción en-tre A y B (i). Cromosomas artificiales de levadura (YACs) y cósmidossolapantes (contiguos, contigs) cubren una parte del intervalo entreA y B. La distancia física de esta región puede estimarse como lasuma de las longitudes netas de los diferentes YACs. En la parteinferior de la figura se muestra la secuencia de pb del ADN corres-

pondiente a uno de los cósmidos.

judicar diferentes actividades enzimáticas a cromosomasdeterminados.

Dado el tamaño y la complejidad del genoma humano,la identificación y localización de los genes no es trivial.Los mapas genómicos intentan facilitar la localización deun gen de interés. Dos tipos de mapas (genéticos o físicos)describen el orden de los marcadores y las distancias en-tre ellos en los cromosomas. Uno de los objetivos del Pro-yecto Genoma Humano es incrementar la resolución deesos mapas hasta que se conozca la localización exacta decada uno de los genes. Un mapa genético determina la po-sición relativa de un gen o un locus sobre la base de las fre-cuencias de recombinación relativas a otros loci en el mis-mo cromosoma. Cualquier secuencia polimórfica cuyopatrón de herencia pueda seguirse es útil para mapeo ge-nético. Los marcadores polimórficos más utilizados sonlas repeticiones de secuencias simples (satélites) y los cam-bios mononucleotídicos. El mapa genético se construyeasignando la frecuencia con que dos marcadores se here-

Fig. 26.- Bandeo cromosómico de un cromosoma gigante de lamosca del vinagre. En el humano, los 22 pares de cromosomas au-tosómicos fueron inicialmente clasificados de acuerdo a su tamaño(longitud de sus brazos largos, q, y cortos, p) y posición del centró-mero en siete grupos (A-G). Por su parte, las técnicas de bandeopermitieron identificar con precisión cada uno de los cromosomas.Las bandas se definen como partes de un cromosoma que aparecenmás oscuras o más claras que las regiones adyacentes, cuando sontratadas con métodos de tinción especiales. Las tinciones de Giem-sa (bandas G), con quinacrina (bandas Q) y otras variantes (bandasC y R), proporcionan mapas de bandeo característicos. El estudiocromosómico suele realizarse a partir de los núcleos de los leucoci-

tos o células blancas circulantes.

dan conjuntamente mediante estudios de ligamiento ge-nético. La localización cromosómica de un gen puede de-terminarse rastreando la herencia de marcadores poli-mórficos.

La frecuencia observada de recombinación entre dosloci es una función de su distancia y se expresa en centi-morgan (cM), nombre que recuerda aThomas H Morgan,un genetista que estudió el ligamiento génico y estableció

Fig. 27.- Hibridación fluorescente in situ: sonda de Williams. El sín-drome de Williams -raro trastorno esporádico que agrupa un perfildistintivo de características médicas, cognitivas, neurofisiológicas,neuroanatómicas y genéticas- está causado por una microdeleccióncromosómica. Hasta un total de 20 son los genes incluidos en la mi-crodelección señalada y que ha sido mapeada en la banda 7q11.23y otras regiones afines (7q31). (Imagen facilitada por la doctora

María Orera, del Hospital General Gregorio Marañón).

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Célula humana Célula de ratón

Célula híbrida

Clones de células híbridas

Cromosomashumanos jpresentes ]en el clon

Clon A Clon B ClonC

CWZM»

L

Fig. 28.- Hibridación de células somáticas. Una de las técnicas más relevantes en biología ha sido que células somáticas de diferentes es-pecies, cuando crecen en el mismo medio de cultivo en presencia de ciertos «catalizadores» -virus, polisacáridos- ocasionalmente se fun-den en una célula híbrida. Ello se ha conseguido entre células humanas y de ratón; las células resultantes contienen 86 cromosomas, los 46cromosomas humanos más los 40 cromosomas murinos. Los híbridos celulares son clonados y los clones de cada una de las células se ca-riotipan. Dado que las células híbridas son inestables, pierden cromosomas de una de las especies en cada división celular; en el caso de hí-bridos humano-ratón se pierden, progresivamente, los cromosomas humanos. Cuando la célula sólo contiene uno o dos cromosomas hu-manos se analizan determinadas proteínas en el medio de cultivo; compuestos que presentan las suficientes diferencias para poder identificarsu origen humano o murino. De este modo, pueden adjudicarse los genes correspondientes a los sucesivos cromosomas identificados encada híbrido. Combinando la técnica de hibridación de células somáticas con otras técnicas de localización, como la hibridación in situ, se

facilita el posicionamiento de los genes en los cromosomas.

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B) •34

22

rO2 |2

2 U

Posible atectacfo

III I

°3 ,3

4 I 2

¿ U2|2 2 |3

l l

Fig. 29.- Análisis de ligamiento en la neoplasia endocrina múltipletipo I (MEN-I). (A) Representación esquemática del cromosoma 11;el gen MEN 1 mapea en la banda 13 del brazo largo (q). En algunosindividuos hay un alelo paterno y otro materno para MEN 1. Semuestran hipotéticos microsatélites (A y B) cerca del locus MEN 7.El marcador A está más cerca del gen MEN 1. Sobre la base del nú-mero de repeticiones en los microsatélites, los genotipos se definen:alelo paterno = "3-4", y alelo materno = "2-2". Sobre la base de estu-dios en el pedigrí, el genotipo "3-4" muestra ligamiento con el genMEN 1. (B) Pedigrí de una familia con MEN 1. Los alelos de los miem-bros de la familia corresponden a los genotipos basados en los mi-crosatélites A y B. En la familia afectada la enfermedad está ligadaal alelo "3-4". El hombre de la 2.a generación, que no es parte dela familia original, también posee el alelo "3-4", pero no padece laenfermedad; ello indica que un genotipo específico presenta liga-miento sólo en una familia, no en la población general. (Modifica-do de P. Kopp y J. L. Jameson; en J. L. Jameson, 1998, pág. 47).

el concepto de que la frecuencia de recombinación varíacomo una función de la distancia entre dos locus géni-cos. Si la frecuencia de recombinación entre dos loci esdel 1 %, ambos loci distan 1 cM. Por lo tanto, el mapa ge-nético se construye calculando, en estudios de ligamiento,la frecuencia con que dos marcadores se heredan juntos.

Ligamiento genético es la tendencia de los genes a here-darse conjuntamente como resultado de su localizaciónsobre el mismo cromosoma. Dado que la frecuencia derecombinación incrementa como una función de la dis-tancia genética, cuanto más próximos se encuentren dosloci mayor posibilidad habrá de que no recombinen yque, por el contrario, se hereden juntos (ligamiento génico).Un conjunto de marcadores lo suficientemente próximospara que se hereden conjuntamente definen un haploti-po. A efectos de identificar un locus cromosómico quesegregue con una enfermedad es necesario determinar el

genotipo de muestras de ADN de varios miembros de va-rios pedigríes. Luego puede determinarse si ciertos alelosmarcadores cosegregan con la enfermedad. Por ejemplo,considérense dos marcadores polimórficos (A, B) sobre elcromosoma 11 que están ligados al gen responsable de laneoplasia endocrina múltiple tipo I (MEN-1). Si se exa-minan suficientes pedigríes, es posible determinar quémarcador está más próximo al locus de la enfermedad;ello, determinando la frecuencia con que cada marcadorsufre recombinación relativa al fenotipo patológico. Si elmarcador A está sometido a una tasa de recombinación del0,2% mientras que el marcador B exhibe una frecuenciamenor (0,1 %), puede concluirse que el marcador 5 estásituado entre el marcador/! y el gen MEN-1 (figura 29).

Los marcadores utilizados en la confección de los mapasgenéticos corresponden a diferentes polimorfismos de se-cuencias de ADN que se distribuyen por todo el genoma.Un polimorfismo ADN es una alteración en una determi-

individuo 1

individuo 2

individuo 3

ndividuo 4

+•*•*•

--

-

autorradiografÍE

-EJEMPLO DE HUELLAS DE ADN •

sonda 2 sonda 3

-

•

Fig. 30.- La «huella dactilar» del ADN es un registro de polimorfis-mos del ADN de una persona realizado sobre la base de analizaruna clase de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción(RFLP): variabilidad en el número de repeticiones en tándem (VNTR)de una determinada secuencia de ADN. En una región cromosómi-ca determinada, una secuencia ADN (representada por una flecha)puede repetirse, por ejemplo, 3, 4, 5 o sólo una vez, en el genomade diferentes individuos. Cuando el ADN de ese cromosoma se cor-ta con una endonucleasa de restricción determinada (los sitios decorte se señalan con una barra vertical), los fragmentos originadosdiferirán en tamaño (longitud) en virtud del número variable de re-peticiones. Su estudio mediante electroforesis en gel resultará en unpatrón de bandas que indicará el tamaño de los fragmentos. En laparte inferior de la figura se muestra el estudio de tres muestras-una procedente de la escena del crimen (E) y dos pertenecientes ados sospechosos (S1 y S2)- enfrentadas a cuatro sondas (1 -4) cons-truidas a partir de cuatro fragmentos de restricción; frente a la ho-mología del patrón correspondiente a las muestras E y S2 (¿autor de

la fechoría?), S1 puede excluirse (¡nocente).

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nada secuencia ADN que se observa con una frecuencia ma-yor del 1 % en una población determinada. A diferencia delas mutaciones, estas alteraciones en la secuencia no condi-cionan efectos adversos en la función de los genes, y puedenconsiderarse variaciones neutras en la secuencia ADN. Lospolimorfismos son importantes porque permiten rastrearun gen —refiriéndolo a una región polimórfica cromosómi-ca determinada— en pedigríes. Los polimorfismos más im-portantes son los debidos a variaciones en la longitud de se-cuencias simples iterativas (véase la pág. 55), y a variaciones deun nucleotido en una posición dada (polimorfismos mono-nucleotídicos, single nucleotide polymorphisms, SNPs). El In-ternational SNP Map Working Group anunció, en no-viembre de 2000, un mapa de más de un millón de SNPsdistribuidos a través del genoma humano, que proporcionauna densidad de secuencias de un SNP cada 1.0 kb.

Una clase especial de polimorfismo es el polimorfismo delongitud del fragmento de restricción (restriction fragment-lenght polymorphism, RFLP). Si el cambio de una baseocurre en un sitio de reconocimiento para una endonu-cleasa de restricción, puede destruir la secuencia de reco-nocimiento de esta enzima y abolir dicho sitio de re-conocimiento; alternativamente, el polimorfismo puedecrear un sitio nuevo de restricción. Polimorfismos de estetipo modifican el tamaño de los fragmentos que resultande una digestión con esa enzima. El tamaño alterado delos segmentos de restricción puede detectarse medianteelectroforesis en gel. Si un determinado sitio de restricciónha sido destruido, la banda polimórfica correspondienteal fragmento de restricción estudiado será mayor, y si seha generado uno nuevo, la banda será de menor tamaño.Tales polimorfismos proporcionan «huellas dactilares» delADN (figura 30).

Por su parte, el mapa físico es la distancia de hecho (ex-presada en pares de bases —pb— de secuencia ADN) entregenes. En términos físicos, 1 cM equivale, aproximada-mente, a un millón de pares de bases (1 Mb). El mapa fí-sico refleja la ordenación y distancias entre genes, y pue-de tener varios niveles de resolución. Un mapa físico debaja resolución indica qué cromosoma ubica un gen par-ticular. El uso de técnicas como la hibridación in situ(F1SH) antes citada permite determinar la localización(cartografía o mapeo) de un determinado gen en un cro-mosoma. Utilizando sondas marcadas con diferentes dis-tintivos fluorescentes es posible «pintar» los cromosomasy demostrar las localizaciones relativas de los distintos ge-nes, aunque ello sigue significando un bajo nivel de reso-lución. Mayor resolución se consigue clonando trozos deADN en diferentes vectores de clonaje y estimando las dis-tancias mediante el solapamiento de los fragmentos. Elacortamiento de los fragmentos incrementa la resolución.En una primera fase, los grandes fragmentos de restricciónse clonan en cromosomas artificiales de levadura (YACs);luego se fragmentan en otros más pequeños que se clonanen cromosomas artificiales de bacterias (BACs), cósmi-dos, fagos y, por último, en plásmidos (tabla III); ello, detal manera que un segmento de ADN queda cubierto por

Identificación de STSs en clones YAC

clon YAC

1

2

3

4

STSA B C D

+ -

+ - • -

- + + -

- + - +

Contigüidad YAC (contig)

Fig. 3 1 . - Mapa STS. La presencia o la ausencia de sitios etiquetadospor secuencia -cortos segmentos de ADN de secuencia conocida-pueden determinarse en varios clones de cromosomas artificiales delevadura (YACs). La comparación de las secuencias STS en los dife-rentes clones YACs permite su ordenación predeterminada, de tal ma-nera que una serie de YAC contiguos (YAC contig) cubren un seg-mento de ADN. (Modi f icado de P. Kopp y J. L. Jameson; en

J. L. Jameson, 1998, pág. 47).

una serie de clones contiguos (contigs). La utilización desitios etiquetados por la secuencia (sequence tagged sites, STSs)como unidad estándar para la confección del mapa físicoha representado una gran ventaja. Los STSs sirven comocontraseñas que permiten solapar fragmentos clonados ydisponerlos en el mismo orden que ocupan en el genoma.Los STSs constan de 200-500 pb (figura 31).

El objetivo final del Proyecto Genoma Humano es co-nocer la secuencia completa de los pares de bases que com-ponen el ADN nuclear humano: la secuenciación del ge-noma. Sin embargo, la tecnología actual no permite lasecuenciación directa del ADN completo de un cromo-

™Hi]M|)MtJld-.)|li)m:j.-l';;;«<.U:H«mí«1lh

vector

cromosoma artificial de levadura (YAC)

cromosoma artificial de bacteria (BAC)

cósmido

fago lambda

plásmido

tamaño insertoADN (kilobases)

1 000

250

35

15

10

69


Proyecto Genoma HumanoEstrategias de secuenciación

CELERA GENOMICSAproche aleatorio Aproche ordenado

J Ruptura del genomaen pequeñosfragmentos B

2 Lectura de la secuenciadel ADN de cadafragmento

3 Ensamblaje de los fragmentosen virtud del solapamientode las secuencias de s jsus extremos H

- mapa genético

1 Segmentación del genomaen fragmentos de tamañodecreciente y ordenado(mapa físico)

2 Ruptura de cadafragmento en otrosmás pequeños

3 Lectura de la secuenciadel ADN de cadafragmento

4 Ensamblaje de losfragmentos deacuerdo a su ordenrelativo conocido

Fig. 31a.- Estrategias de secuencia-ción -ordenada o hierarchical shotgun(Consorcio Internacional, derecha) yaleatoria o whole genome shotgun(Celera Genomics)- seguidas en lasdos versiones del Proyecto Genoma

Humano.

soma; es necesario manejar trozos lo suficientemente pe-queños representados por los BACs. Sobre la base de esteesquema general, se dispone de dos estrategias de se-cuenciación: «abordaje jerárquico» (hierarchicalshotgun),utilizado por el consorcio internacional, y «abordaje ge-nómico global» (whole genome shotgun), aplicado por Ce-lera Genomics. En el primer caso se escinde el ADN decada cromosoma de manera ordenada y en fragmentoscada vez más pequeños (YACS —» BACs —> cósmidos), lo-grándose el reensamblaje de las secuencias de acuerdo conel orden relativo —conocido sobre la base de los diferen-tes marcadores genéticos localizados en el mapa genéti-co, en especial STSs— de cada uno de los fragmentos. Lasegunda estrategia escinde aleatoriamente el ADN en pe-queños segmentos que, tras su clonación, se preparan parasu secuenciación; la reconstrucción se logra mediante el so-lapamiento de las secuencias de los extremos de los frag-mentos (figura 31a).

En 1975, Frederick Sanger -que había recibido el pre-mio Nobel de Química en 1958 por su trabajo sobre laestructura de las proteínas, especialmente la insulina— anun-ciaba que había desarrollado un método para determinareficazmente el orden de los pares de bases en un genoma;por su parte, Alan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron,de manera completamente independiente y el mismo año,un método de secuenciación diferente (figura 32). Pocosaños después, numerosos grupos habían logrado auto-matizar el proceso. El primer prototipo práctico fue desa-rrollado por un equipo en el Instituto Tecnológico de Ca-lifornia, en 1986. Este prototipo fue rápidamente convertidoen un instrumento comercial y puesto en el mercado en

1987. El crecimiento de la capacidad de secuenciación hasido explosivo. En 1976, un investigador era capaz de secuen-ciar 5 kb a lo largo de un año; la capacidad de secuencia-ción conseguida por Celera Genomics es de 100 000 kb/día,lo que ha hecho que la máquina PRISMA 3700 (Perkin-Elmer) sea una pieza clave de su proyecto.

Si los secuenciadores son las herramientas claves, labioinformática es el cerebro del proyecto, principalmenteen el caso de Celera Genomics. Las 230 máquinas PRISMA3700 -completamente ruborizadas en sus funciones- deque dispone Celera vomitan un flujo continuo de datos

Fig. 32.-Walter Gilbert (1932) -derecha- y Frederick Sanger (1918)recibieron conjuntamente la mitad (la otra mitad fue otorgada aP. Berg-véase la fig. 21-) del PNQ de 1980 «por sus contribucionesreferentes a la determinación de la secuencia de bases en los ácidos

nucleicos».

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-señales que representan las bases adenina, citosina, gua-nina y timina- que, a través de una red de fibra óptica, hanestado alimentando un computador desarrollado por Com-paq expresamente para Celera: un sistema en paralelo conuna capacidad de computación de 1.3 teraflop (tera = 1012)o 1.3 billones de operaciones por segundo, que hace de esteartilugio la computadora civil más potente del mundo.Sólo tiene un rival: ASCI Red, construida por Intel parael gobierno de Estados Unidos con el objetivo de mode-lar explosiones nucleares. Tan fantástico apoyo computa-cional se debe a la exigencia de la estrategia seguida por Ce-lera —opuesta a la del consorcio internacional— de secuenciarsegmentos aleatorios de ADN que deben ser correcta-mente ordenados.

El 26 de junio de 2000, en una conferencia de prensapactada tras duras negociaciones entre el Consorcio In-ternacional para la Secuenciación del Genoma Humanoy Celera Genomics, se presentó en la Casa Blanca un «bo-rrador de trabajo» (working dmft) del genoma humano. Elacto lo encabezó el presidente William J. Clinton; fueroncoprotagonistas J. Craig Venter, presidente de Celera, yFrancis Collins, director del consorcio internacional, y asis-tieron como testigos representantes de los países copartí-cipes en el proyecto: por videoconferenciaTony Blair, Pri-mer Ministro del Reino Unido, y en presencia física losdistintos embajadores (figura 33):

El consorcio público Proyecto Genoma Humano da a co-nocer, hoy, la conclusión de un borrador de trabajo de la se-cuencia del genoma humano -la huella genética del ser hu-mano—. Este borrador incluye dos tareas: colocar largosfragmentos de ADN en orden conecto para completar to-dos los cromosomas, y determinar la secuencia de ADNde esos fragmentos. El ensamblaje que hoy se da a conocerconsta de fragmentos solapantes y que cubren el 97% delgenoma humano, y la secuencia hasta ahora ensambladarepresenta un 85% del genoma.

La secuenciación se disparó durante el último año; el60% de la secuencia se ha conseguido en los últimos seismeses. Durante este tiempo el consorcio ha proporciona-do mil bases de secuencia bruta por segundo -siete días ala semana, 24 horas cada día—. La calidad media del bo-rrador de trabajo supera con creces las expectativas originalesdel consorcio para este producto intermedio. Los centros delconsorcio han proporcionado mayor cantidad de secuen-cia que la espetada.

Consecuencia de todo ello es que el borrador de trabajoestá mucho más cerca de la versión final de lo que el con-sorcio había previsto para este momento. Aproximada-mente el 50% de la secuencia del genoma se encuentra enforma casi definitiva, y el 24% lo está definitivamente. Lasecuencia genómica está organizada en segmentos conti-guos de, aproximadamente, 200 000 bases. La Habilidadmedia de la secuencia de ADN en este ensamblaje es del99.9%. La información de la secuencia por parte del pro-yecto público ha sido continua, inmediata y de libre dis-posición, sin restricciones para su utilización o redistribu-ción. La información es consultada a diario por científicosde la academia v de la industria.

Fig. 33 . - J. Craig Venter - i zqu ierda y hrancis t_oll¡ns celebraron, el16 de junio de 2000, el anuncio de las dos versiones -Celera Geno-mics y Consorcio Internacional- del «borrador de trabajo» del genoma

humano.

Hasta este momento ya han sido identificadas algunasdecenas de miles de genes a partir de la secuencia del ge-noma. El análisis de la secuencia disponible muestra los38 000 genes presupuestos y confirmados por evidenciaexperimental. Hay muchos miles de predicciones génicas adi-cionales que han de ser comprobados experimentalmente.Docenas de genes involucrados en enfermedades han sidoidentificados accediendo al borrador de trabajo.

El objetivo del consorcio para la primavera de 2000 fueproducir una versión aproximada de la secuencia humana,un ensamblaje que contiene fragmentos solapantes que cu-bren alrededor del 90% del genoma y que se secuencia enforma de borrador de trabajo; esto es, con algunas lagunasy ambigüedades. El objetivo último del consorcio es pro-ducir una secuencia completamente finalizada; en otras pa-labras, sin lagunas y con el 99.9% de fiabilidad. La fechafijada para este último objetivo era el año 2003, pero a lavista de los resultados actuales es completamente seguroque la obtención de la secuencia definitiva se acortará sig-nificativamente.

En un anuncio paralelo, Celera Genomics anunció hoyque ha completado su propio ensamblaje de la secuencia delADN humano. Los proyectos público y ptivado utilizanautomatismos y tecnología de secuenciación similares, peroemplean distintas estrategias para secuenciar el genoma hu-mano. El proyecto público utiliza el denominado «abor-daje jerárquico» (hierarchical shotgun); el proyecto de Ce-lera, el denominado «abordaje genómico global» (wholegenome shotgun). El abordaje jerárquico tiene la ventaja deque la localización global de cada secuencia individual se co-noce con certeza, pero requiere construir un mapa de lar-gos fragmentos que cubra el genoma. El abordaje globalno requiere este paso, pero tiene otros requerimientos en lafase de ensamblaje. Ambas estrategias alinean la secuenciaa lo largo de los cromosomas humanos utilizando mojo-nes localizados en el mapa físico producido en el ProyectoGenoma Humano.

L.a producción de secuencias más allá de lo esperado haido pareja a una sorprendente cosecha de variaciones géni-cas humanas —los llamados polimorfismos nucleotídicos

71


simples o SNI's—. El Proyecto Genoma Humano tenía el ob-jetivo de descubrir 100 000 SNPs antes del año 2003. Has-ta ahora, con las secuencias ensambladas y otros datos acu-mulados por el Consorcio SNP, los científicos ya hanidentificado más de 300 000 SNPs y seguramente dispon-drán de hasta un millón de SNPs a finales del año 2000. LosSNPs proporcionan una poderosa herramienta para estu-diar las enfermedades y la historia humanas. La secuencia-ción —determinar el orden exacto de las cuatro bases quí-micas del ADN, denominadas A, T, C y G - se haconseguido en el Proyecto Gcnoma Humano merced a losavances tecnológicos en el desciframiento del ADN y a lanaturaleza colectiva del esfuerzo, que ha incluido a 1 000científicos de casi todo el mundo que han trabajado juntoscon eficacia.

El Consorcio Internacional para la Secuenciación delGenoma Humano incluye científicos de dieciséis institu-ciones en Francia, Alemania, Japón, China, Gran Bretañay Estados Unidos. Los cinco centros principales son: elBaylor College of Medicine de Houston, Texas; el JointGenome Institute de Walnut Creek, CA; el Sanger Cen-tre, situado cerca de Cambridge, en Inglaterra; el Was-hington University School of Medicine de Saint Louis, yel Whitehead Institute de Cambridge, Massachusetts. Jun-tos, estos cinco centros han generado el 82% de la se-cuencia.

El proyecto ha sido tan estrechamente coordinado queninguna región del genoma ha sido desatendida, a la vez quese han minimizado las duplicaciones. Los participantes enel consorcio internacional se han adherido a los estándaresde calidad del proyecto y a la política de publicidad de losdatos. El proyecto se financia mediante ayudas de las agen-cias gubernamentales y fundaciones privadas en varios paí-ses, que incluyen el Instituto Nacional para la Investiga-ción del Genoma Humano de los Institutos Nacionales deSalud y el Departamento de la Energía, de Estados Unidos,y el Wellcome Trust, de Inglaterra.

El coste global de la secuenciación del borrador de tra-bajo ha sido, aproximadamente, de 300 millones de dóla-res; de los que, aproximadamente, 150 millones han sidofinanciados por los Institutos Nacionales de Salud de Es-tados Unidos. El coste de la secuenciación del genoma hu-mano se refiere frecuentemente a 3 000 millones de dóla-res. Sin embargo, esa cifra se refiere a la estimación inicialdel Proyecto Genoma Humano para un periodo de quin-ce años (1990-2005) y para una amplia gama de activida-des científicas relacionadas con la genómica, que incluyenestudios de enfermedades humanas, organismos experi-mentales (como bacterias, levaduras, lombrices, moscas yratones), desarrollos de nuevas tecnologías para investiga-ción biomédica, métodos computacionales para el análisisde genomas y aspectos éticos, legales y sociales relacionadoscon la genética.

Por su parte, la aventura de Craig Venter y Celera ha re-presentado otros 300 millones de dólares. El consorciointernacional y Celera ejemplifican dos maneras de hacerciencia: burocracia y ortodoxia de planteamientos frentea iniciativa e innovación. El consorcio inició su marchaen 1990, Celera entró en la competición en 1998. Celeraanunció que lograría la secuencia completa del genoma hu-

mano en tres años, adelantándose en cuatro a los objeti-vos del consorcio; sus previsiones estaban basadas en elanálisis de los datos que el consorcio facilitaba «día a día»en bancos de datos de libre acceso, en una nueva estrate-gia de secuenciación que obvia una parte de la cadena me-todológica simplificándola y abaratándola y que habíasido testada en la secuenciación de genomas más simples-Celera publicó el genoma de Drosophila en marzo de2000- , y en la utilización de máquinas ultrarrápidas -se-cuenciadores automatizados y computadoras- de novísi-ma generación.

El Proyecto Genoma Humano ha sacado a la superficieun serio dilema político sobre la base de una serie de con-flictos de intereses. Temeroso de que Celera patentara lasecuencia, el consorcio reaccionó. El Wellcome Trustbritánico incrementó de inmediato su apotte al proyecto,comprometiéndose a que el Sanger Centre completara untercio de la secuencia; por su parte, Estados Unidos conso-lidó su esfuerzo y creó cuatro supercentros de secuenciación.El consorcio, además, replanteó sus objetivos, que desplazódesde la consecución de una secuencia definitiva a producirun borrador del 9 0 % del genoma para la primavera de2001, la fecha anunciada por Celera. Un año después, elconsorcio revisó sus plazos a la baja, señalando la prima-vera de 2000 como tope, a efectos de adelantarse a los in-tereses de Celera. Llegando juntos a la meta de esta pri-mera etapa, el consorcio y Celera han pactado elreconocimiento del borrador como patrimonio de la hu-manidad. A partir de ese momento comenzó una segun-da etapa, más dura, cuya meta es la transferencia de se-cuencias concretas al mercado del diagnóstico médico: loschips de ADN. En resumen, el genoma humano es parael consorcio internacional un bien público o un bien co-mún; para Celera Gemomics, una fuente de beneficios.

El Proyecto Genoma Humano se centra, ahora, en con-vertir el «borrador de trabajo» en una «obra definitiva». Ellose conseguirá rellenando las lagunas existentes en la se-cuencia presentada e incrementando la fiabilidad de lasecuencia global hasta el 99.99%. Aunque la versión de-nominada «borrador de trabajo» es útil para la mayor partede la investigación médica, una secuencia tan perfectacomo sea posible es crítica para obtener toda la informa-ción contenida en los datos de la secuencia humana. Elloya se ha conseguido para los cromosomas 21 y 22, asícomo para el 2 4 % del total del genoma. La secuencia-ción del c21, el más pequeño de los cromosomas huma-nos, ha deparado un hallazgo inesperado: la pobreza de ge-nes en el cromosoma. Si el número total de genes esperadopara el genoma humano era, aproximadamente, 100 000,la predicción para el c21 se cifraba entre 800 y 1 000 ge-nes. Sin embargo, el consorcio internacional para el c21ha encontrado, solamente, 225 genes. Los genes c21 máslos correspondientes a c22 —el primer cromosoma huma-no secuenciado— son 770; si tal es la tendencia en el res-to de los cromosomas, el número total de genes del genomahumano sería, aproximadamente, 35 000; una cifra muylejana de los 80 000-100 000 previstos.

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La cifra de partida se debe a Walter Gilbert, uno de lospioneros de la genómica, quien, en los años ochenta, es-timó en aproximadamente 100 000 los genes humanos,fundamentando sus previsiones en las bases por él se-cuenciadas en segmentos de ADN. A finales de la décadade 1990, Craig Venter barajaba una cifra de 50 000-80 000genes, e Incyte Pharmaceuticals y Human Genome Scien-ces, otras dos firmas norteamericanas que entraron en la«arena» genómica, llevaron sus predicciones hasta 120 000-150 000 genes. Por otro lado, la estimación a la baja delnúmero de genes ha deparado otra «noticia»: que la dife-rencia cuantitativa génica no es tan dispar entre las distintasespecies.

Sin embargo, esta estimación a la baja —penuria genó-mica— no es tan sorprendente. La dotación genómica(14 000 genes) de la Drosophila melanogaster es inferior ala dotación (19 000 genes) del Caenorhabditis elegans,aunque la mosca es más compleja que el gusano. La con-testación debe estar en relación con el proteoma. Es cadavez más evidente el papel que el procesamiento alternati-vo del ARN tiene en expandir la diversidad proteómica,lo que puede explicar la discrepancia aparente entre elnúmero de genes y la complejidad del organismo. El pro-cesamiento (splicing) alternativo puede generar más trans-criptos que el correspondiente al número de genes en ungenoma dado. Además, una secuencia codificante puedecomenzar a leerse en distintas bases; tal transcripción olectura alternativa incrementa las posibilidades de expre-sión de una secuencia dada. El desarrollo de un catálogocompleto de los transcriptos alternativos (transcriptomo) deun genoma y la determinación de su función será el prin-cipal reto de la era proteómica; un paso más allá de la ge-nómica. Ello obligará a reconsiderar el esquema estándar:un gen —> una proteína.

Con todo, cabe recordar las impresiones de Ralph Wal-do Emerson -recogidas en Science, el 22 de diciembre de2000- tras visitar, en 1833, el gabinete de Historia Naturaldel Jardín Botánico de París: «Los límites de lo posible sehan ampliado [...] y lo real se nos hace más extraño quelo imaginario». Para Science, «la explosión en la secuen-ciación genómica», producida en el último año, hace ac-tual la expresión de Emerson y justifica su elección comoAcontecimiento Científico del Año (Breakthrongh oftheYear2000).

Medicina molecular

En 1909, año en que Wilhelm Johansen acuñó la pala-bra «gen» para referirse a los factores mendelianos, Ar-chibald E. Garrod (figura 34) publicaba Errores innatosdel metabolismo. Al final del primer capítulo («La quími-ca de las especies y del individuo») concluye: «Cuandodiscutamos con más detalle los diferentes errores innatosdel metabolismo conocidos se verá que, en cada uno deellos, la causa más probable sea la carencia congénita de al-guna enzima en particular, en cuya ausencia se bloqueaun paso metabólico». Y, finalizando el capítulo segundo

Fig. 34.- Archibald E. Garrod (1857-1936) -arriba-. Con motivode sus estudios sobre la presencia de ácido homogentísico en laorina de pacientes con alcaptpnuria estableció, en 1899, el con-cepto de «malformación química». Persistió en el estudio de enfer-medades metabólicas (alcaptonuria, cistinuria, albinismo), estable-ciendo, en 1903, el concepto de «errores metabólicos». Designadopara dictar la Croonian Lecture de 1908, disertó sobre Errores inna-tos del metabolismo, que publicó al año siguiente. En 1910 fue ele-gido Fellowde la Royal Society. Linus Pauling (1901-1954). PNQ en1954 «por su investigación sobre la naturaleza del enlace químicoy su aplicación para dilucidar la estructura de las sustancias com-

plejas»; recibió el PN Paz en 1962.

(«La incidencia y herencia de los errores innatos del me-tabolismo»), puede leerse: «Debe criticarse que la mayo-ría de los observadores de esas anomalías han prestadopoca atención a los condicionantes hereditarios [...] peroel análisis conjunto de las piezas de información disponi-bles revela la existencia de semejanzas, especialmente evi-

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dentes en su incidencia ligada al sexo, en su tendencia aocurrir en varios miembros de una generación de una fa-milia y en la rareza de la transmisión directa de padres ahijos. Si el factor subyacente en cada caso es la ausencia deuna enzima determinada, debe esperarse que tales enzimasse comporten como caracteres recesivos mendelianos».

En 1949, Linus Pauling (figura 34) y un grupo de co-laboradores publicaron Anemia de células falciformes: unaenfermedad molecular. El trabajo propone:

1. Que la hemoglobina normal y la hemoglobina de laanemia de células falciformes (sickle cell) tienen di-ferentes globinas.

2. Una relación directa causa-efecto entre la presenciade moléculas de hemoglobina anormales y las con-secuencias patológicas de la enfermedad de células fal-ciformes.

3. Un claro caso de un cambio producido en una mo-lécula de proteína, secundario a una modificación(mutación) en el gen involucrado en su síntesis.

Garrod («errores metabólicos»), Beadle y Tatum («ungen —> una enzima»), y Pauling («enfermedad molecu-lar») representan el trípode de partida de la medicina mo-lecular. La medicina molecular abarca el descubrimientode los componentes moleculares fundamentales que de-terminan el comportamiento celular; la disección de laexpresión génica aberrante y de las interacciones anóma-las, y la modulación o corrección de esas aberraciones y ano-malías con el propósito de prevenir y curar la enferme-dad. La medicina molecular es la aplicación de los métodosde la biología molecular en general, y de la ingeniería ge-nética en particular, a la práctica clínica; intenta dirigirlas acciones diagnóstica y terapéutica al lugar mismo deldefecto (un gen mutado) y no a los efectos pleotrópicos,fenotípicos, secundarios de los productos de ese gen.

El análisis molecular del ADN es, hoy día, parte integralde todas las especialidades médicas; su impacto en medici-na clínica incluye nuevas estrategias diagnósticas de las en-fermedades, detección de patógenos, rastreo de predis-posición a las enfermedades, consejo genético, desarrollode fármacos, farmacogenética y, en casos seleccionados, te-rapia génica. Se conocen más de 3 000 enfermedades hu-manas causadas por mutaciones puntuales que siguenun patrón de herencia mendeliano; más aún, muchasenfermedades están influidas por el ruido de fondo gené-tico de los individuos afectados y existe, con frecuencia,una interacción compleja entre factores ambientales y pre-disposición genética. Muchos de tales trastornos —hiper-tensión, coronariopatías, asma o diabetes— representan pro-blemas de salud pública de primer orden, por lo que laelucidación de sus patogénesis representa un reto extraor-dinario. Otras patologías genéticamente determinadas in-cluyen síndromes causados por aberraciones cromosómi-cas y cánceres hereditarios. Tomadas en conjunto, lasenfermedades genéticas forman un grupo considerable deenfermedades humanas. Más de un tercio de todas las ad-

misiones pediátricas hospitalarias se deben a trastornoscausados, al menos en parte, por factores genéticos. El6-8% están provocadas por defectos génicos únicos, el0.4-2.5 % se debe a cromosomopatías y el remanente tieneuna influencia genética. En términos generales, el 3-5 % de lasenfermedades en la población general tiene una causa ge-nética. Sin embargo, es difícil realizar estimaciones preci-sas dado que diferentes defectos génicos pueden definirun mismo fenotipo (heterogeneidad genética), y la mayo-ría de las enfermedades genéticas son raras (tablas IV, Vy VI). Dado que los rasgos examinados por Mendel estabancausados por genes únicos, las enfermedades humanas mo-nogénicas suelen referirse como trastornos mendelianos.Información de muchas de estas enfermedades genéticaspuede encontrarse en un compendio en continua actuali-zación: Mendelian Inheritance in Man (MIM), iniciadopor Victor A. McKusick, accesible en la web.

Tabla IV. Clasificación general de las enfermedades genéticas

Alteraciones cromosómicas con anomalías numéricas o estructurales, enuno o varios cromosomas.Trastornos mendelianos o monogénicos caracterizados por una muta-ción génica puntual heredada de acuerdo con las reglas mendelianas.Enfermedades multifactoriales o rasgos patológicos complejos, defini-dos por la interacción de múltiples genes y uno o múltiples factores am-bientales.Formas no clásicas de enfermedad genética. Un grupo heterogéneo queincluye trastornos influidos por impronta genómica, o causados por di-somía uniparental, repeticiones de trinucleotidos y varias formas de mo-saicismo.Enfermedades mitocondriales resultantes de mutaciones en el genomamitocondrial. Dado que el ADN mitocondrial se transmite por línea ma-terna, el patrón de herencia difiere de los trastornos mendelianos.Mutaciones que tienen lugar en células somáticas diferenciadas con par-ticular importancia en el desarrollo de cánceres. Aunque no se heredan,pueden originarse en individuos con predisposición hereditaria.

tipo de mutación

genoma

cromosomas

dotación cromosómica anormal

n.° anormal de cromosomasautosómicos

n.° anormal de cromosomassexuales

translocación

delección

duplicación

inversión

delección

duplicación, inserción

fusión

inversión

expansión de tnplete

mutación puntual sin sentido

mutación en procesamientoARNm

ejemplo

tnploidía, tetraploidia

trisomía 21, 18, 13

síndrome de Klineferter, sín-drome de Turner

leucemia mieloide aguda

síndrome «Cri-du-chat»

sexo inverso

oncogén Ret invertido

distrofia muscular de Du-chenne

síndrome Charcot-Marie-Tooth tipo I

aldosteronismo

hemofilia A

síndrome cromosoma X frágil

fibrosis quista

beta globina

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Enfermedades autosómicas dominantes:- Hiperlipidemia familiar- Hipercolesterolemia familiar- Enfermedad de Huntington- Enfermedad renal poliquística- Esferocitosis- Síndrome de Marfan- Neurofibromatosis- Cáncer de colon hereditario sin poliposis- Poliposis de colon- Cáncer de mama familiar- Enfermedad de Willebrand- Cardiomiopatía obstructiva hipertrófica- Distrofia miotónica- Otosclerosis

Enfermedades autosómicas recesivas:- Fibrosis quística- Anemia de células falciformes- Talasemia- Déficit de 1-antitripsina- Hiperplasia adrenal congénita- Fenilcetonuria- Hemocromatosis- Enfermedad de Tay-Sachs

Enfermedades ligadas al sexo (cromosoma X):- Ceguera al color- Hemofilias A y B- Déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa- Distrofias musculares de Duchenne y de Becker- Síndrome del cromosoma X frágil- Ictiosis ligada al cromosoma X

Los avances promovidos por el Proyecto Genoma Hu-mano han tenido una tremenda influencia en el campo dela genética. Casi todas las enfermedades genéticas más co-munes (150-200) y un número considerable de otras me-nos frecuentes (600-800) han sido rastreadas hasta sus ge-nes defectivos (1 500-2 000). En la mayoría de los casosse han encontrado mutaciones causales que han conducidoa una mejora sustancial en las posibilidades diagnósticas.En el curso de tales estudios han salido a la luz nuevosmecanismos genéticos, como la impronta génica (expre-sión diferencial de un gen de acuerdo con su origen pa-rental; por ejemplo, los síntomas de la enfermedad deHuntington, causada por un alelo dominante, se presen-tan durante la adolescencia si la herencia es paterna, perono lo hacen hasta la madurez cuando la procedencia esmaterna) o las deficiencias en la reparación del ADN, que,a su vez, han potenciado nuevos avances diagnósticos yfisiopatológicos. Este progreso global ha permitido un es-tudio más detallado de la relación entre los defectos mo-leculares básicos y los trastornos funcionales de procesosen células, órganos y organismos: correlación genotipo-fenotipo.

El primer beneficiado por tales desarrollos es el diag-nóstico molecular. La década pasada ha sido testigo de gran-des mejoras en la resolución diagnóstica, desde los mar-cadores que identificaban un cromosoma con un genafectado, hasta la detección de reordenamientos, como

grandes delecciones, duplicaciones y translocaciones y demutaciones puntuales de un par de bases. Las tecnologíasde detección de mutaciones y su aplicación diagnósticahan supuesto un logro sin precedentes; sin embargo, exis-te una tendencia a sobrevalorar el diagnóstico molecularque, hoy, está lejos del ideal (tabla VII). Incluso enfer-medades monogénicas bien conocidas para las que el diag-nóstico molecular lleva vigente muchos años, como la dis-trofia muscular de Duchenne, la hemofilia A o la fibrosisquística, la tasa de detección de mutaciones es, sólo, del60-90%; ello se debe a la combinación de factores comola complejidad génica y la frecuencia de nuevas mutacio-nes. La tasa de detección de mutaciones es aún más bajaen el cáncer hereditario de mama; la tasa de detección enfamilias donde la enfermedad cosegrega con el locusBRCA1 en el cromosoma 17 es del 50-60%, lo que de-pende de la población estudiada y de la tecnología em-pleada, y si la enfermedad cosegrega con el locus BRCA2la tasa de detección es sólo del 35 %. Este fenómeno se de-nomina «heterogeneidad genética»: una enfermedad pue-de estar causada por más de un gen defectivo. En el casodel cáncer de mama por, al menos, dos — BRCA1 yBRCA2—, pero posiblemente haya más. La enfermedadpoliquística renal es otro ejemplo; con una frecuencia de1:500, es una de las enfermedades monogénicas más co-munes. El 85% de los casos está causado por mutacionesen PKD1 en el cromosoma 16, con una tasa de deteccióndel 10%, mientras que el 10% de los casos se deben amutaciones en PKD2 en el cromosoma 4. Por su parte, lapérdida de visión por retinitis pigmentosa se asocia a nomenos de 24 loci.

•1enfermedad

monogé

caneeheredíta

nica

rrio

trastornoscardiovasculares

fibrosis quística

distrofia Duchennemuscular

síndrome X-fragil

huntington

hemofilia A

fenilcetonuna

riñon poliquístlco

ovario-mama

síndrome Li-Fraumen¡

ataxia-teleangiectasia

poliposis de colon familiar

no-poliposis de clonhereditaria

hlpercolesterolemiafamiliar

hiperlipidemia

incidencia

1:4000

1:4000

1:4000

1:5000

1:10000

1:10000

1:1500

1:4000

1:4000

1:2000

1:500

gen

CFTR

DMD

FMR

HD

F8C

PAH

PKDIPKD2

8RCA1

BRCA2

P53

ATM

APC

MLH1

MSH2

LDLR

APOE

tasa dedetección

de mutación

98%

90%

100%

100 %

90%

99%

15%

60%

35%

50%

70%

87%

33%

12%

60%

10%

75


La ciencia genómica modificará radicalmente tres as-pectos de la medicina: la naturaleza de la transacción odel contrato médico; la perspectiva de la enfermedad porel enfermo y por el médico, y el contexto social y cultu-ral en el que el contrato médico tiene lugar. El contratomédico, desde el nacimiento de la medicina, se ha esta-blecido sobre las bases de la curiosidad diagnóstica (del ladodel médico) y la expectativa terapéutica (del lado delenfermo). El genio hipocrático insertó el pronóstico en-tre ambos; en toda medicina racional, cualquier terapiaeficaz deberá utilizarse, solamente, cuando el médico pue-da anticipar el curso de la enfermedad con o sin trata-miento. Estas ancianas reglas han guiado el contrato mé-dico durante siglos. La medicina molecular introduciráen el contrato clínico una forma sin precedentes de pro-nóstico; juicio que tendrá un papel protagonista en nu-merosas situaciones. La situación surge de la identifica-ción de genes asociados con susceptibilidad a diferentesenfermedades comunes, como el cáncer, la diabetes olas enfermedades cardiovasculares. En primer lugar, es di-fícil asignar una palabra que defina la situación o el estadocreado por la presencia de tales genes: susceptibilidad, pre-disposición, propensión, proclividad, o riesgo, potencial,probabilidad. Independientemente del término elegido, lacuestión es cómo informar a un paciente que sufrirá unaenfermedad —más o menos grave, en un momento u otrode su vida— con una cierta probabilidad en algunos casosy, en otros, casi con certeza. ¿Cuál es el significado éticode esta clase de pronóstico y de la medicina predictiva?

Todo pronóstico maneja posibilidades y probabilida-des; rara vez el futuro es cierto. En la medicina de nuestrosdías esas posibilidades y probabilidades suelen descansaren estudios epidemiológicos y se explicitan en términos es-tadísticos. Las pruebas que emergen con la medicina mo-lecular van más allá de la probabilidad epidemiológica;tales pruebas informan de personas que poseen variantesgénicas que confieren un riesgo innato de padecer ciertaenfermedad. Pero la ciencia muestra la complejidad de lavía por la que el genotipo expresa el fenotipo o por la queun gen expresa una enfermedad. El riesgo innato defini-do por la presencia de una mutación génica -asociada,por ejemplo, a cáncer- se combina con la informacióncontenida en multitud de otros genes que se expresan enuna cascada de proteínas, que interaccionan con otra mul-titud de acontecimientos biológicos y, quizá, con otros deíndole psicológica, social o ambiental, antes de emergercomo una lesión llamada cáncer. Esta complejidad debepresidir el razonamiento del pronóstico génico referido auna situación específica en un individuo en particular. Dela incertidumbre y de la complejidad de tal pronósticosurge la primera implicación ética del contrato clínico: laveracidad de la información génica para el paciente. Lasnuevas posibilidades de pronóstico de la medicina mo-lecular exigen un vocabulario más sofisticado que permitaexpresar probabilidades más complejas y la historia natu-ral asociadas a las pruebas génicas que irán emergiendo.

La perspectiva tradicional que comparten médicos y pa-

cientes es que la enfermedad es algo indeseable que debeprevenirse y, en su caso, eliminarse. La persona con ries-go de cáncer desea prevenir su manifestación; el pacientecon cáncer desea que su tumor sea extirpado o, si ello esimposible, que su condición general sea mejorada y losefectos letales diferidos. La disponibilidad de pruebas desusceptibilidad a futuras enfermedades desplazará al mun-do médico a millones de personas que no experimentandolor, ni inquietud, ni limitaciones de tipo alguno. Dichapoblación deberá organizar su vida entre colonoscopias omamografías, de la misma manera que va al dentista; mu-chas personas desarrollarán, a causa de ello, síntomas psi-cosomáticos, otras puede que, incluso, vivan como invá-lidos. En cualquier caso, todo aquel en quien se detecte unasusceptibilidad génica entrará a formar parte de una nue-va clase de individuos: los prepacientes. Los prepacientesno serán enfermos en el sentir actual del término, pues nonecesitarán tratamiento; tampoco serán individuos sanos,entendiendo como tales aquellos libres de una condiciónmédica relevante. Tendrán una relación particular con elmundo médico, obligada por la necesidad de una esperavigilada, pero no obtendrán beneficios de las soluciones tec-nológicas de la medicina molecular.

El tercer cambio radical asociado a la medicina molecularafectará al contexto sociocultural. Compañías de seguros,de empleo y de prospección de mercado esperan interesadasla información que fluirá de los bancos de datos génicos.Incluso el control legal de la privacidad génica -que aúnno ha sido desarrollado, excepto en Islandia— tendrá difi-cultades para impedir el acceso a dicha información. Losproblemas de privacidad y de confidencialidad, con serimportantes por sí mismos, tienen mayor trascendencia enel contexto de la medicina molecular. Los principales pro-blemas derivan de la propensión humana a clasificar a laspersonas en grupos y poblaciones con nombres y núme-ros. La información génica consiste, en sentido literal, endatos relevantes a un genos, el término griego para «tri-bu». Desde sus comienzos, la humanidad ha sido encasi-llada en grupos. La información génica puede utilizarse paracrear tribus artificiales; personas clasificadas no comosioux, hutus o caucasianos, sino por sus marcadores génicos,por su propensión a una determinada enfermedad: tribusp53, BRCA1, apoE4, etc. «Donde hay distinción y dis-criminación potencial existe injusticia», comenta AlbertR. Jonsen. La medicina génica predictiva, que dividirá yredistribuirá las poblaciones sobre la base de sus rasgosgénicos, debe acompañarse de normas de justicia que ase-guren que los prepacientes no serán segregados del mun-do socioeconómico que habitan.

A continuación se reproducen algunos artículos del Con-venio relativo a los derechos humanos y la biomedicina, ra-tificado por el reino de España el 23 de julio de 1999:

• Capítulo I. Disposiciones generales.- Artículo 1. Objeto y finalidad: Las Partes en el pre-

sente Convenio protegerán al ser humano en su dig-nidad e identidad y garantizarán a roda persona, sin

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discriminación alguna, el respeto a su integridad ya sus demás derechos y libertades fundamentalescon respecto a las aplicaciones de la biología y me-dicina. Cada parte adoptará en su legislación inter-na las medidas necesarias para dar aplicación a lo dis-puesto en el presente Convenio.

- Artículo 2. Primacía del ser humano: El interés y elbienestar del ser humano deberán prevalecer sobreel interés exclusivo de la sociedad o de la ciencia.

• Capítulo IV. Genoma humano.- Artículo 11. No discriminación: Se prohibe toda

forma de discriminación de una persona a causa desu patrimonio genético.

- Artículo 12. Pruebas genéticas predictivas: Sólo po-drán hacerse pruebas predictivas de enfermedades ge-néticas o que permitan identificar al sujeto comoportador de un gen responsable de una enferme-dad, o detectar una predisposición o una suscepti-bilidad genética a una enfermedad, con fines médicoso de investigación médica y con un asesoramientogenético apropiado.

- Artículo 13. Intervenciones sobre el genoma hu-mano: Únicamente podrá efectuarse una interven-ción que tenga por objeto modificar el genoma hu-mano por razones preventivas, diagnósticas oterapéuticas y sólo cuando no tenga por finalidad laintroducción de una modificación en el genoma dela descendencia.

- Artículo 14. No selección de sexo: No se admitirála utilización de técnicas de asistencia médica a laprocreación para elegir el sexo de la persona que vaa nacer, salvo en los casos en que sea preciso para evi-tar una enfermedad hereditaria vinculada al sexo.

Terapia génica

El término «terapia génica» fue acuñado para distin-guirlo de las connotaciones orwelianas (de George Or-well, seudónimo del escritor Eric A. Blair, 1903-1950) de«ingeniería genética humana» que, a su vez, había deriva-do de la expresión «ingeniería genética». Esta última seutilizó por vez primera en el Sexto Congreso Internacio-nal de Genética, en el año 1932, para referirse a «la apli-cación de los principios genéticos en la cría de animalesy de plantas». El concepto «terapia génica» se ubica, depleno, en el contexto de las tradiciones farmacológica y qui-rúrgica. En principio, «terapia génica» es un conceptosimple: la aplicación de los principios de la genética al tra-tamiento de las enfermedades. Por su parte, la herramientaejecutoria contempla la transfección o trasplante génico;ello es, la cirugía molecular.

«El ascenso de la terapia génica puede compararse -co-mentan J. A. Wolf y J. Lederberg- al desarrollo de la ae-ronáutica. De la misma manera que el intento desastrosode Icaro, fruto de la fantasía griega, guió la imaginación deLeonardo da Vinci (1452-1519) para diseñar extrava-gantes máquinas voladoras, los inicios de la historia de laterapia génica están jalonados —señalan Wolf y Lederberg—por soñadores y profetas del fracaso y por fiascos. En am-

bos casos y antes de que las herramientas necesarias estu-vieran disponibles, se intentaron experiencias precocescondenadas al fracaso. Así como el éxito, en 1903, de loshermanos Wright (Orville, 1871-1948, y Wilbur, 1867-1912) inició un vertiginoso desarrollo que alumbró losaviones supersónicos y los viajes espaciales, el desarrollo delADN recombinante a comienzos de la década de 1970hizo realidad los protocolos de terapia génica humana». Te-rapia génica no es, por tanto, un concepto nuevo. Mu-chos de los pioneros de la genética moderna fueron cons-cientes de que sus descubrimientos pudieran contemplaraplicaciones médicas.

En principio, la terapia génica es simple: colocar mate-rial génico corrector en las células para aliviar los síntomasde la enfermedad; también, silenciar genes indeseables.No es un concepto de reciente adquisición; los hechos bá-sicos de la terapia génica son anteriores al establecimien-to de las herramientas que la han hecho posible. Tatum in-cluía, ya finalizando su discurso de aceptación del premioNobel de Fisiología o Medicina de 1958, las siguientespalabras: «Quizá, algunos de nosotros llegaremos a vercómo el código de la vida desentraña la estructura mo-lecular de las proteínas y de los ácidos nucleicos. Ello per-mitirá la mejora de todos los organismos vivos medianteun proceso que podemos denominar ingeniería genética.Esto podría acaecer en etapas sucesivas. Desde la biosín-tesis in vitro de enzimas más eficientes a la biosíntesis delas correspondientes moléculas de ácidos nucleicos, y a laintroducción de esas moléculas en el genoma de los or-ganismos». Otro de los galardonados aquel año, JoshuaLederberg, escribió, en 1963, en el artículo «Futuro bio-lógico del hombre»: «Podemos anticipar el cultivo in vi-tro de células germinales y manipulaciones como el in-tercambio de cromosomas y segmentos. La aplicaciónúltima de la biología molecular sería el control directo desecuencias nucleotídicas en los cromosomas humanos, enrelación con el reconocimiento, selección e integraciónde los genes deseados».

Por su parte, en un simposio que tuvo lugar en la fa-cultad de Medicina de la Universidad de Columbia, enNueva York, con el título «Reflexiones sobre la investi-gación y el futuro de la medicina», Tatum predijo, en1966, que los virus podrían utilizarse para transducir ge-nes: «puede anticiparse que los virus serán utilizados conefectividad para beneficio de la humanidad, en estudiosteóricos sobre genética de las células somáticas y, posi-blemente, en terapia genética [...] Podemos mostrarnosoptimistas respecto a las posibilidades terapéuticas deri-vadas del aislamiento o diseño, síntesis e introducciónde nuevos genes en células defectivas de órganos particu-lares». Tatum especuló que, como las bases del cáncer songenes alterados, «el tratamiento podría conseguirse mo-dificando y regulando las actividades génicas, o reparan-do reemplazando esos genes». Ese mismo año, 1966, Le-derberg remachó: «La revolución cultural ha iniciado suimpacto más crítico sobre la evolución humana, habien-do generado un poder técnico que incide directamente en

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PF.DRO GARCÍA BARRENO

la naturaleza biológica. La última década de la biología mo-lecular nos ha proporcionado una comprensión mecani-cista de la herencia y una entrada a la misma. Ello es tanaplicable a la naturaleza humana como lo es a la fisiolo-gía microbiana. Algunos temas de la ingeniería biológi-ca son, ya, un acompañante inevitable del progreso cien-tífico y médico de los próximos 20 años [...] como elcontrol químico del genotipo (para evitar repetir una fra-se permítanme hablar de alquimia genética o algenia [...]El requisito sería implantar una secuencia específica de nu-cleotidos en un cromosoma».

También en 1966, Stanfield Rogers publicó un artícu-lo -«Virus del papiloma de Shope: un pasajero en el hom-bre y su significado en el control potencial del genomadel huésped»- donde, a partir de una observación expe-rimental (la inducción de una enzima específica, argina-sa, en células en cultivo previamente carentes de la enzi-ma) y otra clínica (relación lisina/arginina en sangre depersonas expuestas por su trabajo al virus de Shope), con-cluyó que las personas en contacto con el virus incorpo-raban «información viral» y la necesidad de determinar lanaturaleza de la información metabólicamente activa apor-tada por el virus pasajero. Una vez obtenida, continuabaRogers, el ADN de esos virus podría ser utilizado para su-plementar la información genética de pacientes con va-rias enfermedades, en particular de aquellas que resultande delecciones génicas conocidas, como la fenilcetonuria.No sólo sería útil la información que es parte intrínsecadel virus, sino cualquier otra información específica trans-ducida. Rogers concluía su artículo sugiriendo la posibi-lidad de utilizar virus como vectores de información ADNespecífica.

Ante la avalancha de informaciones de este tipo, la pri-mera declaración ético-social sobre las implicaciones dela ingeniería genética humana se produjo en 1967. Uneditorial de la revista Science, firmado por Marshall Ni-remberg y titulado «¿Está la sociedad preparada?», co-mentaba: «Cuando el hombre llegue a ser capaz de darinstrucciones a sus propias células, deberá abstenerse de ha-cerlo hasta que tenga la suficiente sabiduría para utilizareste conocimiento para beneficio de la humanidad».

En diciembre de 1967, tras el anuncio de la primera sín-tesis de ADN in vitro, Arthur Kornberg manifestó «laposibilidad de acoplar un gen al ADN de un virus no pa-tógeno, y utilizar tal virus para vehicular ese gen a las cé-lulas de un paciente que sufra un defecto génico heredi-tario y, con ello, conseguir su curación» (figura 35). Comoremache de todos estos apuntes sobre terapia génica,French Anderson (figura 36) escribió, en 1968, un ar-tículo para The New EnglandJournal of Medicine, una delas revistas de mayor prestigio médico, en el que postu-laba cómo podría llevarse a cabo, algún día, la terapia gé-nica. Los editores rechazaron el manuscrito porque, «aun-que muy erudito y fascinante», resultaba «demasiadoespeculativo». «A efectos de insertar un gen correcto enlas células que presenten una mutación -escribía Ander-son- será primero necesario aislar el gen deseado de un

Gen incorporadoen el virus

Célula anormal congen perdido en

Virus infecía célula anormal

Célula normal resultante

Fig. 35.- «Un sueño de ingeniería genética: la estrategia de Korn-berg para reemplazar un gen ausente o anormal». (Modificado de

F. M. Burnet; pág. 72).

cromosoma normal. Luego este gen deberá ser duplica-do para proporcionar muchas copias. Y, finalmente, seránecesario incorporar la copia correcta en el genoma de lacélula defectiva. [...] Uno de los métodos más promete-dores para lograrlo será el desarrollo de virus no pató-genos capaces de transferir el material génico desde un ge-noma a otro».

En 1970, Rogers llevó a cabo el primer experimentode ingeniería genética en humanos al administrar virus deShope en dos niñas alemanas que padecían argininemia.El experimento (virogénica) provocó una conmoción ge-neralizada; retomando el artículo de Niremberg citadoanteriormente, se puede afirmar que la sociedad no esta-ba preparada. Los más benévolos etiquetaron el experi-mento de prematuro o lo colocaron en el borde de lo éti-camente admisible. Las reacciones generadas por elexperimento hicieron que Rogers abandonara cualquier

Fig. 36.- French Anderson (1937-), «padre» de la terapia génica.

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contacto con la clínica humana y se dedicara por com-pleto a la ingeniería genética vegetal. Lederberg (figura 37)salió en apoyo de Rogers, aunque sin mucho entusiasmo:«Otra estrategia que podría mitigar varias enfermedadeses la extensión de la utilización de cepas virales específi-cas. En la actualidad, su papel en medicina se confina a suuso como vacunas [...] Podemos vislumbrar la ingenieríade otros virus de tal manera que podrían introducir in-formación genética compensadora en células somáticasdefinidas, para restaurar funciones que están afectadas enun defecto genético dado [...) ¿O debemos pasar el pro-blema a otra generación?».

Sir Frank Macfarlane Burnet (figura 37), molesto conla discusión planteada, escribió un libro (Genes, sueños yrealidades, 1971) en contra del experimento. Burnet ini-cia su obra con las siguientes palabras: «El estímulo paraescribir este libro nació de la cantidad de escritos sensa-cionalistas acerca del significado para el futuro de la me-dicina de los descubrimientos en biología molecular». Enel capítulo 4 pasa revista a los diferentes planteamientosde la «nueva biología»; allí puede leerse: «¿Veremos la in-geniería ¿enética aplicada a la cura de las enfermedades ge-néticas? [...] ¿Si pueden traerse rocas lunares a Houston,por qué no vamos a ser capaces de aplicar la biología mo-lecular, citología y el resto, para curar lo que es ahora in-curable? [...] Mi objetivo es indicar cuan lejos de los límitesde la práctica es buscar la reorganización química delibe-rada de las unidades nucleotídicas en el ADN o en el ARNpara producir un resultado predecible, incluso en los or-ganismos con menor importancia práctica». En el capítu-lo 6, dedicado a la «enfermedad genética, la naturaleza delas diferencias entre los hombres», Burnet escribe: «No ha-brá motivos, en mi opinión, para que un gobierno finan-cie tal investigación, ni para que cualquier investigadorasuma la responsabilidad de dirigirla». Y ya finalizando laobra: «Creo que, en 1970, en todas las ciencias mayoresel esquema general ha sido competentemente y en líneasgenerales completamente delineado. La tarea ahora es re-llenar los detalles». Burnet dejó un legado de duda quefue muy difícil vencer. Sin embargo, cuando Burnet tra-bajaba en su libro, Bernard Davis comentaba: «la genéti-ca superará los ataques actuales, igual que sobrevivió a losataques del Partido Comunista en Moscú y de los funda-mentalistas enTennessee. Pero mientras, si queremos evi-tar el peligro de cualquier atisbo de lisenkoismo debemosdefender el valor del conocimiento objetivo y verificable,especialmente cuando entra en conflicto con dogmas po-líticos, teológicos o sociológicos».

Del lado de la tecnología, en 1970, Smith y Nathansidentificaron las enzimas de restricción; en 1971, Berg in-sertó con éxito el genoma de un virus tumoral en un bac-teriófago inaugurando la «era» del ADN recombinante, yen 1972, Stanley N. Cohén y Herbert W. Boyer desarro-llaron la técnica de la clonación que permite la multipli-cación en bacterias de un segmento de ADN extraño. Ta-les éxitos indujeron reacciones de cautela entre los propiosinvestigadores, quienes promovieron una serie de reunio-

Fig. 37.- Dos posturas ante la emergente ingeniería genética. A fa-vor: Joshua Lederberg (1925-), galardonado con «la mitad» del PNFMde 1958 por «su descubrimiento relacionado con la recombinacióny la reorganización del material genético bacteriano». La otra mitaddel premio lo compartieron Beadle y Tatum (véase fig. 4). En contra:Frank Macfarlane Burnet (1899-1985), quién compartió el PNFM de1960 con Peter Brian Medawar (191 5-1987) por «su descubri-

miento de la tolerancia inmunológica adquirida».

nes con la finalidad de discutir los posibles peligros de lanueva tecnología y que popularizaron una pequeña ciu-dad, Asilomar, en California. En enero de 1973 hubo unaprimera reunión que no tuvo cobertura de prensa y cuyasconclusiones se recogieron en el libro Biohazards in Bio-lógica! Research. La reunión más importante fue la celebradaen febrero de 1975, organizada por Berg. Inmediatamentedespués se constituyó el Comité Asesor sobre ADN re-combinante, apareciendo en junio de 1976 la primera di-rectriz oficial de los Institutos de Salud de Estados Uni-dos sobre dicha tecnología. Sin embargo, no sólo lospolíticos, sino también científicos respetados siguieronexpresando sus temores. Ese año, Chargaff escribió: «¿Te-nemos el derecho de contrarrestar, irreversiblemente, lasabiduría evolutiva de millones de años? [...] Soy uno delos suficientemente viejos para recordar que los camposde exterminación en la Alemania nazi comenzaron comoun experimento de genética». Y Theodore Friedmann,otro de los pioneros, afirmaba a raíz de una conferenciasobre «Aspectos éticos y científicos derivados de los usoshumanos de la genética molecular. El futuro de la terapiagénica: una reevaluación»: «... existe el peligro de llegar aser atrapado de tal manera por la belleza de la nueva cien-cia, que la obligación primaria de atender la salud del pa-ciente se subordine a la seducción del trabajo científico».

Con todo, a finales de 1978, la «ciencia» había logra-do vadear las turbulencias, gracias a dos factores. El pri-mero, la adquisición por los científicos de considerablecantidad de datos que demostraban la fiabilidad del ADNrecombinante y, el segundo, el trabajo de Donald Fre-drickson, el director de los Institutos Nacionales de Sa-lud de Estados Unidos, que supo conducir la travesía.Las herramientas de la genética molecular estaban listaspara aislar, clonar y caracterizar genes causantes deenfermedades.

79


Uno de los primeros genes «disponibles» fue el gen¡í-globina humano, cuyo defecto causa importantes en-fermedades, como la anemia de células falciformes y las ta-lasemias (otro tipo especial de anemias). El investigadorMartin Cline, de la Universidad de California, había de-mostrado, en ratones, la posibilidad de introducir genesen las células hematopoyéticas de la médula ósea medianteun sencillo procedimiento, y que tales células genética-mente modificadas podían repoblar eficazmente la mé-dula ósea de un animal al que se había inducido una apla-sia medular. Sobre la base de estos estudios trató célulashematopoyéticas de dos pacientes que padecían talasemia;las células fueron ingen¡erizadas y reintroducidas a los pa-cientes. Este primer ensayo clínico de terapia génica sellevó a cabo en Italia y en Israel; el protocolo careció de lasaprobaciones requeridas, los estudios finalizaron y Clinefue expedientado. Un mal comienzo para la terapia géni-ca en clínica humana.

El reto es desarrollar la terapia génica como un sistematerapéutico, eficaz y seguro, de farmagenes. Este objetivo estásiendo más difícil de conseguir de lo que los investigado-res habían previsto hace unos pocos años. El organismo hainvertido muchos miles de años en aprender a protegersede los peligros ambientales, incluyendo la incorporación deADN extraño en su genoma. Sin embargo, entre los agentespatógenos, los virus han tenido relativo éxito para sortearlas barreras de vigilancia y protección, y ser capaces de in-sertar su material genético en las células humanas; inclusode integrarlo en su genoma. Por ello, los esfuerzos inicialesde la terapia génica se han dirigido a ingenierizar virus quepudieran utilizarse como vectores de transporte de genes te-rapéuticos a los pacientes (figura 38 y tabla VIII).

Los retrovirus fueron elegidos, inicialmente, como losvehículos de transferencia génica (vectores retrovirales o re-trovectores) más prometedores; en la actualidad, cerca del60% de todos los protocolos clínicos aprobados utilizanretrovirus como vectores. Estos virus ARN pueden llevara cabo una transferencia génica eficaz a muchos tipos ce-lulares, integrando de manera estable el gen transferidoen el genoma de la célula huésped y proporcionando, deesa manera, la posibilidad de una expresión a largo plazo.Los retrovirus presentan un riesgo mínimo porque, en sumayoría, han evolucionado en parásitos relativamente nopatógenos; pero hay notables excepciones, como los vi-rus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y los linfo-trópicos de células T humanas. El retrovirus utilizado tra-dicionalmente como vector es el virus de la leucemiamurina (VLMu). Los vectores retrovirales tienen todoslos genes virales eliminados, no pueden replicarse y pue-den aceptar hasta 8 kb de ADN exógeno. Cuatro son losproblemas que los investigadores tienen que resolver paraconseguir retrovectores efectivos: obtención de un trans-portador eficaz, transfección de células en reposo, expre-sión a largo plazo del gen transfectado y desarrollo de unvector con un coste asumible.

Los protocolos de terapia génica que utilizan la estrate-gia ex vivo (véase «protocolos clínicos» más adelante) in-

cluyen vectores retrovirales. Las células que son infectadaspor vectores retrovirales son aquellas que poseen mayordensidad de receptores naturales (receptores anfotrópi-cos) para el VLMu y que están en división activa en elmomento de su exposición al vector. La mayoría de lascélulas humanas que pueden crecer en cultivo (in vitro) sonsusceptibles de ser infectadas y transfectadas. Una céluladiana importante es la célula troncal hematopoyética(CTH), porque la transferencia génica en estas células re-sultaría en una célula genéticamente ingenierizada que seperpetuaría durante toda la vida del receptor; sin embar-go, las CTHs presentan una pobre densidad del receptoranfotrópico en su superficie, son pobremente infectadasy menos aún transfectadas. Las CTHs siguen siendo unadiana escurridiza del máximo interés. Una estrategia en lafabricación de vectores es ingenierizar las proteínas dela envoltura viral, a efectos de hacer selectivo el reconoci-miento de las células diana. Las proteínas de la envolturaviral tienen dos funciones: acoplarse a su receptor sobre lasuperficie de la célula diana, y facilitar la entrada de las nu-cleoproteínas del virus en la célula huésped. La manipu-lación de las proteínas virales incrementará el rendimien-to transfectivo de las células diana.

Aunque la incapacidad de los retrovectores basados enVLMu para transducir células en reposo es muy útil en de-terminadas ocasiones (por ejemplo, cuando un gen suici-da se inserta en células cancerosas en división permanen-te, pero no en células normales que no se dividen), existenmuchas situaciones en que sería deseable insertar un genterapéutico en células en reposo mitótico. La mayoría delas células diana potenciales no se dividen activamente invivo; sólo ciertas células sanguíneas y las células epitelia-les que recubren el tracto digestivo permanecen en con-tinua división. Unos retrovirus singulares, los lentiviruscomo el VIH-1, son capaces de infectar y transducir cé-lulas en reposo mitótico, pero los vectores construidoscon tales virus tienen problemas de seguridad, pues hoypor hoy existe la posibilidad de emergencia de virus re-combinantes patógenos. Sin embargo, los vectores lenti-virales se contemplan como eficientes vectores en un fu-turo próximo.

Asumiendo que consigan desarrollarse vectores efecti-vos de transferencia génica, el siguiente aspecto del pro-blema es conseguir una expresión mantenida, a largo pla-zo, estable y a un nivel apropiado, del gen transfectado.Ésta es, quizá, la principal cortapisa de los vectores actua-les, y son varios los factores involucrados. Primero, la regiónreguladora del gen transfectado no permanece activa, y elpapel de diferentes factores de la célula huésped (linfo-quinas, citoquinas y otros factores de crecimiento) no seconoce. Segundo, aunque los genes se mantengan activos,la célula huésped, a menudo, muere; el sistema inmunedel organismo receptor está diseñado para reconocer y eli-minar productos génicos extraños y las células que pro-ducen una proteína extraña. Aunque los genes virales delretrovector son eliminados, con lo que el reconocimientoinmunológico de las proteínas virales no es un problema,

80


propiedades

nserto máximo

ruta de administración

integración en genoma huésped

duración de la expresión in vivo

estabilidad

problemas inmunológicos

nmunidad preexistente en huésped

problemas de seguridad

vector

retroviral

7-7.5 kb

ex vivo

sí (célula endivisión)

transitoria

buena

pocos

improbable

mutagénesisinserciona

lentiviral

7-7.5 kb

ex/in vivo

si (célula en división)

prolongada

0pocos

improbable, excepto enpacientes con sida

mutagénesisnsercional

adenoviral

30-35 kb

ex/in vivo

no

transitoria

buena

importantes

sí

respuestanflamatoria

AAV

3.5-5 kb

ex/in vivo

sí/no

prolongada

buena

c •

sí

respuesta¡nflamatoria

ADN desnudoliposomas

ilimitado

ex/in vivo

muy pobre

transitoria

muy buena

ninguno

no

ninguno

Ciclo del vector

VECTOR

Gen terapéutico insertado

NO PROTEÍNASVIRALES

£§p. . PROTEINA-•!»& 5® TERAPÉUTICA

NO NUEVOSVIRUS

NO GENESVIRALES

ENSAMBLAJE

GENESVIRALES

Fig. 38 . - Esquema general de transfección mediante un vector viral. Los virus silvestres liberan su material genético en la célula infectada.Material que tanto se integre o no, en el ADN nuclear de la célula infectada, dirige la síntesis de nuevas partículas virales que pueden le-sionar la célula e infectar otras. Para convertir un virus silvestre en un vector de terapia génica, los investigadores remplazan los genes queconfieren la patogenicidad viral por el gen humano alterado. El gen transfectado, libre o integrado en el genoma de la célula diana, producirá

las proteínas deseadas.

el sistema inmunocompetente del huésped sigue siendocapaz de reconocer las proteínas «nuevas» o «modificadas»producidas por el gen terapéutico. Una proteína «normal»,que comienza a producirse a partir de un momento de lavida de un organismo, será reconocida como anormal porun sistema inmune que nunca, anteriormente, había esta-do expuesto a ella. Una vez conseguida la estabilidad del

gen transfectado, otro problema deriva de la necesidad deregular la expresión de ese gen. Muchos genes objetivosde la terapia génica, como el gen insulina, se expresan enrespuesta a diferentes señales fisiológicas; para ello es ne-cesario dotar al gen donante de secuencias reguladoras querespondan a las propias señales del organismo huésped oa fármacos que puedan controlar la función génica.

81


Aunque preocuparse por problemas de fabricaciónreferentes a cómo una compañía farmacéutica manu-facturaría millones de dosis de un vector farmagénicoera irrelevante hace años, hoy es un problema real. Unode los principales problemas deriva de la propensión delos retrovirus a la recombinación; sobre todo dadoque los genomas de las células de los mamíferos con-tienen retrovirus endógenos y, máxime, dada la capa-cidad de los retrovirus para integrarse de manera alea-toria en el ADN de las células del huésped. De todosmodos, el único caso conocido de producción tumoralinintencionada en un experimento de transferencia gé-nica retroviral se publicó en 1992. Otro objetivo far-macéutico es producir un vector que pueda inyectarsede manera directa en el organismo (como la penicilinao la insulina). Esta faceta de fabricación es una de lasmás difíciles de abordar.

Los vectores adenovirales, que utilizan adenovirus comoelemento de transporte, se utilizan, preferentemente, enestrategias farmagénicas in situ. Estos vectores tienen cier-tas ventajas: pueden transportar grandes insertos de ADN(30-35 kb); son virus humanos y son capaces de trans-ducir, con una alta eficiencia, una gran variedad de tiposcelulares humanos; transducen células en reposo, y pue-den producirse en cultivo a muy altos títulos. Son los vec-tores de elección para numerosos laboratorios que inten-tan tratar las complicaciones pulmonares de la fibrosisquística y diversos tipos de cánceres. Los vectores adeno-virales tienen, sin embargo, varios puntos débiles. La cons-trucción de vectores adenovirales mínimos («en su míni-ma expresión») o «aviscerados» (gutless, vectores con todoslos genes virales eliminados) ha originado resultados dis-pares respecto a su inmunogenicidad, estabilidad de la ex-presión génica y persistencia del vector aviscerado in vivo.La eliminación de más y más genes virales no siempre esventajosa, porque algunos genes pueden tener propieda-des favorables, por ejemplo suprimir la respuesta inmunecontra el vector.

Otro virus ADN utilizado en ensayos clínicos es el vi-rus asociado a adenovirus (adeno-asociado, VAA). El VAAno es patógeno y está ampliamente distribuido en la po-blación humana (cerca del 80% de los humanos tiene an-ticuerpos contra VAA). Su interés deriva de que es el úni-co virus mamífero conocido que muestra una integraciónpreferente en una región específica del genoma: el brazocorto del cromosoma 19; una región que comparten losgenes responsables de los fenotipos de susceptibilidad ate-rosclerótica, resistencia a la insulina (leprechaunismo), in-munodeficiencia combinada severa y leucemia linfoblás-tica aguda de células T, entre otros. Parece ser una región«segura» del genoma, aunque se cree que la inserción delVAA es inespecífica; por ello, se ha sugerido insertar se-cuencias complementarias a dicha región en los diferen-tes vectores y a efectos de dirigirlos a ella. Otra ventaja esque puede permanecer como un episoma (elemento ge-nómico extracromosómico, autorreplicativo) hasta que lacélula se divida. Su principal desventaja es que sólo pue-

de aceptar segmentos muy pequeños de ADN. Otras po-sibilidades como vector ofrece el virus herpes simple (vi-rus ADN), por su propensión para transducir células ner-viosas, y también se están explorando otros virus comoposibles vectores citoplasmáticos (episomas) que no se in-tegran en el genoma.

Por último, y aunque los sistemas virales son potencial-mente muy eficientes, dos factores sugieren que sistemasde transportegénico no virales pueden ser una opción en elfuturo: seguridad v facilidad de manufacturación. Talessistemas son el ADN desnudo y los lipocontenedores. Es-tos últimos son estructuras de diferente complejidad: li-posomas los más sencillos y lipoplexos los más complejos.En uno y otro caso se trata de contenedores de materialgénico que son engullidos y digeridos por diferentes ti-pos celulares, donde liberan el farmagén portado. A efec-tos de dirigir su captación por células dianas especificadas,su superficie puede ser dotada de marcadores específicos(liposomas ingenierizados) que serán reconocidos por lascélulas enfermas. Por su parte, varios experimentos handemostrado que la inyección intramuscular de ADN (ADNdesnudo) se expresa y produce la correspondiente proteí-na. Si bien el ADN así administrado es muy inestable,puede ser útil como vacuna (vacunas ADN), pues basta unamínima cantidad de proteína para desencadenar una fuerterespuesta inmunológica.

A los vectores del futuro se les exige que puedan admi-nistrarse por vía endovenosa, que infecten, exclusivamente,las células diana elegidas, y qtie lo hagan de manera seguray eficiente; también, que inserten el gen en las regiones apro-piadas del genoma, que puedan regularse por las señales fi-siológicas o mediante agentes administrados, y que tenganun precio acorde a la relación coste-beneficio aportada.

El primer protocolo clínico aprobado para terapia géni-ca somática humana se inició en septiembre de 1990, paratratar a dos niñas que padecían la enfermedad de inmu-nodeficiencia combinada severa debida a deficiencia con-génita de la enzima adenosina desaminasa. En los diezaños transcurridos se han aplicado 400 protocolos quehan incluido 3 000 pacientes; la mayoría de la actividadse ha realizado en centros de Estados Unidos (tabla IX).Las conclusiones son que la terapia génica tiene el poten-cial para tratar un amplio abanico de enfermedades y queel procedimiento, en términos generales, presenta bajoriesgo de reacciones adversas; sin embargo, la eficacia dela transferencia y expresión génica subsiguiente en pa-cientes humanos es extremadamente baja. Debe señalar-se que, en noviembre de 1999, se produjo el primer fa-llecimiento debido, directamente, a terapia génica. Lamuerte de Jesse Gelsinger, conocida como muerte bio-tecnológica (biotech death), supuso un mazazo a diez añosde esperanzador progreso; máxime cuando, excepto al-guna comunicación, anecdótica, de pacientes aislados quese han beneficiado de este tipo de terapia, no hay ningu-na evidencia concluyente de que algún protocolo de terapiagénica haya representado un éxito comprobado en el tra-tamiento de alguna enfermedad humana.

82

GENES, CÉLULAS YTHJIDOS: ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS PARA EL NUEVO MILENIO...

Tabla IX. Ensayos clínicos de terapia génica presentados

m^m^^^^^^^agosto de 2gHMMtt^^taHl^^^^Htipo

cáncer

sida

enfermedades cardiovasculares

fibrosis quística

inmunodeficiencias

hemofilia

enfermedades metabólicas

anemias

distrofias musculares

artritis

enfermedades neurodegenerativas

otras

número

271 (70.1*

33

28

25

7

6

6

3

3

2

2

23

porcentaje

64(16)*

9

7

6

2

1

1

<1

<1

<1

<1

5

* InmunoterapiaFuente: Human Gen. Ther. 11, n ° 12, 10 de agosto de 2000.

Respecto al ensayo original, iniciado en 1990, se ad-ministraron a las pacientes linfocitos autólogos corregi-dos génicamente; ambas niñas llevan vidas normales en laactualidad. Una de ellas recibió un total de once infusio-nes, la última en 1992, y sus niveles de linfocitos circulantesse han mantenido constantes y funcionales durante losúltimos años; contrajo la varicela a finales de 1996 y ex-perimentó ei mismo curso clínico que cualquier niño dediez años. La segunda paciente continúa recibiendo untratamiento estándar para su enfermedad. Aunque las dospacientes tienen linfocitos ingenierizados en su sangre des-pués de diez años, no ha podido sacarse conclusión algu-na del ensayo, pues ambas mantuvieron y mantienen untratamiento de base, de tal manera que no puede sabersequé parte de la mejoría conseguida se debe al tratamien-to estándar y cuál a la terapia génica.

La talasemia y la inmunodeficiencia congénita son ejem-plos de las innumerables enfermedades monogénicas-aquéllas debidas al fracaso de un gen-, y son, a la vez, lascandidatas preferentes a la terapia génica en cuanto que sutratamiento exige la incorporación de un solo gen. Sinembargo, la mayoría de las enfermedades, y las más fre-cuentes, son poligénicas —son varios los genes involucra-dos en su patogenia—, lo que dificulta, pero no excluye, laestrategia farmagénica.

Se dispone de tres posibles vías de administración delADN terapéutico: ex vivo, in situ e in vivo (tabla X). Laestrategia ex vivo obtiene células dianas del paciente que,una vez manipuladas en el laboratorio, son reincorpora-das al paciente. Tal es el caso de la talasemia o la inmu-nodeficiencia congénita citadas, en las que a células he-matopoyéticas de la médula ósea, o a linfocitos circulantes,se les inserta el gen deficitario correspondiente para serluego reintroducidos en el paciente. La estrategia in situ co-loca el farmagén en el lugar de la alteración. Por ejemplo,a pacientes con enfermedad fibroquística, en la que exis-ten graves lesiones pulmonares, se les administra el gen através de inhaladores; en casos de dilatación de una arte-

ria coronaria por una lesión arteriosclerótica, se inyectain situ un gen involucrado en la prevención de una posi-ble reestenosis posdilatación; en determinados tumoresse inyecta un gen «suicida» que desencadena una respuestaencaminada a su eliminación (figura 39), y en la enfer-medad de Duchenne se inyecta intramuscularmente elgen alterado. Por último, la estrategia in vivo, objetivo úl-timo de la terapia génica, busca vectores capaces de seradministrados por vía intravenosa, de manera similar acomo se administra cualquier otro fármaco; hoy, tal es-trategia no es viable. Una variante de las estrategias in situe in vivo es la inducción de una respuesta inmunológicageneral contra un antígeno codificado por un farmagén ad-ministrado por vía intramuscular (estrategia utilizada enel sida, por ejemplo).

La terapia génica de células somáticas para el tratamien-to de enfermedades graves está hoy aceptada como ética-mente correcta, si bien los protocolos —todos ellos en faseexperimental— deben someterse a rigurosos controles. Laviabilidad de tales protocolos ha hecho que la tecnologíade la terapia génica se haya aplicado a condiciones no pa-tológicas; esto es, con fines de potenciar ciertas caracte-rísticas fisiológicas o con fines cosméticos. Una compañíabiotecnológica ha desarrollado la tecnología para transfe-rir genes (específicamente el gen tirosinasa, responsablede la formación de melatonina, y el gen factor de creci-miento epidérmico) a las células de los folículos pilosos, aefectos de promover la coloración y el crecimiento del ca-bello. La utilización de la ingeniería genética para tratarla calvicie no debería ser un fin en sí mismo, pero es unejemplo de las tendencias sociales. Igual comentario esválido para la posible utilización del gen hormona del cre-cimiento para incrementar la talla, o el gen distrofina paraacumular mayor masa muscular. La terapia génica somá-tica in útero será una realidad en un futuro próximo; ¿porqué esperar a tratar una enfermedad una vez que ha ex-presado un fenotipo irreversible cuando puede prevenir-se in útero? Sm embargo, en la actualidad, la terapia génicade células germinales queda relegada de cualquier intentode abordaje en un futuro próximo. Por último, una si-tuación particular la representa la combinación de terapiagénica y clonación. En un paso más allá de la transgénesis(inyección de un gen en uno de los pronúcleos de un zi-goto), un protocolo contempla la transfección de un genhumano (factor IX de la coagulación: su déficit es causa

. Categorías de terapia génica celular somática

Ex vivo: las células son extraídas del organismo e incubadas con un vec-tor. Las células ingenierizadas retornan al organismo. Es el procedimientoempleado con células hematopoyéticas por su fácil obtención y retorno.In situ: el vector es colocado, directamente, en el tejido afectado. Sonejemplos la instilación de vectores adenovirales en el árbol traqueobron-quial de pacientes con fibrosis quística o la inyección intratumoral de unvector que transporta un gen suicida.

In vivo: donde un vector se inyecta directamente en el torrente sanguí-neo, de manera similar a la inyección endovenosa de numerosos fármacos.En la actualidad, no hay ejemplos clínicos de esta modalidad terapéutica,aunque tal es el objetivo final de la terapia génica.

83

rPEDRO GARCÍA BARRENO

(a) X?

VPC

Célula tumoral

• . Fármaco

• Vector

Fig. 39.- Protocolo que utiliza la administración de genes suicidasen tumores intracerebrales. (a) Mediante un sistema de estereota-xia guiada por imagen por resonancia magnética se inyectan célu-las productoras de vectores (VPCs), directamente en el tumor (b) ymediante un trocar a través del cráneo. Una semana después, tiem-po en el que las VPCs han transferido el gen a las células cancero-sas circundantes, se administra (c) un profármaco por vía intravenosa.El profármaco, inactivo, es activado in situ por el producto del gensuicida (enzima activadora o conversora del profármaco) vehiculadopor las VPCs. El fármaco activo sólo actúa, por lo tanto, en las célu-las cancerosas que expresan el gen (d) y no en las sanas que no lo

incorporaron.

DOOOOCXADN

pre-mARN

transcripción^

procesamiento

ANTl - GEN

\

SEN JELOS - ^ — ONs

ANTl - SENTIDO

mARN 1traducción

tttImaduración

Fig. 40.- Noqueo génico farmacológico. ODN: oligodesoxirribonu-cleotido o antigen; ON: oligonucleotido; antisentido o nucleotido

expresado.

de la hemofilia tipo B) en fibroblastos fetales ovinos; lue-go, los núcleos de estas células han sido clonados y loshuevos ingenierizados han crecido en una oveja adultaque produce el factor humano de la coagulación, útil paratratar pacientes con hemofilia B.

La definición de terapia génica incluye «silenciar genesindeseables» o bloquear la expresión de genes específicos(noqueo génico farmacológico, figura 40). La secuencia nu-cleotídica del ADN o del ARN mensajero, que contienela información de la secuencia aminoacídica de la proteí-na que codifica o que traduce, respectivamente, se de-nomina «secuencia sentido» (en el sentido de la lectura).En el ADN nuclear de doble banda, la secuencia com-plementaria se denomina «antisentido», que es inactiva yno se transcribe. Es posible sintetizar secuencias nucleo-tídicas antisentido que reconozcan, interaccionen y con ellobloqueen las secuencias de lectura. Existen dos estrategiasprincipales, oligodesoxinucleotidos (ODNs) y ARNs an-tisentido. Los ODNs se fabrican de manera automática enun sintetizador de ADN, siendo su secuencia nucleotídi-ca (12-15 bases) complementaria con la del gen diana.Los ARNs antisentido se denominan nucleotidos expre-sados, y utilizan la tecnología recombinante: un vectorque incorpora una secuencia desoxinucleotídica diseña-da dirigirá la síntesis del ARN mensajero antisentido de-seado. De manera similar a los ODNs se intentaron uti-lizar ribonucleótidos sintéticos, pero su inestabilidad lodesaconsejó. Uno de los problemas es que, lejos de la neu-tralidad inmunológica de los ácidos nucleicos y al igual que

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sucede tras la administración de ADN desnudo, los ODNsson potentes inmunógenos. Otra estrategia farmacológi-ca que actúa sobre la transcripción se dirige a los factoresde transcripción o proteínas reguladoras del proceso. Losfactores de transcripción se acoplan a secuencias nucleo-tídicas específicas de la región reguladora de los genes; esposible administrar secuencias nucleotídicas homologas(señuelos) que, compitiendo con las regiones reguladorasgénicas, atrapen los factores de transcripción.

Resumen

«La comunidad involucrada en terapia génica humana—comenta Theodore Friedmann- se encuentra forcejean-do con problemas técnicos y políticos derivados de re-cientes acontecimientos adversos surgidos de estudios enclínica humana y que han tenido una fuerte repercusiónen los medios de comunicación. Polémica que ha estadocatalizada por la muerte de Jesse Gelsinger, un paciente dedieciocho años diagnosticado de una deficiencia enzimática(ornitina transcarbamilasa) y que falleció, aparentemente,como consecuencia directa del protocolo experimental deterapia génica a que estaba siendo sometido. [...] Talesacontecimientos sugieren que la terapia génica no ha con-seguido los estándares de calidad requeridos para su acep-tación en investigación clínica humana». Los principios queconstituyen los fundamentos de investigación clínica enterapia génica deben incluir, en primer lugar, que la ex-perimentación humana implica riesgos; los estudios ge-nómicos humanos se consideran en fase experimental,precisamente, porque sus resultados no se conocen de an-temano. Sin embargo, los resultados adversos no invalidansu racionalidad. Es necesario incrementar los niveles de exi-gencia, control y seguimiento de los protocolos, y endu-recer las normas reguladoras. La experimentación huma-na requiere una cuidadosa selección y protección de lospacientes, y el informe consentido constituye la base de estaprotección. En relación con las características de los pro-cedimientos involucrados en el desarrollo farmacológicode la terapia génica, que hacen casi obligada la presencia deempresas farmacéuticas, es prioritario zanjar cualquierconflicto de intereses financieros por parte de los investi-gadores. «Hay necesidad de mejorar -concluye Fried-mann-, pero también de celebrar: los avances técnicosconseguidos en los últimos meses son prueba inminentede que las vidas de los pacientes pueden mejorar ostensi-blemente con terapia génica».

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