estandarización de un método analítico por cromatografía

130 El Hombre y la Máquina No. 30 • Enero - Junio de 2008

Resumen

Se realizó la estandarización de un método por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para la cuantificación de carba-mazepina en tabletas utilizando un detector de ultravioleta. El método se basa en el uso de agua - metanol - acetonitrilo (50:25:25) como fase móvil so-bre una columna de fase reversa (C18, Novapak®, 4 x 300 mm). Se demostró que el método cum-ple con todos los requisitos para el control químico de calidad de la forma farmacéutica (linea-lidad, especificidad, precisión, exactitud y sensibilidad).

Los resultados del análisis cromatográfico muestran que la metodología es específica, selec-tiva, precisa y lineal en el rango

Estandarización de un método analítico por cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de carbamazepina en tabletas

guillerMo garzón garCía*

Millerlandy popayán JaraMillo**

* Ph.D. Northwestern University, M.Sc. Purdue University, Químico Universidad Nacional de Colombia. Profesor Programa de Química, Centro de Investigaciones en Ciencias Básicas, Ambientales y Desarrollo Tecnológico, CICBA, Universidad Santiago de Cali, Cali, Valle. [email protected]

** Química. Universidad Santiago de Cali, Cali, Valle. [email protected]

Fecha de recibo noviembre 13 de 2007 Fecha de aceptación: marzo 14 de 2008

Fotografía del Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiencia.

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de 80% a 120% de la concentra-ción analítica de trabajo (200 µg/mL), con límites de detección de 6 ppm y el límite de cuantifica-ción de 19 ppm para el analito. Se halló una recuperación media del 100.4%, cumpliendo a satis-facción los criterios de exactitud del método.

Palabras clave

Carbamazepina, cromato-grafía líquida de alta eficiencia, coeficiente de variación.

Abstract

A method by High Perfor-mance Liquid Chromatography (HPLC) was standardized to quantify carbamazepine in ta-blets, utilizing an ultraviolet detector. The method is based on the use of water – methanol – acetonitrile (50:25:25) as a mobile phase on a reversed pha-se column (C18, Novapak®, 4 x 300 mm).

It was demonstrated that this method meet all the proposed re-queriments for a quality chemical control of the pharmaceutical form (linearity, specificity, pre-cision, accuracy and sensibility). The results of the analysis show that the methodology is specific, selective, precise, and linear in the range 80% and 120% of analytical concentration of work (200 μg/mL), with limits of de-tection of 6 ppm and limits of quantification of 19 ppm. A 100,4 % recuperation was found, obe-ying to satisfaction the criteria of accuracy of the method.

Key words

Carbamazepine, High Perfor-mance Liquid Chromatography (HPLC), Coefficient of varia-tion.

Introducción

La carbamazepina es un imi-noestilbeno derivado con una estructura tricíclica, tiene forma de cristales, soluble en alcohol, aceto-na y propilenglicol; prácticamente insoluble en agua.1

Figura 1. Estructura química de carbamazepina

Nombre químico: 5H-Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamida.

Fórmula química: C15 H12 N2 O

Peso molecular: 236.27

C 76,25%, H 5,12%, N 11,86%, O 6,77%.

La carbamazepina (tegretol) es un anticonvulsivante desarrollado en 1957; particularmente eficaz en pacientes aquejados de epilepsia psicomotora o de crisis parciales complejas, enfermedad conocida como epilepsia temporal. En la década de los años setenta se inició el uso de la carbamazepina en los trastornos afectivos y también en los dolores neuropáticos tipo neuralgia del trigémino.

El tratamiento con carbamaze-pina se plantea como alternativa a aquellos pacientes que no respon-den o donde el litio se encuentra contraindicado. También se ha utilizado en combinación con anti-depresivos en depresiones refracta-rias, en el tratamiento del trastorno de personalidad y en el tratamiento de la abstinencia alcohólica o de benzodiacepinas.2

Estandarización de un método analítico por cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de carbamazepina en tabletasGuillermo Garzón García • Millerlandy Popayán Jaramillo


El presente trabajo ofrece el establecimiento de un método analítico que permita cuantificar la carbamazepina como materia prima, ingrediente activo y en estudios de estabilidad de una formulación far-macéutica, mediante un método por HPLC, como herramienta versátil y poderosa para la identificación y la determinación de los componentes químicos en mezclas.

Materiales y métodos

Se usaron los siguientes instru-mentos y solventes:

• Cromatógrafo líquido Waters Alliance 2690 (serie A99S-M7500M) con detector 996 (se-rie A99996507M) y Software Millenium 32 (versión 3.2)

• Balanzas analíticas Mettler Toledo AB 204 (10mg – 210g)

• Ultrasonido FS60H Fischer Scientific

• Bomba de vacío Millipore

• Purificador de agua Milli-Q Millipore Académica 0,22 μm

• Acetonitrilo, metanol y agua grado HPLC

La metodología analítica em-pleada se llevó a cabo con base en las siguientes etapas:3,4

1. Estandarización del método: Consta de información prima-ria, definición del sistema preli-minar y ajuste de los parámetros cromatográficos.

2. Actividades preliminares: Para la preparación de la matriz de excipientes (placebo), se prepararon y mezclaron las si-guientes cantidades de materias primas:

• Aerosol 200 (dióxido de sili-cio)

• Eudragit RL 30D

• Avicel polvo ph 101

• Glicolato de amido sódico

• Estearato de magnesio

• Talco USP

• Color amarillo Subset Laca

• Hidroxipropilmetilcelulosa E5L

• Oparspray Naranja K-1-2441

• Polietilenglicol 6000.

• Color azul No. 2 FD&C AL LAKE

El procedimiento analítico tuvo en cuenta la preparación del están-dar, la preparación de la muestra y los parámetros cromatográficos.5,6 En todas las preparaciones analí-ticas se utilizaron solventes grado HPLC.

Para la preparación del estándar se pesaron exactamente 50 mg de carbamazepina estándar secundario, se llevó a un balón volumétrico de 50 mL, se disolvió y llevó a volu-men con metanol. Se diluyeron 5 mL a 25 mL en un balón volumé-trico con fase móvil. Se filtró por membrana de 0,45 μm y se inyectó en el cromatógrafo.

Para la preparación de la mues-tra se pesaron 20 tabletas del pro-ducto, se calculó y se pesó el equi-valente al peso promedio, se llevó a un balón volumétrico de 50 mL, se disolvió y aforó con metanol. Se diluyeron 5 mL a 25 mL en un balón aforado y se aforó con fase móvil. Se filtró por membrana de 0,45 μm y se inyectó en el cromatógrafo.

3. Parámetros cromatográficos: Fase móvil: mezclar agua: me-tanol: acetonitrilo (50:25:25), filtrar por membrana de 0,45μm y desgasificar. Temperatura 25°C, columna C18, Novapak®, 4 x 300 mm C18, longitud de onda 280 nm, flujo 1 mL / min, volumen de inyección 20 μL, tiempo de retención 4.0 minu-tos.



En la Figura 2 se presenta un es-quema de una separación cro-matográfica.

4. Descripción de las pruebas: Se realizaron pruebas de linea-lidad (concentración 80%, 90%, 100%, 110% y 120%), especi-ficidad, precisión (repetibilidad del método, precisión interme-dia), exactitud, robustez, límite de detección y cuantificación.

Resultados y discusión

Especificidad. Placebo: El cromatograma obtenido para el placebo no muestra ninguna señal en el tiempo de retención de la car-bamazepina.

Hidrólisis ácida: El pico co-rrespondiente a la carbamazepina se observa espectralmente puro, no evidenciándose aparición de com-puestos de degradación.

Hidrólisis alcalina: En el croma-tograma no se detectan compuestos de degradación; la carbamazepina se muestra espectralmente pura.

Oxidación con peróxido: El pico correspondiente a la carbamazepina se observa espectralmente puro.

Oxidación con luz ultravioleta: No se evidencian sustancias de de-gradación que interfieran en la cuan-tificación de la carbamazepina.

Según los resultados obtenidos para este parámetro, no se presenta interferencia por parte de los exci-pientes de la formulación o potencia-les productos de degradación lo que indica la especificidad del método para cuantificar el analito de interés, en este caso la carbamazepina.

linealidad. El valor observado experimentalmente del coeficiente de correlación entre la cantidad de principio activo adicionado y la can-tidad recuperada es de 0.9962.

El coeficiente de variación de los factores de respuesta es de 1.3%. En la Figura 3 se muestra la curva de linealidad entre la con-centración del analito (mg/mL) y la respuesta obtenida (área bajo la curva).

Figura 2. Esquema de una separación cromatográfica



Se rechaza la hipótesis nula de no correlación.

En la prueba de hipótesis para la pendiente se acepta que ésta es significativamente diferente de cero (0) ya que bt > 2,05.0 −nt .

Se acepta la hipótesis nula de que el intercepto es igual a cero (0) debido a que at < 2,05.0 −nt .

Los resultados obtenidos en los test estadísticos demuestran la capa-cidad del método analítico para ob-tener resultados linealmente propor-cionales a la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado (80% - 120%).

Debido a que el método de-mostró ser lineal para la cuantifica-ción de carbamazepina no se hace necesario demostrar la linealidad del sistema, ya que los efectos de los excipientes, como se demostró en la prueba de especificidad, son despreciables.

Precisión del método. El co-eficiente de variación para las respuestas obtenidas en el análisis de seis muestras individuales a la concentración analítica de trabajo fue de 0.2%. Los resultados se ilustran en la Tabla 2.

Se concluye que hay un grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica repetidamente a la misma muestra.

Precisión intermedia. El coefi-ciente de variación para las respues-tas obtenidas entre los dos analistas fue de 0.3%. En la Tabla 2 se muestran los resultados expresados como porcentaje de recuperación, basándose en el análisis individual de seis muestras al 100%.

El coeficiente de variación para las respuestas obtenidas cumple con el criterio de aceptación para este parámetro.

Los resultados obtenidos para este parámetro demuestran la con-fiabilidad del método en diferentes ambientes operacionales durante el desarrollo del mismo (diferente día, diferente analista y diferente instrumento).

Exactitud. El porcentaje de recuperación promedio obtenido fue de 100.4%, no existiendo diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%; además. el factor concentración no tiene influencia en la variabilidad de los resultados. En las Tablas 3 y 4 se muestran los re-sultados para la prueba de exactitud del método utilizando cinco niveles de concentración.

Figura 3. Curva de linealidad del método

En la Tabla 1 se resume la prue-ba de Student para el coeficiente de correlación, donde se rechaza la hipótesis nula de no correlación. En la prueba de hipótesis para la pendiente se acepta que esta es significativamente diferente de cero (0) ya que bt > 2,05.0 −nt . También se puede observar que se acepta la hipótesis nula de que el intercepto es igual a cero (0) debido a que I atI< 2,05.0 −nt .

Estandarización de un método analiíico por cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de carbamazepina en tabletasGuillermo Garzón García • Millerlandy Popayán Jaramillo


n : 30 b : 27074409,17 r : 0,9962

m : 6 2s : 4832242455 2r : 0,9924

k : 5bs :

448713rt : 60,338

∑ x : 6,000bt :

60,3382,05.0 −nt :

2,048

∑ y : 1621519482,05.0 −nt :

2,048

∑ 2x1,224

∑ 2y : 8,94E+14 a : -9817

∑ xy : 33080175as :

90636

Sxx : 0,024at :

-0,108

Syy : 1,77E+132,05.0 −nt :

2,048

Sxy : 649785,82

Tabla 1. Resultados estadísticos de la prueba de linealidad.

Analista 1 Analista 2

Lectura 1

(%)

Lectura 2

(%)

Promedio

(%)

Lectura 1

(%)

Lectura 2

(%)

Promedio

(%)

100,8 101,5 101,1 101,1 101,5 101,3

100,6 100,8 100,7 100,7 101,1 100,9

101,0 101,0 101,0 100,3 100,8 100,5

101,3 100,6 100,9 101,2 101,1 101,2

100,6 100,7 100,6 100,7 100,7 100,7

101,3 101,2 101,2 101,1 101,2 101,2

x : 100,9 x : 101,0

s : 0,2 s : 0,3

RSD : 0,2 RSD : 0,3

12x : 100,9

12s : 0,3

12RSD : 0,3

Tabla 2. Resultados obtenidos para las pruebas de precisión del método y precisión intermedia.



Tabla 3. Resultados para la prueba de exactitud.

Nivel Valor hallado (%) Recuperación (%) X S S2

80 79,4 80,5 78,2 99,2 100,6 97,8 99,2 1,4375 3,5039

90 91,4 90,4 90,7 101,5 100,4 100,8 100,9 0,5396 0,8307

100 103,2 100,8 100,8 103,2 100,8 100,8 101,6 1,4145 3,4153

110 110,8 111,5 110,0 100,7 101,4 100,0 100,7 0,7047 1,2012

120 119,5 119,9 119,7 99,6 99,9 99,7 99,7 0,1463 0,1677

Tabla 4. Evaluación de la exactitud del método utilizando las pruebas estadísticas de Student y Cochran.

Prueba de Student Prueba de Cochran

R : 100,41 2máxs : 3,5039

RSD : 1,2133∑=

k

iis

1

2 :9,1189

expt : 0,3380expG : 0,3842

1,05.0 −nt : 2,1604knG ,,05.0 : 0,6838

Tabla 5. Resultados del proceso de estandarización del método analítico.

Parámetro Criterio de aceptación Resultado

Especificidad Señal del placebo negativa Negativo

Linealidad

r? 0,990 0,9962

r2>0,980 0,9924

RSD ? 5,0% 1,30%

Tb > to, 05,n-2 (tabla = 2,048) 60,34

Precisión del métodoRepetibilidad: RSD ? 2,0% 0,20%

Reproductibilidad: RSD ? 2,0% 0,30%

Exactitud

Texp < tt (ttabla = 2,1604) Prueba Student 0,3380

Gexp < Gt (Gtabla = 0,6838) Prueba de Cochran 0,3842

% Recuperación: 98,0% - 102,0% 100,41%

RSD ? 2,0% 1,21%

Límite detección Informativo 6 ppm

Límite cuantificación Informaivo 19 ppm



Los valores obtenidos en la prueba de Cochran

expG < ),;05.0( knG tabla indi-can que el factor concentración no tiene influencia en la variabilidad de los resultados (igualdad de va-rianzas).

Robustez. Dado que tiene importancia relevante evaluar el tiempo, a partir de la preparación de la muestra, durante el cual ésta es apta para el análisis (se asume que los otros factores se mantienen constantes en el análisis de rutina), se realizó un estudio de estabilidad de la muestra en solución diluente. En el estudio realizado sobre una muestra preparada a la concentra-ción de trabajo, se encontró que al cabo de tres horas la respuesta obtenida para la carbamazepina no varió significativamente (menor al 2%) frente a la respuesta obtenida inicialmente.

límite de detección y límite de cuantificación. El límite de detec-ción calculado, con base en la curva de linealidad del método, fue de aproximadamente 6 ppm; mientras que el límite de cuantificación fue de 19 ppm. Cabe anotar que, dada la finalidad del método (cuantifica-ción del principio activo en formas farmacéuticas), no se previó en el alcance del presente proyecto la verificación de estos valores con muestras preparadas a ese nivel de concentración.

En la Tabla 5 se muestran, a manera de resumen, los resultados del proceso de estandarización del método analítico, para cada uno de los parámetros, con los corres-pondientes criterios de aceptación

establecidos por la farmacopea norteamericana.

Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede concluir que:

El método cromatográfico para la valoración de carbamazepina demostró ser lineal en el rango de 80% a 120% de la concentración analítica de trabajo (200 µg/mL) con un coeficiente de correlación de 0.9962.

En el estudio de precisión del método se encontró una desviación estándar relativa de 0.2%, mientras que para el estudio de precisión intermedia este valor fue de 0.3%.

Lo anterior cumple con los cri-terios de aceptación, lo cual permite inferir que el método es preciso y reproducible, con el concepto de precisión intermedia.

En la prueba de exactitud se halló una recuperación media del 100.4%, cumpliendo a satisfac-ción los criterios de exactitud del método.

Se encontró que la muestra es estable en la solución diluente du-rante un periodo de tres horas.

El límite de detección calculado con base en la curva de linealidad del método fue de 6 ppm y el límite de cuantificación de 19 ppm.

En los estudios de especificidad se demostró que el placebo no in-terfiere en la cuantificación e iden-tificación del principio activo; ade-más, en el análisis de las muestras sometidas a degradación forzada, la señal correspondiente a la carba-

mazepina se observa como un pico espectralmente puro, evidenciando así las propiedades indicativas de estabilidad del método.

La presente documentación permite tener disponibilidad de los resultados del método analítico y cumplir con las exigencias legales.

Por todo lo anterior, se puede afirmar que el método cromatográ-fico para la cuantificación e iden-tificación de la carbamazepina en tabletas cumple con los parámetros exigidos para la estandarización de un método analítico, garantizando de esta manera que los resultados obtenidos al aplicarlo en el análisis del producto terminado y en los estudios de estabilidad de la forma farmacéutica son confiables.

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