Establecimiento de las máximas prevalenciasposibles de infección por Francisella tularensis

en liebres de la Comunidad Foral de Navarra

Olivia Gironés, Ignacio de Blas*, Marta Gil, Félix Royo,Rafael Claver y Jesús orós

Unidad de Patología Infecciosa y Epidemiología . Facultadde Veterinaria . Universidad de Zaragoza . cf Miguel Servet177. 50013 Zaragoza (España)' Autor de contacto : e-mail : deblasioosta.unizar .es.

Resumen

La Tularemia o Febre dei Conejo es una infec-ción natural de roedores y lagomorfos transmi-sible al hombre producida por FrancisellatUlarenSis, de gran importancia sanitaria y cre-ciente incidencia, tanto en animales como enel hombre, en distintas comunidades autóno-ma españolas . En este estudio se establececomo objetivo determinar la presencia de FFtularenSis en lagomorfos en la ComunidadForal de Navarra (España) . Para ello se incuba-ron 198 muestras en medio Thayer Martin mo-dificado a 37°C en atmósfera de aerobiosis du-rante 2-4 días . De las 198 muestras cultivadasno se obtuvo ningún aislamiento positivo loque no nos permiten asegurar la ausencia dedicho patógeno en la Comunidad Foral de Na-varra, aunque globalmente se puede esperaruna prevalencia máxima del 1,5% .

Abstract

Tularemia o Rabbit Fever is a natural infectionof rodents and lagomorphs, that is able totransmit to human, and it is produced byFrancisella tularensis . l t is very important dueto its health impact and increasing incidencen some regions of Spain. The aim of this studyis to determinate presente of FF tularensis i nagomorphs in Comunidad Foral of Navarra(Spain) . 198 samples were Incubated InThayer Martin modificated medium at 37°C inaerobiosis during 2-4 days. AII of the 198samples were negative and this result doesn'taillow us to ensure the absence of thispathogen in Comunidad Foral of Navarra, but itwill be possible a maximum global prevalenceof 1 .5%_

1 ntroducción

La Tularemia o Fiebre del Conejo es una infec-ción natural de roedores y lagomorFos transmi-sible al hombre producida por FrancIsellatularensis, que fue descrita por vez primera en3apón en 1837, aunque su nombre se debe ala descripción en 1911 de una plaga en ardi-l ¡as de campo en el condado de Tulare(California) y al subsiguiente trabajo de carac-terización realizado por el Dr . Edward Francis .

Frrnrc:i.cc•llct rrrlerrc rr .ri.3 es una bacteriacocobacilar Gram negativa de 0,2 a 0,7 mmde longitud y 0,2 mm de diámetro. Es inmóvil,no esporula y es aerobia estricta .Bioquímicamente es casi siempre catalasa po-sitiva, oxidasa negativa, nitrato reductasa ne-gativa, acidifica lentamente, fermenta losazucares sin producción de gas y no produceácido sulfhídrico en el medio TSI (Triple Sugar

¡ ron). Además es ureasa negativo, indol negati-vo y no hidroliza la gelatina .

Todas las cepas presentan el mismo comporta-miento antigénico, pero se diferencian tantopor su virulencia como bioquímica yecológicamente.

Las formas virulentas de FF tularensis estánenvueltas en una cápsula de 0,02 a 0,04 mmde grosor que no afecta a su viabilidad peroque si condiciona su virulencia, ya que los por-centajes de lípidos de la pared y de la cápsulano son los habituales para una bacteria Gramnegativa, de tal forma que la naturaleza de losácidos grasos caracteriza el poder patógeno deFrancisella.

Epidemiológicamente se puede clasificar endos tipos principales : el Tipo A (FF tularensisvariedad tularensis) que es más virulento (co-nejos y humanos) y se localiza en EE .UU . y elTipo B (FF tularensis variedad palaeartica) queprovoca una infección más leve . Además se hadescrito otra cepa no incluida en esta clasifi-cación : FF tularensis variedad mediasiatica.

Bioquímicamente se diferencian en que FFtularerrsis subesp, trslare>asi.r : es sensible aeritromicina, diversos macrólidos ylincomicina, acidifica la glucosa, el glicerol, lamaltosa y es citrulin-ureidasa positiva, mien-tras que FF lulcererrsi .+' subesp . Irrrlr~~rrritcr (quese divide en tres biovares todos ellos citrulinureidasa negativos), dé los cuales las cepasbiovar 1 son sensibles a la eritromicina,acidifican la glucosa y la maltosa pero no elglicerol, las cepas biovar II son resistentes a laeritromicina,

diversos

macrólidos yii ncomicina, acidifican la glucosa, maltosa yglicerol y por último las cepas biovar Japonicason sensibles a la eritrornicina, acidifican laglucosa, maltosa y glicerol . Por último FFrr.rhrr'e tsi .+ subesp . rrre cli~r.+larle cr es sensible ala eritromicina, acidifica el glicerol y en la ma-yoría de los casos no acidifica la glucosa nimaltosa y es citrulin ureidasa positiva .

Se estima que puede afectar a unas 145 espe-cies de vertebrados como lagomorfos (conejosy liebres), roedores (microtinos . . . ), insec-tívoros, carnívoros (castores), ungulados,marsupiales, aves, anfibios, peces, . . .

Entre las 111 especies de invertebrados en lasque se han detectado, se encuentran : pulgas,chinches, mosquitos, tábanos, garrapatas(AmbIN,omrna, I)errncac'entot; Haemcr~la~ ralí,r,

ixodes y Dmitl7ocloros, se ha observado quetrasmiten la enfermedad a la descendencia) . . .también en amebas, lo que explicaría su eleva-da supervivencia en agua y lodo (Mórner,1992) .

En la liebre, la sintomatología de esta enfer-medad es muy llamativa y se caracteriza ini-cialmente por fiebre, apatía y posición de bola .Luego evoluciona provocando incoordinaciónde movimientos, crisis de excitación con rechi-nar de dientes y muerte en pocos días (3-4días) . Las lesión más habitual es la apariciónde focos de necrosis gris blancuzcos de tama-fío variable (punteado disperso a varios milíme-tros de diámetro) sobre la superficie del híga-do, bazo y ganglios linfáticos que

microscópica mente presentan un área centralde necrosis caseosa rodeada por una zona deii nfocitos con neutrófilos y macrófagos . Ade-más se ha observado con cierta frecuenciatrombosis de pequeños vasos sanguíneos .

En el perro, la enfermedad cursa con tempera-tura corporal de 39,4-40,6°C, descargasnasales y oculares, abscesos en zonas de in-yección, sarpullidos en regiones axilares einguinales y recuperación espontánea sin trata-miento. En el gato, la enfermedad cursa conapatía fiebre y anorexia. En el resto de las es-pecies, se presenta como una afecciónganglionar con manifestaciones poco clarascomo fiebre, ligera disnea, tos y diarrea(Alonso et cd. . En todos los casos laslesiones son semejantes a la liebre oinaparentes .

El hombre es sensible a padecer la enferme-dad que comienza, tras un periodo deincubación de 3 a 5 días (de l a 14 días), confiebre, mialgias, escalofríos, malestar y fatigacreciente en la mayoría de infectados

Se han detectado diferentes formas clínicasdependiendo de la forma de contagio y virulen-cia de la cepa infectante : ulceroganglionar(con lesiones ulcerativas de la piel yi i nfoadenopatia, se presenta en 75-85% de loscasos), ganglionar (con fiebre y linfoadenopatíasin ulceración, en el 5-10% de los casos), ti-foidea (fiebre, postración y pérdida de peso sinli nfoadenopatia, en el 5-15% de los casos),oculoganglionar (con conjuntivitis unilateral yi i nfoadenopatia cervical o preauricular, en el1-2°/% de los casos) y orofaríngea(faringotonsilitis, amigdalitis unilateral doloro-sa con fiebre y linfoadenopatía cervical demaxilares y yugulocarotídea, es extremadamen-te rara) .

Las complicaciones pleuropulmonares sei ncrernentan en 30-80% en casos tifoideos yde 10-15% en casos ulceroganglionares . Y hayque indicar que la tasa de mortalidad es alta

cuando se presentan este tipo de complicacio-nes pleuropulmonares y en la forma tifoidea dela enfermedad . De forma que si no se instaura

un tratamiento efectivo, la tasa de mortalidad

es del orden de 0,1% en Europa (infecciones

debidas a F, tularensis subesp . holoarctica)pero en América del Norte alcanza un 6% (in-

fecciones por F tularensis subesp. tularensis)

JustificaciónEn Estados Unidos son descritos anualmenteaproximadamente 1.50 a 300 casos deTularemia, reportándose un incremento en suincidencia en los últimos 50 años, debido aque en invierno la transmisión se produce porlos conejos y en verano es vehiculado por lasgarrapatas .

En Francia se detectó por primera vez en1946, aunque originado por cepas menos viru-lentas que las estadounidenses, y en España,el primer caso fue descrito en Castilla-León en1997 aunque se sospecha que con anteriori-dad pudiera haber sido la causa de diversasmortandades de liebres sin que se llegara aconfirmarse la implicación del patógeno .

Posteriormente se diagnosticaron casos en hu-manos relacionados con el cangrejo rojo{Proc[xrnhurus clarkii) en Cuenca en julio de1998 y aunque se identificaron anticuerposfrente a Francisella tuLarerasis no se pudo ais-lar el agente . El último caso reportado en hu-manos se ha producido en un cazador del PaísVasco a principios del año 2000 aunque sedesconoce el lugar exacto en el que se pudoi nfectar.

Así pues debido a la importancia sanitaria y ala creciente incidencia de la Tularemia, tantoen animales como en el hombre, en distintascomunidades autónomas se establece comoobjetivo del presente estudio determinar lapresencia de i : tularerasr.c en lagomorfos en laComunidad Foral de Navarra .

Material y métodos

A. Técnica de diagnóstico

La metodología utilizada para el diagnóstico dela enfermedad se basa en el diagnóstico dife-rencial anatomopatológico con pseudotubercu-losis (si se presentan lesiones macroscópicasen caso de animales), el aislamiento dei micro-organismo y la diferenciación microscópicacon BruCella con la que puede dar reaccionescruzadas. Se deben realizar las técnicasbioquímicas antes nombradas para diferenciarlas distintas cepas .

El aislamiento de esta bacteria es difícil sien-do indispensable para su crecimiento, a excep-ción de algunas cepas, la presencia de cisteinao de cistina y favorece el crecimiento Inclusode otras especies de FranCisella que no produ-cen esta enfermedad, por ejemplo FF noviCida .De tal forma que los principales medios decultivo utilizados para su aislamiento y multi-plicación son : Francis, Mc Coy y Chapin, glu-cosa-cisteina-peptona, agar chocolate enrique-cido con Isovitox y/o Thayer Martin modificado(que fue el seleccionado en nuestro caso y tie-ne como base agar corazón cistina al que se leañade hemoglobina al 2% en polvo soluble yun suplemento de Vitox en las proporciones re-comendadas) .

Se incuba a 37°C en atmósfera de aerobiosisdurante 2-4 días (aunque puede prolongarsehasta 10 días) y se observa la aparición de co-lonias es de 2 a 3 mm en FF tUlarensis y de 4 a6 mm en FF novicida .

En medio de Thayer Martin modificado, las co-lonias son verdosas, viscosas o gelatinosas, li-sas y las colonias tienden a converger. Sin em-bargo el color y la morfología de estas coloniaspuede variar según el medio de forma que enmedio de glucosa-cisteina-peptona, las colo-nias son redondeadas, lisas, ligeramente visco-sas, de color blanco grisáceo y entorno a ellashay un halo de coloración verdoso y en agarchocolate enriquecido con Isovitox, las colo-nias son blancas y lisas .

A las colonias sospechosas o compatibles conla morfología típica de Francisella spp, se rea-l izaron pruebas bioquímicas y serológicas es-pecíficas como siembra en medio deMcConkey, tinción Gram y pruebas de aglutina-ción con antisuero frente a FF tularenSis a dis-tintas diluciones .

Además hay que tener en cuenta que ciertascepas de la especie Francisella y deFrancisella tularensis que son atípicas : no exi-gentes de cisteina o cistina (Bernard etal .,1994) y otras cepas oxidasa negativas, concrecimiento positivo en agar sangre, glicerolnegativas y citrulin ureidasa positivas .(Clernolge et al., 1996) .

En la actualidad se disponen de primers espe-cíficos para FF tularensis para la aplicación deI a PCR (Polimerase Chain Reaction) que detec-ta el 16sRNA mitocondrial de la bacteria, yque presenta mayor fiabilidad y sensibilidad .

B. Muestra utilizada

Al tratarse de un estudio con voluntarios no seplanteó a priori la determinación del tamañode muestra necesario para la detección de laenfermedad . Para la selección de la muestrase ha contado con la colaboración del Serviciode Guardería de la Comunidad Foral de Nava-rra y Sociedades de Cazadores que aportaronlos animales cazados en 39 términos munici-pales distintos de la Comunidad Foral durantelos meses de noviembre y diciembre (tempora-da de caza) de los años 1998, 1999 y 2000correspondiendo a un total de 198 muestrasde hígado y en algunos casos aislados de bazoy pulmón, aunque hubo que desechar 12 delas muestras por encontrarse en mal estado(tabla I) .

La distribución geográfica de los términos mu-nicipales de donde proceden las muestras seplasma en la figura 1, y se puede constatarque la mayoría de los muestras corresponden ala zona media de Navarra y ribera del Ebro .

Las muestras tomadas se remitieron congela-das al laboratorio de la Unidad de PatologíaInfecciosa de la Facultad de Veterinaria de laUniversidad de Zaragoza donde se procedió asu procesado según las técnicas diagnósticasanteriormente comentadas .

C . Cálculo de la prevalencia máxima posible

Suponiendo que las zonas descritas mantienenpoblaciones homogéneas de un mínimo de500 liebres, podemos calcular según la fórmu-la, Implementada en el programa Win Episcope2.0 (Thrusfield et al., 2001) y que se ofrece acontinuación, el porcentaje máximo de anima-les positivos que pueden quedar en la pobla-ción con un 95% de nivel de confianza :

-D= 1-(1-NC)e

N n21

Jdonde D es el número máximo de animalespositivos en la población, NC es el nivel deconfianza expresado en tanto por uno (0,95), nes el número de diagnósticos negativos y N esel tamaño de la población estudiada .

Resultados

De las 198 muestras cultivadas, sólo 7 mostra-ron colonias morfológicamente compatiblescon FF tularensis y una vez realizadas las prue-bas de identificación con el antisuero específi-co en ningún caso se obtuvo aglutinación posi-tiva a FF tularensis, por lo que se concluye queno se obtuvo ningún aislamiento positivo entretodas las muestras remitidas .

Para avanzar en el estudio, se optó por agrupar

los datos obtenidos en cinco zonasecológicamente similares correspondientes aribera baja del Ebro, ribera alta del Ebro, zonamedia oriental (río Aragón), zona media occi-dental (ríos Arakil y Arga) y valle de Baztán . Deesta forma se obtuvo la agrupación de datosque se observa en la tabla II, y en la figura 2se muestran gráficamente los resultados obte-nidos según un gradiente de color .

Conclusiones

No se ha detectado el agente etiológico de laTularemia (Francisella tularensis) en ningunade las 198 muestras recogidas durante losaños 1998, 1999 y 2000 . Estos resultados nonos permiten asegurar la ausencia de dichopatógeno en la Comunidad Foral de Navarra,aunque globalmente se puede esperar una pre-valencia máxima del 1,5% en función de losresultados globales obtenidos .

Esta comunidad presenta una densidad de po-blación de liebres heterogénea debido a sugran diversidad de hábitats que se presentanen la misma . Las muestras obtenidas procedenen mayor número de aquellas zonas donde laexplotación cinegética es mayor lo que nospermite ofrecer unos resultados más precisos,de tal forma que en las zonas correspondientesa la ribera del Ebro se establece una menorprobabilidad de presencia de este patógeno,frente a las zonas medias y valle del Baztándonde dicha probabilidad es mayor debida almenor tamaño de la muestra recogidas, lo queharía preciso un mayor número de muestraspara obtener una grado de seguridad sanitariamás alto, por lo que en la actualidad se estánllevando a cabo estudios más exhaustivos .

Tórmino municipal 1998Ablitas 0

Aibar

0

3

Altsasu

0

4

5

6

7

8

Andosilla

Aranguren---- ------------ - ----------- ---Arroniz

Azagra

Bargota

8Baztan

4----- ---10

Berrioplano

0

11

Burgui

0

21

Fustiéana22

Huarte-Arakil

23 Imoz

24 Lerin

25 Liedena26 Lodosa 0

27

Los Arcos

0

8

1

12

Caparroso

6

4

10

13

Carcastillo

0

2

0

2

14

Cascante

4

0

15

Cintruenigo

1

4

16

Corella

2

2

5

17

Egáes

18

Falces

19

Fontellas

0

4

4

0

0

9

34

San Adrian

35

Sangáesa

36

Santacara

37

Sesma

38

Tafalla

39

VianaSin identificar

Total* Origen desconocido

45

1

4

2

8

2

0

1

9

2

0

0

8

64

1

15

9

12

5

9

1

2

9

1

30 Peralta 4

31 Pitillas 0

4

32 Ribaforada 0

0

Figura 1 . Tórminos municipales de procedencia de las muestras (La codificaciún corresponde a la indicada en la tabla 1)

Figura 2. Prevalencia máxima de tularemia en liebres de la Comunidad Foral de Navarra

Algunas consideraciones sobre la influencia deltamaáo muestra) al estimar el impactode las enfermedades en cunicultura

Ignacio de Blas*, Olivia Gironós, Imano) Ruiz, ]osó Luis Alonso y losó Luis Muzquiz

Unidad de Patologéa Infecciosa y Epidemiologéa . Facultad de Veterinaria . Universidad de Zaragoza. c/ Miguel Servet177. 50013 Zaragoza (Espaáa)* Autor de contacto ; e -mail : deblas@posta.unizar.es

ResumenEl objeto del presente trabajo es poner de manifiesto la importancia clave de los mótodos demuestreo en el diseáo de los experimentos orientados a dos objetivos búsicos : la determinaciín dela prevalencia de una enfermedad y la detecciín de la misma .

La representatividad de una muestra viene determinada por dos condiciones búsicas : aleatorIedad [todos los animales de la poblaciín tienen que tener la misma probabilidad de formar parte de lamuestra) y homogeneidad (debe conservar las proporciones que se guardan en la poblaciín en loreferente a sus caracterésticas esenciales) . Para ello es importante utilizar un correcto mótodo demuestreo y seleccionar un tamaáo de muestra adecuado .

Por eso consideramos la necesidad de conocer la existencia de posibles errores de muestreo, lautilizaciín incorrecta de los datos obtenidos para fines distintos para los que inicialmente serecogieron, el cúlculo del error aceptado, la realizaciín de muestreos estratificados y el ajuste deltamaáo muestra)

AbstractThe objective of thIs contribution is to describe the capital importance of sampling methods whenwe design an experiment oriented to two basic targets : determination of disease prevalence anddetection of disease .

Representativity of a sample is determinated by two basic conditions : randomize (each animal hassame chance of taking part of the sample) and homogeneIty (proportions of intrinsic characteristicsof population must be similar in the sample) . For this reason it is important to use a correctsamplIng method and to select an adequate sample sIze .

So we consider than it is necessary to know the existence of possible sampling errors, incorrect useof data collected, calculation of accepted error, making stratified samples and to adjust sample size .