Estabilización de enzimas mediante

métodos de inmovilización

Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores

Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas

MECANISMOS DE INACTIVACIÓN DE ENZIMAS

+ + +

Alta temperatura Disolventes pHs extremos

M. acuoso pH neutro 4º C

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE PROCESOS DE INMOVILIZACIÓN

Rigidificación de la estructura 3-D Estabilización de la estructura cuaternaria

Curso Posgrado 2012

+

RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D

ESTABILIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA

MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN

Curso Posgrado 2012

Muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores muy cortos Soporte rígido

Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionarte

ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL

ESTABILIZACIÓN 3-D

COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES

Curso Posgrado 2012

Inmovilización – estabilización enzimas multiméricas

- inmovilización intensa multisubunidades - entrecruzamiento con polialdehidos

Curso Posgrado 2012

CHO CHO CHO CHO

CHO CHO CHO

entrecruzamiento con polialdehidos

J. Mol. Catal. B- Enzym.1999. 7, 181-189.

inmovilización intensa multisubunidades

94000

67000

43000

30000

1 2 3 4 5

Desorción de sub-unidades de derivados inmovilizados de extractos crudos de E. coli sobre Sepabeads epóxido

2.- Extracto crudo

3.- Desorción después de

inmovilización a pH 7.0

4.- Desorción después de

incubación a pH alcalino

5.- Desorción después de

tratamiento con polialdehidos

Estabilización de “todas” las proteínas multiméricas

+ SDS – 100 º C

Curso Posgrado 2012

0

25

50

75

100

0 10 20 30 40 50

Tiempo, (h)

% a

cti

vid

ad

Estabilización de acilasa de A. turbidans

Condiciones: pH 6.5 25º C

Curso Posgrado 2012

RESULTADOS PREVIOS

+

+

J. Mol. Catal. B- Enzym. 2001. 11, 633-638

Biomacromolecules. 2001. 2, 95-104

Biotechnol. Progr. 2001. 17,537-542

J. Mol. Catal. B- Enzym. 1999. 7, 173-179.

0

25

50

75

100

0 1 2 3 4 5

Tiempo

Acti

vid

ad

rem

an

en

te

Curso Posgrado 2012

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES

Soportes glioxil

Inmovilización de las dos subunidades a través de la región más rica en lisinas Inmovilización a pH 10

Guisán. Enzyme Microb. Technol. 1988 10, 375-82

O CH2 C

O

H

Curso Posgrado 2012

+

Inmovilización de solo una subunidad por la región más rica en lisinas

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES

Curso Posgrado 2012

Objetivo planteado: máxima estabilización posible de todas las enzimas multiméricas

Desarrollo de una nuevo tipo de soportes heterofuncionales a medida y protocolos de inmovilización en varias etapas

Grupos capaces de adsorber multiméricas involucrando el máximo numero de subunidades a pH 7…….orientación correcta

Grupos CHO …………………Unión Covalente Multipuntual muy intensa, a través de los grupos aminos, a pH 10

Curso Posgrado 2012

ESTUDIO DEL PROCESO DE ADSORCIÓN

Adsorción multipuntual involucrando varios

residuos en la superficie de la proteína

N+

COO

COO

Me +2

-

-

NH3

+

COO-

Curso Posgrado 2012

J. Chromatogr. A. 1059, 89-94.

Enzimas grandes adsorbidas por regiones muy grandes

- - -

-

ADSORCIÓN DE ENZIMAS GRANDES SOBRE SOPORTES POCO ACTIVADOS

Curso Posgrado 2012

HIPÓTESIS

Adsorción multipuntual y multisubunidades

Adsorción multipuntual de una sola subunidad

Curso Posgrado 2012

DISEÑO DE NUEVOS SOPORTES HETEROFUNCIONALES PARA LA INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL Y MULTISUBUNIDADES DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS

Mínimo de grupos que permite adsorción a pH 7: Garantía de mayor superficie Muchos grupos CHO que no unen a pH 7 y unen a pH 10 para UCM

N+

COO

COO

Me +2

-

-

NH3

+

COO-

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

Curso Posgrado 2012

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

Incubación a pH alcalino Union covalente suave

pH neutro Adsorción a pH neutro

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

Curso Posgrado 2012

INGENIERÍA GENÉTICA DE ENZIMAS DE ESTRUCTURA 3-D CONOCIDA

SH

SH

SH

SH

HS

HS

Curso Posgrado 2012

SH

S S

UCM amino-glioxil a pH alcalino

SH

S S

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

S SR

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

SH

S H

Inmovilización a pH neutro por intercambio tiol disulfuro

Curso Posgrado 2012

S S

Orientación deseada + Unión Covalente Multipuntual

S S S S

Curso Posgrado 2012

VALIDEZ PARA OTRAS ENZIMAS MÁS COMPLEJAS

Enzimas más complicadas… tratamiento con polímeros

Curso Posgrado 2012

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS DE MICROORGANISMOS TERMÓFILOS

Mesófilo Vs termófilo Unión unisubunidad Vs multisubunidades

Unión unipuntual Vs multipuntual

DERIVADOS MÁS ESTABLES

Enzima de mesófilo

Enzima de termófilo

Curso Posgrado 2012

Unión de enzimas con varios aminos terminales a soportes activados con grupos glioxil pH 7

Hipótesis multiméricas:

NH2

NH2

pH 8

NH2

Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8

Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

CLEAs

PREPARACIÓN DE CLEAs

Agente entrecruzante

precipitante PEG

sales, disolventes

Curso Posgrado 2012

CLEA: Disociación de subunidades no es posible

Inmovilización convencional de enzimas: Disociación de subunidades es posible

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Clea1/10

Clea1/100

soluble1/10

soluble1/200

Efecto de la dilución en la estabilidad térmica de CLEA catalasa de M. lysodeiktycus

Tiempo (h)

Act

ividad r

esidua

l (%

)

Condiciones experimentales: 60ºC , pH 7, 10000 IU/ml

Curso Posgrado 2012

BIOTRANSFORMACIONES ENZIMÁTICAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES

Aumentar la concentración de sustratos poco solubles. Evitar etapas de cristalización, realizando la biotransformación en presencia de agua saturada de disolvente. Desplazar equilibrios hacia la síntesis. Modificar la selectividad de las enzimas al inducir cambios en la conformación y en el mecanismo de reacción.

PROBLEMA: INESTABILIDAD DE LAS ENZIMAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES

Curso Posgrado 2012

INACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS EN PRESENCIA DE MEZCLAS AGUA-DISOLVENTE ORGÁNICO (pH neutro y baja Tª)

No se produce modificación química No es posible agregación (enzima inmovilizada) No existe inactivación por interfase hidrofóbicas CAUSA DE INACTIVACIÓN: Cambios conformacionales inducidos por el disolvente.

Enzima desnaturalizada

Enzima hidratada

Enzima interacciona

con disolvente

Codisolvente

Medio acuoso

pH 7 4’C

Curso Posgrado 2012

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS

AUMENTO DE LA ESTABILIDAD DERIVADO ENZIMÁTICO

GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIPER-HIDROFÍLICOS

Presencia de disolventes en el entorno enzimático

REDUCCIÓN DE:

Cambios conformacionales en la estructura enzimática

RIGIDIFICACIÓN

Curso Posgrado 2012

Estabilización de la enzima por UNIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL

Rigidificación 3D

Reduce los cambios conformacionales inducidos

por cualquier agente distorsionante

A través de:

varios residuos de la enzima

unidos por brazos espaciadores cortos al soporte

A/ REDUCCIÓN DE LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES EN LA ESTRUCTURA ENZIMÁTICA

Curso Posgrado 2012

B/ REDUCCIÓN DE LA PRESENCIA DE DISOLVENTES EN EL ENTORNO ENZIMÁTICO

Generación capas hidrofílicas protegiendo a cada molécula de enzima:

Estructuras muy abiertas (permitan paso S y P) polímeros no estructurados Capa altamente hidrofílica (fenómenos de “reparto” = disminución % disolvente en el entorno de la enzima)

S

P 90% CODISOLVENTE 30%

Curso Posgrado 2012

GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIDROFÍLICOS ALREDEDOR DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS

Unión covalente multipuntual Generación de micro-ambientes

+ =

Derivado PGA-glioxil-agarosa (estabilizado)

Curso Posgrado 2012

COINMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA CON POLÍMEROS HIDROFÍLICOS POLIFUNCIONALES NO ESTRUCTURADOS

Características generales: altamente hidrofílicos estructuras abiertas y flexibles contienen gran cantidad de grupos funcionales capaces de generar microambientes hidrofílicos en torno a cada molécula de enzima

Tipos: A/ Polietilenimina (PEI) B/ Dextrano aldehído C/ Dextrano sulfato

Condiciones de inactivación: Alta concentración de disolvente orgánico (80,90%,…) Baja temperatura (4º C) pH neutro

Curso Posgrado 2012

A/ POLIETILENIMINA (PEI)

2/Los grupos amino ionizados pueden adsorberse sobre:

Polímeros poli-aniónicos Proteínas

NH3+ NH

2+ NH +

1/Los grupos amino primarios pueden reaccionar con:

Grupos aldehído en el soporte Grupos aldehído de polímeros + + + + +

+ +

+ + +

+ +

+ - NH2 - NH2

- NH2 - NH2

Curso Posgrado 2012

B/ DEXTRANO - ALDEHÍDO

Reaccionan con grupos amino primarios de:

Soportes Polímeros con aminos primarios (PEI) Proteínas

CHO

CHO CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

CHO

Curso Posgrado 2012

C/ DEXTRANO- SULFATO

Se adsorben a: • Proteínas • Polímeros policatiónicos (PEI)

“sal polimérica” extremadamente hidrofílica

-O-SO3-

-O-SO3-

-O-SO3- -O-SO3

-

-O-SO3-

-O-SO3-

-O-SO3-

-O-SO3-

Curso Posgrado 2012

OPTIMIZACIÓN DEL DERIVADO ENZIMÁTICOS CON MICROAMBIENTES HIDROFÍLICOS

Coinmovilización de PGA y Polietilenimina de distinto tamaño: NO ESTABILIZACIÓN

PGA no interacciona con soportes modificados con PEI

DISOLVENTE ORGÁNICO

PGA

Polietilenimina

Curso Posgrado 2012

Modificación de derivados de PGA con PEI- dextrano sulfato:

ESTABILIZACIÓN MUY MODERADA

La capa hidrofílica es muy fina y no cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA

DISOLVENTE ORGÁNICO

PGA

Dextrano sulfato

Polietilenimina

Curso Posgrado 2012

Modificación de derivados de PGA con PEI-dextrano aldehído: ESTABILIZACÓN ELEVADA

INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0

PEI 60 KD

PEI 25 KD

PEI 1000 KD

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Tiempo (horas)

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

resi

du

al (

%)

Curso Posgrado 2012

DISOLVENTE ORGÁNICO

PGA

Dextrano aldehido

Polietilenimina

La capa hidrofílica cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA Curso Posgrado 2012

PROTOCOLO OPTIMIZADO

1º- Inmovilización covalente multipuntual

2º- Coinmovilización con PEI 3º- Reacción entre PEI y dextrano-aldehído (varias capas)

4º- Formación de sales poliméricas con dextrano sulfato

Curso Posgrado 2012

DERIVADO FINAL ÓPTIMO

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400 500

Tiempo (horas)

Act

ividad e

nzim

ática

residua

l, (%)

INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0

3 capas + Dextrano sulfato (75% actividad recuperada)

Glioxil-PGA

Eupergit-PGA comercial

1 capa

Curso Posgrado 2012

Estrategia de estabilización válida para varias enzimas (PGA, esterasas,...) y varios soportes (p.e. Sepabeads, agarosa,...) RIGIDEZ + HIDROFILIZACIÓN = DERIVADO CON ALTA ESTABILIDAD FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS (6 órdenes de magnitud mayor con respecto al derivado Eupergit-PGA comercial)

PGA

Dextrano sulfato

Polietilenimina

Dextrano aldehido

DISOLVENTE ORGÁNICO

DERIVADO HIDROFILIZADO

Curso Posgrado 2012

INACTIVACION DE ENZIMAS EN CONDICIONES QUMICAMENTE INERTES, disolventes, pH y temperaturas suaves.

Distorsión de la estructura 3D: estructura primaria inalterada

Uso de disolvente industrial

Desplegamiento Urea

Guanidina

Replegamiento pH 7.0 25ºC Agua

REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INACTIVADAS

Curso Posgrado 2012

0

25

50

75

100

0 10 20 30

8M Guanidine

Water

Completa 24 h reactivación. 30 min reactivación

Desplagamiento-replegamiento

Time (days)

Re

sid

ual

act

ivit

y, (

%)

REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS-ESTABILIZADAS TRAS INACTIVACIÓN EN DISOLVENTE

Curso Posgrado 2012

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

INACTIVATION BY HEAT

8 M guanidine

No guanidine

Reactivación del derivado glioxil de la BTL

Tiempo (h)

% a

ctiv

idad

Curso Posgrado 2012