espectroscopía uv-vis-nir agilent-cary. en la vanguardia ... · biología. actividades...
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Espectroscopía UV-Vis-NIR Agilent-Cary. En la
vanguardia de la Tecnología.
Madrid, 28 de septiembre 2011
October 5, 2011
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2
Algunas características de la espectroscopía
UV-Vis
• Es una técnica de uso general en los laboratorios.
C O
H
H
x x Ejempo sencillo x =
=
= n
• Es una técnica madura y
fiable
Cary 14 UV-Vis-NIR (1954) • Es económica.
• De manejo sencillo
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!!Entonces!! ¿Que podemos aportar en UV-Vis?
Dar solución a las nuevas demandas de los investigadores y empresas y a los
nuevos métodos de análisis que se siguen desarrollando.
Biotecnología.
Nuevos materiales/catalizadores/nanotecnologías.
Farmacia/Control de calidad.
Mayor productividad.
Análisis de microvolúmenes.
Análisis “in situ”.
Análisis de muestras sólidas.
Línea de productos Agilent UV-Vis y fluorescencia
Cary 60
Cary 100/300 Cary 4000/5000/6000i
Cary Eclipse
DAD 8453
!! NUEVO Cary 60!!
Características principales
Lámpara de Xenon pulsante
Inmune a la luz ambiental
Microvolúmenes, fibras ópticas. Traycell.
Gran velocidad de adquisición de datos.
80 puntos por segundo
Gran velocidad de barrido
24000 nm/min
Intervalo de trabajo. 190-1100 nm
SBW fijo de 1.5 nm
Cumple farmacopea.
Intervalo fotométrico: 3.5 UA
Ruido fotométrico: <0.005 a 500nm y 2uA
Estabilidad fotométrica: < 0.0004 a 500 nm
Soft de alto nivel: Cary Win 5.0
Cary 60 Puntos clave
Carácterísticas analíticas superiores. Nueva electrónica de bajo nivel de ruido
Detector bastante cercano a la muestra
Adaptado a muestras turbias que generan dispersión de luz
Exactitud y linearidad fotométrica
usando materiales certificados
medidos a 590 nm
TECHNICAL NOTE AVAILABLE
5990-7948EN Superior linear range (>3.5 Abs) of the Agilent Cary 60 Uv-Vis
Inmunidad luz ambiente No restricciones debidas al tamaño de la muestra
Mayores posibilidades para desarrollar medidas con accesorios.
Ej Fibras ópticas – mejor exactitud, linearidad y
reproducibilidad.
R² = 0,9934
R² = 0,9934 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 50 100 150 200 250
Abs
mg/L
Closed
Open
Measuring KMnO4 in a cuvette with the sample compartment open and closed
Cary 60 Puntos clave
Fibras Opticas No hay necesidad para cubetas caras
Mejora la productividad del laboratorio llevando el instrumento a la
muestra.
Posibilidad de medir muestras frías, calientes o irregulares “in situ”
Análisis “in
situ”
Mejora la
productividad
y minimiza la
preparación
de muestra
APPLICATION NOTES AVAILABLE:
5990-7863EN Measuring purity of low volumes of DNA at 4 ºC with fiber optics microprobe
5990-7945EN Determination of drug tablet concentration in pharmaceutical applications for drug development
5990-7864EN Simple, automated measurements of the photocatalytic properties of colorimetric species
Cary 60 Puntos clave
No foto-degradación de muestras sensibles a la luz Medida de muestras biológicas o estudios de reacciones
fotoquímicas.
APPLICATION NOTES AVAILABLE:
5990-7862EN Eliminate photodegradation of aromatic markers used in UV-Vis
5990-7864EN Simple, automated measurements of the photocatalytic properties of colorimetric species
SI-A-1251 Investigation of photochemical reactions
SI-A-1200 Investigation of the photo-kinetics of a platinum organoamine complex
Ausencia de
fotodegradación de
marcadores
colorimétricos
(azul de metileno, 664
nm)
Cary 60 Puntos clave
Medida de microvolúmenes de muestras líquidas con mayor
precisión y reproducibilidad Muestras químicas o biológicas valiosas
Barridos múltiples de una
muestra de DNA. Demuestra la
tremenda reproducibilidad del
Cary 60 usando solo 3 L de
DNA
APPLICATION NOTES AVAILABLE
SI-A-1219 Practical Limits of DNA Quantitation in Microliter samples
5990-7863EN Measuring the purity of low volumes of DNA at 4 ºC with fiber optics microprobe
Cary 60 Puntos clave
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Hellma TrayCell – linearity
Delivers good linear
performance to 2.3abs
Hellma TrayCell 10mm cuvette 1.0mm cap 0.2mm cap
max abs 3.5 abs 2.3 abs 2.3 abs
dilution factor 10x 50x
equiv abs 23 abs 115 abs
No dilution necessary 0 to 115 abs!
La adquisición de datos más rápida (24,000 nm/min; 80
puntos/seg) Barridos de long de onda o cinéticas puntuales
Posibilidad de estudiar reacciones completas en segundos
Seguimiento del decaimiento
rápido de un compuesto verde
APPLICATION NOTE AVAILABLE
SI-A-1177 Monitoring fast reactions using Stopped Flow Kinetics
Cary 60 Puntos clave
ANALISIS DE MUESTRAS EN DISOLUCIÓN:
AGILENT 8453 DAD
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Características principales
Velocidad de adquisición de datos.
10 puntos por segundo
Intervalo de trabajo. 190-1100 nm
SBW fijo de 1.0 nm
Cumple farmacopea.
Intervalo fotométrico: 3.0 UA
Luz difusa:0.05% a 220 nm método ASTM
Ruido fotométrico: <0.0002 a 500nm y 0uA
Estabilidad fotométrica: < 0.001 a 500 nm
Tiempo típico de barrido. 1.5 seg
Agilent 8453 How it works
Grating
Slit
1024 element
diode array
Lens
Cell
Deuterium lamp
Tungsten lamp
Lens
Shutter
Agilent Confidential
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Campos de aplicación
Medio ambiente.
Nitratos, nitritos, amonios, fosfatos, boro, color.
Todo tipo de ensayos colorimétricos.
Química.
Síntesis química, cinéticas.
Biología.
Actividades enzimáticas.
Km, Constantes de inhibición. Cooperatividad.
Desnaturalización de DNA y proteínas.
Ratio, DNA/proteína.
Interacciones, stop flow.
Abs
Cinética de reacción con stop-flow .
Cuantificación de cromo hexavalente
Cuantificación de ácidos nucleicos/proteína en microvolúmenes
! Pero en ocasiones esto no es suficiente!
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A veces, en estudios cinéticos, los blancos no son estables a lo largo del
tiempo.
En ocasiones las muestras son complejas y es conveniente restar la
contribución de la matriz.
Cuando se requiere una mayor resolución en los espectros, o medir con
absorbancias altas o muy bajas.
A veces es interesante “resaltar las diferencias entre dos muestras”
O es necesario un control perfecto de la temperatura.
O las muestras son muy turbias, incluso sólidas y dispersan la luz.
Es necesario mayor productividad en control de calidad
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Monocromador
Referencia
Muestra
Divisor de
haz
Esquemas ópticos UV-Vis de haz doble
Cary 100
Cary 300
El SBW de el Cary 300
es completamente variable
entre los 0.2 y 4 nm en pasos de
0.1nm
Rendijas variables
La misma muestra medida con
SBW de 0.2, 2.0 y 4.0 nm.
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS LIQUIDAS O
SOLIDAS: VARIAN CARY 100/300
Mínima luz difusa: Amplia linealidad fotométrica
Muestras de
KMnO4 desde 10
mg/l a 450 mg/l
Algunas aplicaciones
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Espectro en un UV-
Vis convencional
2
0
Comercial Agilent Jefe Laboratorio
farmacéutico
300 450
Algunas aplicaciones
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Long. onda a
%T max.
% T a long. de
onda max.
Resultado
Env 75 ml Cara 1 450 6.56 Pasa
Env 75 ml Cara 2 450 5.62 Pasa
Env 150 ml Cara 1 450 5.57 Pasa
Env 150 ml Cara 2 450 5.94 Pasa
Env 500 ml Cara 1 450 4.63 Pasa
Env 500 ml Cara 2 450 7.56 Pasa
Env 900 ml Cara 1 450 5.88 Pasa
Env 900 ml Cara 2 450 6.44 Pasa
Fondo envase 75 ml 450 4.46 Pasa
Fondo envase 150 ml 450 4.22 Pasa
Fondo envase 500 ml 450 4.47 Pasa
Fondo envase 900 ml 450 6.63 Pasa
Control de temperaturas. Sistemas biomelt
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El mejor sistema de
control de temperaturas.
Desde -10ºC a 100ºC
Con un error inferior a
0.05ºC en el medio en el
que está la muestra.
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Muestras líquidas (bioquímica)
Estructura y estabilidad de proteínas.
Estructura y estabilidad de DNA y RNA. Tm, cromaticidad.
Cinéticas diferenciales.
Espectroscopía diferencial de proteínas. Interacciones.
Estudios de membranas. Orientación de Lípidos y Proteínas.
Muestras líquidas (química)
Espectroscopía diferencial.
Muestras turbias, en suspensión, o de fuerte absorbancia.
Estudios de interacción con disolventes.
Muestras sólidas.
Caracterización de muestras sólidas por reflectancia difusa.
Campos de aplicación
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UV-Vis-NIR Análisis de muestras sólidas
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Esquema òptico equipo de altas prestaciones
Cary 4000, Cary 5000 y Cary 6000
Sistema óptico Littrow fuera de plano
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS O
LIQUIDAS: VARIAN CARY 4000/5000/6000
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Características principales
Cary 4000 Cary 5000 Cary 6000
Monocromador doble doble doble
Red de difracción 1200 l/mm a 250nm 1200 l/mm a 250nm 1200 l/mm a 250nm
300I/mm a 1192nm 600l/min a 1000 nm
Detectores PMT PMT y PbS smart ref PMT y AsInGa ref
Intervalo trab. 175-900 nm 175-3300 nm 175-1800 nm
Resolución < 0.048 nm < 0.048 nm <0.048nm
Luz difusa UV < 0.00007% < 0.00007% <0.00007%
Luz difusa NIR <0.0002% a1420nm <0.00001 a 1420 nm
<0.00045 a 2365nm
Interv fotometrico >8 uA >8 uA >8uA
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Non-Measurement Phase Stepping (NMPS)
Grating moves Grating continues Sample measured at to move different wavelength
NMPS to reference
Barridos convencionales
Dark Reference
Dark Reference
Sample
Sample
Chopper moves Grating stops Sample measured at only during same Wavelength as NMFS of the reference chopper cycle
NMPS los resultados son mucho más precisos!
3.장점
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Non-Measurement Phase Stepping (NMPS)
El NMFS asegura que las medidas fotométricas a una long de onda particular, se mantienen constantes independientemente de la velocidad de barrido.
Se muestran los espectros superpuestos de una misma muestra medida a 1800, 900, 600, 450 y 200 nm/min
Más de 8 UA de linealidad. Medidas con filtros Hellma a partir de
cristal Schott NG1.
Una calibración a Abs@546 nm vs.
grosor nominal de los filtros permite
obtener un coeficiente de correlación
de r2 = 0.999951
Más de 6 UA de linealidad con
esfera integradora en UV-Vis y
más de 3 en NIR con Cary 5000
. Medidas con filtros Hellma a partir
de cristal Schott NG1.
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS O LIQUIDAS: AGILENT
CARY 4000/5000/6000
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Agilent Cary 5000
DRA externa 2500
Small spot kit
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: ANALISIS DE
MUESTRAS DE TEJIDOS CARY 5000
Espectros UV-Vis-NIR Análisis de color
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ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: ANALISIS DE COLOR
DE TEJIDO PIXELADO CARY 5000
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ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: ANALISIS DE COLOR
DE TEJIDO VERDE OLIVA CARY 5000
lluminant = CIE D65 ANGULO 10º Tristimulus : X = 6.6692 Y = 7.0078 Z = 5.6461
Chromaticity : x = 0.3451 y = 0.3627 z = 0.2922
Chromaticity : u' = 0.2072 v' = 0.4900
CIELAB : L* = 31.8246 a* = 0.2601 b* = 7.5112
CIELUV : L* = 31.8246 u* = 3.8818 v* = 8.4439
Hunter Lab : LH = 26.4722 aH = 0.1856 bH = 2.5062
Metric : L* = 31.8246 C* = 7.5157 h = 88.0165
Medida de %R frente al
ángulo de incidencia para el
sustrato con y sin recubrir
El cálculo del índice de
refracción es determinado
tomando la tangente del
ángulo a que los dos
barridos intersectan.
Luego el índice puede
usarse para calcular el
grosor del recubimiento
Analizado en un Cary 5000 con un Accesorio de Reflectancia
Especular de Angulo Variable con el ADL VASRA refractive Index
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Reference material
UV application note 90 – Determination of thin films thickness using reflectance spectroscopy
Basado en un
ángulo de
incidencia de
7º, índice de
refracción de
1.51 y la cuenta
de 16 franjas
de interferencia
el grosor
calculado fue
de 4.95 m
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: ANALISIS DE CAPAS
FINAS CON AGILENT CARY 4000/5000/6000
Reference material
UV application note 93 – Measuring the optical properties of photovoltaic cells using the Varian Cary 5000 UV-Vis-NIR spectrophotometer and the External DRA-2500
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Estudio de la reflectividad de células termo-solares en UV-VIS.NIR
Compound Absorption
Edge (nm)
Band Gap Energy
(Eg; eV)
TiO2 370 3.35
K2Ti4O9 310 4.00
(C3H7NH3)2Ti4O
9
387 3.20
C6H12(NH3)2Ti4O9
384 3.23
(Fe3(CH3COO)7
OH)Ti4O9
510 2.43
Reference material
UV application note 81 – The measurement of absorption edge and band gap properties of novel nanocomposite materials
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Determinación del energy band gap de diferentes materiales por DRA
Nota: Excelente relación
señal/ruido en las regiones de
muy baja reflectancia dentro
de la zona Vis y tambien en
NIR NIR
Este ejemplo ilustra la potencia de la
configuración del Cary 6000 con un sistema
optico específico para disminuir enormemente
la luz difusa en NIR y la mayor sensibilidad del
detector de InGaAs sobre el de PbS. Con
este sistema se consique mayor rendimiento
óptico, mejor resolución, menores tiempos de
lectura y mayor sensibilidad
ESPECTROSCOPÍA DE MUESTRAS SOLIDAS: AGILENT CARY
4000/5000/6000
Espectros de cristales recubiertos con capas finas antireflectivas con Cary 6000
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Luminiscencia
Tipos de fenómenos luminiscentes
Fluorescencia Fosforescencia
Fotoluminiscencia
Bioluminiscencia
Quimioluminiscencia
Sonoluminiscencia
Electroluminiscencia
Otros
Luminiscencia
Triboluminiscencia
Catodoluminiscencia
Radioluminiscencia
Fluorescencia retrasada
„Todo fenómeno de emisión de radiación electromagnética desde
un estado excitado‟.
„La luminiscencia tiene lugar por la capacidad de ciertas sustancias
de absorber la luz a frecuencias relatívamente altas y re-emitirla
instantaneamente en paquetes discretos de frecuencias más bajas
'
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Ventajas de Fluorescencia
•Mayor Sensibilidad que UV/VIS (100-1000 veces)
•Mayor Selectividad.
• Solo el 10% de sustancias emiten fluorescencia
• Espectros de Emisión y Excitación específicos.
• Separaciones de mezclas (Barridos sincrónicos).
•Información cualitativa del ambiente químico.
• PH.
• Polaridad local.
• Viscosidad.
• Temp
•Gran intervalo lineal
• Absorción: 3 órdenes
• Emisión 6-7 órdenes
•Información multidimensional.
• 2 transiciones, doble información.
•Marcadores más seguros
• Sustituyen los marcadores radioactivos.
•Técnica sencilla y económica
• Tanto los instrumentos como la operación es sencilla y económica.
•Dispersión Raleigh por los solutos de la muestra, que puede dar lugar a la aparición de picos fantasma, picos de segundo orden, etc
•Bandas de Raman del disolvente, que pueden confundirse con bandas de emisión del compuesto estudiado
•Fotobleach. O destrucción del fluoroforo en el estado excitado
Fluorescencia ECLIPSE
Barridos completos en
menos de 3 sg. Rango hasta 900 nm en
excitación y emisión
Fuente de Xe de alta
Intensidad
Fluorescencia,
Fosforescencia. Barridos de
excitación y emisión
Fluorescencia a luz
ambiente con sólo 0,5
mL de muestra
Electrónica ultrarápida con
resolución de menos de 1 us
Amplio rango de
accesorios;
Peltier,
microplacas,
multicubetas…
Rendijas
variables en
excitación y
emisión
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Accesorios y software para todas las aplicaciones
Polarizadores rápidos automáticos
Polarizadores manuales
Filtros rápidos para Ca
intracelular
Sondas de control de
temperatura
Criostatos
Soportes de
muestras
sólidas
Sistemas peltier
Sistema biomelt
Lector de placas
Optica colectora de la fuente en montaje
Schwarzchild
Optica colectora Schwarzchild –
dentro del módulo de lámàras !
• Una colección eficiente de la luz
implica que podremos enviar más luz
a la muestra
• ~100 veces más potente que la
lámpara del Cary 50
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Segmentos de aplicación de la espectroscopía de
fluorescencia Las aplicaciones biológicas ocupan un ~70% del mercado de la fluorescencia.
• Investigación bioquímica y biofísica
• Enzimología
• Biología molecular
• Ciencias de los alimentos y nutrición
• Farma
El enorme crecimiento de las aplicaciones de fluorescencia en el campo de las ciencias de la vida ha sido posible gracias al desarrollo de un gran número de nuevas “sondas” fluorescentes.
Física/Química/Ciencias de los materiales • Departamentos de física-química
• Química analítica.
R&D en empresas farmaceuticas.
Laboratorios de enseñanza.
Espectro de fluorescencia de Europio en disolución
potenciadora DELFIA™
Modo Fluorescencia
Modo Fosforescencia (TRF) mode
Pico desestructurado a 450 nm atribuido a la
emisión de fondo de la solución potenciadora
Delay time = 0 s
Delay time = 100 s Optimización
del delay time 0
1
2
3
4
5
6
7
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
Gráfica logarítmica de la intensidad de la fosforescencia vs. Concentración. Linealidad en el intervalo entre 0.1 – 1000 nM (inserto 0.1 – 10000 nM)
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Aplicaciones de FRET o RT FRET
TR FRET
Caracteriación del proceso de hibridación por FRET de una proteína
marcada con un quencher (DABCYL) y una sonda de DNA marcada con un
compuesto fluorescente (5 y 6 carboxifluoresceína)
Cary Eclipse equipado con paquete biomelt (sistema multiceldas termostatizado
con peltier, controlador y sondas de temperatura. Software para el cálculo de
temperaturas de melting (Tm) mediante el método de la derivada
Aplicaciones: Estudios de interacciones e hibridación de
ácidos nucléicos o proteínas.
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Imagen de experimento de entrada de Ca con sonda Fura 2
Aplicaciones: Medida de Calcio intracelular
Pueden medirse y caracterizarse toda la familia de proteínas GFP en
células intactas o en orgánulos intracelulares
Aplicaciones: Medida de la familia de proteínas GFP
Estructura de la
proteína verde
fluorescente
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Esquema de un Fluoroinmunoensayo
Aplicaciones: Inmunoensayos con sondas fluorescentes
El significado de tener un Cary
1954 Introducción del Cary 14 UV-Vis-NIR
1970 Introducción del
espectrofotómetro Cary 17 UV-Vis-NIR
Howard Cary – el hombre que
realizó los primeros diseños 2011. La tradición en
la vanguardia del
conocimiento