escuela academico profesional de farmacia y bioquÍmica

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR

CROMATOGRAFÍA DE GASES PARA CUANTIFICAR

MENTOL EN UNGÜENTO”

TESIS II

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO

DE

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

AUTORES: VARGAS MARQUINA, PABLO ROBERTO

VÁSQUEZ PÉREZ, GÉNESIS CYNTIA DEL PILAR

ASESOR: Mg. Q. F. ROGER A. RENGIFO PENADILLOS

CO-ASESORA: Q.F. MARIELENA BERMÚDEZ CHAGARAY

TRUJILLO – PERÚ

2012

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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Agradecimientos:

A Dios:

Gracias por guiar nuestros caminos

y permitir que nuestras metas sean logradas.

Gracias por el inmenso amor que nos tienes,

por tus bendiciones y

por el regalo de la vida.



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A nuestros padres:

Desde lo más profundo de nuestro corazón

mil gracias por su compresión,

por sus sabios consejos y

por su ayuda incondicional para

hacer realidad uno de nuestros mas hermosos sueños,

El ser profesional.

A nuestros hermanos:

Por su constante apoyo,

comprensión y entusiasmo,

y por ser nuestros mejores amigos.



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Un sincero agradecimiento al

Mg.Q.F. Roger Rengifo Penadillos

por su generosa dirección, asesoramiento y dedicación en la

realización del presente trabajo.

Un especial agradecimiento a la

Q.F. Marielena Bermúdez Chagaray

por la confianza, el apoyo y la oportunidad

brindada, para que este trabajo haya

podido ser realizado.



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Al Laboratorio Farmacéutico MARKOS S.A.,

por las facilidades brindadas para

la realización del

presente trabajo.



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JURADO EVALUADOR

----------------------------------------

Dr. Juan Arbayza Fructuoso

PRESIDENTE

-----------------------------------

Dr. Pedro Alva Plasencia

MIEMBRO

-----------------------------------

Mg. Roger Rengifo Penadillos

MIEMBRO



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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado:

Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento

para la obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE

FARMACÍA Y BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO, presento a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de

Tesis II, intitulado: “VALIDACIÓN DEL METODO ANALÍTICO POR

CROMATOGRAFÍA DE GASES PARA CUANTIFICAR MENTOL EN

UNGÜENTO”, con el que pretendemos obtener el GRADO DE BACHILLER.

Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del

presente Informe de Tesis II.

Trujillo, Abril de 2012

Pablo R. Vargas Marquina Génesis C. Vásquez Pérez



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INDICE

RESUMEN…………………………………………………....i

ABSTRACT………………………………………..…………ii

I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1

II. MATERIAL Y MÉTODO .................................................... 6

III. RESULTADOS ........................................................ ….…. 30

IV. DISCUSIÓN ........................................................................ 35

V. CONCLUSIONES ................................................................ 41

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................. 42

ANEXOS ..................................................................................... 46



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i

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue demostrar que el método analítico por

cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento, cumple con los

parámetros de validación establecidos por la Farmacopea de los Estados

Unidos de América (USP 34), para el uso específico previsto. Para lo cual se

utilizó como fase móvil el gas Helio y fase estacionaria una columna G16

(Polietilenglicol 60m x 0,250mm x 0,50um). Se realizó la identificación del

pico de mentol por comparación del tiempo de retención del estándar con la

muestra, se evaluó la presencia de interferencias en las soluciones blanco,

placebo y placebo + principio activo (Salicilato de metilo) y se realizó el

análisis del placebo y la muestra sometidos a condiciones de estrés,

obteniendo resultados conformes. El % de recuperación promedio obtenido

fue 100,07%; Gexp=0,6803 y texp=0,4175. En la linealidad del estándar, la

pendiente (m) fue 0,0077 y el intercepto (b) de -0,0070; el coeficiente de

correlación (r) fue 0,9999 y el coeficiente de determinación (r2) de 0,9998;

los límites de confianza de “m” fueron 0,0077 y 0,0076; y texp=285,6489; los

límites de confianza de “b” fueron 0,0195 y 0,0055; y texp=1,2142;

tr=285,6489 y la desviación estándar relativa (RSD) de 0,52%. En la

linealidad de la muestra se obtuvó m=0,0078 y b=-0,0171; r=0,9987;

r2=0,9973; los límites de confianza de “m” fueron de 0,0075 y 0,0080; y

texp=69,3531; los límites de confianza de “b” fueron de 0,0735 y 0,0393; y

texp=0,6544; tr=69,3531 y el RSD=1,94%. En la aptitud del sistema se halló

un RSD=0,16%. Para la repetibilidad se obtuvó un RSD=0,41% y en la

precisión intermedia dada entre analistas en diferentes días fue 0,33%. Por

tanto los valores de los estimadores determinados permiten dar como

validado el método analítico propuesto para cuantificar mentol en ungüento,

al cumplir con los parámetros de validación según USP34.

Palabras claves: Cromatografía de gases, mentol, validación, USP34



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ii

ABSTRACT

The purpose of this study was to demonstrate that the analytical method by gas

chromatography to measure menthol ointment, fulfills the validation parameters set

by the Pharmacopoeia of the United States of America (USP 34), for the specific

intended use. To which was used as the mobile phase and stationary phase helium

gas G16 column (Polyethylene glycol 60m x 0,250mm x 0,50um). Identification was

performed by comparing menthol peak retention time of standard sample, we

assessed the presence of interference in the solutions, placebo and placebo + active

ingredient (methyl salicylate) and performed the analysis of the placebo and the

sample subjected to stress conditions, obtaining results in line. The % average

recovery obtained was 100,07%; Gexp=0,6803 and texp=0,4175. The linearity of the

standard, the slope (m) was 0,0077 and the intercept (b) of -0,0070, the correlation

coefficient (r) was 0,9999 and the coefficient of determination (r2) of 0,9998; the

confidence limits of "m" were 0,0077 and 0,0076; and texp=285,6489; the confidence

limits of "b" were 0,0195 and 0,0055; and texp=1,2142; tr=285,6489 and the relative

standard deviation (RSD) of 0,52%. The linearity of the sample was obtained

m=0,0078 and b=-0,0171; r=0,9987; r2=0,9973; the confidence limits of "m" were of

0,0075 and 0,0080; and texp=69,3531; confidence limits of "b" were 0,0735 and

0,0393; and texp=0,6544; tr=69,3531 and RSD=1,94%. The ability of the system

found a RSD=0,16%. For repeatability was obtained RSD=0,41% and intermediate

precision given among analysts on different days was 0,33%. Thus the values of

certain estimators lead to allow validated analytical method proposed to quantify

menthol ointment, to meet the validation parameters according to USP34.

Keywords: Gas chromatography, menthol, validation, USP34



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1

I. INTRODUCCIÓN

En la fabricación de productos farmacéuticos, es indispensable realizar una

inspección completa al proceso de producción aplicando normas establecidas a fin de

garantizar la producción de productos farmacéuticos de buena calidad. Para ello debe

sujetarse a las normas aceptadas internacionalmente, comúnmente conocidas como

“Buenas Prácticas de Manufacturas”, (BPM) 1.

Las BPM constituyen un conjunto de normas mínimas para la correcta fabricación de

productos farmacéuticos, y establecen los estándares que deben ser observados por la

industria farmacéutica para la fabricación de sus productos, de manera que puedan

satisfacer los criterios de calidad requeridos, a fin de cautelar la salud de la población

usuaria 1.

En la actualidad los laboratorios de control de calidad de la Industria Farmacéutica

buscan validar sus métodos analíticos, la cual establecen por medio de estudios y

programas documentados asegurando que el método posee todos los requisitos para

el uso propuesto. La validación es parte integral de las BPM y del desarrollo de un

método de análisis puesto que sin fiabilidad de los resultados analíticos es imposible

asegurar que un medicamento cumple con las especificaciones exigidas, además,

contribuye a garantizar la calidad y asegurar las propiedades de calidad de un

producto determinado 2,5,12,16.

La calidad de los resultados analíticos debe ser acaparada mediante la fiabilidad y

reproducibilidad del método analítico utilizado en su obtención y esta demostración

debe estar debidamente documentada con el detalle de la preparación de las muestras

efectuadas y los datos obtenidos. Existen varios productos farmacéuticos, cuyos

métodos de análisis no se encuentran publicados en las obras oficiales de consulta

como la Farmacopea americana, británica, europea y japonesa. Esto hace necesario el



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desarrollo de la validación de métodos analíticos con el fin de cuantificar los

principios activos de dichos productos farmacéuticos 2,5,12,16.

La validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante estudios

en laboratorio, que las características de validación del método cumplen los

requisitos para las aplicaciones analíticas previstas 3,7.

Entre las características analíticas típicas utilizadas para la validación de métodos se

encuentra la Exactitud, Precisión, Especificidad, Límite de detección, Límite de

cuantificación, Linealidad, Intervalo y Robustez 3,11.

La especificidad es la habilidad para evaluar inequívocamente el analito en busca de

la presencia de componentes esperados. Típicamente estos pueden incluir impurezas,

degradantes, matriz, etc. La falta de especificidad de un método analítico individual

puede ser compensada por otros métodos analíticos de apoyo 3,4.

La exactitud de un método analítico expresa el grado de concordancia entre el valor,

el cual es aceptado ya sea como un valor verdadero convencional o un valor de

referencia aceptado, y el valor encontrado 2. La exactitud se calcula como el

porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad

conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la

valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza 3.

La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener resultados de

prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una

transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras

dentro de un intervalo dado 3,4.

La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los resultados

de las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a múltiples



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muestreos de una muestra homogénea 4. La precisión de un método analítico

habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar

relativa de una serie de mediciones 3. La precisión puede ser una medida del grado de

reproducibilidad o de repetibilidad del método analítico en condiciones normales de

operación 3,4.

La reproducibilidad expresa la precisión entre diferentes laboratorios. La precisión

intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes

días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio.

La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un

laboratorio durante un periodo corto por el mismo analista con el mismo equipo 3.

Para desarrollar el método de la presente validación, se utilizó la técnica de

separación, Cromatografía de gases.

La cromatografía de gases (CG) es una técnica que permite separar los componentes

volátiles de una muestra, que se distribuyen entre una fase gaseosa móvil y una fase

estacionaria líquida o sólida contenida en una columna. La muestra a analizar se

volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se

produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte; la cual no interactúa con la

fase estacionaria ni con las moléculas del analito, su única función es transportar el

analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases:

cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC) 6,13,18.

La GLC utiliza una fase estacionaria líquida; disponible en columnas rellenas o

capilares, en columnas rellenas la fase estacionaria líquida se deposita sobre un

soporte sólido inerte finamente dividido como polímeros porosos o carbón grafito, en

columnas capilares la fase estacionaria se deposita sobre la superficie de la columna.

La GSC está disponible únicamente en columnas rellenas, el cual generalmente es un

absorbente activo 3,18.



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Un Cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector,

una columna, un detector y un dispositivo registrador 3.

Los gases más utilizados son el nitrógeno, helio, aire, hidrógeno u oxigeno. El uso de

alguno de ellos dependerá de la columna, el detector en uso, el costo y la seguridad

3,6.

La inyección de la muestra se realiza generalmente con una microjeringa

hipodérmica a un alineador de vidrio (glass insert) contenido en un bloque metálico,

donde se vaporiza y es barrida hacia la columna. El bloque se calienta a una

temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prácticamente

en forma instantánea la muestra líquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada

es del orden de µL para líquidos, el volumen inyectado no debe superar la capacidad

de la columna y entre más pequeño sea el volumen usado de la muestra mayor será la

eficiencia y la reproductibilidad del análisis 6,15,18.

Las columnas cromatográficas varían en longitud desde menos de 2 hasta 50 metros

o más, a fin de colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran

como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La temperatura de la columna es una

variable importante para un trabajo preciso, por ello la columna normalmente se

introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna

depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido

6,18.

Las sustancias presentes en la muestra pasan a través de la columna, donde son

separados y llegan al sistema de detección 6,14. El tipo de detector que se usa depende

de la naturaleza de los componentes que se analizan y es específica según la

monografía individual, tiene las siguientes características: 1) Adecuada sensibilidad,

2) Buena estabilidad y reproductibilidad, 3) Una respuesta lineal para los analitos, 4)



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Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente

hasta el menos 400 ºC, 5) Alta fiabilidad y manejo sencillo, 6) Respuesta semejante

para todos los analitos y 7) No destructivo de la muestras 3,14,15.

La señal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en

función del tiempo y la medida del área o altura del pico, es una función de la

cantidad presente 15.

El producto farmacéutico considerado como muestra de análisis para la presente

validación, es un ungüento que asocia dos principios activos: Mentol y Salicilato de

metilo. Siendo motivo de estudio la validación del método analítico para la

cuantificación del principio activo Mentol por cromatografía de gases, dicho

producto farmacéutico es indicado para el alivio local del dolor y las limitaciones

funcionales de las afecciones musculares, traumáticas y reumáticas. El método de

análisis para la cuantificación de mentol en ungüento no se encuentra publicada en

las obras oficiales de consulta, lo que hace necesario desarrollar un método de

análisis en el laboratorio para cuantificar dicho principio activo.

Es por ello que el presente proyecto de tesis tiene por finalidad demostrar que el

método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento

cumple con los parámetros de validación establecidos por la Farmacopea de los

Estados Unidos de América (USP 34), además de probar la confiabilidad del método

analítico para asegurar la calidad y eficacia del producto farmacéutico.

El problema planteado fue ¿El método analítico por cromatografía de gases para

cuantificar mentol en ungüento cumple con los parámetros de validación establecidos

por la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP 34)?

Dentro de los objetivos específicos se consideró, determinar los parámetros de

validación (Selectividad, Exactitud, Linealidad y Precisión) para el método analítico



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por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento, así como también

evaluar los parámetros de validación mencionados para establecer si cumplen con los

criterios establecidos por la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP

34).

II. MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

1.1. Materiales

1.1.1. Material de análisis

- 100 g de placebo ungüento.

- Potes de ungüento conteniendo Mentol 8,18g/100g de Laboratorios

Farmacéuticos Markos S.A.

1.1.2. Estándares

- Estándar primario Menthol USP

USP Reference Standard MENTHOL 250 mg

Lote: JOI189

Potencia: 99,9%

- Estándar secundario Mentol

Lote: 1011260

Potencia: 99,03% Tal cual (T/C)

Protocolo: ST16/11

Reanálisis: 2012-09-15



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1.1.3. Material de vidrio

- El de uso común en laboratorio, debidamente verificado.

1.2. Reactivos y solventes

- 1- Butanol Merck 2,5; lote K40272690 007.

- Metanol grado HPLC Merck 4 L, lote I577107 106.

- Agua ultrapura.

1.3. Equipos

DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE

PROTOCOLO

DE

CALIFICACIÓN

Balanza analítica Ohaus PA214 8328320492 PCI-CC.016

PCO-CC.016

PCD-CC.016

Baño María Memmert WB14 1499-0288 PCI-CC.023

PCO-CC.023

PCD-CC.023

Cromatógrafo de

gases

Agilent

Technologies 7820A CN11172021

PCI-CC.038

PCO-CC.038

PCD-CC.038

Cabina de flujo

laminar (Luz

UV)

S/M S/M S/S PCI-CC.044

PCO-CC.044

PCD-CC.044

Microbalanza Sartorius MSE3.6P-

000-DM 27203340

PCI-CC.045

PCO-CC.045

PCD-CC.045



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Purificador de

agua Millipore Reference F1NA21877C

PCI-CC.046

PCO-CC.046

PCD-CC.046

Ultrasonido Fisher Scientific

FS23 222043 PCI-CC.016

PCO-CC.016

PCD-CC.016

1.4. Otros

- Columna G16 (DB-WAX/Polietilenglicol 60 m Largo x 0,250

mm Ancho x 0,50 um Film). Límite de temperatura: 20 – 250 °C,

serie USB102436H.

- Termómetro de líquido en vidrio Silver Brand, lote 05J.

- Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño de poro 0,45

um x 47 mm; lote 0611 25006 1140323.

- Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño de poro 0,45

um x 25 mm; lote 1111 25006 1140783.

- Portafiltro descartable Agilent Technologies Econofilter 25 cm

de diámetro x 0,2 um de tamaño de poro PTFE.

- Tapas y septas Agilent Technologies, lote 091996-3-1.

- Viales 100/PK Agilent Technologies, lote 1112001095.

- Jeringas de plástico 5 mL 21G x 11/2”.

- Papel Parafilm “M”, Laboratorio Film.

- Guantes de látex, Rubbercare lote 110.

2. MÉTODO:3,4,8,9,10

2.1. Selección y tamaño de la muestra



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Se realizó el proceso de muestreo aleatorio de los potes de ungüento que

contienen Mentol, teniendo en cuenta el manejo de las Tablas Militar

Estándar 105E (Ver Anexo 01).

A partir del cual se determinó según el nivel de inspección general III y el

tamaño de lote fabricado (500 potes de ungüento), el código de inspección

“J”. Él cual a su vez teniendo en cuenta el plan de muestreo y considerando

un 2,5% de nivel de aceptabilidad de la calidad se determinó como tamaño

de muestra 5 potes de ungüento, los cuales fueron tomados al azar.

2.2. Condiciones cromatográficas

Columna : G16 (Polietilenglicol 60 m Largo x 0,250 mm

Ancho x 0,50 um Film). Límite de temperatura:

20 – 250 °C.

Gas Carrier : Helio

Flujo : 2,01 mL/min

Makeup flow (He) : 30,8 mL/min

Flujo Columna +Hidrógeno: 31,2 mL/min

Flujo Columna + Aire : 426 mL/min

Flujo de venteo : 29,8 mL/min

Purga : 2,58 mL/min

Tipo de inyección : Split

Detector : FID (Detector de ionización a la

llama) a 250 °C

Temperatura Inyector : 250 °C

Temperatura Horno Inicial: 70 °C, tiempo: 1 minuto

Rampa 1 : 7,5 °C/min

Temperatura Horno Final: 180 °C, tiempo: 9 minuto

Volumen de Inyección : 1 L



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2.3. Preparación de las soluciones de trabajo

- Preparación del estándar interno

En un matraz volumétrico de 100 mL, se adicionó 1 mL de 1-butanol,

enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45

µm x 25 mm.

- Preparación de la solución estándar

Se pesó aproximadamente 100 mg de mentol estándar y añadió a un

matraz volumétrico de 50 mL, se enrasó con metanol y homogeneizó.

Luego se transfirió 5 mL de ésta solución en un matraz volumétrico de 50

mL y añadió 1 mL del estándar interno, disolvió y enrasó con metanol,

luego se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45µm x25 mm.

- Preparación de la muestra

En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó aproximadamente 1,32 g de

muestra (equivalente a 100 mg de mentol), añadió 30 mL de metanol, se

colocó a baño maría hasta obtener una solución homogénea, luego se

enfrió y enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de ésta solución

en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL del estándar interno,

disolvió, enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana

de 0,45 µm x 25 mm.

2.4. Parámetros de validación

2.4.1. Selectividad

a. Identificación del pico de mentol en la muestra

Se procedió a preparar la solución estándar y solución muestra según lo

descrito en el ítem 2.3. e inyectó separadamente por duplicado.



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Criterio de aceptación4

El tiempo de retención que presente el pico resultante de la muestra

coincide en el tiempo de retención de la solución estándar.

b. Interferencias

Se evaluó la presencia de interferencias a nivel de blanco, placebo sólo y

placebo + principio activo (Salicilato de metilo).

- Blanco

Se empleó la solución diluyente (Metanol), filtró a través de membrana

de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.

- Placebo sólo

Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico de 50 mL,

añadió 30 mL de metanol y colocó en baño maría hasta obtener una

solución homogénea, enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5

mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL

de estándar interno, disolvió y enrasó con metanol, homogeneizó y filtró

a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.

- Placebo + principios activos

Se pesó 1,32 g de placebo + 383 mg de salicilato de metilo y transfirió a

un matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol y colocó en

baño maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con

metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz

volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y

enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45

µm x 25 mm e inyectó por duplicado.

- Solución Estándar

Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3., filtró a

través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.

- Muestra



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Se preparó la muestra según lo descrito en el ítem 2.3., filtró a través de

membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.


Ausencia de pico en el tiempo de retención del mentol en la solución

blanco, placebo y placebo + principio activo (Salicilato de metilo).

c. Análisis de muestras sometidas a condiciones de estrés

Se procedió a realizar el estudio de la muestra y el placebo sometidos a

condiciones de estrés para generar compuestos potencialmente

interferentes.

- Termólisis

Se sometió aproximadamente 15 g de placebo y muestra a 105 ºC durante

5 horas.

Placebo tratado: Se pesó 1,32 g de placebo tratado y transfirió a un

matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño

maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con

metanol, luego se transfirió 5 mL de esta solución en un matraz

volumétrico de 50 mL, añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y

enrasó con metanol.

Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e

inyectó por duplicado.

Muestra tratada: Se pesó 1,32 g de muestra tratada y transfirió a un

matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño

maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con

metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz

volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y




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- Fotólisis

Se sometió aproximadamente 15 g de placebo y muestra a la acción de la

luz UV (254 nm) durante 5 horas.

Placebo tratado: Se pesó 1,32 g de placebo tratado a la acción de la luz

UV y transfirió a un matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de

metanol, colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea,

enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en

un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,

disolvió y enrasó con metanol.



Muestra tratada: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz

volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño maría

hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con metanol,

luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50

mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y enrasó con metanol.



- Hidrólisis alcalina

Placebo: Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico

de 50 mL, añadió 5 mL de Hidróxido de sodio 1 N y se llevó a ebullición

con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Ácido

Clorhídrico 1 N para neutralización, se añadió 30 mL de metanol y

colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se dejó

enfriar y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en



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ICA

14

un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,




Muestra: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz volumétrico

de 50 mL, añadió 5 mL de Hidróxido de sodio 1 N y se llevó a ebullición

con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Ácido

Clorhídrico 1 N para neutralización, luego se añadió 30 mL de metanol y

colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se dejó

enfriar y se enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de está

solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar

interno, disolvió y enrasó con metanol.

Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e


- Hidrólisis Ácida


de 50 mL, se añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1 N y llevó a ebullición

con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Hidróxido de

sodio 1 N para neutralización, luego se añadió 30 mL de metanol y

colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se enfrió y

enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de está solución en un

matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se





de 50 mL, añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1 N y se llevó a ebullición

con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Hidróxido de



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IOQUÍM

ICA

15

sodio 1 N para neutralización, se añadió 30 mL de metanol y colocó en

baño maría hasta obtener una solución homogénea, se enfrió y enrasó con

metanol, después se transfirió 5 mL de está solución en un matraz

volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y




- Oxidación


de 50 mL, se añadió 5 gotas de peróxido de hidrógeno y se sometió a

baño maría a 60 ºC durante 2 horas, se dejó enfriar y añadió 30 mL de

metanol, se colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea,

se enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución

en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,

se disolvió y enrasó con metanol.




de 50 mL, se añadió 5 gotas de peróxido de hidrógeno y se sometió a

baño maría a 60 ºC durante 2 horas, se dejó enfriar y añadió 30 mL de

metanol, luego se colocó en baño maría hasta obtener una solución

homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, después se transfirió 5

mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL

de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol.



Se comparó el tiempo de retención del pico de Mentol de la solución

estándar con los resultantes de la inyección del placebo y las muestras



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ICA

16

sometidas a condiciones de estrés. En éste último se determinó la

resolución del interferente con respecto al pico del mentol. La resolución,

es calculada mediante la aplicación de la formula:

Criterio de aceptación3,4

- La muestra sometida a condiciones de estrés, no presenta productos de

degradación que interfieran con el tiempo de retención del Mentol;

asimismo, el interferente próximo al pico de Mentol debe tener una

resolución mayor o igual a 1,5.

- El placebo sometido a las condiciones de estrés, no presenta productos

de degradación que interfieran con el tiempo de retención del Mentol.

2.4.2. Exactitud

a. Solución estándar

Se preparó la solución estándar, estándar interno según lo descrito en el

ítem 2.3., luego se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e

inyectó por 5 veces.

b. Preparación de las muestras

- Muestra al 80%


placebo + 32 mg de estándar de mentol, se añadió 100 mL de metanol, 4

mL de estándar interno y colocó en baño maría hasta obtener una

21

122ww

ttR RR

s



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17

solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, se preparó por

triplicado. Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x

25 mm.

- Muestra al 100%

En un matraz volumétrico de 200 mL se pesó aproximadamente 1 g de





25 mm.

- Muestra al 120%






25 mm.

c. Cálculos y análisis estadístico: 20

- Se determinó la cantidad de mentol hallado en cada muestra, mediante la

aplicación de la siguiente fórmula:

Donde:

mg mentol : Cantidad de mentol hallada en la muestra (mg).

fxPstxRst

Rmpmentolmg



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18

Rmp : Ratio del pico de mentol y estándar interno de la

solución muestra.

Rst : Ratio del pico de mentol y estándar interno de la

solución estándar.

Pst : Peso del estándar de mentol (mg).

f : Factor de dilución del estándar y la muestra.

- La exactitud se expresó como el porcentaje de mentol recuperado:

Donde:

R : Porcentaje de recuperación promedio

mg (h) : Miligramos de mentol hallados

mg (a) : Miligramos de mentol añadidos

Criterio de aceptación

El porcentaje de recuperación promedio (R) deberá acercarse al 100%.

En este caso, por tratarse de análisis de un principio activo en producto

terminado se considera como indicativo de exactitud valores de 98-

102%.

- Se evaluó la influencia de la concentración en la variabilidad de los

resultados mediante la aplicación de la prueba estadística G de Cochran:

Donde:

s2 : Máxima desviación estándar relativa

100)(

)(x

amg

hmgR

2

3

2

2

2

1

2 maxexp

sss

sG



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19

: Sumatoria de las desviaciones estándar relativa de

cada cada grupo de concentraciones


Si el G experimental (Gexp) es menor al G de tabla (Gtabla) para un valor

de p=0,05; 3 grupos de concentraciones (k=3) y 3 número de

determinaciones por grupo (n=3), entonces el factor de concentración no

influye en la variabilidad de los resultados.

- La exactitud se determinó mediante la aplicación del test de Student:

Donde:

texp : Valor de t obtenido experimentalmente

R : Porcentaje de recuperación promedio

n : Número de determinaciones (9)

RSD : Desviación estándar relativa del total de determinaciones


Si el texp es menor al ttabla; para (n-1) grados de libertad y un nivel de

confianza del 95 % (α=0,05), entonces no existirá diferencia significativa

entre la recuperación promedio y la cantidad añadida de mentol.

3.2.4.3. Linealidad

3.2.4.3.1. Linealidad del estándar

RSD

nRt

100exp

2

3

2

2

2

1 sss



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20

Se determinó preparando soluciones del estándar en concentraciones del

40%, 80%, 100%, 120% y 160% por triplicado, considerándose como

100% a la concentración de trabajo (0,2 mg/mL).

a. Preparación de las muestras

- Muestra 40%

Se pesó un aproximado de 80 mg de mentol estándar y transfirió en un

matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió utilizando un ultrasonido y

enrasó con metanol, de esta solución se transfirió 5 mL en un matraz

volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y

enrasó con metanol, luego se homogeneizó y filtró a través de membrana

de 0,45 µm x 25 mm (0,08 mg/mL).

- Muestra 80%


matraz volumétrico de 200 mL, se añadió 4 mL de estándar interno, se

disolvió utilizando un ultrasonido y enrasó con metanol, se homogeneizó

y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm (0,16 mg/mL).

- Muestra 100%





- Muestra 120%





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21



- Muestra 160%





b. Cálculos y análisis estadístico: 3,4,20,22

- Cálculo de la recta de regresión:

Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (ratio) con

la concentración del analito sobre los puntos sin promedio.

Ecuación de la recta:

Siendo:

X : Concentración de analito (mg/mL)

Y : Ratio del pico cromatográfico

b : Valor de la pendiente de la recta

a : Valor del intercepto o del término independiente de la recta

con el eje “Y”

Donde:

aXbY

n

X

i

n

YiXi

iX

YiXib 2

2



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22

- Coeficiente de correlación (r)

El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón

existente entre las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es

cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad

elevada.

Criterio de aceptación:

r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,999

se consideran como aceptables.

- Coeficiente de determinación r2

Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r" e indica la proporción

de la varianza total de "Y".


r2 no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,990

se consideran como aceptables.

- Test de verificación de la pendiente “b” o de la Linealidad (Límites

de confianza de la pendiente y test de t para n-2 grados de libertad y

p=0,05)

n

XibYia

n

iY

in

Xi

i

n

YiXi

YX

YiXir

2

2

2

2



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23

Varianza del error experimental total o Residual (S2y,x):

Varianza de la pendiente (S2b):

Desviación estándar de la pendiente (Sb):

Desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel. (%)):

Límites de confianza de la pendiente:

b ± tSb

Test de t:

2

2

2

,

n

xybyays xy

n

xx

Ss

xy

b 2

2

2

,2

2

bb ss

100.(%) xb

SrelS b

b



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24

Criterios de aceptación

En los límites de confianza de la pendiente, estos no incluyen el cero.

Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza

del 95% (p=0,05), para que “b” sea diferente de cero (Ha).

- Test de verificación de la variable independiente (Intercepto) o de

proporcionalidad “a” (Límites de confianza del término

independiente y test de t para n-2 grados de libertad y p=0,05)

Varianza del término independiente o intercepto (S2a):

Desviación estándar del término independiente o intercepto (Sa):

Desviación estándar relativa del término independiente o intercepto

(Sarel. (%)):):

Limites de confianza del término independiente o intercepto:

a ± tSa

bS

bt exp

n

xxSs ba

2

22

2

aa Ss

100.(%) xa

SrelS a

a



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25

Test de t:

Criterios de aceptación:

En los límites de confianza del término independiente o intercepto, estos

incluyen el cero.

Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza

del 95% (p=0,05), para que “a” sea estadísticamente igual a cero (Ho).

- Test estadístico del coeficiente de correlación "r"

HO: No hay correlación entre X e Y

Ha: Hay correlación entre X e Y

Donde:

r : Coeficiente de correlación lineal

n : Número de determinaciones


Si el valor de tr obtenido es mayor que el ttabla calculado para (n-2) grados

de libertad y un nivel de confianza del 95% (α=0,05), entonces existe

correlación lineal significativa.

- Test de linealidad

Se define obteniendo el factor de respuesta (f) por cada determinación:

X

Yf

aS

at exp

21

2

r

nrtr



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Donde:

X : Concentración de analito (mg/mL)

Y : Ratio del pico cromatográfico


DSR f ≤ 2 %

3.2.4.3.2. Linealidad de la muestra

Se determinó preparando soluciones de muestra en concentraciones del

40%, 80%, 100%, 120% y 160% por triplicado, considerándose como

100% la cantidad de 1,32 g de muestra.

a. Preparación de las muestras

- Muestra 40%

En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 0,53 g de

muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener

una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se

transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y

añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,

homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.

- Muestra 80%









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27

- Muestra 100%







- Muestra 120%







- Muestra 160%







Se realizó el análisis de regresión lineal y el correspondiente análisis

estadístico como lo indicado en la linealidad del estándar.

3.2.4.4. Precisión



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3.2.4.4.1. Aptitud del sistema

Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3. e inyectó

6 veces consecutivas, para evaluar la dispersión de las mismas.

a. Cálculos

- Se cálculo la desviación estándar relativa (RSD)


La desviación estándar relativa de los ratios hallados debe ser ≤ 2%.

3.2.4.4.2. Precisión del método

a. Solución estándar

Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3. e inyectó

5 veces.

b. Soluciones muestra:

- Muestra al 80%





PX

sRSD

100.



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29



- Muestra al 100%







- Muestra al 120%







Se repitió el análisis de la misma muestra 2 veces adicionales, en 2 días

diferentes y por un analista diferente cada vez.

c. Cálculos y análisis estadístico:

La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar

(S) o como la desviación estándar relativa (DSR). El estimador de la

desviación estándar se calculó como:

11

2

n

XX

n

i

pi

s



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Donde:

n : Número de determinaciones

Xi : Valor medido por el ensayo i

Xp : Estimador de la media proporcional

La desviación estándar relativa (RSD) se calculó como:

Se evaluó la precisión del método a nivel de repetibilidad y precisión

intermedia:

- Repetibilidad:

Se evaluó los resultados obtenidos por un mismo analista, el mismo día y

en la misma serie de análisis.

- Precisión intermedia:

Se evaluó los resultados obtenidos en el análisis de la misma muestra

por los tres analistas en los tres diferentes días.


Repetibilidad : DSR ≤ 2%

Precisión intermedia : DSR ≤ 2%

n

X

p

n

i

i

X

1

PX

sRSD

100.



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31

III. RESULTADOS

Cuadro 1: Parámetro de Selectividad para la validación del método analítico

por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento

Prueba Criterio de aceptación Resultado Conformidad

Identificación

Estándar Presencia del pico en

el tR de mentol

tRpromedio=14,285

Conforme

Muestra tRpromedio=14,286

Interferencias

Estándar

Presencia de pico en

el tR de mentol

Presencia Conforme

Muestra Presencia Conforme

Blanco

Ausencia de pico en el

tR de mentol

Ausencia Conforme

Placebo Ausencia Conforme

Placebo + principio

activo Ausencia Conforme

Análisis de muestras sometidos a condiciones de estrés

Placebo tratado

(Termólisis) Ausencia de

Ausencia Conforme



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Tiempo de retención (tR)

Cuadro 2: Parámetro de Exactitud para la validación del método analítico

por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento

*Tabla G de Cochran (Gtabla: 0,8709) para: p=0,05; k=3 y n=3

**Tabla t de Student (ttabla: 2,306) para: α=0,05 y n-1 grados de libertad

Placebo tratado

(Fotolisis) interferentes en el tR

del pico de mentol

Ausencia Conforme

Placebo

(Hidrólisis acida) Ausencia Conforme

Placebo

(Hidrólisis alcalina) Ausencia Conforme

Placebo (Oxidación) Ausencia Conforme

Muestra tratada

(Termólisis) Ausencia de

interferentes en el tR

del pico de mentol y

Resolución (Rs)≥ 1,5

Ausencia/Rs=86,601 Conforme

Muestra tratada

(Fotolisis) Ausencia/Rs=14,776 Conforme

Muestra

(Hidrólisis acida) Ausencia/Rs=89,698 Conforme

Análisis de las muestras sometidos a condiciones de estrés

Muestra

(Hidrólisis alcalina)

Ausencia de


del pico de mentol, Resolución (Rs)≥ 1,5


Muestra (Oxidación) Ausencia/Rs=83,529 Conforme

Estimadores

estadísticos Criterio de aceptación Resultado Conformidad

Porcentaje de

recuperación

promedio

98– 102% 100,07% Conforme

G de Cochran* Gexp ˂ Gtabla 0,6803 Conforme

test de Student** texp ˂ ttabla 0,4175 Conforme



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33

Cuadro 3: Parámetro de Linealidad del estándar para la validación del

método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en

ungüento

Estimadores estadísticos Criterio de

aceptación

Resultado Conformidad

Coeficiente de correlación

(r) r > 0,995 0,9999 Conforme

Coeficiente de

determinación (r2) r2 > 0,990 0,9998 Conforme


aceptación


Test de verificación de la

pendiente

- Límite de

confianza

(LC)

- Test de t

LC no incluye el

cero

texp > ttabla

LS=0,0077

LI=0,0076

texp=285,6489

ttabla=2,160

Conforme


variable independiente

- Límite de

confianza

(LC)

- Test de t

LC incluye el cero

texp ˂ ttabla

LS=-0,0195

LI=0,0055

texp=1,2142

ttabla=2,160

Conforme

Test estadístico del

coeficiente de correlación

"r"*

tr > ttabla 285,6489 Conforme

Test de linealidad DSR ≤ 2% 0,52% Conforme



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*ttabla: 2.160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad

Y = 0,0077 X – 0,0070

Límite inferior (LI), Límite superior (LS)

Cuadro 4: Parámetro de Linealidad de la muestra de la validación del

método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en

ungüento


aceptación


Coeficiente de correlación

(r) r > 0,995 0,9987 Conforme


aceptación


Coeficiente de

determinación (r2) r2 > 0,990 0,9973 Conforme


pendiente

- Límite de

confianza

- Test de t

LC no incluye el

cero

texp > ttabla

LS=0,0075

LI=0,0080

texp=69,3531

ttabla=2,160

Conforme


variable independiente

- Límite de

confianza

- Test de t

LC incluye el

cero

texp ˂ ttabla

LS=-0,0735

LI=0,0393

texp=0,6544

ttabla=2,160

Conforme

Test estadístico del

coeficiente de correlación tr > ttabla

69,3531 Conforme



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35

*ttabla: 2.160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad

y = 0,0078 x -0,0171

Cuadro 5: Parámetro de Aptitud del sistema para la validación del método

analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento

Cuadro 6: Parámetro de Precisión del método para la validación del método

analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento

"r"*

Test de linealidad DSR ≤ 2% 1,94% Conforme

Estimadores


DRS de ratios DSR ≤ 2% 0,16% Conforme

Estimadores


Repetibilidad DSR ≤ 2% 0,41% Conforme

Precisión

intermedia

DSR ≤ 2%

0,33% Conforme



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36

IV. DISCUSIÓN

En el presente trabajo se desarrolló un método analítico por cromatografía de gases

para la cuantificación de mentol en ungüento, el cual no figura en ninguna obra

oficial. Por tanto debe ser validado previamente a su uso en rutina, con el fin de

garantizar un alto grado de confiabilidad, seguridad y calidad de los resultados, lo

cual se traduce en disminución de errores y repeticiones del análisis.

La selectividad es un parámetro definido según la Conferencia internacional sobre la

armonización de requerimientos técnicos para el registro de productos farmacéuticos

para uso humano (ICH), como la habilidad para evaluar inequívocamente al analito

en busca de la presencia de componentes esperados como impurezas, productos de

degradación y componentes de la matriz. Realizada a través de las pruebas de



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37

identificación para asegurar la identidad del analito, aplicada también a las sustancias

relacionadas para asegurar de no obtener resultados positivos y la determinación de

la pureza en el que se evalúa la separación de los componentes a través de la

resolución de los mismos, que eluyen cerca el uno del otro 4.

En el Cuadro 1, encontramos los resultados obtenidos de la prueba de identificación,

así mediante el uso de cromatogramas se identificó que el mentol en la solución

estándar tiene un tiempo de retención (tR) promedio igual a 14,285 y al compararlo

con el tR promedio del pico generado de la muestra; el cual es igual a 14,286, se

puede afirmar que ésta contiene mentol, por lo tanto el resultado es conforme.

Se evaluó la ausencia de interferentes en las soluciones relacionadas en los ensayos

como el blanco, placebo y placebo más el principio activo de salicilato de metilo;

mediante el uso de cromatogramas, con la finalidad de discriminar la presencia de

componentes que puedan ser identificados en el mismo tR del mentol, de los

resultados se halló la ausencia de picos con similar tR que el mentol.

La determinación de la pureza se realizó mediante el análisis de la muestra y el

placebo sometido a condiciones de estrés como termólisis, fotolisis, hidrólisis acida,

hidrólisis alcalina y oxidación. Se determinó que la muestra y el placebo son

susceptibles a la formación de productos de degradación, por lo cual se evaluó la

ausencia de interferentes en el tR del mentol en los placebos y las muestras, además

se consideró para esta última que la separación del interferente próximo al pico de

mentol deberá tener una resolución mayor o igual a 1,5 para asegurar que los

componentes de la mezcla se separen adecuadamente. De los resultados se obtuvó la

ausencia de interferentes en el tR del mentol en los placebos y las muestras, en este

último también se determinó una resolución mayor a 1,5 de los interferentes

próximos con respecto al pico del mentol presente en la muestra, demostrando que el

resultado del ensayo no es afectado por la presencia de los excipientes y otros

interferentes.



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38

La exactitud; según la Guía de validación de métodos analíticos de la Asociación

Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), puede evaluarse mediante la

recuperación del analito denominado porcentaje de recuperación. También mediante

la aplicación del test G de Cochran (Gexp < Gtabla), para determinar si el factor

concentración tiene alguna influencia en los resultados. El test de t student (texp <

ttabla) para evaluar la diferencia significativa entre la recuperación media y 100 20,21.

En el cuadro 2, el porcentaje de recuperación promedio obtenido fue de 100,07% del

principio activo de mentol siendo los límites de aceptación de 98 -102%. Mediante el

test G de Cochran se determinó el Gexp=0,6803 y Gtabla=0,8709; al comparar del valor

de Gexp con Gtabla, se observó que este último es mayor, por lo tanto las varianzas de

las tres concentraciones utilizadas son iguales; es decir, el factor concentración no

influye en la variabilidad de los resultados. Como tercer estimador analítico se

consideró el “t Student”, donde el valor de texp=0,4175 es menor que el ttabla= 2,306;

al ser texp menor al ttabla no existe diferencia significativa entre la recuperación media

y el 100% confirmándose que el método es exacto.

Para evaluar el parámetro de linealidad; la USP 34 y la Guía de validación de

métodos analíticos de la AEFI, establecen que los resultados deben hallarse mediante

métodos estadísticos adecuados como el cálculo de una línea de regresión por el

método de los mínimos cuadrados, la intersección con el eje de ordenadas (b), la

pendiente de la línea de regresión (m) y la suma de los cuadrados residuales. Así

también se debe presentar el coeficiente de correlación (r) el cual indica el grado de

relación entre la variable X (concentración) y la variable Y (respuesta), el valor

recomendable es ≥ 0,995. El coeficiente de determinación (r2), expresa la proporción

de la variación total de Y explicada por el método, el valor recomendable es ≥ 0,990

3,20,22.

El test de linealidad, verificado mediante el coeficiente de variación de los factores

de respuesta (f), éste expresa la relación entre respuesta y la concentración, siendo

recomendable considerar la desviación estándar relativa (RSD) ≤ 2%; o la



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39

significación estadística de la desviación estándar de la pendiente mediante la prueba

t de Student, empleada para comprobar que exista una pendiente significativamente

distinta de cero. El test de proporcionalidad, el cual permite evaluar si la recta pasa

por el origen de coordenadas determinando si la variable independiente es

significativamente distinta de cero. El test estadístico del coeficiente de correlación

"r" (tr > ttabla) permite determinar si el coeficiente correlación “r” es lo

suficientemente grande para afirmar que hay correlación entre los valores X y Y

3,20,22.

En el cuadro 3 y 4, la ecuación de la recta de las cinco concentraciones de la solución

estándar resultó Y=0,0077X - 0,0070 y de la muestra Y=0,0078X - 0,0171. Del

análisis estadístico se obtuvó un valor de r=0,9999 para el estándar y r=0,9987 para

la muestra; para n-2 grados de libertad (n=15), lo cual demuestra que existe una

correlación positiva con una probabilidad superior al 99,99% para el estándar y una

probabilidad del 99,87% para la muestra. El valor de r2 para la solución estándar fue

de 0,9998 y de la muestra 0,9973; lo que significa que la variable independiente o

intercepto explica un 99,98% y 99,73% de la varianza total de Y respectivamente en

el estándar y la muestra.

En la linealidad del estándar, los límites de confianza de la pendiente hallados fueron

0,0077 y 0,0076; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación del test de t el

valor hallado de texp=285,6489 es mayor al ttabla=2,160; por lo tanto se rechaza la

hipótesis nula (b=0) y se acepta la hipótesis alternativa (b≠0); es decir, el valor

hallado indica que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada (> 99,5%). Los límites

de confianza del término independiente o intercepto hallados fueron de -0,0195 y

0,0055; este intervalo incluye el cero, en el test de t el valor obtenido de texp=1,2142

es menor al ttabla=2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula (a=0); es decir,

éste valor hallado indica que la probabilidad de ser a=0 es mayor (Superior al

99,5%), lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero.



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40

En la linealidad de la muestra, los límites de confianza de la pendiente hallados se

encuentran entre 0,0075 y 0,0080; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación

del test de t el valor obtenido de texp=69,3531 es mayor al ttabla=2,160; por lo tanto se

rechaza la hipótesis nula (b=0) y se acepta la hipótesis alternativa (b≠0); es decir, el

valor hallado indica que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada (> 99,5%). Los

límites de confianza del término independiente o intercepto obtenidos fueron de -

0,0735 y 0,0393; este intervalo incluye el cero, en el test de t el valor hallado de

texp=0,6544 es menor al ttabla=2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula

(a=0); es decir, éste valor hallado indica que la probabilidad de ser a=0 es mayor

(Superior al 99,5%), lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente

igual a cero.

En la aplicación del test estadístico del coeficiente de correlación "r", el valor

obtenido en la solución estándar fue tr=285,6489, para la muestra fue tr=69,3531 y el

ttabla=2,16; al hacer las comparaciones de los tr obtenidos con el ttabla se observó que

este último es menor que los dos primeros, con lo cual se rechaza la hipótesis nula

(HO: No hay correlación entre X e Y); es decir, hay una correlación significativa

entre los valores X y Y.

En la aplicación del test de linealidad, se determinó el valor promedio de f=0,0076

para la solución estándar y f=0,0077 para la muestra, los cuales indican que no existe

diferencia significativa entre el valor de la pendiente del estándar y de la muestra con

respecto a los valores de f hallados de cada determinación. Así también se halló el

valor de RSD=0,52% para la solución estándar y un RSD=1,94% para la muestra; los

cuales cumplen el test de linealidad.

La aptitud del sistema, es usado para verificar que las condiciones cromatográficas

sean adecuadas para el análisis; asimismo, según las recomendaciones dadas por la

USP 34 considera la expresión de la precisión del sistema como la RSD de

inyecciones repetidas de una solución estándar, siendo RSD ≤ 2% 3.



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41

En el cuadro 5, el RSD obtenido del análisis de las respuestas (ratios) halladas de la

solución estándar fue de 0,16%, por tanto las condiciones del sistema son adecuadas

para el análisis de cuantificación del mentol.

Tenemos como último parámetro de validación la precisión del método, según la

USP 34 la precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como el

RSD de una serie de medidas, considerándose el valor de RSD ≤ 2%. La precisión

puede considerarse en tres niveles repetibilidad, precisión intermedia y

reproducibilidad 3,24.

En el cuadro 6, dentro de las pruebas que se realizó incluyeron la repetibilidad y la

precisión intermedia. En la repetibilidad se obtuvó un RSD de 0,41% del ensayo

realizado por un analista. Para el caso de la precisión intermedia, se realizó

considerando el análisis en diferentes días y por un analista diferente cada día, se

analizó en las concentraciones del 80%, 100% y 120%, obteniendo un RSD de

0,33%. Con lo cual se comprobó el grado de concordancia (grado de dispersión)

entre una serie de medidas múltiples a partir de muestras homogéneas en las

condiciones establecidas en el método analítico aplicado.

De este modo, podemos constatar que el método fue suficientemente preciso, por lo

que no repercutieron apreciablemente los errores aleatorios en la determinación

considerando que la variabilidad del método puede deberse a errores aleatorios

inherentes a todo método de ensayo.

Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser

siempre controlados como: el analista, el equipo instrumental, los reactivos, el

tiempo, etc, es por ello la importancia de este parámetro de validación.



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42

V. CONCLUSIONES

1. El método analítico desarrollado para la cuantificación de mentol en

ungüento por cromatografía de gases cumple con los parámetros de

validación (Especificidad, Exactitud, Linealidad y Precisión) establecidos

por la USP 34 para el uso específico previsto.



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43

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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n/Optimization_and_validation_of_liquid_chromatography_and_headspace_gas_

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saicinoids_salicylic_acid_glycol_monosalicylate_methyl_salicylate_ethyl_sal

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13. Barquero Quiroz M. Principios Aplicaciones de la Cromatografía de Gases.

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15. Guía de Selección de Columnas Agilent J&W para GC. Agilent Technologies

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http://www.chem.agilent.com/Library/selectionguide/Public/5989-

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naproxeno sódico 550 mg. tableta por cromatografía líquida de alta

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18. Yagües G. Tema 3: Cromatografía de Gases. [Sede Web] 2008. [acceso 09 de

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ANEXOS



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ANEXO 1: TABLAS MILITAR ESTÁNDAR 105E

CODIGO DE

INSPECCIÓN



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49

NIVEL DE

ACEPTACIÓN

Fuente:

- Military Standard: Sampling procedures and tablesfor inspection by attributes.

- ISO 2859.



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1

ANEXO 2: ESQUEMA DEL MÉTODO

- Preparación del estándar interno

- Preparación del estándar

1 mL 1-Butanol

Fiola 100 mL Enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

Pesar aproximadamente

100 mg de mentol

estándar

Enrasar con metanol

Homogeneizar Transferir 5

mL

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar



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2

- Preparación de la muestra

Añadir 30 mL

metanol

Baño María

Enfriar

Enrasar con metanol

Homogeneizar Transferir 5

mL

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar


1,32 g de Muestra



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3

- Termólisis

ÁNALISIS DE MUESTRAS SOMETIDAS A CONDICIONES DE ESTRES


1,32 g de Placebo tratado

Añadir 30 mL

metanol

Baño María Enrasar con metanol

Homogeneizar

Transferir 5

mL

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

105°C X 5 h

15 g Placebo

y Muestra


1,32 g de Muestra tratada

Enfriar

Homogeneizar

Enrasar con metanol



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4

- Fotolisis


1,32 g de Placebo tratado

Añadir 30 mL

metanol

Baño María Enrasar con metanol

Homogeneizar

Transferir 5

mL

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

105°C X 5 h

15 g Placebo

y Muestra


1,32 g de Muestra tratada

Enfriar



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5

- Hidrólisis alcalina


1,32 g de Placebo

5 mL

NaOH 1N Baño María

Homogeneizar

Transferir 5

mL Homogeneizar

105°C X 5 h


1,32 g de Muestra

Enfriar Ebullición

x 1h

Enfriar

5 mL HCl

1N Añadir 30 mL

metanol



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6

- Hidrólisis acida

Enrasar con metanol Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Filtrar


1,32 g de Placebo

5 mL

NaOH 1N

Baño María

Transferir 5

mL

105°C X 5 h


1,32 g de Muestra

Enfriar Ebullición

x 1h

Enfriar

5 mL HCl

1N Añadir 30 mL

metanol



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7

- Oxidación

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar


1,32 g de Placebo

Baño maría

60m°C x 2h

Baño María

Transferir 5

mL

105°C X 5 h


1,32 g de Muestra

Enfriar

5 gotas de Peróxido

de hidrogeno

Enfriar

Añadir 30 mL

metanol



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Y B

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8

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Añadir 1 mL

estándar interno y

enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar



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ICA

9

- Muestra al 80%

EXACTITUD

Pesar 0.8 g Placebo

32 mg de estándar

mentol

Fiola 200 mL

100 mL metanol 4 mL estándar

interno

Baño maría

Hasta

homogeneizar

Enfriar

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

+



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10

- Muestra al 100%

- Muestra al 120%

Pesar 1 g Placebo

40 mg de estándar

mentol

Fiola 200 mL


interno

Baño maría

Hasta

homogeneizar

Enfriar

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

+



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Y B

IOQUÍM

ICA

11

Pesar 1,2 g Placebo

48 mg de estándar

mentol

Fiola 200 mL


interno

Baño maría

Hasta

homogeneizar

Enfriar

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

+



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Y B

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12

P 80 mg de mentol

estándar

P 32 mg de mentol

estándar

P 40 mg de mentol

estándar

Fiola 100mL

enrasar con

Metanol

Transferir 5mL

Fiola 50mL

Añadir 4 mL estándar

interno y enrasar con

metanol

Estándar 40%

P 48 mg de mentol

estándar

Fiola 200mL

Añadir 1 mL estándar

interno y enrasar con

metanol

Estándar 80%

Estándar 100%

Estándar 120%

LINEALIDAD DEL ESTANDAR



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13



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14

P 0.53g de Muestra

P 1.06g de Muestra

P 1.32g de Muestra

Muestra 40%

Muestra 80%

Añadir 30mL

metanol

Baño Maria Enfriar y

enrasar

metanol

Transferir 5mL

- Añadir 1mL

de estándar

interno

Muestra 100%

LINEALIDAD DE LA MUESTRA



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Y B

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15

Muestra 160%

P 2.11g de Muestra

P 1.58g de Muestra Muestra 120%



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16

- Muestras

PRECISIÓN DEL MÉTODO

80% - Pesar 1,06 g Muestra

Fiola 50 mL

Añadir 30 mL

metanol

Enfriar

Enrasar con

metanol

Transferir 5

mL

Baño maría





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Y B

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ICA

17

1 mL estándar

interno

Enrasar con metanol

Homogeneizar

Filtrar

Fiola 50 mL



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Y B

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ICA

18

ANEXO 3: PARAMETRO DE VALIDACIÓN DE ESPECIFICIDAD

1. Identificación del pico de mentol en la muestra

Estándar secundario Mentol:

Lote: 1011260


Protocolo: ST16/11


Diluciones:

Resultados:

Solución Inyección tR Promedio



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Y B

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Estándar

1 14,285 14,285

2 14,285

Muestra

1 14,287 14,286

2 14,286

Conclusión:

Se identificó que el mentol en la solución estándar tiene un tiempo de retención (tR) promedio igual a 14,285 y al compararlo con

el tR promedio del pico generado de la muestra; el cual es igual a 14,286, se puede afirmar que ésta contiene mentol, por lo tanto

el resultado es conforme.

2. Interferencias


Lote: 1011260


Protocolo: ST16/11


Factores:



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Y B

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20

Conclusión:

Ausencia de picos en el tiempo de retención del mentol en la solución blanco, placebo y placebo + principio activo (Salicilato de

metilo).

3. Análisis de muestras sometidas a condiciones de estrés



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Y B

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21


Lote: 1011260


Protocolo: ST16/11


Resultados:

Análisis de muestras sometidos a condiciones de estrés

Prueba Criterio de

aceptación Resultado Conformidad

Placebo tratado

(Termólisis)

Ausencia de


del pico de mentol

Ausencia Conforme

Placebo tratado

(Fotolisis) Ausencia Conforme

Placebo

(Hidrólisis acida) Ausencia Conforme

Placebo Ausencia Conforme



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Y B

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22

Tiempo de retención (tR)

Conclusión:

No existen compuestos potencialmente interferentes

(Hidrólisis alcalina)

Placebo (Oxidación) Ausencia Conforme

Muestra tratada

(Termólisis)

Ausencia de


del pico de mentol y

Resolución (Rs)≥ 1,5


Muestra tratada

(Fotolisis) Ausencia/Rs=14,776 Conforme

Muestra

(Hidrólisis acida) Ausencia/Rs=89,698 Conforme

Muestra

(Hidrólisis alcalina) Ausencia/Rs=128,912 Conforme

Muestra ( Oxidación) Ausencia/Rs=83,529 Conforme



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