REGULACIÓN HORMONAL DEL

METABOLISMO DELA GLUCOSA

Equipo 7.Blancas Mejía Sandra AngélicaMacías Hidalgo Víctor Francisco Pineda García Christian Eulises Villa Vázquez Margarita.

OBJETIVOS

Conocer la definición de hormonas. Conocer que las hormonas participan en la regulación

del metabolismo. Conocer los mecanismos de acción y transducción de

la señal por insulina: activación de proteínas cinasas y de proteínas involucradas en transporte y metabolismo.

Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la toma de glucosa por diferentes tejidos.

Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transducción de señales en el transporte de glucosa.

REGULACIÓN HORMONAL En las células eucariotas, la mayoría de genes

están regulados a nivel transcripcional ya sea por secuencias promotoras o intensificadoras (enhancers), a las cuales se unen factores de transcripción que permiten o incrementan la transcripción de un gen.

Ulrich Clever y Peter Karlson demostraron que hay moléculas efectoras originadas fuera de la célula que pueden regular la expresión genética en eucariotas, un ejemplo de estas moléculas son las HORMONAS.

Las hormonas Son señales químicas que

alteran o regulan la actividad celular y juegan un papel clave en la integración del metabolismo.

INSULINA

Hormona proteica

Hexámero de la proteína llamada proinsulina, la cual es producida y secretada por el páncreas a través de las células β de los islotes de Langerhans. Ésta pasa al aparato de Golgi donde sufre modificaciones (pierde un fragmento llamado Péptido C y forma enlaces disulfuro) formando a la insulina.

ACCIÓN DE LA INSULINA La insulina circula en plasma formando

dímeros o hexámeros, que se separan en moléculas individuales para activar al receptor.

Estimula el almacenamiento de combustibles y la síntesis de proteínas. ES DECIR PROMUEVE PROCESOS ANABÓLICOS (EXCEPTO LA INDUCCIÓN QUE HACE DE LA GLUCOLISIS QUE ES EL ÚNICO PROCESO CATABOLICO PROMOVIDO POR INSULINA)

Actúa sobre las cascadas de proteínas cinasas.

POR LO QUE, Acelera la glicólisis hepática, la cual a su vez,

incrementa la síntesis de ácidos grasos. Estimula la síntesis de glucógeno tanto en el

músculo como en el hígado, al tiempo que suprime la gluconeogénesis en el hígado.

Favorece la captación de amino ácidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) por el músculo, lo que favorece la síntesis de proteínas musculares. Además inhibe la degradación proteica intracelular.

El receptor se autofosforila en un residuo de tirosina lo que desencadena la fosforilación de proteínas como IRS-1y Shc.

Señalización dependiente de insulina Después de que ocurre la

autofosforilación del receptor, Las proteínas cinasas lo reconocen y

se activan, fosforilando a otra cinasa. Pueden activar a 1) enzimas que son parte del

metabolismo: glucogénesis, síntesis de lípidos, síntesis de proteínas y el catabolismo de la glucosa

2) A otras cinasas para activar la movilización de vesículas de membrana

¿Cómo ocurre la activación debida a insulina?

Por lo que se activa el transporte de la glucosa. A TRAVÉS DE LA MOVILIZACIÓN DE VESÍCULAS CON TRANSPORTADOR.

Por lo tanto promueve la entrada de glucosa en las células que tienen al transportador almacenado en vesículas.

Tejidos denominados insulino dependientes para el transporte como son: el músculo y el tejido adipos0.

Transportadores de glucosa (GLUT) Los miembros de la familia GLUT1 a 5, constan de

una sola cadena polipeptídica de unos 500 aa. La proteína tiene 12 segmentos transmembranales. El centro de unión de glucosa mira alternativamente hacia dentro y hacia afuera de la célula, cuando está ocupado por el azúcar.

Transportador de glucosa

GLUT 4

El GLUT4, transportador de glucosa con una KM de 5 mM, es mediador en la entrada de glucosa en el músculo y en células grasas.

La insulina, induce un rápido aumento del número de transportadores GLUT4 en la membrana plasmática. Causando un incremento de 10 a 40 veces la toma de glucosa

OTROS TRANSPORTADORES DE MONOSACÁRIDOS

Material biológico Hígado, músculo y tejido adiposo de rata.

Reactivos− Solución Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (130mM NaCl,

5mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2mM MgSO4 7 H2O, 10 ⋅mM Glucosa, 1 mM CaCl2 2 H2O, 0.2% BSA y 20 ⋅mM HEPES pH 7.0)

− 0.9% NaCl− Solución de insulina 2000 μU/mL− 4 μM Wormanina

SOLUCIÓN KREBS-RINGER- GLUCOSA-HEPES Es un buffer que mantiene la presión osmótica del

tejido tal y como si estuviera en el cuerpo de la rata; además proporciona una cantidad importante de glucosa al medio para poder determinar la efectividad de la insulina.

SOLUCIÓN DE HEPES Es un buffer orgánico, altamente utilizado en cultivos

celulares, ya que es bueno manteniendo el pH fisiológico aún con cambios en la concentración de dióxido de carbono (producido por la respiración celular).

Es bueno manteniendo la estructura y funcionalidad de las enzimas a bajas temperaturas.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

• Extracción de los tejidos de las ratas

Paso 1

AISLAMIENTO DE TEJIDOS.Posteriormente realizar dislocación cervical.

Sujetar y levantar la piel con unas pinzas y hacer una incisión a lo largo de la línea media con tijeras y abrir la piel a cada lado.

Recolección de los órganos : Hígado, tejido adiposo y músculo.

LOCALIZACIÓN DE ALGUNOS ÓRGANOS DE LA RATA.

PASO 1

Protocolo de inducción de la toma de glucosa por insulina y determinación del efecto de wormanina en el proceso de transducción de señales iniciado por insulina.

PASO 2

PREINCUBACIÓN DEL TEJIDO CON WORMANINA

Colocar 2 mL de solución Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-

Glu) en un tubo falcón de 50 mL marcado como W. Adicionarle

50 μL wormanina para una

concentración final de 100 nM.

Pesar el tubo con el líquido. Añadir un trozo del tejido y volver a pesar el

tubo.

Incubar por 30 min a

37°C. Este paso es la

preincubación del

tejido con wormanina

.

Añadir 0.5 mL de la solución

de insulina 2000 μU/mL y

0.5 mL de NaCl 0.9%. Mezclar e Incubar en baño de agua con agitación moderada a 37°C por 30

min.

Añadir 47 mL de agua.

Filtrar el tejido.

Determinará el

contenido de glucosa

PASO 2

WORTMANINA: Wortmanina es un metabolito esteroide de una

micotoxina del Myrothecium roridium y del Penicillium wortmanni

Metabolito fúngico capaz de entrar en células intactas y puede inducir la muerte celular por apoptosis.

Inhibidor de la fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K) Se une de manera específica al sitio de unión de ATP

de la enzima

PASO 2

PASO 2

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GLUCOSA TRANSPORTADA.

OBJETIVOS

Conocer el fundamento de la determinación de glucosa, método de Nelson-Somogyi.

Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.

PASO 2

REACTIVO DE SOMOGY-NELSON

El reactivo de Somogy es una solución de Cu+2, que en contacto con un agente reductor (azúcar) pasa a Cu+1. El método se basa en un medio alcalino, los glúcidos reductores reducen el ión cúprico a cuproso.

Reactivo Arsenomolibdico o reactivo de Nelson: El reactivo de Nelson es una solución de Mo+4 que en

contacto con un agente reductor (Cu+1) pasa a Mo+2. Está compuesto por Molibdato de Amonio, Arsénico

disódico 7 H2O, ácido Sulfúrico y agua destilada. Los iones cuprosos, formados por la acción reductora de los glúcidos, al reaccionar con el reactivo Arsenomolibdico, el Molibdeno hexavalente se reduce y toma un intenso color azul que es proporcional a la concentración inicial de azúcar reductor.

PASO 3

REACTIVOS

Solución patrón de glucosa, 200 μg/mL. Solución A para determinación de glucosa.

Contiene Na2CO3, tartrato de sodio y potasio, NaHCO3 y Na2SO4,

Solución B para determinación de glucosa. CuSO4 y H2SO4

Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solución A + 1 parte de

solución B. Prepararlo justo antes de usarlo. Reactivo de arsenomolibdato ((NH4)6Mo7O24,

Na2HAsO4 y H2SO4

PASO 3

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Numerar los tubos de ensayo según se indica en la tabla.

Descongelar los sobrenadantes y agitar.

Añadir los reactivos en la cantidad y orden señalados

C

á

l

c

u

l

o

d

e

l

a

t

o

m

a

d

e

g

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u

c

o

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a

p

o

r

e

l

t

e

ji

d

o

.

a) Elaborar la curva patrón de la glucosa.

PASO 3

b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recordando que la solución Krebs-Ringer tiene una cantidad inicial de glucosa.

Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes, utilizando los valores de regresión lineal obtenidos en el inciso a).

Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el inciso b) y la determinada para cada muestra problema

Dividir entre el peso en gramos del tejido que se coloco , para obtener lo μg de glucosa transportada por gramo de tejido

d) Realizar la gráfica de toma de glucosa (μg de glucosa incorporada/ g tejido) vs concentración de insulina y añadir en la misma gráfica el resultado de insulina más wormanina.

PASO 3

PASO 3