Epigenética: Silenciamiento o interferencia (iRNA)

• Turner et al. (2006) fueron los primeros después de alimentar larvas de la polilla de la manzana (Epiphyas postvittana) con dsRNAs dirigidos contra un gen codificante para carboxiesterasa, incorporados en una dieta artificial. 

• En el trabajo de Baum et al. (2007) demuestran la factibilidad del sistema contra un coleóptero de maíz (Diabrotica virgifera) y un lepidóptero de algodón (Helicoverpa armigera) y obtuvieron también buenos resultados  contra la vaquita colorada de la papa aunque fracasaron con el picudo del algodón. 

• En el trabajo de Mao et al. (2007) obtuvieron protección contra la oruga capullera del algodón y no ensayaron el sistema contra el picudo. 

¿Qué proponemos que sea distinto a lo ya hecho?

Hacerlo con genes nativos de picudo y no de un lepidóptero poco relacionadoTrabajar con genes de mayor efecto potencial (factores de transcripción, microRNAs)Construcciones que ataquen más de un gen en forma simultánea¿Combinación con Bt?

Primera etapa:Secuencias de genes esenciales de Anthonomus grandisinvolucrados en el desarrollo del insecto y por lo tanto blanco del silenciamiento génico. 1. Obtención de RNA en cantidades suficientes para secuenciarlos por pirosecuenciación2. Almacenamiento de datos provenientes de la pirosecuenciación del transcriptoma del intestino del picudo algodonero3. Análisis bioinformático de las secuencias y cuantificación relativa de los niveles de expresión de los mensajeros diferenciales 

Estrategia diseñada

Transgén para iRNA de un gen esencial para el picudo

iRNA

AnatomAnatomíía interna a interna

ExtracciExtraccióón de intestino y n de intestino y diseccidiseccióón de la regin de la regióón n

correspondiente al intestino correspondiente al intestino medio de larvasmedio de larvas

Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera, Curculionidae)

Extracción de ARN total utilizando TRIZOL

1.Colocar en un eppendorf de 1,5 ml 10 intestinos con 1 ml de TRIZOL2.Homogeneizar3.Transferir el homogenato a un eppendorf de 1,5 ml y centrifugar por 10 min a 12000 x g (11700 rpm) a 2-8 ºC.4.Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y agregar 0,2 ml de cloroformo por cada ml de TRIZOL usados al comienzo.5.Agitar vigorosamente por 15” e incubar a 15-30ºC por 2-3’.6.Centrifugar a no más de 12000 x g por 15’ a 2-8ºC.7.Deberán diferenciarse las dos fases, en la inferior, la orgánica, se debería ver el tono rojizo, mientras que en la superior, la acuosa, seencuentra el ARN.8.Fase acuosa: DNA, RNA, proteínas9.Fase orgánica: Fenol-cloroformo (rojiza): Lípidos, restos de membranas10.Agregar isopropanol (agregar 0,5 ml por ml de TRIZOL usado al comienzo) para precipitar el ARN11.Incubar a 15-30ºC por 10’ y centrifugar a no más de 12000 x g (11000 rpm) por 10’ a 2-8ºC.12.Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 75% (1 ml cada ml de TRIZOL al inicio)13.Mezclar y centrifugar a 7500 xg (8000 rpm) por 5’ a 2-8ºC.14.Eliminar el etanol y dejar secar.15.Disolver en unos 20 µl de agua libre de RNasa, pipetear e incubar a 55-60ºC por 10’.

Fase acuosaARN

Extracción de intestino (región de intestino medio)

Se procesaron aproximadamente 500 larvas, colocando grupos de 10 intestinos en 500 ul de TRIZOL

Calidad y cuantificación de muestras de RNA

Cuantificación y control de calidad del RNA

Selección de las muestras que mostraron valores óptimos de OD relación 260/280 >1.8 y 260/230>1.8

Análisis mediante geles de agarosa

3) Análisis mediante BioAnalyzer

Nanodrop BioAnalyzer

Muestra 260/280 260/230 ng/ul RNA Integrity Number (RIN):

1 1,88 1,94 3210,96 1,00

2 1,89 1,88 3139,90 N/A

3 1,85 1,83 3166,46 6,70

4 1,85 1,69 3610,78 5,80

5 1,81 1,66 3629,61 3,30

6 1,95 1,91 2705,35 N/A

7 2,00 1,95 2368,22 7,10

8 2,02 1,99 2196,35 7,40

9 2,00 1,93 2614,50 7,70

10 2,00 1,96 2446,27 7,00

11 2,06 2,24 1639,09 N/A

11 (duplicado) 2,06 2,24 1639,09 N/A

Análisis mediante Nanodrop y BioAnalyzer

En amarillo se indican las muestras de mejor calidad.

Se seleccionan las muestras 7, 8 y 9 para su envío al servicio de secuenciación.

Inicio de trámites para secuenciación: Pedido de presupuesto para secuenciación a dos empresas americanas y una europea. Envío de muestras a LifeSequencing (Valencia, España)

Se poseen los resultados de la secuenciación de la muestra de cDNA.

Se han obtenido cerca de 400.000 lecturas de 236,7 pares de bases.

Se realizaron los ensamblajes y se poseen los datos en el cluster.

Actualmente se está realizando el análisis bioinformático de las secuencias obtenidas.

SecuenciaciSecuenciacióón del transcriptoma de intestino medio de n del transcriptoma de intestino medio de A. grandisA. grandis

Personal Involucrado

Alicia ScioccoEntomología Molecular

Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola

Instituto de Biotecnología

Ricardo SalvadorBecario postdoctoral

Financiación