enzimo terminado

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1. INTRODUCCINEl mtodo clsico de clonacin de cidos nucleicos es el queaprovecha la capacidad de las clulas para replicar el DNA.Surge gracias a la aparicin de una serie de tcnicas quepermiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en losaos 70 de las enzimas de restriccin, que hace posible en ellaboratorio cortar el DNA e incorporar los fragmentos avectores, que a su vez se introducen en clulas anfitrionas,donde tiene lugar su replicacin. Aunque, en principio, estatecnologa slo se planteaba para clonacin del DNA, existenactualmente variantes que amplan su eficiencia y extiendensu aplicacin al RNA. 2. ENZIMAS DE RESTRICCINPara poder describir el proceso de clonacin del DNA, es necesario hacer un inciso paraestudiar con cierto detenimiento las propiedades y caractersticas de las endonucleasas derestriccin. Aunque estas enzimas desempean una funcin propia en las clulas procariotasen las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental envarias reas de la Biologa Molecular, de inters tanto bsico como aplicado al diagnsticoclnico. En especial, se utilizan en el proceso de la clonacin molecular de DNA; de ah laoportunidad de su estudio en este lugar. Adems, tienen aplicacin en otras tcnicas, comola secuenciacin del genoma y el estudio de los polimorfismos, se inicia el estudio de estasenzimas con un breve recordatorio de las nucleasas en general.INTRODUCCIN A LAS NUCLEASASSe denomina de forma genrica nucleasa a cualquier enzima con capacidad de escindir losenlaces fosfodister de la cadena polinucleotdica de los cidos nucleicos; son por tanto,fosfodiesterasas. Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios: 1. Escisin en posiciones internas o terminales en la estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas, respectivamente). 3. Las exonucleasas hidrolizan exclusivamente enlaces fosfato en los que participa el nucletido terminal (bien 5o bien 3, dependiendo de la exonucleasa). Generan, por tanto, una cadena polinucleotdica acortada y un nuclesido (N), un nuclesido- monofosfato (pN o Np) o un nuclesido-bifosfato (pNp). Las endonucleasas slo hidrolizan enlaces internos de la cadena, es decir, sin afectar a los nucletidos terminales. Generan dos fragmentos polinucleotidcos.2. Actuacin sobre uno de los dos tipos de enlace fosfoster: Algunas nucleasas (tipo a) actan especficamente hidrolizando los enlaces fosfato formados con el OH 3, mientras que otras (tipo b) hidrolizan los formados con el OH 5. De este modo, las de tipo a dan lugar a extremos 3-OH y 5-P, mientras que las de tipo b producen extremos 3-P y 5-OH. Ejemplos de especificidad tipo a y b de endonucleasas: 4. 3. Reconocimiento de nuclesidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada(slo en algunas nucleasas): desoxirribonucleasas o DNasas, que actan slo sobreDNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA; finalmente, algunas nucleasasdistinguen entre nuclesidos purnicos de pirimidnicos.Ejemplos de especificidad por nuclesidos: ENZIMAS DE RESTRICCINCaractersticas GeneralesLas enzimas de restriccin se llaman tambin nucleasas de restriccin, endonucleasas derestriccin y, en ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas. Pertenecen a este grupouna gran diversidad de endodesoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias dedistintas bacterias y caracterizadas en los aos 70. Se disponen hoy comercialmente deun gran nmero de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza. 5. Se nombran con tres letras tomadas del gnero y especie de la bacteria de la que seaislaron originalmente, seguidas a veces por una letra ms, que identifica el serotipo(variantes antignica de la bacteria), y finalmente por un nmero romano que las identificaen el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas condistinta especificidad:La importancia de las enzimas de restriccin radica en su gran especificidad dereconocimiento de una secuencia corta de DNA dplex y la consiguiente hidrlisis de unenlaces fosfodister en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNAllamadas sitios de reconocimiento o de restriccin. Los fragmentos de DNA originados sontiles para iniciar la clonacin celular o acelular, para el anlisis de DNA, para elaborarmapas fsicos de restriccin, para la deteccin de polimorfismos, etc.Las diversas enzimas de restriccin se agrupan normalmente en tres familias, de acuerdocon sus propiedades: 6. Nos concentraremos en el estudio de las enzimas de tipo II, pues, al cortar en secuencias muy definidas, son loas utilizadas como herramientas en ingeniera gentica. Papel biolgico del sistema metilacin-restriccin La existencia natural de las nucleasas de restriccin en muchas bacterias ofrece a estas un mecanismo de defensa contra la entrada de material gentico de otro organismo, concretamente de virus bacterifagos (cuya reproduccin depende de la maquina gentica de la bacteria): se trata de los sistemas de restriccin-modificacin o metilacin- restriccin. Para cada enzima de restriccin, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de restriccin y une covalentemente grupos metilo a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la metilasa es una protena independiente, mientras que las de tipo I y III poseen las actividades nucleasa y metilasa en su molcula oligomrica, como subunidades que actan coordinadamente. El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una forma especfica caracterstica de cada especie bacteriana (en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilacin de las bases impide la unin de la enzima de restriccin, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la clula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrn de metilacin diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restriccin, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma habr un cierto nmero de secuencias de 4,6 u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habr secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo de accin combinada surgi precisamente el nombre de enzimas de restriccin: la accin de la nucleasa restringe la posibilidad de infeccin por virus. 7. Si est metilada una solo hebra del DNA, el sito no es reconocido por la enzima derestriccin, pero si por la metilasa, que aade el grupo metilo a la otra hebra. Esto es loque ocurre, por ejemplo, al final de la replicacin, donde el dplex est formado por unahebra molde, preexistente y, en consecuencia, metilada, y la otra hebra recinsintetizada, que an carece de grupo metilo. Esta accin de las metilasas asegura quetodo el DNA de las dos clulas hijas quede metilado lo antes posible.La metilacin del DNA afecta principalmente a citosinas y adeninas de la secuenciareconocida. En la reaccin, las metilasas utilizan como donador del grupo metilo elcompuesto S-adenosilmetionina. 8. Debe adelantarse que la metilacin del DNA interviene en eucariotas como unmecanismo de regulacin de la expresin gnica, aunque este proceso no tiene nadaque ver con el mecanismo de proteccin que desempean los sistemas metilasa-restrictasa en procariotas. Esencialmente, en eucariotas los genes tienden a estardesmetilados en los tejidos donde se expresan y metilados donde no se expresan,especialmente en las regiones de DNA llamadas islotes CpG, por tener esta secuenciadinucleotdica en la que C sufre la metilacin. Accin de las enzimas de restriccin de tipo II. Son estas las restrictasas estructuralmente ms simples y las mejor estudiadas por su utilidad en Ingeniera Gentica, a modo de tijeras para el corte del DNA. El sitio de restriccin es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrlisis. Se hidrolizan de forma muy especfica enlaces fosfoster del DNA, uno en cada hebra, generndose dos fragmentos de restriccin. El enlace hidrolizado es siempre el 3-P (es decir, son endonucleasas del tipo a,), por lo que el fosfato queda unido a 5,dejando en ambos fragmentos extremos 3 -OH y 5-P.la reaccin no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las enzimas de tipo I y III. 9. Ilustracin de los distintos tipos de extremos resultantes de la accin de enzimas derestriccin:Algunas enzimas de restriccin de tipo II empleadas en Ingeniera Gentica: 10. * Extremos compatibles: en algunos casos, distintas enzimas de restriccin generan extremoscuyo saliente tiene la misma secuencia. Ejemplo: Bam HI, Bgl II Y MboI ( ).* Isoesquizmeros: nombre que se aplica a dos o ms enzimas que reconocen la mismasecuencia; pueden cortar en el mismo punto o bien se diferencian en que el corte o la metilacinasociada tienen lugar en puntos distintos dentro de esa secuencia comn de reconocimiento. Ejemplos: MboI y Sau 3AI ( ); Acc 651 y KpnI ( ).Obsrvese que en todos los casos los extremos de los dos fragmentos generados sonidnticos, tienen la misma secuencia (se puede ver girando 180 uno de ellos). Esto esconsecuencia de la simetra del palndromo y de la posicin simtrica de los puntos decorte en cada hebra. Todo ello se debe a que la enzima acta en forma de dmero, portanto reconociendo una misma secuencia y cortando un mismo tipo de enlace en las doshebras: por ejemplo, Eco RI corta el enlace (5) GAATTC (3) en ambas hebras. Laformacin de extremos cohesivos es de gran inters aplicado en ingeniera gentica, puesfragmentos generados con una misma restrictasa a partir de dos DNAs distintos puedeninteraccionar mediante el apareamiento de las bases de sus extremos cohesivos (talinteraccin no es posible entre extremos romos). Igualmente se pueden asociar losfragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles.Debe resaltarse que el producto de la reasociacin de los dos fragmentos en ninguno delos casos es idntico al DNA de partida, pues est formado por dos molculas. La falta deenlace covalente entre los extremos de los fragmentos r