Generalmente considerado agradable y altamente demandada por los consumidores, frutas altoandinos son comnmente comercializados frescos en la misma regin donde se producen. Estas frutas tienen una vida til corta con un rpido deterioro de sus propiedades en esta fase, lo que afecta su calidad. Por lo tanto, es necesario disear estudios de los procesos fsicos, fisiolgicos y bioqumicos que caracterizan su maduracin. En la regin andina, una amplia gama de especies frutales con buen potencial agronmico han sido identificados, incluyendo curuba redonda o gulupa (Passiflora edulis Sims) (Lobo, 2000). La mayor parte de la produccin de esta especie en Colombia se exporta (por lo general a los mercados europeos) que alcanza 2.250 t en 2012, con un valor de US 9,75 millones dlar (Agronet, 2012).Las enzimas pueden estar activos durante poscosecha y los cambios que determinan pueden influir positiva o negativamente en las caractersticas organolpticas de la fruta, por lo que es importante conocer las diferentes reacciones que catalizan en los tejidos vegetales, con el fin de explotar sus ventajas y evitar sus efectos indeseables (Toms-Barbern y Espn, 2001). Una gran parte de la fraccin proteica de fruta sometida a los cambios en las diferentes etapas de maduracin est constituido por enzimas (Belitz y Grosch, 1997; Abu-Goukh y Bashir, 2003), que determinan, entre otros procesos, la susceptibilidad a la pre y deterioro manejo poscosecha . Dentro de la fruta, las enzimas estn involucradas en reacciones anablicas y catablicas, actuando slo de acuerdo con las necesidades celulares. Si las clulas se lesionan, algunas enzimas se liberan de sus compartimentos y entran en contacto con el sustrato correspondiente, resultando en diferentes reacciones que no son siempre deseables (Brummell y Harpster, 2001). Las enzimas realizan actividades especficas en diferentes etapas de desarrollo. Sin embargo, cuando se utiliza la planta (o fruta) como alimento, todos los cambios posteriores en el punto de consumo ptimo son indeseables y deben evitarse durante la manipulacin y el almacenamiento (Haard, 1985).

Una de las enzimas que participan en las reacciones de maduracin de la fruta es la a-amilasa (EC 3.2.1.1), que promueve la hidrlisis de enlaces glicosdicos a-1-4 y un 1-6 de almidn, produciendo as oligosacridos, tales como maltosa y glucosa. Este proceso tiene lugar incluso si la fruta se ha separado de la planta en la etapa preclimatrica. Esto permite cosecha temprana (pre-climaterio), que, cuando es seguido de almacenamiento en condiciones controladas, impide que el fruto de la maduracin antes de su comercializacin (Bowers, 1992; Granados, 1994; Garca y Pea, 1995; Seymour y Gross, 1996; Willats et al., 2001; Arellano et al., 2005; Menndez et al, 2006)..

Pectinmetilesterasa (PME; EC 3.1.1.11) est relacionada con la degradacin de las sustancias pcticas de la lamela media de las clulas. PME hidroliza los metoxilo y carboxilo grupos de pectina, dando pectinas de bajo metoxilo. Este proceso produce grupos carboxlicos libres (cido ctrico) que participan en la regulacin del pH, de la pared celular equilibrio inico y otras actividades enzimticas hidrolticas. Actividad PME no afecta ablandamiento durante la maduracin, pero altera sustancialmente la integridad de la fruta durante el procesamiento (Hagerman y Austin, 1986; Granados, 1994;. Willats et al, 2001; Aponte y Guadarrama 2003, Menndez et al., 2006). Ms tarde, algunas otras enzimas catalizan la hidrlisis de las cadenas de cido poligalacturnico, lo que resulta en unidades individuales de cido D-galacturnico (Granados, 1994). Datos genmicos han demostrado recientemente que la PME pertenecen a grandes familias multigene cuyas estructuras primarias y cuaternaria se conservan entre los taxones vegetales (Pelloux et al., 2007). Esta enzima es inhibida por los cidos fenlicos y activado por el etileno, segn lo informado por Arellano et al. (2005) despus de investigar su actividad en zapote negro (Diospyros digyna Jacq).

Poligalacturonasa (PG; EC 3.2.1.15) hidroliza los enlaces glucosdicos de poligalacturonidos desesterifica, azcares y cidos orgnicos que producen. Junto con PME, PG constituye un sistema de enzima que provoca la degradacin textura de la fruta y los resultados en la dureza del consumo adecuado. Sin embargo, la actividad excesiva aumenta la concentracin de cido galacturnico, que causa el ablandamiento notable y hace que la fruta ms susceptible al ataque de patgenos (Bowers, 1992; Garca y Pea, 1995; Menndez et al., 2006).

En presencia de oxgeno molecular, polifenol oxidasa (PPO; EC 1.10.3.1) cataliza la oxidacin de compuestos fenlicos, no slo conducen a productos que son responsables de pardeamiento enzimtico durante la cosecha, poscosecha, procesamiento y almacenamiento, pero que determinan en gran medida la calidad y valor econmico de las frutas y verduras, as. Moretones, esquejes y otros daos planta mecnica de las paredes celulares permiten que el oxgeno penetre y entre en contacto con las enzimas y sus sustratos, lo que resulta en procesos de oscurecimiento o pardeamiento (Garca et al, 2006;.. Ayaz et al, 2008; Guerrero, 2009 ; Llorente, 2010; Oort, 2010). PPO es una enzima unida a la membrana, la accin del etileno en la permeabilidad de la membrana durante la maduracin puede promover la accin de la enzima sobre compuestos fenlicos (Arellano et al, 2005;.. Castro et al, 2006). Llorente (2010) afirma que este tipo de enzima no se ha asignado una ubicacin precisa dentro de una ruta metablica y que su funcin biolgica no est claro todava.

Dada la importancia de las reacciones en las que estas enzimas tienen lugar y sus efectos sobre la calidad de la fruta, el presente estudio tuvo como objetivo identificar la actividad enzimtica en frutas gulupa durante la pre y poscosecha, con el fin de contribuir a la gestin de los cultivos en estas etapas.

MATERIALES Y MTODOS

Ubicacin. El cultivo experimental fue plantado en La Selva del Centro de Investigacin (Rionegro, Antioquia, Colombia), que pertenece a Corpoica (67'49 '' N, 7524'49 '' W; 2.090 msnm, la temperatura promedio de 17 C; precipitacin anual de 1917 mm; la humedad relativa media [RH], el 78%; insolacin media, 1.726 horas / ao, y la evapotranspiracin promedio, 1.202 mm), que corresponde a una Montane Selva Baja (LM-rf).

El material biolgico. El ensayo se realiz en un rea experimental en 10 accesiones gulupa se plantaron al azar. Los materiales son parte del Banco de Colombia Gen (administrado por Corpoica), que, despus de Amplified Fragment Length Polimorphism (AFLP) y simple secuencia de repeticin (SSR) el anlisis de marcadores moleculares, se inform a tener una baja variabilidad gentica (Ortiz, 2010). Segn ngel et al. (2011), los frutos se obtuvieron de flores homogamticos con y sin hercogamia, que fueron etiquetados con hilos de colores, estas etapas estn tomando como da cero de la edad de la fruta. Desde entonces, los registros de tiempo se marcaron como das despus de la floracin (DAF). La cosecha se realiz a los 91 DAF segn lo establecido por Franco et al. (2013).

Procedimiento experimental. Para todos los anlisis, se realizaron muestreos destructivos cada siete das a partir de 49 a 112 DAF DAF, a excepcin de PPO, que se determina a partir de 84 DAF en adelante. Para el anlisis post-cosecha, se recogieron los frutos desde 91 DAF y monitoreadas cada siete das hasta los 21 das despus de la cosecha, coincidiendo con el 98, 105 y 112 DAF. Estos registros se utilizaron para comparar la actividad enzimtica de las frutas y fuera de la via. La unidad de muestreo consisti en 10 frutos que se haban reunido al azar de los materiales plantados, formando muestras equilibradas de forma independiente con respecto al tamao de la fruta. Ellos fueron transportados en cajas de espuma de poliestireno que contienen hielo seco (temperatura interna de 4 C). Las determinaciones se realizaron en el laboratorio de Ciencias de la Alimentacin de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Variables de poscosecha se evaluaron en el Laboratorio de Poscosecha de Corpoica.

Jugo crudo se obtuvo mediante la reduccin de los frutos a travs de la zona ecuatorial y tamizando la pulpa y las semillas. Todos los procedimientos se realizaron en un recipiente que contiene hielo, a fin de obtener una temperatura de aproximadamente 4 C. El jugo resultante se coloc en un recipiente enfriado con hielo. Para la determinacin de la actividad enzimtica, el jugo de frutas 10 se mezcl hasta homogeneidad completa, con la consiguiente extraccin de tres muestras para su anlisis.

a-amilasa actividad. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 5 g de pasta con 10 ml de una solucin tampn de citrato 0,05 M (pH 4,5, EDTA 13 mM, 10 mM 2-mercaptoetanol, y 1% de polivinilpirrolidona [w / v]). Por 40 minutos, la mezcla se centrifug a 4.000 rpm y 4 C en una centrfuga LABNET Hermle Z366. El sobrenadante se utiliz para el anlisis de la enzima. a-amilasa actividad se determin por el mtodo descrito por Bernfelds (1955) con algunas modificaciones. 250 l de extracto de enzima se aadieron a una solucin de almidn al 1% en tampn fosfato 0,02 M (pH 6,9) y se mantuvo a 23 C durante 10 min. La reaccin se detuvo mediante la adicin de 500 l de una solucin DNS 1% y la mezcla se llev a 90 C durante 5 min, despus de lo cual se enfri en bao de hielo. La absorbancia a 540 nm fue ledo por medio de un Thermo Scientific Genesis 20 espectrofotmetro UV-Vis. La actividad de la a-amilasa se expres como mol min-1 de maltosa liberada por mg de protena total en las condiciones del experimento.

Actividad PG. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 5 g de pasta con 10 ml de una solucin tampn de citrato 0,05 M (pH 4,5, EDTA 13 mM, 10 mM 2-mercaptoetanol y 1% de polivinilpirrolidona [w / v]). Por 40 minutos, la mezcla se centrifug a 4.000 rpm y 4 C en una centrfuga LABNET Hermle Z366. El sobrenadante se utiliz para el anlisis de la enzima. Siguiendo la metodologa por Nelson (1944), la actividad PG se determin por medicin espectrofotomtrica (Miller, 1959) de los azcares reductores generados despus de la accin de la enzima sobre el cido poligalacturnico. 60 l de extracto de enzima se aadieron a 540 l de un 0,4% (w / v) solucin de cido poligalacturnico en 0,05 M de tampn de acetato, pH 4,0. Esta mezcla se incub a 37 C durante 10 min y la reaccin se detuvo mediante la adicin de 600 l de una solucin DNS 1%. La mezcla se llev a 90 C durante 5 min, despus de lo cual se enfri en bao de hielo. La absorbancia a 540 nm fue ledo por medio de un Thermo Scientific Genesis 20 espectrofotmetro UV-Vis. Actividad PG se expres como mol min-1 de cido galacturnico liberados por mg de protena total, en las condiciones del experimento.

La actividad PME. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 4,5 g de pulpa con 15 ml de un 8,8% (w / v) solucin de NaCl. La mezcla se agit vigorosamente durante 30 s y luego se centrifug a 4000 rpm y 4 C en una centrfuga LABNET Hermle Z366 durante 40 min. El sobrenadante constituy el extracto de enzima, que se ajust a pH 7,5 con 0,1 N NaOH. Actividad PME se determin mediante la monitorizacin del cambio de pH producido por la hidrlisis del enlace ster en la molcula de cido poligalacturnico travs de azul de bromotimol (que absorbe a una longitud de onda de 620 nm) cambio de color. Para la determinacin de la actividad enzimtica apropiada, 100 l de extracto de enzima se aadieron a 200 l de una solucin de NaCl 0,15 M, 100 l de 0,5% (w / v) azul de bromotimol y 1 ml de una solucin de pectina ctrica 0,25% (w / v ) ajustado a pH 7,5 con 0,1 N NaOH. Despus de tres minutos, la diferencia en la absorbancia a 620 nm, que fue ledo por medio de un espectrofotmetro Multiskan V1.2 Spectrum Thermo Scientific, expresa la actividad enzimtica como dAb min-1 por mg de protena total, en las condiciones del experimento (Hagerman y Austin, 1986).

Actividad de la PPO. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 4 g de pasta con 20 ml de una solucin tampn de fosfato 0,2 M (pH 7,0) que contiene 0,4 g de polivinilpirrolidona (PVP). La mezcla se agit vigorosamente durante 30 s y luego se centrifug a 400 rpm y 4 C en una centrfuga LABNET Hermle Z366 durante 40 min. El sobrenadante constituy el extracto enzimtico. Actividad de la PPO se determin basndose en el mtodo descrito por Garca (2006), en el que una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que produce un aumento de absorbancia de 0,001 unidades min-1 a 30 C. Un millar l de extracto de enzima se aadieron a 1480 l de una solucin de catecol 100 mM y 500 l de tampn de fosfato 0,2 M, pH 7,0. La mezcla se llev a 30 C durante 3 min, despus de lo cual la absorbancia a 420 nm fue ledo por medio de un Thermo Scientific Genesis 20 espectrofotmetro UV-Vis durante 5 min. La actividad de PPO se expres como UA min-1 por mg de protena total, en las condiciones del experimento.

La protena total. La protena total se midi por el mtodo de Bradford (1976), que cuantifica la unin del colorante azul de Coomassie a una protena desconocida y lo compara con una curva estndar preparada con diferentes concentraciones de protena de albmina de suero (BSA).

El total de slidos solubles. Los slidos solubles totales se determinaron de acuerdo con la Norma Tcnica Colombiana (Norma Tcnica Colombiana - NTC) 4624 por Icontec (1999), utilizando un refractmetro Milton Roy Company a una temperatura de 20 C. La cuantificacin se realiz en cada uno de los 10 frutos recogidos en cada perodo de muestreo.

RESULTADOS Y DISCUSIN

a-amilasa actividad especfica. Un aumento de la actividad comenz el 63 DAF y alcanz el registro ms alto en 70 DAF (Figura 1). Resultados similares fueron reportados por Menndez et al. (2006), que estableci que el amarillo fruta de la pasin (P. edulis var. Flavicarpa Degener) a-amilasa actividad era ms intensa en la novena semana y luego disminuy.

Se encontr que la mayor actividad de esta enzima para ser asociado a los slidos solubles en la concentracin de aumento (Figura 2), debido a que el sustrato de esta enzima es el almidn (Shiomi et al., 1996; Menndez et al., 2006). Al hidrolizado, almidn contribuye a la glucosa aumento, dando el fruto gulupa un sabor dulce. Valores de postcosecha mostraron la misma tendencia de los frutos en la vid, asegurando as el procesamiento de almidn por esta enzima y, por consiguiente, una ptima calidad de la fruta.

Actividad especfica PME. Aumento y pico mximo de esta actividad (Figura 3) coincidi con la observada para la a-amilasa, estando de acuerdo con un informe previo de Aponte y Guadarrama (2005) y Menndez et al. (2006). Estos autores determinaron que la actividad de esta enzima aumenta hacia la madurez fisiolgica y luego disminuye en la cosecha (Figura 3). En el proceso de maduracin de la fruta de la pasin, Aponte y Guadarrama (2003) y Menndez et al. (2006) tambin observ que la actividad de esta enzima es ms alta en la etapa de madurez comercial, con disminucin de la actividad durante las etapas de maduracin ms.

Actividad PME no afecta ablandamiento durante la maduracin, pero altera significativamente la integridad de la fruta durante su procesamiento (Granados, 1994; Hagerman y Austin, 1986; Willats et al 2001;. Aponte y Guadarrama 2003). PME prepara la fruta para la accin de otras enzimas que catalizan la hidrlisis de las cadenas de cido poligalacturnico, la produccin de unidades individuales de cido D-galacturnico (Granados, 1994). Durante poscosecha, la actividad PME mostr una tendencia a disminuir, lo que contrasta con la de otras frutas climatricas como zapote negro (Diospyros digyna Jacq), donde este parmetro mostr un aumento que haca juego con otros eventos metablicos tales como la produccin de etileno (Arellano et al ., 2005).

Actividad especfica PG. Como PME, esta enzima est asociada a la maduracin de la fruta. PG mostr una baja actividad en 84 DAF, con un pico a los 91 DAF (Figura 4), similar a un informe anterior en amarillo fruta de la pasin por Menndez et al. (2006), que estos autores observaron a una edad diferente, sin embargo. Esto fue probablemente debido a la diferente ubicacin geogrfica y altitud de las zonas en las que se realizaron los experimentos. La coincidencia entre el mximo pico de actividad PG y slidos solubles aumento contenido fue muy claro en este estudio. Durante poscosecha, la actividad PG seguido una tendencia ascendente hasta siete das despus de la cosecha, como se indica por Aponte y Guadarrama (2005).

Actividad especfica PPO. Los valores encontrados en este estudio para la actividad especfica de PPO en gulupa eran pequeos (Figura 5), coincidiendo con las observadas por Falguera et al. (2011) en amarillo fruta de la pasin. Estos registros mostraron un patrn creciente durante la maduracin y poscosecha, en consonancia con las observaciones del Lobo (1995) en la papaya (Carica papaya L.) y Dueas et al. (2008) en pitahaya (Acanthocereus pitajaya sensu Croizat). En algunos casos esta enzima muestra una intensa actividad despus del pico climatrico, produciendo problemas de pardeamiento en frutas como la manzana (Malus domestica Borkh), para lo cual se ha sugerido la aplicacin de tratamientos, como la radiacin ultravioleta para inactivar el efecto negativo sobre el jugo (Falguera et al., 2011). Tambin durante poscosecha, PPO mostr una tendencia creciente, diferente de la observada en otras frutas como el banano Gros Michel, donde Garca et al. (2006) encontraron que la actividad ms baja de esta enzima en etapas avanzadas de la maduracin, lo que sugiere su degradacin con la maduracin. Los valores observados indican que la accin PPO en compuestos polifenlicos se reduce, lo que favorece el procesamiento de gulupa (Ayaz et al, 2008;. Guerrero, 2009; Llorente, 2010, de Oort, 2010).

CONCLUSIONES

Desde el punto de vista de la calidad de la fruta, la actividad de las enzimas a-amilasa y PG en gulupa (Passiflora edulis Sims) es importante, ya que refuerza aumentan los slidos solubles. La baja actividad de PPO garantiza el procesamiento industrial de zumo de gulupa, probablemente con slo pardeamiento enzimtico suave.