entendiendo la correlaciÓn entre formaciÓn de …
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lysozyme-PB
10-1 101 103 105
10-1 101 103 105
10-1 101 103 105
10
20
30
40
DH
(n
m)
PPMR
101
102
DH
(n
m)
103
PPMR
101
102
DH
(n
m)
103
104
PPMR
20
60
40
DH
(n
m)
BSA-PB
BGG-PB
FBS-PB
ΔD
H m
ax.(
µm
)
BSA
lysozyme
BGG
FBS
10-3 10-1 101 103
mixing ratio(0.95) (95.0) (9500)
Agustín S. Picco,1,* Larissa F. Ferreira,2 Flavia E. Galdino,2 Jean-François Berret,3 Mateus B. Cardoso2
1Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA-UNLP-CONICET). La Plata, Argentina. 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS-Sirius). Campinas, Brasil. 3Matière et Systèmes Complexes, UMR 7057 CNRS Université Denis Diderot Paris-VII. Paris, France.
ENTENDIENDO LA CORRELACIÓN ENTRE FORMACIÓN DE CORONAS PROTEICAS Y FENÓMENOS DE AGREGACIÓN EN NANOPARTICULAS
La nanomedicina enfrenta grandes desafíos que condicionan su transferencia a la clínica médica. En particular, la formación de coronas de proteínas sobre nanopartículas (NPs) dispersas en fluidos biológicos (ej. suero), afecta radicalmente la interacción de NPs con sistemas biológicos, modificando su destino y performance. Además, al modificar las propiedades coloidales, la corona proteica puede inducir (o prevenir) la agregación de NPs. Frecuentemente, los estudios que examinan la interacción NP-proteína aplican esquemas de titulación y utilizan concentraciones que distan de las encontradas en fluidos biológicos. En este trabajo, se presenta un enfoque alternativo, basado en la aplicación del método de las variaciones continuas (Berret; Macromolecules 2007, 40, 4260) al estudio de la interacción de NPs (de silica, SNPs) y diferentes proteínas o fuentes de proteínas. como albumina bovina (BSA), lisozima, γ-globulina bovina (BGG) o suero fetal bovino (FBS) mediante DLS, SAXS y cryo-TEM, prestando especial atención al efecto de la adsorción de proteinas sobre la estabilidad coloidal de SNPs.
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1
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10-1 101 103
0
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10-1 101 103
0
1
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0
1
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PPMR
PP
PPMR
P
PPMR
P
BSA-PB
BGG-PB
lysozyme-PB
FBS-PB
PM
AX
PM
AX
PM
AX
PM
AX
BSA
lysozyme
BGG
FBS
10-3 10-1 101 103
mixing ratio(0.95) (95.0) (9500)
105
105
105
100 nm
10 nm
lisozima
BGG(IgG)
BSA
incre
men
to pI
NP-SiO2
𝑃𝑃𝑀𝑅 =[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛]
[𝑛𝑎𝑛𝑜𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑐𝑙𝑒]
SNPs (DTEM~ 23nm, DH~30nm y z-pot~-30mV a pH = 7.4) fueron incubadas con proteinas modelo de diferentes pI como BSA (pI~4.7-5.6), lisozima (pI~11.4) y BGG (pI~6.6), en buffer fosfato (PB, pH = 7.4, I~25mM) o buffer fosfato salino (PBS; pH=7.4, I~163 mM), a diferentes particle-to-molar ratios (PPMR) y estudiadas mediante DLS, SAXS y Cryo-TEM. También se estudio la interacción de SNPs incubadas con FBS, en este caso a diferentes mixing ratios (equivalentes a la relación de concentraciones entre proteína y SNP en g/L)
𝐼𝑎𝑔𝑔= 𝐵𝑒−𝑞2𝑅𝑠
2
3𝑒𝑟𝑓(𝑞𝑘𝑅𝑎/ 6) 3
𝑞
𝑃
I(q)= 𝐼𝑁𝑃 + 𝐼𝑝𝑟𝑜𝑡 + 𝐼𝑎𝑔𝑔 + 𝐵
Los patrones SAXS de cada mezcla fueron adquiridos en la línea SAXS-1 de LNLS. Los patrones fueron modelados considerando la sumatoria de 3 niveles: SNP (esferas polidispersa), proteína y agregados de SNPs.
10-3
Inte
nsi
ty (
cm
)-1 101
10-2
10-1
100
102
0.10.1 1
lysozyme
SiO2
q (nm )-1
11110110011000
PP
MR
10-3
101
10-2
10-1
100
0.10.1 1q (nm )-1
datafitsphereaggregateprotein
Inte
nsi
ty (
cm
)-1
Los agregados fueron modelados como un decaimiento siguiendo una ley de potencia (con exponente negativo P, con cut-off) como lo implementado en el modelo de Beaucage ( J. Appl. Crystallogr. 1995, 28, 717)
MOTIVACIÓN
MATERIALES Y METODOS
ANALISIS DE DATOS SAXSSNP + lisozima en PB SNP + BSA en PBS (PPMR~26)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
P ~ 0
100 nm
P < 2
100 nm
P ~ 2-3
100 nm
P ~ 3-4
SNP + BSA en PB (PPMR~25)
SNP + FBS en PB (mixing ratio~0.5)
SNP + lisozima en PB (PPMR~270)
SNP + BGG en PBS (PPMR~25)
A izquerda y derecha, evolución con PPMR de DH (por DLS) y valores de P derivados de SAXS en PB, respectivamente. Los resultados en PBS se encuentran en el material suplementario. BSA se adsorbe sobre las SNP formando coronas proteicas en PB (sin agregación), mientras que induce agregación leve en PBS. BGG no induce agregación solo a bajos PPMR. A valores mayores, genera grandes agregados de SNPs con características de fractal de superficie (P~3-4). El proceso es mas abrupto en PBS que en PB. Lisozima produce agregación masiva de SNPs en ambos buffers, mostrando agregados de tipo fractal de masa (P~2-3). FBS genera agregación muy leve en PB (formación de multímeros de SNPs; P<2) y agregados mayores (de tipo fractal de superficie) en PBS.
Las tendencias observadas por DLS y SAXS fueron confimadas mediante cryo-TEM de muestrasseleccionadas (a PPMRs mostrando ΔDH maximo). Las imagenes muestran los 4 comportamientos característicos observados: Formación de corona proteica (sin agregación), agregación muy leve (multimeros de SNPs), generación de agregados fractales (de masa) e inducción de agregados compactos fractales (de superficie). Las graficas debajo de las imagenes esquematizan lo mencionado y muestran su relación con P derivado por SAXS
CONCLUSIONES El método de variaciones continuas, utilizando la combinación de DLS, SAXS y Cryo-TEM, permite explorar la relación entre adsorción de proteínas y agregación de NPs a lo largo de varios ordenes de magnitud. En vista de los resultados y considerando los pI de las diferentes proteínas queda en evidencia, grosso modo, que en la interacción entre SNPs y las proteínas (y los fenómenos de agregación inducidos, el componente electrostático cumple un rol fundamental. AGRADECIMIENTOS
CONICET, UNLP, FAPESP, LNLS
ΔD
H m
ax.(
µm
)Δ
DH
max
.(µ
m)
ΔD
H m
ax.(
µm
)
Material suplementario disponible en:https://docs.google.com/document/d/1W8O-y1Iy22sYHIIcPNeYfNezJD0ZGm05do4AJNn9tjA/edit?usp=sharing