Ensayo de toxicidad aguda con larvas y juveniles de peces 115

Ensayo de toxicidad aguda con larvas y juveniles de los peces Brachydanio rerio y Poecilia reticulata

Felipe Fernando Martnez-Jernimo y Flix Espinosa Chvez

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ClasifiCaCin del ensayo: ae

Principio de la prueba

La prueba se basa en la determinacin de efectos de intoxicacin aguda (inmovilizacin o mortalidad), observados en un tiempo de exposicin de 96 horas, en larvas de Brachydanio rerio (pez cebra) (figura 8.1) o en juveniles de Poecilia reticulata (gupy) (figura 8.2), ambas especies de peces dulceacucolas. Durante este ensayo se expone al organismo seleccionado a diferentes concentraciones de muestras problema que pueden ser compuestos (puros o combinados) o productos formulados, que deben ser solubilizados y estar biodisponibles en el agua de dilucin. Este ensayo tambin es utilizado para determinar efectos txicos agudos ocasionados por efluentes con o sin tratamiento, as como muestras de aguas de sistemas acuticos diversos, que pueden recibir descargas de

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aguas contaminadas, as como aguas subterrneas que reciban influencias contaminantes (lixiviados).

Figura 8.1. Organismos adultos de Poecilia reticulata. A) macho y B) hembra

Figura 8.2. Organismo adulto de Brachidanio rerio

Para realizar este bioensayo se debe garantizar la calidad del material de prueba, teniendo control sobre el linaje y la forma de produccin de los orga-nismos de ensayo, siendo importante indicar el origen del lote utilizado.

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La relevancia del empleo de peces como organismos de prueba radica en su ubicacin y funcin en los sistemas acuticos, ya que adems de ocupar diferentes posiciones trficas en los ecosistemas, al tratarse de organismos vertebrados, son normalmente considerados como buenos representantes de organismos de mayor complejidad y por lo tanto los efectos txicos observados en ellos son ms fciles de comprender e interpretar, pues adems muchas especies de peces representan pesqueras de importancia comercial o son sujeto de cultivo para la produccin de alimentos o como especies ornamentales.

En el caso de B. rerio, la prueba se realiza con las larvas recin eclosionadas del huevo con edad menor a 24 horas, que cuentan con reserva de vitelo. En el caso de los juveniles de P. reticulata, los organismos de prueba son los juveniles recin avivados de la hembra vivpara (edad menor a 24 horas).

El bioensayo consiste en exponer a los organismos de prueba a diferentes concentraciones de los compuestos problema o diluciones porcentuales de efluentes y muestras de agua problema. Se requiere la preparacin de al menos cinco concentraciones o diluciones, ms una serie control. Estas soluciones se preparan despus de un ensayo exploratorio para la determinacin del in-tervalo, siguindose preferentemente una serie geomtrica base 2. Para cada solucin se debe contar con al menos tres rplicas, cada una de las cuales constar de 10 individuos de las caractersticas antes descritas.

Se evala la mortalidad cada 24 horas y hasta el trmino del bioensayo (96 horas), haciendo anotaciones sobre el nmero de organismos afectados (que se observan con movilidad o desplazamientos anormales). Los datos de mortalidad acumulada al trmino de la prueba permiten construir la grfica concentracin-efecto, que es la base para la determinacin de la Concentra-cin Letal Media (CL50).

La prueba es adecuada para la evaluacin de los efectos txicos agudos (letales) de efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de descargas, compuestos puros y en mezclas de composicin conocida o desconocida, principios activos y productos formulados comercia-les. Es adems adecuada para la clasificacin de la toxicidad de compuestos, en el monitoreo de ecosistemas acuticos y en la evaluacin de la eficiencia de los sistemas de tratamiento de las aguas residuales.

Infraestructura en el laboratorio

Los laboratorios que se dediquen a este tipo de evaluaciones toxicolgicas de-bern contar con cmaras bioclimticas o cuartos con fotoperodo y tempera-

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tura controlados. Adicionalmente, tendrn que disponer de la infraestructura suficiente para realizar el cultivo controlado de alimento y para propiciar las condiciones de mantenimiento y reproduccin que se detallan en el apartado correspondiente de este ensayo.

Material

Los recipientes para el cultivo y mantenimiento de los reproductores debern ser preferentemente de vidrio de borosilicato, del volumen adecuado para ga-rantizar no se rebase la carga mxima que puede tolerar el sistema en funcin de la cantidad de oxgeno disuelto (1 g/L de biomasa en peso fresco). Para las pruebas de toxicidad aguda se emplearn preferentemente recipientes de vidrio de borosilicato de volumen no menor a 250 mL (para B. rerio) o 500 mL (para P. reticulata), los cuales debern ser sometidos a la rutina de lavado adecuada para garantizar su uso libre de compuestos que pudieran modificar la toxicidad de los productos o las muestras problema.

Para la preparacin de los bioensayos se emplear la cristalera y materiales adecuados y suficientes para garantizar procedimientos seguros y repetibles, tales como pipetas automticas calibradas de diferentes volmenes, matraces aforados de la capacidad necesaria, pesamuestras desechables, esptulas de acero inoxidable, etc.

Equipo

Los equipos requeridos son los bsicos de cualquier laboratorio de anlisis biolgicos y de manera general incluye el siguiente equipamiento: balanza analtica, estereomicroscopio, potencimetro, oxmetro, salinmetro o conductivmetro, cmara bioclimtica (con control de temperatura, ilumi-nacin y de fotoperodo), espectrofotmetro, compresor de aire y bombas sumergibles.

Reactivos

Se deber contar con los reactivos necesarios para la preparacin del agua de dilucin y de los medios de cultivo, tanto para los peces como para la produccin de alimento para los reproductores. Los reactivos debern ser grado analtico y libres de trazas de metales pesados. Se sugieren las marcas J. T. Baker, Aldrich o Sigma Chemical.

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En todos los casos se recomienda la preparacin de soluciones concentradas (stock), a partir de las cuales se pueden preparar de manera ms sencilla los medios de cultivo y el agua de dilucin. Se deber tener un control sobre los procedimientos para la preparacin de soluciones concentradas y medios de cultivo, y poner especial atencin en la conservacin de los compuestos que pudieran degradarse o contaminarse; en todos los casos se debern aplicar las condiciones de mantenimiento que eviten la modificacin de la concentracin o alteracin qumica de las soluciones.

Organismos de pruebas

Los organismos que se utilicen como organismos de prueba para este ensayo deben ser obtenidos a partir de cultivos controlados de laborato-rio; tambin se pueden obtener mediante adquisicin con distribuidores de material biolgico que garanticen la identidad especfica y la calidad del material biolgico, aunque no es lo ms recomendado. Lo que no es permitido y deber evitarse; por lo tanto, es la utilizacin de organismos comprados en tiendas de mascotas, pues en este caso no se conoce la procedencia, linaje, ni la historia qumica, que son factores que pueden modificar significativamente la respuesta biolgica durante su exposicin a la muestra problema.

Los laboratorios que realicen este tipo de bioensayos debern contar con la cepa adecuada, como ya se mencion anteriormente, y lograr su es-tabilizacin siguiendo las instrucciones especficas de mantenimiento que se detallan como parte de este ensayo. Los lotes de reproductores debern ser monitoreados continuamente, poniendo especial nfasis en cualquier indicio que denote alteracin en el desarrollo normal de la especie, pues esto es sntoma de un cultivo inadecuado en el que se manifiestan factores ambientales y de manejo del sistema de produccin que pueden afectar la calidad del material biolgico y por lo tanto su respuesta durante la reali-zacin del bioensayo.

Todos los cultivos deben ser iniciados con hembras y machos sanos, con alimentacin controlada. Los organismos de prueba para los bioensayos debe-rn proceder de lotes estabilizados y controlados, para los cuales se establecer una vigencia mxima del lote para la produccin de cras (dependiendo de la especie elegida).

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Cultivo y mantenimiento de los organismos de prueba

La obtencin de los organismos de prueba depende del lote de reproductores. En particular, B. rerio es una especie de relativo fcil mantenimiento y propa-gacin en condiciones de cautiverio, aunque se deben propiciar condiciones especiales a los reproductores para que se pueda consumar exitosamente el proceso reproductivo, debiendo considerar que este pez es ovparo, con fecun-dacin externa y que el tamao del huevo es relativamente pequeo. Para un adecuado cultivo es indispensable contar con el abasto suficiente y oportuno de alimento, que debe ser vivo y obtenido en condiciones controladas, al menos para las primeras fases de desarrollo larvario (despus de que se ha absorbido el saco vitelino) y hasta que los organismos tienen la capacidad de ingerir alimento balanceado en hojuelas. Para lo anterior, es deseable implementar sendos cultivos de protozoarios (Paramecium sp.) y de Ceriodaphnia dubia; sta ltima podra sustituirse con nauplios de Artemia franciscana obtenidos a partir de la eclosin de quistes.

Para el cultivo de reproductores se emplearn los recipientes que resulten adecuados para el desarrollo de los adultos, preferentemente acuarios de vidrio de 20 L de v