enrique lastra ucg, s. oncología médicaucg, s. oncología

Enrique LastraUCG, S. Oncología MédicaUCG, S. Oncología MédicaH. Universitario de Burgos

OBJETIVOS DEL TALLEROBJETIVOS DEL TALLER

• 1.- Introducción: importancia dx. sdr. de Lynch

P l ió bl ió l• 2.- Pre-selección en población general

• 3.- Selección en población de riesgo

• 4.- Estudio molecular en tumor: IHQ y microsatélites

• 5.- Vía estudio en tumores IHQ normal5. Vía estudio en tumores IHQ normal

• 6.- Vía estudio en tumores MLH1 deficientes

• Ví t di t MSH /MSH6/PMS d fi i t• 7.- Vía estudio en tumores MSH2/MSH6/PMS2 deficientes

• 8.- Análisis genéticos en línea germinal

1.1.-- INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

INMUNOHISTOQUÍMICA Y GENES MMR

Tinción MLH1 Tinción MSH6Tinción MSH2

Déficit MLH1 Déficit MSH6

4 1

Vasen HFA, J Med Genet 2007; 44:353-362

Disorder Lower age limit (years) Examination Interval (years)

LynchLynch ss.. 2020--2525 ColonoscopyColonoscopy 11--22GG3030--3535 GynaecologicalGynaecological 11--22

examination,examination, transvaginaltransvaginalultrasound,ultrasound, aspirationaspiration biopsybiopsy,, pp p yp y

3030--3535 Gastroduodenoscopy*Gastroduodenoscopy* 11--223030--3535 AbdominalAbdominal ultrasound,ultrasound, 11--22

i l ii l i dd t lt l i †i †urinalysisurinalysis andand cytologycytology urine†urine†

FCC-X and other 45 y or 5-10 y Colonoscopy 3-5familial clustering before the youngestof colorectal cancer case in the family

*If gastric cancer is present in the family or in countries with high incidence of gastric cancer† If urinary tract cancer is present in the familyFCC-X: Familial Colorectal Cancer type X

Schmeler KM. NEJM, 2006; 354:261-269

Lindor NM JAMA, 2005;293:1979-1985

F ili l C l t l C XFamilial Colorectal Ca - X

Lindor NM JAMA, 2005;293:1979-1985

Disorder Lower age limit (years) Examination Interval (years)Lynch syndrome 20-25 Colonoscopy 1-2

30-35 Gynaecological 1-230-35 Gynaecological 1-2

examination, transvaginal

ultrasound, aspiration biopsy

30 35 Gastroduodenoscopy* 1 230-35 Gastroduodenoscopy* 1-2

30-35 Abdominal ultrasound, 1-2

urinalysis and cytology urine†

FCCFCC--XX /other/other 4545 yy oror 55--1010 yy ColonoscopyColonoscopy 33--55FCCFCC XX /other/other 4545 yy oror 55 1010 yy ColonoscopyColonoscopy 33 55famfam clusteringclustering beforebefore youngestyoungestofof CRCCRC casecase inin thethe familyfamily

1.1.-- INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

• Sdr. Lynch: riesgos cáncer y manejo clínico diferentes

• Importante distinguir sdr. Lynch de otras entidades

• Demanda de certeza diagnóstica por las familiasg p

• Avances clínicos y moleculares: precisión diagnóstica

V i bilid d l l d h i di ó i• Variabilidad en el empleo de herramientas diagnósticas

• Estrategias de diagnóstico modificables (dinámica de dx)

• Discusión de aspectos conflictivos en algoritmos de dx

Í

Mujer de 58 a antecedente de hipercolesterolemia y

CASO CLÍNICO

Mujer de 58 a, antecedente de hipercolesterolemia y angina esfuerzo hace 1 a., coronariografía normal.

Debuta con dolor abdominal por un adenocarcinoma de ciego, con CEA 6 mcg/L, y con extirpación de 6 pólipos

d t l i adenomatosos en colonoscopia.

Es tratada con hemicolectomía dcha. La AP es de un Es tratada con hemicolectomía dcha. La AP es de un adenocarcinoma de colon pobremente diferenciado, G3

pT3V1 pN0(0/16)Mo.

Muestra preocupación por riesgo familiar de cáncer.

Se presenta por su cirujano general en comité de tumores digestivos (cirugía general, digestivo, anatomía

patológica, radiología, oncología médica, oncología radioterápica) para decidir:

1.- ¿Indicación de quimioterapia adyuvante?

2.- ¿Indicación de estudio y asesoramiento para síndrome de cáncer hereditario?, ¿remitir a UCG?

• Criterios clínicos

• Modelos estadísticos

• Critrios moleculares

I

IIII

1 d1adenoma

IIIIII

6adenomas 1adenoma

IV

http://www.dfci.org/premm

CRIT. MOLECULARES: IHQ/MSI POBL. GENERAL

¿Aplicación real en nuestro ámbito?: Aspectos económicos, ético-

legales, estructurales y administrativos (organización UCG,

programas de consejo genético)

¿Perfil molecular completo del tumor?: ahorro muestra, fenotipo

dMMR/MSI (pronóstico y ¿predictivo en adyuvancia?), coloprint

(pronóstico en adyuvancia, ¿interés estadios II MSS?), KRAS

(predictivo tto anti-EGFR estadio IV), BRAF (descartar sdr.Lynch, (p ), ( y ,

¿predictivo tto. Anti-EGFR estadio IV?), ¿secuenciación masiva

(next-generation secquencing?)(next generation secquencing?)

2.2.-- PREPRE--SELECCIÓNSELECCIÓN

• Dx. sdr. Lynch: proceso de decisiones en diferentes fasesDx. sdr. Lynch: proceso de decisiones en diferentes fases

• Identificar candidatos a estudio en población general

• Profesionales de cualquier nivel asistencial

H.T. Lynch,N Engl J Med 348;10 2003

AMSTERDAM CRITERIA

• There should be at least three relatives with colorectal cancer (CRC) or with a Lynch

syndrome-associated cancer: cancer of the endometrium, small bowell, ureter o renal

pelvis (AC I include only CRC AC II include all the cancers listed)pelvis (AC I include only CRC, AC II include all the cancers listed).

• one relative should be a first-degree relative of the other two,

• at least two successive generations should be affected,

• at least one tumor should be diagnosed before the age of 50 years,

• Familial Adenomatous Polyposis should be excluded in CRC casesFamilial Adenomatous Polyposis should be excluded in CRC cases.

• Tumors should be verified by histopathological examination

REVISED BETHESDA GUIDELINES

1. CRC diagnosed in a patient <50 years.

2 Presence of synchronous metachronous colorectal or other Lynch 2. Presence of synchronous, metachronous colorectal or other Lynch syndrome-related tumors*, regardless of age.

3. CRC with high MSI phenotype diagnosed in a patient aged <60 yearsyears.

4. Patient with CRC and a first-degree relative with a Lynch syndrome-related tumor*, with one of the cancers diagnosed at age <50 years.

5. Patient with CRC with two or more first-degree or second-degree relatives with a Lynch syndrome-related tumor*, regardless of age.

*Lynch syndrome-related tumors include colorectal, endometrial, stomach, ovarian, pancreas, ureter, renal pelvis,biliary tract and brain tumors, sebaceous gland adenomas and keratoacanthomas, and carcinoma of the small bowell

PrevalenciaLu KH, J Clin Oncol 2007;25:5158-5164

Grover S, JAMA, 2012; 308: 485-492

Balmaña J, J Med Genet 2008. Balmaña J, Clin Transl Oncol 2007

Balaguer F, Gastroenterology 2008; 134:39-46

Piñol V, JAMA 2005 ;293:1986-1994

Hampel H, J Clin Oncol 2008;26:5783-5788

Piñol V, JAMA 2005 ;293:1986-1994

Moreira L, JAMA 2012 ;308(15):1555-1565

Hampel H, N Engl J Med 2005 ;352:1851-1860

• Adyuvancia estadio II:

o Alta MSI: No tto.

Baja MSI ó MSS:o Baja MSI ó MSS:

• Criterios clínico-patológicos de riesgo: adyuvancia (tras discutir con el enfermo)

• No criterios clínico-patológicos de riesgo: no adyuvancia (tras discutirlo con el enfermo), ¿¿coloprint??


• Criterios Bethesda revisados, criterios Ámsterdam

• Nuevos criterios clínicos: ca endometrio < 50 a

• Estudios moleculares en CCR: IHQ, microsatélitesQ,

• Modelos estadísticos

Opción: experiencia, logística, organización, desarrollo estudios

Programas activos a gran escala: posibilidad añadir estrategias

(previo análisis coste eficacia)(previo análisis coste-eficacia)

Ladabaum U, JAMA 2012 ;308(15):1581-1583

Se presenta por su cirujano general en comité de tumores Se presenta por su cirujano general en comité de tumores digestivos (cirugía general, digestivo, anatomía

patológica, radiología, oncología médica, oncología radioterápica) para decidir:

1 ¿I di ió d i i t i d t ?1.- ¿Indicación de quimioterapia adyuvante?

2.- ¿Indicación de estudio y asesoramiento para síndrome de cáncer hereditario?, ¿remitir a UCG?

SÍ

Aproximación al diagnóstico del síndrome de Lynch en Aproximación al diagnóstico del síndrome de Lynch en esta familia seleccionada dentro de una Unidad Consejo

Genético:

1.- ¿Estudios y valoraciones iniciales?: ¿modelos i i di l l l di estimativos, estudios moleculares en el tumor, estudio

mutaciones MMR genes en línea germinal?

3.3.-- SELECCIÓN EN POBL RIESGOSELECCIÓN EN POBL RIESGO

Piñol V, JAMA 2005 ;293:1986-1994

Balmaña J, J Med Genet 2008. Balmaña J, Clin Transl Oncol 2007


• Dx en pobl riesgo debe hacerse en UCGDx en pobl riesgo debe hacerse en UCG

• UCG: experiencia, combinación eficiente herramientas dx

• Criterios clínicos, mod estadísticos, estudios moleculares

PREMM 1,2 Balmaña J, JAMA 2006;296:1469-1478 PREMM 1,2,6 Kastrinos F, Gastroenterology 2011; 140(1): 73-81

Chen S, JAMA 2006;296:1479-1487

Balmaña J, XII Congreso SEOM, 2009


• UCG: 1º aplicar modelos estadísticos, 2º estudio en CCR

• Resultados complejos: grupo multidisciplinar

• Mod est:ayudan selección individuos, guían eval moleculary , g

• Sirven para estimar cuánto profundizar en el estudio

S i i ió d i• Son instrumento para comunicación de riesgos

¿Q é est dio molec lar aplicar en CCR?¿Qué estudio molecular aplicar en CCR?

4.4.-- ESTUDIO CCR: IHQESTUDIO CCR: IHQ

¿Qué estudio molecular aplicar en CCR?¿Qué estudio molecular aplicar en CCR?

CRC: colorectal cancer; MSI: microsatellite instability

Hall G, Pathology 2010;42(5):409-413

4.4.-- ESTUDIO CCR: MSIESTUDIO CCR: MSI

¿Qué estudio molecular aplicar en CCR?¿Qué estudio molecular aplicar en CCR?

MSI: microsatellite instability; LS: Lynch syndrome; IHC: immunohistochemistry; CRC: colorectal cancer

4.4.-- ESTUDIO CCR: IHQ, MSIESTUDIO CCR: IHQ, MSI

NOTA: CONCORDANCIA 97.5%; SI IHC NO CONCLUYENTE, EL TEST MSI PUEDE AÑADIR VALOR INFORMATIVO

SL: Síndrome de Lynch; GBr: guías de Bethesda revisadas; CA: criterios de Amsterdam; IHQ: inmunohistoquímica;MSI: inestabilidad de microsatélites; CG: consejo genético.

Resultados del estudio de IHQ en el tumor de esta Resultados del estudio de IHQ en el tumor de esta enferma:

Expresión correcta de proteínas reparadoras MLH1, MSH2 y PMS2

Tinción débil y focal de MSH6

¿Actitud?

Hablar con el patólogo:

¿Tamaño de la muestra y estado de conservación (oxidación)? Adecuados(o dac ó )? decuados

¿Existe control interno +? NO

Con control interno+, tinción débil y focal de MSH6 puede ser pérdida de función protéica por mutación puede ser pérdida de función protéica por mutación

patogénica germinal en MSH6

Sin control interno +, puede ser error en la técnica .No se pueden concluir hallazgos patogénicos en la IHQ.

¿Actitud?

Probabilidad estimada “a priori” de mutación Probabilidad estimada a priori de mutación

Dudas de técnica de tinción en MSH6

Puede haber mutaciones patogénicas en MSH6 y MLH1 con IHQ normalcon IHQ normal

Progresar a estudio de inestabilidad de microsatélites: g bTumor con estabilidad de microsatélites (MSS)

¿Actitud?

Estimación estadística de mutación después de haber realizado estudio molecular en tumor: realizado estudio molecular en tumor:

modelo MMRPRO

Si alta probabilidad, estudiar MSH6 en línea germinal

Si baja probabilidad, descartar sdr. Lynch y excluir fenocopiafenocopia

¿Excluir fenocopia?

I

MMRPRO en otro probando

II

MMRPRO en otro probando,tras MSS en primer probando

II

1 d1adenoma

IIIIII

6adenomas 1adenoma

IV

I

II¿Excluir fenocopia?

II

III

IV

Descartar fenocopia: estudio de nuevo probando con CCR a los 48 aCCR a los 48 a

IHQ: Expresión correcta de proteínas reparadoras Q p p pMLH1, MSH2, MSH6, PMS2

di i éli SSEstudio microsatélites: MSS

Probable FCC-X estudios ligamientoProbable FCC-X, estudios ligamiento

55 -- VÍA: CCR IHQ NORMALVÍA: CCR IHQ NORMAL5.5.-- VÍA: CCR IHQ NORMALVÍA: CCR IHQ NORMAL

Cuando no se confirma el SL pueden considerarse estudios de ligamiento.*Excluir fenocopia;¥Si baja probabilidad de mutación,considerar descartar SL sin más estudios; †Si se cumplen CA o alta sospecha de SL, considerar estudio de genes MMR, especialmenteMSH6 (alguna mutaciones en MSH6 no dan MSI); ‡Especialmente test MLH1: algunas mutaciones en MLH1 no impiden la expresiónde la proteína.

MMR: sistema de reparación de desapareamientos del ADN; MSS: estabilidad de microsatellites; CCF-X: cáncer colorrectal familiartipo X

Descartar fenocopia: estudio de nuevo probando con CCR a los 48 aCCR a los 48 a

IHQ: Tinción débil y focal de MLH1, con adecuado Q y ,tamaño y conservación de la muestra, con control interno +, sin expresión de PMS2, con expresión

d S d S 6correcta de MSH2 y de MSH6

¿Actitud?¿Actitud?

Estudio de mutación BRAF V600E: no mutado

Estudio de metilación promotor de MLH1: no hipermetilado

Estudio de mutación en genes MMR (comenzando por MLH1 y PMS2): mutación patogénica en MLH1y ) p g

Estudio de la mutación en tía materna: no portadora (fenocopia)

6.6.-- VÍA:CCR MLH1 DEFICIENTEVÍA:CCR MLH1 DEFICIENTE

• Habitualmente PMS2 deficiente y MSI-high

Á• Fam Ámsterdam o alta prob: valorar test MLH1 (¿PMS2?)

• 10-15% CCR esporádicos son MSI,MLH1- por metilación 5 p , p


• 1ª opción: estudio mutación somática en gen BRAF:

- 40% CCR MSI, 5% CCR MSS

- 68% CCR esporádicos, con metilación MLH1 y prot MLH1-p , y p

- No en SL: excluye SL con 100% especificidad


• CCR esporádico, MSI, metilación MLH1: mut BRAF en 80%

• CCR esporádico: metilación MLH1>frecuente que mut BRAFp q

CCR ádi MLH il d d BRAF• CCR esporádicos MLH1 metilado,pueden no tener mut BRAF

• CCR MLH1-, no mut BRAF: estudio metilación MLH1

Si hipermetilación promotor MLH1: excluye SL con alta prob - Si hipermetilación promotor MLH1: excluye SL con alta prob

6.6.-- VÍA:CCR MLH1 DEFICIENTEVÍA:CCR MLH1 DEFICIENTE• Metilación MLH1: 2º hit alelo WT de CCR x mut gen MMR

• Epimutación MLH1 en línea germinal:prev 0.6% CCR MLH1-p g p

• Herencia epigenética: evento precoz post-cigoto

Hitchins MP, N Engl J Med 2007;356:697-705

Estudio de mutación BRAF V600E: no mutadoEstudio de metilación promotor de MLH1:

hipermetilado

¿Estudiar hipermetilación u otras mutaciones MLH1 en línea germinal?g

Estimación tras estudio molecular Estimación “a priori” (baja para MLH1)


Cuando no se confirma SL, pueden considerarse estudios de liagamiento. *Excluir fenocopiaCuando no se confirma SL, pueden considerarse estudios de liagamiento. Excluir fenocopia

ÍCASO CLÍNICO

Varón 52 a, dx 48 a adenocarcinoma ángulo esplénico colon pT4pN1M0, tratamiento con hemicolectomía izqda

QT d ty QT adyuvante

Familia con criterios de Ámsterdam II para sdr. Lynch

I

IIII

III

IV

Estudio de IHQ: déficit de expresión de proteínas MSH2 y MSH6

Test genético en línea germinal: no mutación en MSH2, MSH6 ni MLH1 por secuenciación, no mutación en MSH6 ni MLH1 por secuenciación, no mutación en

MLH1, MSH2, MSH6 ni PMS2 por MLPA

E ti ió t t di l l t di lí i lEstimación tras estudio molecular y estudio en línea germinal

¿Estudio gen EpCAM?¿Estudio gen EpCAM?

Se había realizado:MLPA kit salsa P008-A1 (incluye sondas para EpCAM)

N i l t t di E CAM Necesario completar estudio gen EpCAM con:MLPA kit salasa P003-B2MLPA kit salsa P072-B2MLPA kit salsa P072 B2

MLPA kit salsa 248

No mutación

Alta probabilidad de sdr Lynch a pesar de no haber Alta probabilidad de sdr. Lynch a pesar de no haber encontrado mutación deletérea, estimada tras estudios

moleculares y genéticos

Sin embargo, estudio molecular realizado es IHQ

Aconsejable, por importancia del dx. y manejo, confirmación con estudio microsatélites:confirmación con estudio microsatélites:

MSI-high: alta probabilidad de sdr. Lynch(estudios de ligamiento)

7.7.-- VÍA:CCR MSH2 DEFICIENTEVÍA:CCR MSH2 DEFICIENTE

• Habitualmente también prot MSH6 deficiente

• 1ª opción: test mutaciones en genes MSH2 y MSH6p g y

Si ió SL• Si se encuentra mutación: SL

• Si no mut: no descartar SL en fam Ámsterdam, o alta prob, o

con fenotipo clínico especial: gen EpCAM/TACSTD1 con fenotipo clínico especial: gen EpCAM/TACSTD1

7.7.-- VÍA:CCR MSH2 DEFICIENTEVÍA:CCR MSH2 DEFICIENTE• Deleciones gen EpCAM/TACSTD1: evento nuevo en SL

• Metilación germ MSH2,silenciamiento epigenético MSH2 Metilación germ MSH2,silenciamiento epigenético MSH2

Nagasaka T, Cancer Res 2010;70:3098-3108


• Deleciones gen EpCAM/TACSTD1, prevalencia:

- 19% SL sin mut en MLH1/MSH29 /

8 % d f SL (H l d Al i )- 2.8-1.1% de fam con SL (Holanda y Alemania)

- Mutación fundadora americana


Kempers MJ, Lancet Oncol 2011;12:49-55

7.7.-- VÍA:CCR MSH2 DEFICIENTEVÍA:CCR MSH2 DEFICIENTE• Deleciones gen EpCAM/TACSTD1, fenotipo:

- Hipermetilación MSH2 (tb se da en otras mut MSH2)p ( )

- IHQ: proteínas MSH2 y EpCAM deficientes

Kloor M, J Clin Oncol 2010;29:223-227


Patients and MethodsImmunohistochemistry was used to assess EPCAM expression in LynchImmunohistochemistry was used to assess EPCAM expression in Lynchsyndrome–associated MSH2-negative tumors (n 26). Multiplex ligation-dependentprobe amplification (MLPA) analysis was performed to detect germline deletionsof the EPCAM and MSH2 gene loci.g

ResultsIn four MSH2-negative tumors, a concomitant lack of EPCAM expression wasg pdetected. MLPA analysis revealed heterozygous EPCAM deletions in all patientswith EPCAM-negative tumors. In contrast, EPCAM expression was positive in allcancers from patients with germline alterations affecting MSH2 but not EPCAM.Two EPCAM deletions were detected in patients with an EPCAM-positive tumor.


Cuando no se confirma SL, pueden considerarse estudios de ligamiento. *Excluir fenocopia; **Si pérdida de PMS2: Considerarmutación BRAF /metilación MLH1 en familias de bajo riesgo, y test gen MLH1 en familias de alto riesgo.


• Proteína MSH2 correctamente expresadaProteína MSH2 correctamente expresada

• Progresar a test genético mutaciones en MSH6: Si mut, SL

• Si no mutación: progresar a estudio MSI

• MSI alta: probable SLp

• Si MSS: SL no es probable,

P f lt i d l i t MSH6 lt- Pero en fam alto riesgo, no puede excluirse mut MSH6 oculta

- Excluir fenocopias, posibilidad estudios ligamiento

7.7.-- VÍA:CCR PMS2 DEFICIENTEVÍA:CCR PMS2 DEFICIENTE

• Proteína MLH1 correctamente expresadaProteína MLH1 correctamente expresada

• Progresar a test genético mutaciones en PMS2: Si mut, SL

• Si no mutación: progresar a estudio MSI

• Si MSS: SL no es probablep

• Excluir fenocopias, posibilidad estudios ligamiento

Si lt MSI l í CCR MLH d fi i t• Si alta MSI: valorar vía CCR MLH1 deficiente:

- Baja prob: BRAF, metilación MLH1; alta prob: MLH1 test

Cuando no se confirma SL, pueden considerarse estudios de ligamiento. *Excluir fenocopia; **Si pérdida de PMS2: Considerarmutación BRAF /metilación MLH1 en familias de bajo riesgo, y test gen MLH1 en familias de alto riesgo.

7.7.-- PATRÓN IHQ ABERRANTEPATRÓN IHQ ABERRANTE

• Microsatélites en genes MMR pueden sufrir segundas mutMicrosatélites en genes MMR pueden sufrir segundas mut

• Patrones de pérdida de proteínas no comunes

• CCR MLH1- y MSH6- (o parcialmente teñida):

- Segunda mut en MSH6 en subclones de un CCR x mut MLH1g

- 1ª opción: test genético de mut en MLH1

S it i i l• Son situaciones excepcionales

8.8.-- A GENÉTICO LÍNEA GERMINALA GENÉTICO LÍNEA GERMINAL

• Mut patogénica en 60% pacientes con CCR con defecto MMR

• Confirma SL y permite diagnóstico presintomáticoy p g p

• Diferentes estrategias:

S i ió t di d d d l i- Secuenciación y estudio de grandes deleciones

- Estudio de mutaciones fundadoras y recurrentes

- Estudio variantes de significado desconocido

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• Conocimiento clínico y molecular SL

• Mejora en la precisión diagnósticaj p g

• Dx diferencial de SL con otras entidades

• Al it d i ió di ó ti l SL• Algoritmo de aproximación diagnóstica al SL

• Aspectos conflictivos

• Otras estrategias y propuestas son posibles

GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓNGRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓNelastra@hgy es

Algorithm 1: Diagnosis In all cases when LS is not confirmed, linkage studies may be considered. *Exclude phenocopy; **If loss of PMS2: Consider BRAF mut/MLH1 methylation in low risk families, and MLH1 test in high-risk families; ;¥If low probability of carrying a mutation, consider LS exclusion without further studies; †If AC are met, or high LS suspicion, consider MMR genes testing, specially MSH6 (some MSH6 mutations do not result in MSI); ‡Specially MLH1 testing: Some MLH1 mutations do no abrogate protein expression.

[email protected]

enrique lastra ucg, s. oncología médicaucg, s. oncología

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