Lic. Roy Cedeño

Elución.

Absorción.

•PROCEDIMIENTO EN EL CUAL SE ADHIERE UNO O MÁS ANTICUERPOS A LOS A LOS ANTÍGENOS CORRESPONDIENTE EN LOS ERITROCITOS PARA LA SUBSIGUIENTE REMOCIÓN (DEL ANTICUERPO) DEL SUERO.

•LUEGO EL SUERO ABSORVIDO SE PRUEBA CON UN PANEL PARA DETERMINAR SI HAY PRESENCIA DE ALOANTICUERPOS ENMASCARADOS.

ES EL PROCEDIMIENTO DE ADSORCIÓN EN EL QUE SE ADHIEREN LOS ANTICUERPOS DEL PACIENTE UTILIZANDO SUS PROPIOS ERITROCITOS SI EL PACIENTE NO HA SIDO TRANSFUNDIDO EN LOS ULTIMOS 3 MESES.

ES EL PROCEDIMIENTO DE ADSORCIÓN EN EL QUE SE ADHIEREN LOS ANTICUERPOS DEL PACIENTE CON ERITROCITOS NO GENETICAMENTE IDENTICOS.

PROCEDIMIENTO EN EL QUE SE DISOCIAN COMPLEJOS ANTIGENOS ANTICUERPO QUE SE ENCUENTRA EN LA MEMBRANA DE LOS ERITROCITOS .LUEGO SE PRUEBA LA ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO IgG LIBERADO. A LA SOLUCIÓN QUE CONTIENE EL ANTICUERPO LIBERADO SE LE LLAMA ELUATO; ES REQUERIDO CUANDO EL COOMBS DIRECTO RESULTA POSITIVO POR IgG.

1. FACTORES TÉCNICOS (TOMA DE LA MUESTRA, ALMACENAMIENTO Y SENSIBILIDAD DEL MÉTODO).

2. NIVELES ELEVADOS DE INMUNOGLOBULINAS (SIDA, MIELOMA MULTIPLE, PACIENTE RECIBIENDO INMUNOGLOBULINAS INTRAVENOSA.

3. DROGAS (CEFALOSPORINAS, CISPLASTINA Y SURAMINAS) QUE CAUSAN ADSORCIÓN NO INMUNOLOGICA DE PROTEÍNAS EN LOS ERITROCITOS.

4. TRANSPLANTE DE MÉDULA ABO INCOMPATIBLE (DONANTE GRUPO “O” Y PACIENTE “A”)

5. TRANSPLANTE DE ÓRGANOS SÓLIDO ( EJ. DE PULMONES) EN DONDE EL ANTI A y/o ANTI B O ALOANTICUERPO DERIVADOS DE LOS LINFOCITOS DEL DONANTE PUEDEN CAUSAR UN COOMBS DIRECTO POSITIVO Y HEMÓLISIS.6. USO DE PRODUCTOS DE PLASMA NO ABO ESPECÍFICO O INMUNOGLOBULINA INTRAVENOSA CONTENIENDO ANTI A y/o ANTI B.7.ENFERMEDADES COMO FALLO RENAL, MAYORMENTE SI ESTAN EN DIÁLISIS.

8.TRANSFUSIÓN DE SANGRE .

SI EL COOMBS DIRECTO INICIAL RESULTA POSITIVO, REPITA LA PRUEBA USANDO ERITROCITOS LAVADOS CON SALINA, SI EL COOMBS DIRECTO RESULTA NEGATIVO EN LA REPETICIÓN REPORTE NEGATIVO.SI EL COOMBS DIRECTO PREVALECE POSITIVO EN LA REPETICIÓN EFECTÚE LOS ESTUDIOS INMUNOHEMATOLÓGICOS ADICIONALES QUE SEAN REQUERIDOS.

LOS ANTICUERPOS FRIOS PUEDEN SER REMOVIDOS DEL SUERO MEDIANTE UNA O MAS ADSORCIONES.SE UTILIZAN CELULAS AUTÒLOGAS.SI EL AUTOANTICUERPO ES POTENTE PUEDEN USARSE LAS PROPIAS CELULAS TRATADAS CON ENZIMAS.

MUETRA: UN TUBO CON ANTICUAGULANTE UN TUBO SIN ANTICUAGULANTE

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

LA MUESTRA CON ANTICOGULANTE DEBE SER MEZCLADA INMEDIATAMENTE Y PUESTA EN UN BAÑO MARIA A 37ºC.CENTRIFUGAR LA MUESTRA ANTICOAGULADA SI ES POSIBLE A 37ºC Y SEPARAR TODO EL PLASMA.LAVAR LAS CELULAS CON SALINA CALENTADA A 37ºC POR 4 VECES Y EMPAQUETAR LAS CELULAS.

CELULAS AUTOLOGAS

PLASMA CON EL AC A ADSORVER

COLOCAR UN VOLUMEN DE SUERO PROBLEMA Y UN VOLUMEN DE CELULAS LAVADAS.MEZCLAR Y COLOCAR EN BAÑO MARIA MUY FRIO, CON ABUNDANTE HIELO MEZCLANDO FUERTEMENTE PARA PARA LOGRAR MAYOR CONTACTO ENTRE EL SUERO Y LAS CELULAS.INCUBAR EN LA NEVERA A 4ºC POR 30 A 60 MINUTOS MEZCLANDO FRECUENTEMENTE.DEMOSTRAR QUE LA ADSORCION FUE ADECUADA COLOCANDO EN UN TUBO DOS GOTAS DE SUERO Y UNA GOTA DE CELULAS AUTOLOGAS FRESCAS AL 5%.CENTRIFUGAR Y LEER, SI NO HAY AGLUTINACIÓN LA ADSORCIÓN FUE SATISFACTORIA DICHO SUERO SE IDENTIFICARA COMO ADSORVIDO Y SE UTILIZARA PARA LAS SUBSECUENTES PRUEBAS.

SI LA AGLUTINACIÓN PERSISTE REALIZAR OTRA ADSORCIÓN CON CELULAS FRESCAS.

SI TODAVIA LA AGLUTINACIÓN PERSISTE ES RECOMENDABLE TRATAR UN MUESTRA FRESCA CON ENZIMAS.

EN PRESENCIA DE MEZCLA DE ANTICUERPO FRIOS DE AMPLIO RANGO TERMICO Y AC CALIENTES.

EN PRESENCIA DE UN COOMBS DIRECTO POSITIVO QUE REACCIONA A TEMPERATURA AMBIENTE O BAJA TEMPERATURA EN DONDE DICHO ANTICUERPO PUEDE ESTAR ENMASCARA NDO O INTERFIRIENDO CON LA IDENTIFICACION DE OTRO.

A UN VOLUMEN DE CÉLULAS AUTÓLOGAS LAVADAS Y EMPAQUETADAS AGREGAR UN VOLUMEN IGUAL DE FICINA AL 1% Y MEZCLAR.INCUBAR A 37ºC POR 15 MINUTOS.CENTRIFUGAR Y REMOVER LA FICINA LAVANDO 3 VECES CON SALINA Y EMPAQUETAR LAS CÉLULAS DESPUÉS DEL ÚLTIMO LAVADO.

MEZCLAR IGUAL VOLUMEN DE SUERO PROBLEMA Y DE CÉLULAS FICINADAS MEZCLAR BIEN E INCUBAR A 4ºC DE 15 A 60 MINUTOS .CENTRIFUGAR Y REMOVER EL SUERO ADSORVIDO Y PROBARLOS CON CÉLULAS AUTÓLOGAS FRESCAS AGREGANDO EN UN TUBO DOS GOTAS DE SUERO ADSORVIDO Y UN GOTA DE CÉLULAS FICINADAS INCUBAR A TEMPERATURA DEL LABORATORIO POR 15 MINUTOS .CENTRIFUGAR Y LEER SI HAY O NO AGLUTINACIÓN .SI LA AGLUTINACION PERSISTE REPETIR EL PROCEDIMIENTO CON CELULAS FISCINADAS FRESCAS.

EN EL CASO DE UNA ADSORCION ALOGENICA SE ULITIZA CÉLULAS CON ANTIGENOS CONOCIDOS ESPECÍFICOS PARA EL ANTICUERPO QUE SE DESEA ADSORVER.

ELUCIÓN POR CALENTAMIENTO.

ELUCIÓN POR CONGELAMIENTO RÁPIDO.

ELUCIÓN POR ETER.

ELUCIÓN POR XILENO (XILOL ).

ELUCIÓN POR CLOROFORMO.

PREPARACION DE LA MUESTRA:LAVAR EL VOLUMEN DE CÉLULAS CON UN EXESO DE SALINA POR 6 VECES, DESPUÉS DEL ÚLTIMO LAVADO CONSERVAR UNA ALICUOTA DE SALINA PARA INVESTIGAR ANTICUERPOS LIBRES, SI PERSISTE APLICAR LAVADOS ADICIONALES HASTA QUE EL RESIDUO DE SALINA NO PRESENTE ANTICUERPOS.DESPUES DEL ULTIMO LAVADO EMPAQUETAR BIEN LAS CÉLULAS Y AGREGAR IGUAL VOLUMEN DE SE SOLUCIÓN DE ALBUMINA BOVINA AL 6% Y MEZCLAR BIEN.LLEVAR AL BAÑO MARIA A 56ºC DURANTE 10 MINUTOS MEZCLANDO PERIODICAMENTE.CENTRIFUGAR A ALTA VELOCIDAD POR 5 MINUTOS.SEPARAR EL SOBRENADANTE ROSADO EN UN TUBO APARTE IDENTIFICADO ADECUADAMENTE.ESTE METODO OFRECE BUENOS RESULTADOS PARA ELUIR ANTICUERPOS ANTI-A Y ANTI B PERO NO ES RECOMENDABLE PARA OTROS ANTICUERPOS.

COLOCAR EN UN TUBO 0.5ML DE GLOBULOS ROJOS EMPAQUETADOS Y LAVADOS PREVIAMENTE 6 VECES.AGREGAR 3 GOTAS DE SALINA NORMAL Y MEZCLAR BIEN.TAPAR EL TUBO Y ROTARLO EN POSICION HORIZONTAL PARA QUE LAS CELULAS SE DISTRIBUYAN EN UN CAPA DELGADA EN TODA LA SUPERFICIE INTERIOR.COLOCARLOS EL TUBO EN EL CONGELADOR DE FORMA HORIZONTAL ENTRE -20 A -70 POR 10 MINUTOS.DESCONGELAR RAPIDAMENTE COLOCANDO EL TUBO EN EL CHORRO DE AGUA Y CENTRIFUGAR FUERTEMENTE POR 2 MINUTOS Y TRANSFERIR EL SOBRENADANTE ROSADO A UN TUBO LIMPIO.

EL ELUATO DEBE SER PROBADO CONJUNTAMENTE CON UN ALICUOTA DEL SOBRENADANTE DEL MISMO LAVADO.ESTE MÉTODO ES UTIL PARA RECUPERAR ANTICUERPOS ANTI-A Y ANTI-B POR EJEMPLO EN EL CASO DE LA ENFERMEDAD HEMOLITICA DEL RECIEN NACIDO. TIENE POCA SENSIBILIDAD PARA ELUIR AUTO O ALOANTICUERPO.

LAVAR UN VOLUMEN DE GLOBULOS ROJOS POR 6 VECES Y EMPAQUETAR FUERTEMENTE EN EL ÚLTIMO LAVADO Y CONSERVAR UN ALICUOTA DE LA SALINA RESIDUAL .AGREGAR AL PAQUETE GLOBULAR UN VOLUMEN DE SALINA Y DOS VOLUMENES DE ETER.Y AGITAR FUERTEMENTE EL TUBO EN FORMA HORIZONTAL DURANTE 1 MINUTO. QUITA EL TAPON CUIDADOSAMENTE PARA DEJAR ESCAPAR LOS VAPORES DEL ETER.CENTRIFUGAR A ALTA VELOCIDADES DURANTE 10 MINUTOS, DESPUÉS DE LA CENTRIFUGACIÓN SE PUEDE OBSERVAR 3 CAPAS BIEN DEFINIDAS : 1.UNO SUPERIOR TRANSPARENTE QUE ES EL ETER.2.UN INTERMEDIA: FORMADA POR ELTROMA Y PROTEÍNAS 3.Y UNA INFERIOR COLOREADA DE ROJO POR LA HEMOGLOBINA QUE ES EL ELUATO.ASPIRAR EL ELUATO CON UN PIPETA PASTEUR Y TRANSFERIRLO A UN TUBO LIMPIO.

LLEVAR EL TUBO DESTAPADO AL BAÑO MARIA A 37ºC PARA QUE EL ETER SE TERMINE DE EVAPORAR

SI QUEDA UNA PORCION DE ETER RESIDUAL SE RECOMIENDA COLOCAR EL TUBO PARA LA PRUEBA DOS GOTAS DEL ELUATO Y LLEVARLO A BAÑO MARIA A 37ºC DURANTE 5 MINUTOS PAR QUE ETER SE EVAPORE.

COLOCAR UN VOLUMEN DE GLOBULOS ROJOS EMPAQUETADOS Y LAVADOS PREVIAMENTE 6 VECES Y AGREGARLE IGUAL VOLUMEN DE XILOL.TAPAR EL TUBO Y COLOCARLO DE FORMA HORIZONTAL Y AGITAR FUERTEMENTE DURANTE 1 A 2 MINUTOS.INCUBAR EN BAÑO MARIA A 56ºC DURANTE 10 MINUTOS AGITANDO PERIODICAMENTE .CENTRIFUGAR A ALTA VELOCIDAD (3,000 RPM) POR 10 MINUTOS.RETIRAR LA CAPA SUPERIOR Y EL ESTROMA TENIENDO EL CUIDADO DE RECENTRIFUGAR FUERTEMENTE EL ELUATO PARA ELIMINAR RESIDUOS CONTAMINANTES DEL ESTROMA.

COLOCAR EN UN TUBO 1 ML DE GLOBULOS ROJOS EMPAQUETADOS Y LAVADOS PREVIAMENTE 6 VECES AGREGAR 1ML DE ALBÚMINA Y 2 ML DE CLOROFORMO.TAPAR EL TUBO CON UN TAPON DE CORCHO Y COLOCARLO DE FORMA HORIZONTAL Y AGITAR FUERTEMENTE DURANTE 15 SEGUNDOS. LUEGO MEZCLAR POR INVERSION DURANTE 1 MINUTO.DESTAPAR Y COLOCAR EL TUBO EN BAÑO MARIA A 56ºC DURANTE 5 MINUTOS, MEZCLAR EL CONTENIDO CON UN APLICADOR DURANTE ESTE TIEMPO.CENTRIFUGAR FUERTEMENTE (3,400 RPM) POR 5 MINUTOS TRANSFERIR EL ELUATO( CAPA SUPERIOR) EN UN TUBO LIMPIO.

LOS PROCEDIMIENTOS DE ELUCIÓN O ADSORCIÓN SON DE GRAN UTILIDAD PARA AQUELLOS CASOS DONDE ES NECESARIO OBTENER O SEPARAR DEL GLOBULO ROJOS INMUNOGLOBULINAS CON EL FIN DE INDENTIFICAR EL TIPO DE ANTICUERPO INVOLUCRADO O EN TAL CASO PARA EVITAR LA INTERFERENTE DE ESTE CON LA IDENTIFICACION DEL PANEL.

HAY PROCESOS MANUALES QUE SON DE GRAN UTILIDAD SIN EMBARGO LA DISPONIBILIDAD DE METODOLOGIAS MÁS SENSIBLES Y SENCILLAS EVITAN EL PROBLEMA DE LA MANIPULACION DE COMPUESTOS UN TANTO PELIGROSOS.