Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Botánica Universidad de Concepción

Efectos de la toxina del Pulpo de anillos azules

Omar Blas Alvarado Carripan

Licenciatura Química -Químico 2005-400208-4 Química de Algas Profesor Mario Silva

Introducción y conocimiento general sobre el espécimen es cuestiónPulpo de Anillos Azules.

El tema a tratar son los efectos de la toxina que posee el pulpo de anillos azules, donde la concentración del trabajo consistirá en tratar de recopilar todas o la máxima cantidad de propiedades químicas y físicas que posee esta toxina ,tratar de averiguar cual es su molécula central para su funcionamiento , y tratar de encontrar en esta informaciones minuciosas e importantes, para así comprender que tan alto es su poder de toxicidad y el peligro que puede causar al estar expuesta a ella, si el objetivo es logrado se dará paso a encontrar los beneficios que esta puede otorgar tanto para procedimientos farmacológicos o beneficios medicinales generales.

El pulpo de anillos azules (Hapalochlaena Maculosa) se encuentra en todas las costas marinas de Australia, India y el pacifico indonésico. El pulpo es una especie de tamaño pequeño sus tentáculos miden de unos 3cm a 6cm de largo y su cuerpo en total con sus tentáculos extendidos no se exceden de los 20cm.El pulpo de anillos azules por naturaleza no es agresivo, cuando este se siente amenazado o asustado cambia sus colores y aparecen anillos azules muy brillantes en su piel y su cuerpo toma un tono café polvoriento.

Se han reportado muchísimos casos de ataques de estos pulpos a seres humanos con resultados fatales en la mayoría de ellos para las victimas, aunque son las menores de las veces hay reportes documentado de muchas personas que han sobrevivido. El pulpo posee un aguijón por el cual luego de su picadura introduce saliva venenosa dentro de la herida de la víctima. Los síntomas que comienzan a presentar las victimas una vez introducido el veneno en sus cuerpos son : dificultades respiratorias que desencadenan un paro respiratorio , resequedad en la boca y la garganta , distorsión de la visión , perdida de la sensación del tacto , ataxia (descoordinación en el movimiento de las partes del cuerpo de la victima) y la mas importante de todas parálisis muscular, ya que esta es su principal ventaja en el método de alimentación del pulpo, el cual se alimenta principalmente de cangrejos a los cuales les rocía su toxina que se encuentra en grandes glándulas salivales y sale despedida desde su aguijón en forma de choro esta solución viaja por el agua, rodea al cangrejo este comienza con los síntomas antes descritos y finalmente queda paralizado luego de unos 2 minutos y el pulpo entra a alimentarse con su aguijón estando el cangrejo aun vivo (a veces espera su muerte).

Debido al gran tamaño de sus glándulas salivales (almacenamiento del veneno) un mismo pulpo es capaz de mata a 10 seres humanos adultos con ataques simultáneos, mismo efecto se produce en especies vertebradas de tamaños menores (ratas, sapos, conejos) por lo cual es de gran certeza concluir que el pulpo de anillos azules posee un altísimo nivel de toxicidad en su veneno (toxinas) lo que lo clasifica en un puesto muy diferente al de sus especies análogas ya que la gran mayoría de las otras clases de pulpos conocidos no poseen estas características lo que produce una nueva conclusión la, cual insita a pensar en que el Hapalochlaena Maculosa posee toxinas diferentes y únicas en comparación a las otras especies de pulpos.

Además en experimentos realizados en donde se tomaron conejos como victimas para el pulpo de anillos azules, se encontró que luego de aplicada la picadura del pulpo y antes de que los conejos comenzaran con los síntomas característicos (añadiendo convulsiones) los conejos no sangraron por los orificios causados por la picadura lo cual sugiere que la saliva del pulpo contiene anticoagulantes lo que es comúnmente encontrado en la secreción de otros pulpos.

Como ultimo punto es importante destacar que existe al menos unas 10 clases distintas de pulpos de anillos azules pero la especie estudiada, el Hapalochlaena Maculosa, es el mas grande y común las demás solo difieren en tamaño y en su hábitat ya que el Hapalochlaena Maculosa puede vivir en profundidades marinas mas grandes que otra especie como el Hapalochlaena lunulata que es mas pequeño y vive en las costas marinas australianas contrarias y a mayor superficie.

Análisis de la secreción salival del pulpo de Anillos azules.

El Investigador y científico Simons en 1964 que los efectos tóxicos de la saliva del pulpo de anillos azules indica que estas secreciones salivales contienen un componente no presente en la saliva de otros pulpos. Por otro lado, algunas de las sustancias normalmente encontradas en la saliva de otros pulpos también están presentes en la saliva del pulpo de anillos azules, estas son la Tiramina y la Octopamina.

Para poder comprender la toxina que guarda este pulpo es necesario extraer su secreción y averiguar sus propiedades.

Para ello, y luego de muchos experimentos y métodos realizados con anterioridad por investigadores, el científico de apellido Croft en 1971 consiguió un método de aislamiento de la toxina para poder ser examinada. De un pulpo (Hapalochlaena Maculosa) muerto diseccionó sus glándulas salivales posteriores (lugar en donde guarda el pulpo su toxica secreción salival), las cuales las disolvió, homogenizándolas, en metanol. Escombros de proteínas y células fueron removidas por filtración. El extracto crudo es purificado por cromatografía de absorción sobre una columna de silica-gel, desde donde se extrajo la toxina Maculotoxina (MTX), esta se extrajo en dos fracciones de elusiones, la primera en un 50 % de metanol en cloroformo, la segunda se extrajo con 5 % de acido acético en metanol.

Luego, ni la delgada capa cromatográfica ni la espectroscopia infrarroja revelaron alguna diferencia entre estas dos fracciones, las cuales posteriormente son juntadas y secadas en forma de una especie de polvo blanco el cual es muy soluble en agua y en metanol, pero muy insoluble en acetona o cloroformo.

Así también se vio que la MTX es muy cómoda para trabar, ya que además de poseer un bajo peso molecular, 540 g/mol más o menos, puede ser guardada indefinidamente a la temperatura de 2 ºC sin perdida de toxicidad, al igual que cuando es expuesta a HCl 1M o calentado hasta 2 horas a 60 ºC, es decir es estable en medio acido, pero en soluciones alcalinas (PH superior o igual a 8), la toxicidad es perdida completamente.

Otra característica importante que fue encontrada es que la toxina puede comportarse como un cation, donde la toxina queda retenida en resina de intercambio catiónico, la Dowex-50w-acido sulfonico, además la electrolisis capilar sobre silica-gel o celulosa MN300 a PH 1.9 también muestran las propiedades cationicas de la maculotoxina.

Dos toxinas también provenientes de organismos marinos las cuales son la Saxitoxina y la Tetradotoxina (siempre considerada muy similar o igual a la maculotoxina), las cuales también son retenidas por intercambio catiónico, poseen átomos básicos de nitrógeno, es posible que las propiedades de intercambio cationico de la maculotoxina también pueda deberse a la presencia de un átomo básico de nitrógeno.

Además otra característica importante de la Maculotoxina es que es capaz de complejar al cation sodio, eso si, no hay una variación en la toxicidad de la toxina cuando esta libre de sodio o en la forma complejada, aquí es importante destacar que esta propiedad cumple un rol fundamental en el accionar de la toxina.

En 1970 los investigadores Freeman y Turner reportaron que la maculotoxina es probable que sea químicamente idéntica a las toxinas marina tetradotoxina y la saxitoxina (antes mencionadas). Pero cuando la tetradotoxina y la maculotoxina fueron comparadas usando cromatografía capilar, por Croft en 1971, las dos toxinas fueron claramente distinguidas.

Cromatografía capilar comparativa de la Tetradotoxina y la Maculotoxina

Absorbente Solvente Rf TTX Rf MTX Silica gel i-PrOH-HOAc-H2O

(70-5-25) 0.6 0.1-0.2

Celulosa MN300 n-BuOH-HOAc-H2O (2:1:1)

0.55 0.3-0.4

Celulosa MN300 t-BuOH-HOAc-H2O 0.65 0.3-0.4

La tetradotoxina y la maculotoxina también pueden ser distinguidas con reacciones

de coloración. La tetradotoxina da una reacción positiva con el agente Ninhidrina (ampliamente ocupada en peritaje) y otros agentes utilizados para la detección de aminas, mientras con la MTX es negativa, al igual que con muchos otros agentes colorantes, pero con las ninhidrinas y junto con el colorante de Jaffe da una reacción positiva de color distintivo comparado con la reacción de TTX.

El espectro infrarrojo da señales indicativas de varios grupos y moléculas químicas presentes en al MTX: normalmente hidrógenos enlazados a grupos OH, unas aminas secundarias o grupos hidroxilos y posiblemente grupos carbonilos, pero en cambio el análisis del espectro NMR da solamente resultados negativos, un microanálisis muestra la presencia de los siguientes grupos: Na 14.3 %, K 6.4 %. C 9.7 %, H 1.98 %,

N 3.52 %, no han sido encontrados evidencias de fosfatos. El oxigeno esta presente en cantidades significantes pero no fue encontrado el porcentaje exacto.

Por lo tanto, de todos estos experimentos y evidencias se puede hacer y dar conclusiones de la toxina del pulpo de anillos azules: En primer lugar no es una

-6

proteína, probablemente no esta contenida dentro de los grupos aminos, además tiene un peso molecular menor o igual a 540g/mol, esta positivamente cargado y puede formar complejos con los iones sodio, finalmente esta toxina (MTX) es claramente diferente en estructura a la TTX y la STX.

Modo y Mecanismo en que opera la toxina

Al exponer a cierta cantidad de animales a la MTX fue observado que: en los corazones de estos animales no hubo cambios trascendentales, solo un poco de taquicardia que duro aproximadamente unos 5 minutos después de la inyección, pero luego vuelve a la normalidad. Pero sin lugar a dudas las características más llamativas visto en todos los animales es la parálisis muscular y el paro respiratorio.

En experimentos donde se ha trabajado con las uniones nervio-músculo separadas del cuerpo de ranas y ratas, se ha encontrado que la MTX inhibe y desaparece los potenciales de acción, los cuales son los encargados de causar las contracciones (movimientos) en las fibra del esqueleto muscular.

Para poder registrar esto, 2 micro electrodos fueron insertados en una fibra, una para pasar corriente al pulso para despolarizar la superficie de la membrana y la otra para registrar el potencial de la membrana en reposo y los potenciales de acción. Registros de estos experimentos se muestran en la siguiente tabla que muestra el debilitamiento de los potenciales de acción.

Luego el sistema fue expuesto a la MTX con una concentración de 1x10 g/ml, donde después que esta fue adherida, los potenciales de acción desparecieron rápidamente, pero no existieron cambios en el potencial de la membrana. Luego los potenciales de acción se recomponen velozmente una vez extraído la MTX.

Es así como la MTX se diferencia de otros agentes o procedimientos que bloquean los potenciales de acción, en efecto el número total de potenciales de acción que son disminuidos antes de que el nervio fuera bloqueado se relaciona exponencialmente a la concentración de MTX usada.

1

100

4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 5,2

(MTX) x10(-6) g/ml

Pro

med

io d

e p

ote

ncia

les d

e

accio

n

Esto demuestra que los potenciales de acción bloqueados dependen solo de la concentración de la concentración de MTX ocupada e independiente del tiempo tomado para estimularlos.

El accionar de la MTX va en el bloqueo de la despolarización de la membrana y de la conductividad de los sodios activados los cuales son los que normalmente conducen a un potencial de acción, así cuando una membrana excitable es despolarizada, la permeabilidad de los iones sodio aumenta, así el potencial electroquímico para el sodio esta perfectamente activo y los iones sodio entran a la célula y despolarizan la membrana. Esta permeabilidad del sodio es acompañado por el incremento en la permeabilidad de otro ion involucrado, el potasio, que es menor en magnitud y tiene un curso menor de tiempo.

Algunas drogas que bloquean los potenciales de acción no son específicos a inhiben el incremento en la conductividad del sodio y del potasio en respuesta a la despolarización de la membrana, pero algunas toxinas (como la tetradotoxina y la saxitoxina) bloquean solo la actividad despolarizadora del sodio cambiando específicamente su conductividad, pero sin efecto en el lento desarrollo del incremento de la conductividad del potasio, estos tipos de agentes que hacen esto se llaman Natrotoxinas y la MTX es muy probable que se encuentre en esta categoría.

La actividad de MTX esta influenciada por la concentración de iones sodio, la superioridad en las concentraciones de sodio hace que el efecto del bloqueo de los potenciales de acción ocasionado por la MTX sea menor. Este comportamiento se ve en el siguiente grafico, el cual muestra resultado obtenidos de 1395 fibras en 42 musculos externos.

0

200

400

600

80 100 120 140 160 180

(Na+) mM

Pro

med

io d

e P

ote

ncia

les d

e

accio

n

-6

-6 -6 -6 Grafico para 4 concentraciones de MTX 4.0 x10 g/ml triángulos blancos, 4.25

x10 g/ml triángulos negros, 4.5 x10 g/ml círculos blancos y 5.0 x10 g/ml círculos negros. Otra posible explicación para la interacción entre los iones sodio y la MTX es que ambos compitan por un sitio cargado negativamente en la membrana. Como la MTX se comporta como cation debido a que tiene uniones fuertes a intercambios cationicos y migra a el cátodo en la electrolisis, es posible que durante en un potencial de acción, los iones sodio obligan a que un grupo cargado negativamente sea expuesto por la despolarización de la membrana, la MTX puede acceder a estos sitios con una mayor facilidad durante un potencial de acción, así bloquea los canales de sodio e interrumpe y elimina los potenciales de acción.

Los potenciales de placa final (epp) y los pequeños potenciales de placa final (mepp) se encuentran en la placa final de las fibras musculares, y la MTX no tiene ningún efecto sobre lo mepp, este no puede tener ningún efecto sobre la interacción de la acetilcolina y los receptores postsipnapticos.

Así en definitiva la MTX bloquea las trasmisiones neuromusculares por inhibición en los potenciales de acción en las terminales presipnapticas y fibras musculares lo que lo define y encasilla dentro de los natrotoxinas presipnapticas. No tiene efecto sobre los otros pasos involucrados en la transmisión neuromuscular.

El beneficio de esta toxina para el hombre se ve reflejado en el área farmacológica debido a que es ocupado como un anestésico local ya que su mecanismo de inhibir el potencial de acción el cual es el encargado (entre muchas cosas) de transmitir ráfagas eléctricas ocasionadoras del dolor, pero no se puede ocupar como anestésico general debido a que produce daños en el sistema nervioso central.