efecto modulador ex vivo de los fármacos biológicos para
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA,
ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN
BIOMÉDICA DEL HOSPITAL
UNIVERSITARIO DE LA PRINCESA
Efecto modulador ex vivo de los fármacos biológicos para la enfermedad inflamatoria intestinal sobre las
células mononucleares de sangre periférica y la mucosa intestinal
TRABAJO FIN DE GRADO
Autor: Lucía Vicioso Gómez
Tutor: Samuel Fernández Tomé
Julio de 2019
ii
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA
AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
GRADO DE BIOTECNOLOGÍA
EFECTO MODULADOR EX VIVO DE LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS PARA LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL SOBRE LAS CÉLULAS
MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA MUCOSA INTESTINAL
TRABAJO FIN DE GRADO
Lucía Vicioso Gómez
MADRID, 2019
Director: Samuel Fernández Tomé
Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital
Universitario de La Princesa
Profesor: José Manuel Palacios
Dpto. de Biotecnología y Biología Vegetal
iii
TITULO DEL TFG- EFECTO MODULADOR EX VIVO DE LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS PARA LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL SOBRE LAS CÉLULAS
MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA MUCOSA INTESTINAL
Memoria presentada por Lucía Vicioso Gómez para la obtención del título de Graduado en Biotecnología por la Universidad Politécnica de Madrid
Fdo: Lucía Vicioso Gómez
VºBº Tutor
Samuel Fernández Tomé Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de La Princesa
VºBº Tutor UPM
José Manuel Palacios Alberti Dpto. de Biotecnología y Biología Vegetal ETSIAAB - Universidad Politécnica de Madrid
Madrid, 25, junio, 2019
iv
ÍNDICE
ÍNDICE DE TABLAS v
ÍNDICE DE FIGURAS v
LISTA DE SÍMBOLOS vi
LISTA DE ABREVIATURAS vii
RESUMEN viii
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1
1.1. INTRODUCCIÓN 1
1.1.1. LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL 1
1.1.2. LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS 3
1.1.3. ANTECEDENTES DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN,
PLANTEAMIENTO DE LA HIPÓTESIS Y
APORTACIÓN DEL TFG
8
1.2. OBJETIVOS 10
CAPÍTULO 2. MATERIAL Y MÉTODOS 11
2.1. ASPECTOS ÉTICOS Y TOMA DE MUESTRAS HUMANAS 11
2.2. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS 11
2.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 11
2.4. TINCIÓN EXTRACELULAR DE PBMCs 13
2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 14
CAPÍTULO 3. RESULTADOS 15
3.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS APCs EN BASE A
MARCADORES DE MIGRACIÓN
15
3.2. ESTUDIO FUNCIONAL DE LA CAPACIDAD DE MIGRACIÓN
DE LAS APCs
18
CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN 22
CONCLUSIONES 24
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 25
APÉNDICES 28
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Mecanismos de acción de los principales fármacos anti-TNF-α en la EII 6
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tratamiento farmacológico actual de la EII 3
Figura 2. Caracterización fenotípica de las APCs en base a marcadores de
migración
16
Figura 3. Evaluación del efecto de los fármacos biológicos sobre el fenotipo de
las APCs en base a marcadores de migración
17
Figura 4. Influencia de ligandos quimioatrayentes sobre la migración de las
APCs
18
Figura 5. Influencia de fármacos biológicos sobre la migración de las APCs 19
Figura 6. Influencia de ligandos quimioatrayentes y fármacos biológicos sobre
la migración de las APCs
20
vi
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC: grados Celsius
h: horas
µg: microgramos
µL: microlitros
mL: mililitros
ng: nanogramos
p: p-valor
rpm: revoluciones por minuto
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
APCs: Células presentadoras de antígenos
CCL: Ligando de quimiocinas
CCR: Receptor de quimiocinas
CU: Colitis ulcerosa
DC: Células dendríticas
EC: Enfermedad de Crohn
EII: Enfermedad inflamatoria intestinal
FACS-buffer: Tampón fosfato para citometría de flujo
Ig: Inmunoglobulina
IL: Interleucina
LB: Linfocitos B
LPMCs: Células mononucleares de lámina propia
MAdCAM-1: Molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1
mDC: Células dendríticas mieloides
Mo: Monocitos
PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica
pDC: Células dendríticas plasmacitoides
RPMI: Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute
Th: Linfocito T helper
TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa
VCAM-1: Molécula de adhesión vascular 1
viii
RESUMEN
Inflammatory bowel disease comprises a group of chronic disorders of the gastrointestinal
tract mainly classified into Crohn's disease and ulcerative colitis. It is a serious condition
that affects millions of people worldwide and which precise etiology remains unknown.
Despite the variety of pharmacological treatments available, such us the new biological
drugs, there is no effective treatment to cure this pathology and the current goal is to
induce and maintain remission to improve the quality of life of these patients. Biological
drugs can act on different targets that have a key role in the disease, however their
mechanisms of action are partly understood.
This work aims to evaluate the ex vivo modulatory effect of biological drugs with different
targets –infliximab, inflectra and adalimumab (anti-TNF-α), and vedolizumab (anti-
integrin α4β7)– on the migration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to the
intestinal mucosa in healthy patients. To this end, PBMCs were obtained and cultured in
the absence/presence of biological drugs. Afterwards, migratory surface markers (beta7,
CCR2, CCR5, CCR6 and CCR9) of the subpopulations of antigen presenting cells (APCs)
were characterized by flow cytometry, as well as their capacity to migrate towards
different intestinal chemoattractants (CCL2, CCL25 and MAdCAM1) on a transwell
culture model.
This study demonstrates the blockade that vedolizumab exerts on integrin α4β7, reducing
the expression of beta7 on the surface of APCs. In contrast, anti-TNF-α drugs seem to
increase the expression of this integrin in monocytes. Functional assays on transwell
model show that ligand CCL2 induces the most potent effect over the spontaneous
migration of APCs. Moreover, after culture with biological drugs, this study suggests that
the ex vivo modulatory effect of biological drugs over the recruitment of APCs might be
preferentially mediated through ligand CCL2. This work highlights the role of biological
drugs over the migratory capacity of circulating APCs towards the intestinal mucosa in
healthy individuals, setting the basis to further explore this mechanism of action in
inflammatory bowel disease patients.
1
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.1. INTRODUCCIÓN
1.1.1. LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un grupo heterogéneo de enfermedades en
las que ocurre una inflamación crónica del tracto digestivo. La EII se clasifica,
principalmente, en la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), las cuales se
diferencian por la zona del aparato digestivo que resulta afectada. La inflamación en la
EC se puede observar en cualquier parte del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el
ano, aunque normalmente suele afectar al íleon y colon proximal, mientras que en la CU
las lesiones solo aparecen en el colon. Otra diferencia entre ambas patologías radica en
las características de las lesiones, siendo de tipo transmural y con la aparición de
granulomas en la EC, pero localizándose en la superficie de la mucosa en el caso de la
CU (Chapel et al., 2014; Ananthakrishnan et al., 2017). Al igual que otras enfermedades
autoinmunes, la EII alterna periodos de remisión con periodos de recurrencia o brotes
(Gassull et al., 2007).
La EII afecta considerablemente a la calidad de vida de los pacientes. Los síntomas más
representativos incluyen dolor abdominal, diarrea, sangrado rectal, fiebre, cansancio,
anemia, pérdida de peso y malnutrición ocasionada por la incapacidad del organismo para
absorber los nutrientes adecuadamente (Rich et al., 2018). También pueden aparecer
manifestaciones extraintestinales que suelen afectar a articulaciones, hígado, piel y ojos
(Gassull et al., 2007).
Este grupo de enfermedades afecta a un gran número de individuos. Se estima que 1,5 y
2 millones de personas padecen EII en América y Europa, respectivamente. Aunque su
aparición se suele asociar a países occidentalizados e industrializados, en los últimos años
la prevalencia está aumentando en Sudamérica, Asia y África (Ng et al., 2017; M'koma,
2013). Por otra parte, el diagnóstico de esta enfermedad se suele realizar en adultos con
20-40 años (Ananthakrishnan et al., 2017), pero los últimos estudios indican un aumento
de casos pediátricos (Malmborg y Hildebrand, 2016).
La causa de esta enfermedad no se conoce por completo por el momento, pero se sospecha
que puede ser debida a una combinación de factores ambientales, genéticos y microbianos
junto a una desregulación del funcionamiento del sistema inmune (Ananthakrishnan et
2
al., 2017; Rich et al., 2018). En la EII ocurren defectos en el sistema inmune innato como
cambios en la morfología del epitelio intestinal y una acumulación de especies reactivas,
lo que se relaciona con una respuesta inmune alterada de la mucosa intestinal hacia la
microbiota comensal. Asimismo, dentro de la inmunidad adaptativa, tradicionalmente se
ha descrito en la EC una respuesta exacerbada mediada por linfocitos T helper 1 y 17
(Th1 y Th17), mientras que en la CU la respuesta inmune es de tipo Th2. En ambas
enfermedades se acompaña de un aumento de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e
interferón gamma, entre otras citocinas proinflamatorias. También se produce un aumento
intestinal de células T reguladoras, un descenso de inmunoglobulina (Ig) A y un aumento
en la producción de IgG e IgM (Abbas et al., 2012; Ananthakrishnan et al., 2017).
La EII supone un gran coste para el sistema sanitario debido a la alta frecuencia de
consultas médicas y hospitalizaciones por brotes, así como por el elevado coste de las
pruebas diagnósticas y de los tratamientos empleados. Actualmente la EII no tiene cura,
pero los tratamientos disponibles permiten controlar la enfermedad, aminorar la gravedad
de sus síntomas y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Los tratamientos actuales
incluyen estrategias nutricionales, quirúrgicas y farmacológicas (Gomollón, 2014).
Como se muestra en la Figura 1, los tratamientos farmacológicos más usados para el
manejo de la EII incluyen las siguientes opciones: i) 5-aminosalicilatos, fármacos anti-
inflamatorios de acción localizada en la mucosa intestinal que, sin embargo, pueden
producir efectos secundarios en el 30-50% de los pacientes (Casellas y Oltra, 2016;
Ananthakrishnan et al., 2017); ii) corticosteroides, fármacos anti-inflamatorios que
inducen la remisión de la EII pero no sirven para el mantenimiento de ésta, ya que
presentan diversos problemas asociados a su uso como la corticodependencia, la falta de
eficacia o corticorresistencia y sus numerosos efectos adversos (Casellas y Oltra, 2016);
iii) inmunomoduladores, usados cuando fracasa el tratamiento con corticosteroides, son
agentes que modifican las respuestas inmunes sistémicas por diferentes mecanismos de
acción, pero que pueden aumentar el riesgo de infecciones oportunistas y neoplasias
(Ananthakrishnan et al., 2017); iv) antibióticos, se usan junto a otros tratamientos aunque
su eficacia no ha sido plenamente demostrada (Ananthakrishnan et al., 2017); y v)
fármacos biológicos, que han supuesto una revolución no solo en el tratamiento de la EII,
sino también en otras enfermedades inflamatorias derivadas de alteraciones en el correcto
3
Figura 1. Tratamiento farmacológico actual de la EII. (Adaptado de Casellas y Oltra, 2016).
funcionamiento del sistema inmune, como la artritis reumatoide o la psoriasis (Boehncke
y Radeke, 2007).
1.1.2. LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS
Los fármacos biológicos son proteínas o moléculas derivadas de las mismas que se
producen por técnicas biotecnológicas y que imitan el mecanismo de acción de procesos
que ocurren naturalmente en el organismo. Por lo tanto, los fármacos biológicos pueden
modular las respuestas del sistema inmune (Boehncke y Radeke, 2007).
Hasta hace poco, los tratamientos disponibles para la EII resultaban insuficientes. Sin
embargo, la reciente aparición de los fármacos biológicos ha conseguido mejorar la
inducción de la remisión en brotes graves, disminuir las intervenciones quirúrgicas y
mejorar la calidad de vida de los pacientes.
Una de las dianas a las que se dirigen los fármacos biológicos en la EII es el TNF-α. El
TNF-α es una molécula efectora en varios procesos inflamatorios del organismo y una de
las principales citocinas implicadas en la fisiopatogenia de la EII. Se han detectado altos
niveles de TNF-α en el suero de estos pacientes, así como un alto número de células
secretoras de TNF-α en la mucosa intestinal inflamada (Billmeier et al., 2016). Debido a
ello, una terapia eficaz consiste en la administración de anticuerpos anti-TNF-α para
conseguir la neutralización de esta citocina. Dentro de los fármacos anti-TNF-α, cabe
destacar el uso de infliximab, adalimumab, inflectra, certolizumab pegol y golimumab
para la EII.
4
Infliximab fue el primer anticuerpo anti-TNF-α aprobado para el tratamiento de la EII. Es
un anticuerpo IgG1 monoclonal bivalente y quimérico (25% murino que constituye la
región variable y 75% humano que forma la región constante), cuya administración es
por vía intravenosa. Induce la remisión en la EC y la CU y permite un menor uso de
corticosteroides y la cicatrización de la mucosa (Billmeier et al., 2016; Slevin y Egan,
2015). Al igual que infliximab, adalimumab induce la remisión y su mantenimiento en la
EC y la CU. Adalimumab es un anticuerpo IgG1 monoclonal humano recombinante que
se administra por vía subcutánea. (Billmeier et al., 2016; Slevin y Egan, 2015).
Inflectra es un biosimilar de infliximab. Un biosimilar es un fármaco biológico similar en
estructura y, por tanto, en eficacia a otro fármaco biológico ya aprobado por la Food and
Drug Administration (Neurath, 2017).
Certolizumab pegol y golimumab son fármacos anti-TNF-α usados con menor frecuencia.
Certolizumab pegol es un anticuerpo humanizado carente de la región constante, aun no
aprobado por la Agencia Europea de Medicamentos. Se administra por vía subcutánea
(Billmeier et al., 2016). Golimumab es un anticuerpo monoclonal humano aprobado para
el tratamiento de la CU que también se administra por vía subcutánea (Billmeier et al.,
2016).
Una terapia alternativa a la neutralización de citocinas, como TNF-α, es el bloqueo de la
circulación de células del sistema inmune periférico hacia la mucosa intestinal inflamada.
Esta migración celular se encuentra mediada por la interacción entre las integrinas de los
linfocitos T y las moléculas de adhesión específicas de tejido localizadas en las células
endoteliales de los vasos sanguíneos (Coskun et al., 2017). Por lo tanto, una de las dianas
terapéuticas de estos fármacos biológicos son también las integrinas.
Dos fármacos dirigidos a estas integrinas son vedolizumab y natalizumab. Vedolizumab
es un anticuerpo IgG1 monoclonal humanizado anti-integrina α4β7 que induce la remisión
en pacientes con CU y EC. Bloquea selectivamente la interacción entre la integrina α4β7
y la molécula de adhesión celular adresina de la mucosa-1 (MAdCAM-1) localizada en
el intestino, lo que hace que tenga un buen perfil de seguridad (Coskun et al., 2017;
Neurath, 2017). Por el contrario, natalizumab, un anticuerpo IgG4 monoclonal
humanizado y recombinante anti-integrina α4, actúa bloqueando la interacción de las
integrinas α4β1 y α4β7 con las moléculas de adhesión endoteliales denominadas molécula
de adhesión vascular (VCAM-1) y MAdCAM-1, respectivamente. VCAM-1 no tiene una
5
expresión específica en el tejido intestinal, pues también se localiza en el sistema nervioso
central, lo que hace que natalizumab pueda aumentar el riesgo de sufrir efectos
secundarios muy graves en el sistema nervioso (Coskun et al., 2017). Debido a ello,
natalizumab solo se usa en casos excepcionales.
En la actualidad, se están desarrollando varios fármacos biológicos dirigidos a bloquear
otras citocinas proinflamatorias y sus vías de señalización (Neurath, 2017). Un ejemplo
sería ustekinumab, un anticuerpo anti-p40, que es una subunidad compartida por las
interleucinas IL-12 e IL-23 que inducen respuestas Th1 y Th17, respectivamente (Coskun
et al., 2017).
A pesar de que los fármacos anti-TNF-α son hoy en día considerados como una de las
terapias más eficaces para la EII, solo un tercio de los pacientes experimenta remisión a
largo plazo; otro tercio, a pesar de tener una mejoría al inicio del tratamiento, pierde la
capacidad del mantenimiento de la remisión a medio-largo plazo; mientras que el otro
tercio no responde al tratamiento desde el inicio (Chaparro et al., 2012a; Neurath, 2017).
Se ha observado que el uso concomitante de inmunomoduladores reduce de forma
significativa la pérdida de respuesta al anti-TNF-α infliximab, mientras que el tabaco la
aumenta. En el caso de adalimumab, la pérdida de respuesta es mayor en aquellos
pacientes que no han tomado anti-TNF-α previamente o que presentan manifestaciones
extraintestinales (Chaparro et al., 2011; Chaparro et al., 2012b).
Ante la falta o pérdida de respuesta a los anti-TNF-α, los clínicos optan por un incremento
en la dosis administrada, por el cambio a otro agente anti-TNF-α, o por el cambio a otro
fármaco biológico que tenga otra diana alternativa al TNF-α (Chaparro et al., 2011).
Asimismo, se han observado diferencias en la respuesta inducida por fármacos dirigidos
a una misma diana terapéutica, lo que ha llevado a pensar que su efecto no está basado
únicamente en el bloqueo de su diana específica.
Como se muestra en la Tabla 1, diversos estudios han demostrado que los anti-TNF-α,
además del bloqueo de citocinas proinflamatorias, pueden actuar a otros niveles como en
la barrera intestinal, la apoptosis celular, inducir efectos inmunomoduladores o actuar
sobre la migración de células sanguíneas a la mucosa intestinal.
6
Tabla 1. Mecanismos de acción de los principales fármacos anti-TNF-α en la EII.
FÁRMACO TIPO DE
ESTUDIO MUESTRA# MECANISMO DE ACCIÓN BIBLIOGRAFÍA
Infliximab
In vitro
Células Jurkat Inducción de la apoptosis en células Jurkat T CD3/CD28 activas ten Hove et al. (2002)
Células Jurkat Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente
de complemento Ueda et al. (2013)
Ex vivo
Mo de sangre periférica (VS
y EC) Reducción del número de Mo circulantes Slevin et al. (2016)
LPMCs (VS, CU, EC) Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2+ cocultivados con
macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII Atreya et al. (2011)
Fibroblastos de intestino
(VS, EC)
Reducción de la producción y migración del factor de angiogénesis
VEGF-A Rutella et al. (2011)
In vivo
Íleon terminal y colon (VS,
EC)
Inducción de la producción de IL-22 por parte de linfocitos T
CD4+ Fang et al. (2018)
Íleon terminal* Inhibición de la disminución de uniones interepiteliales (ocludinas,
claudina-2) inducida por TNF-α entre los enterocitos ileales Fries et al. (2008)
LPMCs (VS, EC) Inducción de la apoptosis de linfocitos T Van den Brande et al. (2007)
LPMCs (VS, EC) Inducción de la apoptosis de linfocitos T CD3+ activos ten Hove et al. (2002)
Células epiteliales
intestinales*
Reducción de la apoptosis, disminuyendo a su vez la expresión del
marcador Fas Marini et al. (2003)
LPMCs (VS, EC) Reducción de los niveles de proteína C reactiva en pacientes
respondedores y no respondedores a infliximab Van den Brande et al. (2007)
Sangre periférica y colon
(VS, CU, EC)
Aumento de la circulación de células T reguladoras CD4+
CD25+Foxp3+ y CD4+ CD25-Foxp3+, y menor expresión de Foxp3
en la mucosa intestinal
Li et al. (2010)
PBMCs (VS, CU, EC)
Inducción de la expresión de macrófagos regulatorios
(CD206+/CD68+) solo en pacientes en los que se da cicatrización
de la mucosa
Vos et al. (2012)
Colon transversal y recto
(VS, EC) Inhibición de la producción de GM-CSF Agnholt et al. (2004)
Colon (EC) Reducción de células endoteliales CD31+ relacionadas con el nivel
de angiogénesis Eder et al. (2016)
7
Colon (VS, CU, EC) Reducción del porcentaje de neutrófilos CD66b+ y disminución de
la producción de IL-6 e IL-8 Zhang et al. (2018)
PBMCs (VS, EC) Normalización de la función de los canales de calcio en linfocitos
Th2 en pacientes pediátricos Orbán et al. (2016)
PBMCs (VS, EC) Normalización de la función de los canales de potasio en linfocitos
T CD8+ en pacientes pediátricos Orbán et al. (2017)
LPMCs* y suero* Reducción de la expresión del factor inflamatorio alográfico Román et al. (2017)
Colon proximal (CU, EC) Aumento de la expresión de β-catenina en células caliciformes y
activación de p38 en células epiteliales Román et al. (2017)
Adalimumab
In vitro Células Jurkat Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente
de complemento Ueda et al. (2013)
Ex vivo LPMCs (VS, CU, EC) Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2+ cocultivados con
macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII Atreya et al. (2011)
In vivo Colon (EC) Reducción de células endoteliales CD31+ relacionadas con el nivel
de angiogénesis Eder et al. (2016)
Golimumab In vitro Células Jurkat Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente
de complemento Ueda et al. (2013)
Certolizumab
pegol
In vitro Células Jurkat Inducción de muerte celular no apoptótica Ueda et al. (2013)
Ex vivo LPMCs (VS, CU, EC) Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2+ cocultivados con
macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII Atreya et al. (2011)
# Todas las muestras son de origen humano, a excepción de aquellos estudios que se indican con (*): modelo murino (Mus musculus). Entre paréntesis se indica si las muestras humanas proceden
de voluntarios sanos (VS) o de pacientes con enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU).
EII: enfermedad inflamatoria intestinal; IL: interleucina; LPMC: lamina propria mononuclear cells o células mononucleares de lámina propia; Mo: monocitos; PBMCs: peripheral blood
mononuclear cells o células mononucleares de sangre periférica; TNF-α: tumor necrosis factor α o factor de necrosis tumoral α
8
Por ejemplo, Román et al. (2017) demostraron que infliximab remodela la arquitectura
de la barrera intestinal que se encuentra alterada en pacientes con EII, ya que el fármaco
reduce la expresión de biomarcadores proinflamatorios mientras que aumenta la
expresión de los factores de remodelamiento β-catenina y p38. Por otro lado, Fries et al.
(2008) descubrieron que infliximab también recupera la estructura de las uniones
interepiteliales de enterocitos ileales de ratón alterada por la citocina TNF-α,
favoreciendo, por tanto, la integridad de la barrera intestinal.
Asimismo, los fármacos anti-TNF-α (entre ellos infliximab, adalimumab y certolizumab
pegol) pueden estimular la apoptosis de linfocitos T en modelos in vitro, ex vivo e in vivo
de la mucosa intestinal (Atreya et al., 2011; ten Hove et al., 2002). En la misma línea, se
observó que infliximab, adalimumab y golimumab pueden inducir in vitro la citotoxicidad
mediada por anticuerpos y dependiente de complemento en células que expresan TNF-α
en su membrana (Ueda et al., 2013).
Respecto a su efecto inmunomodulador, Fang et al. (2018) determinaron que infliximab
estimula la producción de la citocina anti-inflamatoria IL-22, mientras que Li et al. (2010)
observaron que este fármaco también puede inducir el aumento de poblaciones T
reguladoras en sangre periférica. De la misma manera, se ha observado un mayor número
de macrófagos reguladores periféricos en pacientes tras el tratamiento con infliximab
(Vos et al., 2012).
1.1.3. ANTECEDENTES DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN,
PLANTEAMIENTO DE LA HIPÓTESIS Y APORTACIÓN DEL TFG
El sistema inmune juega un papel determinante en la fisiopatogenia de la EII y es, por
tanto, un campo esencial para el estudio y la identificación de posibles dianas terapéuticas.
Dentro del sistema inmune, las células presentadoras de antígenos (APCs) son
poblaciones celulares clave para el mantenimiento de la homeostasis intestinal. Las APCs
son un grupo de células encargado de secretar citocinas y presentar moléculas
coestimuladoras en su superficie con el fin de conseguir una respuesta T efectora. Entre
las APCs se incluyen las células dendríticas (DC), los linfocitos B (LB), macrófagos,
células del endotelio vascular y varias células epiteliales y mesenquimales (Abbas et al.,
2012). Las DC son las APCs por excelencia, siendo la mayoría de linaje mieloide
hematopoyético (las células dendríticas mieloides (mDC)), aunque existe una
subpoblación plasmacitoide (las células dendríticas plasmacitoides (pDC)) que responde
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ante las infecciones virales. Por otra parte, los macrófagos y monocitos (Mo) son
fagocitos mononucleares. Los Mo circulan por la sangre, para después migrar a los
tejidos, donde se diferencian a macrófagos. Por último, los LB participan en la respuesta
inmune humoral mediante la secreción de anticuerpos y la internalización y presentación
de antígenos proteicos a los linfocitos Th (Abbas et al., 2012).
El grupo de investigación de acogida ha demostrado recientemente que la mucosa de
pacientes con EII tiene un mayor número de macrófagos CD11chigh, con características
similares a los Mo circulatorios pro-inflamatorios, mostrando a su vez esta mucosa
inflamada una mayor capacidad para reclutar Mo CD14+ circulantes de forma
dependiente del receptor 2 de quimiocinas (CCR2) (Bernardo et al., 2018). También han
demostrado que las DC CD103+SIRPα+ de fenotipo tolerogénico están disminuidas en el
colon inflamado de pacientes con CU, pero no con EC (Bernardo et al., 2019).
Ante la hipótesis de que los fármacos biológicos empleados en la EII pueden actuar sobre
la migración de células circulantes hacia la mucosa intestinal, este proyecto pretende
estudiar la capacidad de migración ex vivo de LB, Mo, pDC y mDC de sangre periférica,
así como evaluar el efecto modulador de fármacos biológicos con distintas dianas
terapéuticas, anti-TNF-α (infliximab, adalimumab e inflectra) y anti-integrina α4β7
(vedolizumab), sobre el perfil de quimiocinas relacionadas con la migración intestinal en
controles sanos. Esta parte del proyecto resulta esencial para comparar con los efectos
que se encuentren en pacientes con EII, cuya realización está siendo actualmente evaluada
por el grupo de acogida. El conocimiento en mayor profundidad de los mecanismos
patogénicos implicados en la EII, así como el efecto que tienen los fármacos biológicos
sobre ellos, contribuirá a la comprensión de la heterogeneidad de esta enfermedad, así
como al desarrollo y aplicación de actuales y futuras estrategias terapéuticas.
10
1.2. OBJETIVOS
El principal objetivo de este proyecto consiste en evaluar el efecto modulador ex vivo de
fármacos biológicos con distintas dianas terapéuticas –infliximab, inflectra y adalimumab
(anti-TNF-α) y vedolizumab (anti-integrina α4β7)– sobre la capacidad de migración de
subpoblaciones circulantes de APCs en voluntarios sanos. Para cumplir este objetivo se
plantearon los siguientes objetivos parciales:
I. Caracterización fenotípica de los marcadores de migración celular beta7, CCR2,
CCR5, CCR6 y CCR9 de APCs en condiciones basales y tras cultivo con dichos
fármacos biológicos.
II. Estudio funcional del reclutamiento de APCs inducido por los quimioatrayentes
intestinales CCL2, CCL25 y MAdCAM1.
III. Análisis del efecto de los fármacos biológicos sobre la capacidad de migración
que presentan las APCs de forma espontánea e inducida por dichos
quimioatrayentes intestinales.
11
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. ASPECTOS ÉTICOS Y TOMA DE MUESTRAS HUMANAS
El procedimiento para la obtención de sangre y biopsias intestinales fue aprobado por el
Comité de Ética de la Investigación con medicamentos del Hospital Universitario de La
Princesa. El código del protocolo es GIS-INH-2015. Las muestras de este estudio se
obtuvieron de voluntarios sanos que acudieron a realizarse una colonoscopia para el
despistaje, seguimiento y/o diagnóstico de una alteración intestinal. Se reclutaron
aquellos sujetos que cumplían los criterios de inclusión/exclusión del estudio y que no
padecían una enfermedad crónica avanzada o cualquier patología con importancia clínica.
Previamente a la realización de la colonoscopia, se informó a los voluntarios sobre el
estudio, el procedimiento de obtención de las muestras y sus posibles riesgos. Tanto el
paciente como el clínico a cargo de la colonoscopia firmaron un consentimiento para la
recolección y manejo de las muestras.
De cada sujeto se obtuvieron, aprovechando la vía de sedación, 20 mL de sangre en dos
tubos de heparina - litio (Vacuette, Greiner Bio-One) y 10 mL de sangre en un tubo de
gelosa (SST II Advance, BD Vacutainer). Además, durante la colonoscopia, se recogieron
4 biopsias dobles de colon izquierdo, colon derecho e íleon terminal, que se transfirieron
a viales estériles con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640, Sigma-
Aldrich). Estos viales se almacenaron en hielo hasta su inmediato procesamiento en el
laboratorio.
2.2. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS
En este estudio se obtuvieron muestras de un total de 11 voluntarios sanos, distribuidos
en 3 varones con una edad comprendida entre los 51 y los 63 años y 8 mujeres de entre
44 y 69 años. La edad media de todos los voluntarios del estudio es de 58 años.
2.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
A. SANGRE
Desde la sangre obtenida en los tubos de heparina – litio, se aislaron las células
mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)
usando el medio de gradiente de densidad Ficoll-PaqueTM Plus (GE Healthcare). Una vez
obtenida la suspensión celular, las PBMCs se lavaron dos veces con RPMI-1640, y se
cuantificó su concentración con el analizador de hematología Nihon Kohden (Celltac α).
12
A continuación, se sembró 1 × 106 de PBMCs en tubos de citometría (Falcon, Corning)
y las células se cultivaron ex vivo durante 18 h a 37 ºC en ausencia (condición basal) y
presencia de cada uno de los fármacos biológicos objeto del estudio. Las condiciones de
cultivo fueron las siguientes:
• Condición basal: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo
[RPMI-1640, 10% suero fetal bovino, 1% L-glutamina, 1% solución antibiótica
penicilina-estreptomicina y 0,1% gentamicina (Sigma-Aldrich)].
• Condición infliximab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo
completo suplementado con infliximab (10 µg/mL).
• Condición inflectra: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo
suplementado con inflectra (10 µg/mL).
• Condición adalimumab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo
completo suplementado con adalimumab (10 µg/mL).
• Condición vedolizumab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo
completo suplementado con vedolizumab (100 µg/mL).
Los fármacos de este proyecto fueron donados por las compañías farmacéuticas
respectivas (MSD, Hospira, AbbVie y Takeda).
Además, 1 × 106 de PBMCs se añadieron a tubos de citometría para realizar una tinción
extracelular a tiempo cero con paneles de anticuerpos a los que llamaremos “FACSCanto”
(las células teñidas con este panel se analizaron con el citómetro BD FACSCANTOTM II)
y “Fortessa” (las células teñidas con este panel se analizaron con el citómetro BD
LSRFortessaTM, servicio prestado por el Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares). El protocolo de tinción para citometría de flujo se detalla en el
apartado 2.4.
Una vez transcurridas las 18 h de cultivo en las distintas condiciones experimentales, las
PBMCs se centrifugaron (1500 rpm, 5 minutos, 4 ºC) y se recogió el sobrenadante de
cultivo en criotubos que se almacenaron a -80 ºC para futuros estudios “ómicos” del
grupo. Las células obtenidas tras la centrifugación se utilizaron para dos abordajes
experimentales:
a) Tinción Fortessa: Las PBMCs tras cultivo fueron teñidas (apartado 2.4.) para ser
analizadas por el citómetro BD LSRFortessaTM.
13
b) Tinción FACSCanto: Las PBMCs tras cultivo se resuspendieron en medio de cultivo
completo y se sembraron (200.000 células) en la cámara apical (superior) de una placa
de cultivo de 96 pocillos con insertos de tipo transwell (Corning HTS Transwell). En
la cámara basal (inferior) de la placa se añadió medio de cultivo completo (como
condición basal) o los siguientes quimioatrayentes: ligando de quimiocinas 2 (CCL2)
(100 ng/mL) (R&D Systems), ligando de quimiocinas 25 (CCL25) (500 ng/mL)
(R&D Systems), y MAdCAM-1 (1000 ng/mL) (R&D Systems).
La placa de cultivo transwell se incubó a 37 ºC durante 4 h. A continuación, se recogió
el medio de la cámara basal (inferior) para obtener las PBMCs que migraron desde la
cámara apical (superior) a través del inserto. Estas células se tiñeron con el panel
“FACSCanto” (apartado 2.4.) y se analizaron en el citómetro BD FACSCANTOTM II.
Por otro lado, la sangre extraída en el tubo de gelosa se centrifugó a 2500 rpm durante 15
minutos. El suero (sobrenadante) se almacenó en crioviales y se preservó a -80 ºC para
futuros estudios “ómicos” del grupo.
B. INTESTINO
Las biopsias de cada región intestinal (colon izquierdo, colon derecho e íleon terminal)
se lavaron de forma separada con medio Hanks’ Balanced Salt Solution (Gibco). A
continuación, se incubó una biopsia por pocillo en placas de 24 pocillos (Thermo
Scientific) durante 18 h a 37 ºC. Las biopsias de cada región intestinal se incubaron en
0,5 mL siguiendo las mismas condiciones de cultivo a las descritas en el caso de las
PBMCs (basal, infliximab, inflectra, adalimumab y vedolizumab).
Tras el cultivo, se recogieron los sobrenadantes de los pocillos y se centrifugaron (1500
rpm, 5 minutos, 4 ºC). El sobrenadante de cultivo libre de células se preservó en criotubos
a -80 ºC. El precipitado celular se resuspendió con RNAlaterTM (Invitrogen, Thermo
Fisher Scientific) y se llevó a un criotubo junto con la biopsia del pocillo correspondiente.
Ambos criotubos se preservaron a -80 ºC para futuros estudios “ómicos” del grupo.
2.4. TINCIÓN EXTRACELULAR DE PBMCs
Después de los distintos protocolos experimentales indicados anteriormente con las
PBMCs, para realizar su tinción extracelular, las células se lavaron en 1 mL de tampón
fosfato para citometría de flujo (FACS-buffer) [Tampón fosfato salino, 2% suero fetal
bovino, 0,01% azida de sodio y 0,04% EDTA (Sigma-Aldrich)] y se centrifugaron (1500
14
rpm, 5 minutos, 4 ºC). Tras el lavado, las células fueron resuspendidas en 100 μL de
FACS-buffer y 20 μL de suero fetal bovino para bloquear las uniones inespecíficas.
A continuación, las células se tiñeron (20 minutos, 4 ºC, en oscuridad) con los anticuerpos
específicos de superficie de los paneles “FACSCanto” y “Fortessa” que se detallan en el
Apéndice A.
Tras la tinción, las células se lavaron (centrifugación 5 minutos, 1500 rpm, 4 ºC) y se
fijaron (10 minutos, 4 ºC, en oscuridad) con 250 µL de paraformaldehído 2% (Santa Cruz
Biotechnology). Finalmente, las células se volvieron a lavar (centrifugación 5 minutos,
1500 rpm, 4 ºC), se resuspendieron en 250 µL de FACS buffer y se mantuvieron en
refrigeración hasta su adquisición. Así, las células teñidas con el panel “FACSCanto” se
analizaron con el citómetro de flujo BD FACSCANTOTM II, y las células teñidas con el
panel “Fortessa” se analizaron con el citómetro de flujo BD LSRFortessaTM.
En el Apéndice B se muestra un ejemplo de la estrategia de identificación celular
empleada para el análisis de citometría. Las PBMCs se identificaron dentro de las células
sencillas (no dobletes) y viables (> 95% de viabilidad). Dentro de las PBMCs, las distintas
subpoblaciones de APCs (LB, Mo, pDC y mDC) se identificaron en base a los marcadores
HLA-DR, CD19, CD14, CD123, CD11c, CD141 y CD1c. El análisis de los datos de
citometría se llevó a cabo con el software FlowJo V10 (FlowJo LCC, Ashland, Oregon,
USA).
2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software
Inc., La Jolla, CA, USA). Las comparaciones se realizaron mediante análisis t-test para
muestras pareadas o no pareadas según se indique en el pie de figura. En todos los casos
se consideró una diferencia significativa (*) un p-valor (p) inferior a 0,05; (**) p < 0,01;
(***) p < 0,001 y (****) p < 0,0001.
15
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS APCs EN BASE A
MARCADORES DE MIGRACIÓN
El análisis del perfil fenotípico de las APCs según los niveles de expresión de beta7,
CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en estado basal y tras cultivo se muestra en la Figura 2. Se
observó un descenso significativo en la expresión del marcador beta7 en todas las
subpoblaciones de APCs tras el cultivo, a excepción de los Mo. No obstante, estas células
mostraron también una notable tendencia en la reducción de este marcador (p = 0,1103).
De una forma similar, el marcador de migración CCR2 tendió a disminuir sus niveles tras
cultivo en todas las subpoblaciones de APCs siendo este descenso estadísticamente
significativo en el caso de los Mo, pDC y CD1c mDC. En cambio, la expresión de los
marcadores CCR5 y CCR6 no se vio modificada notablemente durante el cultivo o bien
experimentó un aumento. Este aumento fue significativo en el caso de los LB y las CD141
mDC para CCR5, y de los Mo y CD1c mDC para CCR6. Sin embargo, el marcador CCR9
tuvo un bajo nivel de expresión en todas las poblaciones celulares y no se observaron
diferencias significativas tras el cultivo (Figura 2).
Una vez caracterizado el perfil fenotípico de las APCs en estado basal y tras cultivo, se
evaluó el efecto modulador de los fármacos biológicos sobre dichos marcadores de
migración. Como se muestra en la figura 3, cabe destacar que el cultivo ex vivo con el
fármaco vedolizumab disminuyó notablemente la expresión de beta7 en todas las
subpoblaciones celulares. Este descenso fue estadísticamente significativo en LB (p <
0,0001), pDC (p < 0,01) y CD1c mDC (p < 0,05), pero no en Mo (cultivo: 1,055 ± 0,466;
vedolizumab: 0,211 ± 0,075; p = 0,0766) y CD141 mDC (cultivo: 6,680 ± 3,189;
vedolizumab: 0,441 ± 0,279; p = 0,0620). Sin embargo, tras el cultivo con los fármacos
anti-TNF-α los niveles celulares de beta7 se vieron aumentados generalmente, siendo este
aumento significativo en el caso de los Mo tratados con los anti-TNF-α inflectra (p <
0,05) y adalimumab (p < 0,05), pero no con infliximab (p = 0,1131) debido a la
variabilidad observada.
Con respecto a la expresión del resto de marcadores de migración, los niveles de CCR2,
CCR5 y CCR6 se mantuvieron constantes tras el cultivo con todos los fármacos, con la
excepción de una leve disminución de CCR2 en LB inducida por adalimumab, así como
un moderado aumento de este marcador en Mo inducido por inflectra y adalimumab y del
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Figura 2. Caracterización fenotípica de las APCs en base a marcadores de migración. Se analizó la expresión de los marcadores de migración beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en linfocitos
B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) a tiempo cero y tras
cultivo en medio de cultivo completo durante 18h (n=11). Los datos se analizaron estadísticamente con un t-test pareado y se consideraron diferencias significativas: *p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,0001.
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Figura 3. Evaluación del efecto de los fármacos biológicos sobre el fenotipo de las APCs en base a marcadores de migración. Se analizó la expresión de los marcadores de migración beta7,
CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides
CD141 (CD141 mDC), comparando su expresión tras el cultivo durante 18h en medio de cultivo completo con respecto al cultivo con los fármacos infliximab (IFX), inflectra (Inflec), adalimumab
(ADA) y vedolizumab (VEDO), respectivamente (n=11). Los datos se analizaron estadísticamente con un t-test pareado y se representa la media ± el error estándar de la media: *p<0,05; **p<0,01;
****p<0,0001.
LB
Mo
pDC
CD1c
mDC
CD141
mDC
beta7 CCR2 CCR5 CCR6 CCR9
18
marcador CCR6 en CD141 mDC tras el tratamiento con infliximab y vedolizumab. Como
observamos en el anterior caso (Figura 2), los niveles de CCR9 no fueron muy elevados
y presentaron una alta variabilidad, aunque merece la pena mencionar que el cultivo con
los tres fármacos anti-TNF-α tendió a reducir su expresión, en mayor medida que lo
observado para vedolizumab (Figura 3).
3.2. ESTUDIO FUNCIONAL DE LA CAPACIDAD DE MIGRACIÓN DE LAS
APCs
El estudio de la capacidad de migración de las APCs se realizó mediante un modelo in
vitro basado en una placa de cultivo de tipo transwell. En este estudio se analizaron,
además de las subpoblaciones de LB, Mo, pDC, CD1c mDC y CD141 mDC, las células
totales y las mDC totales (total mDC) (Apéndice B).
En la figura 4 se presentan los porcentajes de migración de las APCs inducidos por los
ligandos quimioatrayentes CCL2, CCL25 y MAdCAM1. Se vio un aumento significativo
en la migración de Mo (125,0 ± 12,4 %), pDC (334,8 ± 49,3 %) y CD1c mDC (153,9 ±
16,6 %) hacia el medio suplementado con CCL2, con respecto al basal (100 %). Sin
embargo, este ligando indujo una disminución en la capacidad de migración de las CD141
(58,7 ± 3,6 %).
Por otro lado, ninguna subpoblación de APCs se vio afectada en su migración espontánea
por los ligandos quimioatrayentes CCL25 y MAdCAM1 (Figura 4).
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Figura 4. Influencia de ligandos quimioatrayentes sobre la migración de las APCs. Se representa el porcentaje de
migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC),
el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células
dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) inducido por el ligando de quimiocinas 2 (CCL2), ligando de quimiocinas
25 (CCL25) y la molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1 (MAdCAM1), con respecto a la migración basal
espontanea representada por una línea discontinua (100%) en un modelo in vitro de cultivo en placa transwell. Los
datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de valores con la media:
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.
19
Se analizó también el efecto de los distintos fármacos biológicos sobre la migración
espontanea de las APCs hacia medio de cultivo completo libre de quimioatrayentes
(Figura 5). Aunque se observaron algunas diferencias, el porcentaje de migración de todas
las poblaciones celulares fue similar al de las células que habían sido cultivadas en medio
de cultivo completo libre de fármacos y no se encontraron efectos estadísticamente
significativos.
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Figura 5. Influencia de fármacos biológicos sobre la migración de las APCs. Se representa el porcentaje de
migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC),
el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células
dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) tras cultivo durante 18h con los fármacos infliximab (IFX), inflectra
(Inflec), adalimumab (ADA) y vedolizumab (VEDO), con respecto a la condición control cultivada en ausencia de
fármacos y representada con una línea discontinua (100%) en un modelo in vitro de cultivo en placa transwell. Los
datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de valores con la media.
Por último, se evaluó la capacidad de migración hacia los distintos quimioatrayentes de
las APCs que habían sido cultivadas con los fármacos (Figura 6). Como se muestra en la
Figura 6A, la migración de las pDC hacia CCL2 se redujo cuando estas células habían
sido cultivadas con fármacos anti-TNF-α, siendo significativo en el caso de infliximab e
inflectra, pero no para adalimumab (p = 0,0789). Sin embargo, considerando el recuento
de las mDC totales, el cultivo con infliximab, inflectra y vedolizumab supuso un
incremento estadísticamente significativo en su migración hacia CCL2; mientras que en
el caso de la subpoblación CD141 de las mDC, todos los fármacos aumentaron su
porcentaje de migración, aunque solo fue significativo en las que se habían cultivado con
vedolizumab (174,6 ± 30,9 %). Cabe mencionar que también la migración hacia CCL2
de los Mo que habían sido cultivados con inflectra aumentó en un 138,0 ± 15,1 %.
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Figura 6. Influencia de ligandos quimioatrayentes y fármacos biológicos sobre la migración de las APCs. Se
representa el porcentaje de migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células
dendríticas plasmacitoides (pDC), el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas
mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) tras cultivo durante 18h con los
fármacos infliximab (IFX), inflectra (Inflec), adalimumab (ADA) y vedolizumab (VEDO), con respecto a la condición
control cultivada en ausencia de fármacos, representada con una línea discontinua (100%) y utilizando un modelo in
vitro de cultivo en placa transwell que tenía suplementado el compartimento basal con a) ligando de quimiocinas 2
(CCL2), b) ligando de quimiocinas 25 (CCL25) y c) molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1
(MAdCAM1). Los datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de
valores con la media; *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001.
21
No obstante, y de forma similar a la descrita en el estudio en ausencia de fármacos (Figura
4), ninguna población celular mostró una variación significativa en su capacidad de
migración hacia los ligandos CCL25 o MAdCAM1 con independencia del tratamiento
con los fármacos biológicos (Figura 6B y Figura 6C).
22
CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN
Las APCs juegan un papel fundamental en la EII manteniendo un delicado balance entre
tolerancia e inmunidad. De hecho, las DC y los macrófagos son abundantes en el sistema
inmune gastrointestinal. Estas células extienden sus prolongaciones entre los enterocitos
hacia el lumen y se encargan de inducir una respuesta T protectora, así como de estimular
la función de las células T reguladoras ante la microbiota comensal y los alimentos
ingeridos. No obstante, en la EII, esta capacidad de protección se ve alterada y resulta en
una respuesta inmune exacerbada hacia las bacterias comensales (Abbas et al., 2012;
Ananthakrishnan et al., 2017). Además, los tratamientos utilizados en el manejo de la EII
resultan insuficientes y todavía no se conoce en profundidad los mecanismos de acción
que median su efecto terapéutico (Billmeier et al., 2016). Por ello, resulta de vital
importancia profundizar en los mecanismos patogénicos inmunes implicados en esta
enfermedad, como la migración celular, así como comprender el efecto modulador de los
fármacos biológicos actualmente utilizados en la EII.
En el análisis del fenotipo y la función de las APCs de nuestro estudio observamos que la
expresión de la integrina beta7 disminuyó tras el cultivo con vedolizumab en todas las
APCs. Esto resulta evidente ya que la diana molecular de este fármaco biológico es la
integrina α4β7 y, por tanto, interfiere selectivamente en su interacción con MAdCAM-1 y
el consecuente reclutamiento celular (Coskun et al., 2017; Neurath, 2017). Sin embargo,
resultó llamativo el aumento en la expresión de esta integrina en los Mo tras el cultivo
con inflectra y adalimumab, lo que conduce a la hipótesis de que los fármacos anti-TNF-
α podrían inducir un incremento en la expresión de beta7 en las APCs, mecanismo no
descrito en la bibliografía actual, hasta nuestro conocimiento.
La expresión del receptor de quimiocinas CCR9, cuyo principal ligando es CCL25 (White
et al., 2013), fue bastante reducida en todas las APCs tanto a nivel basal como tras cultivo
en las condiciones ensayadas (ausencia y presencia de fármacos). Este resultado
fenotípico en las APCs se puede trasladar a su capacidad funcional de migración hacia el
ligando de quimiocinas CCL25, el cual no indujo variaciones significativas en el
reclutamiento celular, con independencia del tratamiento con los fármacos de nuestro
estudio.
El ligando de quimiocinas CCL2, cuyo receptor es CCR2, es también conocido como la
proteína quimioatrayente de Mo (White et al., 2013; Deshmane et al., 2009). Acorde a
23
ello, se observó un aumento de la migración espontánea de los Mo hacia el medio
enriquecido con el ligando CCL2 tanto en ausencia de un tratamiento previo como tras el
cultivo con el fármaco inflectra. Siguiendo esta observación, encontramos un aumento
fenotípico en la expresión del receptor de quimiocinas CCR2 tras el cultivo de Mo con
inflectra y adalimumab.
Con respecto al resto de subpoblaciones celulares, CCL2 también ejerció un efecto sobre
la migración de las DC, encontrándose diferencias entre la migración basal y la inducida
tras el cultivo con fármacos. Las mDC aumentaron su porcentaje de migración hacia este
ligando de quimiocinas tras haber sido cultivadas con los fármacos anti-TNF-α y anti-
α4β7. Sin embargo, las pDC migraron en menor medida hacia el medio con CCL2 tras
haber sido cultivadas con los fármacos anti-TNF-α. Estos hallazgos concuerdan con el
trabajo de Penna et al. (2002), que indica la diferente capacidad de los subtipos de DC a
la hora de migrar en respuesta a distintos ligandos de quimiocinas, aunque la expresión
de los receptores de quimiocinas sea equiparable en ambos subtipos celulares. En
conjunto estos resultados sugieren que los fármacos biológicos podrían modular el
reclutamiento de precursores sanguíneos hacia la mucosa intestinal preferentemente a
través del ligando CCL2.
Este proyecto llevado a cabo con controles sanos sienta las bases y sirve de referencia de
futuras investigaciones que estudien el efecto de los fármacos biológicos sobre la
migración de APCs en pacientes con EII.
24
CONCLUSIONES
Las conclusiones que se pueden extraer de este trabajo son:
1) Las distintas subpoblaciones de APCs (LB, Mo y DC) presentan diferentes niveles
de expresión de los marcadores de migración beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y
CCR9, tanto en condiciones basales como tras su cultivo celular.
2) El fármaco biológico vedolizumab bloquea la expresión de beta7 en todas las
APCs, mientras que los fármacos biológicos anti-TNF-α aumentan la expresión
de esta integrina particularmente durante el cultivo de los Mo.
3) En comparación con los quimioatrayentes intestinales CCL25 y MAdCAM1, el
ligando CCL2 posee el mayor efecto inductor del reclutamiento de APCs
circulantes hacia la mucosa intestinal.
4) Los fármacos biológicos anti-TNF-α y anti-integrina α4β7 del estudio no
modifican la actividad migratoria espontánea de las subpoblaciones de APCs.
5) El efecto modulador de los fármacos biológicos sobre el reclutamiento intestinal
de APCs circulantes podría estar preferentemente mediado a través del ligando
CCL2.
En un futuro, este trabajo se podría ampliar con un mayor número de muestras de
controles sanos. Asimismo, es de gran interés tomar como referencia los datos obtenidos
en este estudio en proyectos que evalúen el efecto modulador de los fármacos biológicos
sobre la migración de las APCs en pacientes con EII.
25
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suppresses proinflammatory activities of mucosal neutrophils in inflammatory bowel disease”. Mediators
Inflamm. 2018(1): 3021863
28
APÉNDICES
• Apéndice A
Anticuerpos y canales empleados en la citometría de flujo.
Panel “FORTESSA” Panel “FACSCanto”
Canal Anticuerpo Marca Anticuerpo Marca
BV421 CD141 Miltenyi Biotec CD141 Miltenyi Biotec
BV510 - - HLA-DR BD Biosciences
BV570 HLA-DR Biolegend - -
BV605 CCR2 Biolegend - -
BV711 CCR5 BD Biosciences - -
BV786 CCR6 Biolegend - -
FITC CD123 BD Biosciences CD11c Miltenyi Biotec
PE Beta7 BD Biosciences CD19 BD Biosciences
PECF594 CD14 BD Biosciences - -
PC5 CD19 BD Biosciences CD14 Miltenyi Biotec
PC7 CD1c Miltenyi Biotec CD1c BD Biosciences
APC CCR9 BD Biosciences CD123 BD Biosciences
Alexa700 CD11c Biolegend - -
• Apéndice B
Estrategia de identificación celular.
Se muestra una figura representativa de la estrategia utilizada mediante citometría de flujo para el estudio de las
subpoblaciones celulares. Las células singletes y viables son las referidas como células totales en el estudio funcional
de migración celular transwell. El software empleado es FlowJo V10.