EFECTO INHIBITORIO DE ACEITE DE CLAVOS SOBRE Listeria monocytogenes EN

CARNE Y QUESO

K. Vrinda Menon and S.R. Garg

RESUMEN

La actividad antilisterica de aceite de clavos se examinó en la carne y el queso, tanto a 30ºC

como a 7ºC. En concentraciones de 0,5% y 1% de aceite de clavos de olor, se restringió el

crecimiento de Listeria monocytogenes en los alimentos a ambas temperaturas. La actividad

inhibitoria del aceite de clavo de olor fue más pronunciada a una concentración de 1%. El

recuento de Listeria en las muestras tratadas fueron de 1-3 log10 UFC g-1

menos en comparación

con los controles a diferentes intervalos durante el almacenamiento. Los resultados revelan el

potencial del aceite de clavo de olor como un conservante natural en la carne y el queso.

INTRODUCCIÓN

Listeria monocytogenes ha ganado una

creciente atención como un patógeno de

importancia en la salud pública debido a un

gran número de brotes de origen

alimentario de la listeriosis. La listeriosis

humana es a menudo muy grave, con tasas

de mortalidad tan altas como del 20% al

30% de los casos reportados (NACMCF

1991). Diferentes tipos de productos

alimenticios han sido asociados con estos

brotes (Farber y Peterkin 1991), por lo que

existe un interés considerable en poner fin a

esta tendencia que aumenta cada vez más.

Debido a la percepción negativa de los

consumidores hacia los conservantes

químicos, la atención se está desplazando

hacia alternativas naturales. El clavo

(Eugenia caryophyllus) es conocido desde

tiempos antiguos por poseer una actividad

antimicrobiana atribuida a su componente

activo el eugenol.

Este estudio examina la actividad

antimicrobiana del aceite de clavo de olor

sobre L. monocytogenes en la carne picada

(de cordero) y queso de pasta blanda

(mozzarella).

MATERIALES Y MÉTODOS

Alimentos Sustratos

Se utilizó carne de cordero picada fresca

comprada a un distribuidor local y queso

mozzarella italiano adquirido directamente

de un fabricante local. El queso no contiene

ningún conservante. Los alimentos fueron

esterilizados en autoclave a 121ºC durante

15 minutos y el aceite de clavo de olor se

añadió a las concentraciones deseadas a una

parte mientras que otra parte se utilizó

como control.

Aceite de Clavo

Se adquirió Aceite de clavo disponible

comercialmente de un proveedor local de

productos a base de hierbas. Se verificó su

esterilidad mediante la inoculación en

infusión de cerebro corazón (BHI) y

medios de cultivo de agar BHI. Fue usado

en concentraciones del 0,5% y 1% en los

alimentos utilizados como sustratos. El

contenido de eugenol en el aceite fue de

aproximadamente 85% al 92% (Pruthi

1980).

Cultivo de Ensayo

Se utilizaron dos cepas de L.

monocytogenes estándar obtenidas del

Microbial Type Culture Collection y Gene

Bank (MTCC), y el Instituto de Tecnología

Microbiana, Chandigarh, India. Estos

incluyen las cepas MTCC 657 (NCTC

7973) y MTCC 1143 (NCTC 11994). Se

usaron suspensiones de soluciones salinas

fisiológicas de los cultivos durante la noche

para inocular los sustratos alimenticios de

prueba.

Inoculación de las Muestras y

Almacenamiento

Las muestras fueron inoculadas

asépticamente en contenedores estériles con

aproximadamente 104 células de L.

monocytogenes g-1

. Estos fueron

mantenidos a 30ºC durante 7 días y 7ºC

durante 15 días.

Conteo de L. monocytogenes

Las muestras tratadas con aceite de clavos y

las muestras de control sin tratamiento

fueron examinadas por conteo de L.

monocytogenes al principio del experimento

(día 0) y subsecuentemente después de 1, 2,

3, 5 y 7 días para las muestras almacenadas

a 30ºC; y después de 3, 6, 9, 12 y 15 días

las muestras almacenadas a 7ºC. Las

muestras de carne mantenidas a 30 º C

mostraron signos visibles de deterioro, por

lo tanto el examen se limitó a 5 días

solamente. Los recuentos fueron tomados

en placas de agar en medio BHI con una

dilución adecuada de las muestras de forma

aséptica por duplicado. Fue utilizado como

diluyente solución salina fisiológica.

Análisis Estadístico

Los datos de dos repeticiones de cada

experimento, y una repetición de las dos

muestras de ensayo en cada intervalo de

muestreo se analizaron utilizando la prueba

paired t-test.

RESULTADOS

Efectos del aceite de clavos sobre L.

monocytogenes en Carne Picada

Las muestras de carne tratada con aceite de

clavo de olor presentaron menor cantidad

de L. monocytogenes que las

correspondientes muestras de control

manteniéndolas a 30ºC y 7ºC (Tabla 1). La

adición de 0,5% de aceite de clavo de olor

limitó el crecimiento de la población inicial

de Listeria de 7,7 × 103 UFC g

-1 a 1,8 × 10

5

UFC g-1 después de un almacenamiento de

un día a 30ºC, mientras que el

correspondiente aumento de la carne de

control fue de 8,7 × 103 UFC

g-1 a 2,6 × 10

6

UFC g-1.

Del mismo modo, el pico de los

recuentos obtenidos después de 5 días de

almacenamiento a 30ºC en la muestra

tratada y su control eran 3,5 × 107 UFC g

-1

y 2,8 × 108 UFC

g-1 respectivamente (P ≤

0,01). A 7ºC, el tratamiento con 0,5% de

aceite de clavo reveló un efecto antilisterico

llamativamente significativo después de 3,

6 y 9 días de almacenamiento, con el

recuento de UFC de dos cepas de Listeria

en la carne tratada siendo 5,1 × 104 g

-1, 9,0

× 104 g

-1 y 6.1 10

5 g

-1, respectivamente, en

comparación con 1,3 × 105 g

-1, 7.4 × 10

5 g

-1

y 1,3 × 106 g

-1 en los controles respectivos.

Una mayor concentración de aceite de clavo

(1%) mejora la acción antilisterica en la

carne. Como resultado, la población de

Listeria inicial de 104 UFC g

-1 mostró una

caída marginal en la carne tratada en el día

0 a 3,9 × 103 UFC g

-1. A un

almacenamiento a más de 30ºC, los

microorganismos mostraron una tendencia

gradual al alza de 2.0 × 107, 3.2 × 10

7 y 3.0

× 108 UFC g

-1 en los controles después de

1, 2 y 3 días respectivamente, pero los

niveles respectivos de sólo 3.7 × 104, 1.7 ×

105 y 2.5 × 10

6 UFC g

-1 fueron alcanzados

en la carne tratada durante este periodo. Los

conteos en el grupo tratado después de 5

días también fueron significativamente más

bajos que en el grupo de control (P ≤ 0,01).

Las muestras de carne almacenadas a 7ºC,

presentaron niveles significativamente más

bajos de células durante el experimento. La

población de Listeria de la muestra de carne

de control alcanzó un máximo de 1.8 × 107

UFC g-1

, pero varía entre sólo 6.1 × 103 y

4.2 × 105 UFC g

-1 en el grupo tratado

durante los 15 días del período de

experimentación (Tabla 1).

Tabla 1. Actividad antilisterica de clavos de olor en la Carne

Temperatura

(°C)

Tiempo de Almacenamiento

(días)

Promedios del Conteo de L. monocytogenes (UFC-1

)

0.5% de A. de Clavos 1% de A. de Clavos

Control Tratamiento Control Tratamiento

30

0 8.7×103 7.7×103 1.2×10

4 3.9×10

3

1 2.6×106 1.8×10

5a 2.0×10

7 3.7×10

4a

2 N.D. 1.6×106 3.2×10

7 1.7×10

5a

3 4.5×107 2.3×10

7 3.0×10

8 2.5×10

6a

5 2.8×108 3.5×10

7a 1.8×10

8 5.0×10

7a

7

0 1.7×104 1.6×10

4 1.8×10

4 1.2×10

4

3 1.3×105 5.1×10

4a 1.1×10

5 6.1×10

3a

6 7.4×105 9.0×10

4a 6.2×10

6 6.7×10

3a

9 1.3×106 6.1×10

5a 1.3×10

7 3.7×10

4a

12 2.0×106 2.1×10

6 1.8×10

7 3.6×10

5a

15 1.1×106 8.7×10

5 4.5×10

6 4.2×10

5a

Diferencia entre la muestra tratada y la de control estadísticamente significativas (P ≤ 0,01). N.D. no hecha.

Efectos del Aceite de Clavos de Olor sobre

L. monocytogenes en Queso

La adición de aceite de clavos de olor a

concentraciones de 1% causó una reducción

significativa en la tasa de crecimiento de

Listeria en las muestras de queso

almacenadas a 7ºC y 30ºC.

A concentraciones de aceite de 0.5% las

muestras tratadas mostraron una

disminución en la población cerca del 1

log10 UFC g-1

comparada con las muestras

de control después del almacenamiento a

30ºC para los días 1, 2, y 3, aunque en el

crecimiento posterior, la diferencia entre los

dos grupos no fue significativa (Tabla 2).

Se observaron diferencias significativas

entre los dos grupos a 7ºC, aunque la

diferencia máxima se registró nueve días

después (P ≤ 0,01).

El aumento de la concentración de aceite de

clavo a 1% mejoró la acción inhibidora

sobre L. monocytogenes. A 30ºC, se

registraron diferencias significativas en el

recuento en las muestras de control y las

tratadas durante los primeros 5 días de

almacenamiento. Los promedios de dos

conteos de cepas de L. monocytogenes en

las muestras de queso de control fue de 1.5

× 106 UFC 10

6 g

-1 después del día 1,

mientras que el valor correspondiente en

muestras de queso tratadas fue sólo de 1.9 ×

103 UFC g

-1, una diferencia alrededor de 3

log10 UFC g-1

. Una diferencia de 1-2 log10

UFC g-1

entre los dos grupos también se

registró en las muestras almacenadas a 7 º C

durante los primeros 12 días del

experimento.

Tabla 2. Actividad antilisterica de aceite de clavos de olor en el Queso

Temperatura (°C)

Tiempo de almacenamiento (días)

0.5% de A. de Clavos 1% de A. de Clavos

Control Tratamiento Control Tratamiento

30

0 7.1×103 6.9×103 4.8×103 1.8×103

1 5.7×105 9.8×104b 1.5×106 1.9×103b

2 2.1×106 4.6×105b 2.1×106 4.1×104b

3 2.7×107 2.1×106b 1.5×107 1.5×106b

5 2.7×107 1.3×107 2.4×107 1.5×106b

7 6.7×106 4.0×106 1.7×107 1.3×107

7

0 1.5×104 1.2×104 1.4×104 9.6×103

3 7.3×104 1.2×104a 6.9×104 1.1×103b

6 2.0×105 9.1×104a 1.9×105 8.0×103b

9 3.8×106 8.0×104b 2.6×105 6.0×104b

12 3.7×106 5.1×105b 6.0×105 5.1×104b

15 6.5×105 3.8×105 5.5×105 1.2×105 Diferencia entre la muestra tratada y la de control estadísticamente significativas (a P ≤ 0,05 and b P ≤ 0.01)

DISCUSIONES

La actividad antilisterica del aceite de

clavos de olor en medios de cultivo ha sido

señalada en varios trabajos anteriores (Bahk

et al. 1990, Aureli et al. 1992, Lis-Balchin y

decanos 1997). El presente estudio reveló

su acción sobre los sustratos alimenticios

carne y queso. Aunque el microorganismo

no fue eliminado ni completamente

inhibido, el aceite de clavos de olor fue

capaz de restringir la proliferación de L.

monocytogenes en los alimentos

anteriormente mencionados. El efecto fue

más evidente con concentraciones de aceite

de clavo al 1% comparado con

concentraciones de 0.5% ambas a 30ºC y

7ºC. El retraso en el crecimiento del

microorganismo es particularmente útil en

términos de seguridad alimentaria para el

almacenamiento corto de productos, porque

en el almacenamiento prolongado de

Listeria puede alcanzar niveles altos en los

alimentos a pesar de la presencia de aceite

de clavo de olor.

En un estudio anterior, Ting y Deibel

(1992) demostraron que el clavo de olor en

polvo a una concentración del 1% inhibe el

crecimiento del microorganismo en

suspensiones de carne. Se sabe que los

aceites de especias muestran una mejor

actividad antimicrobiana que los extractos y

polvos (Subrahmanyan et al. 1957). Hao et

al. (1998a, b) informó de un efecto

inhibidor de eugenol, el principio activo del

clavo de olor, de L. monocytogenes en la

carne de vacuno y aves de corral cocidas a

los 5ºC y 15ºC. En varios estudios, el aceite

de clavos de olor ha mostrado una rápida

acción germicida en medios de cultivo

(Ting y Deibel 1992, Smith-Palmer et al.

1998), pero en el presente estudio, el

tratamiento con aceite de clavo de olor no

se tradujo en una disminución de la

población de Listeria inmediatamente

después de tratar los alimentos en el día 0.

Esto podría ser causa de algún efecto

protector de los alimentos en el

microorganismo (Hao et al. 1998b). La

comida también puede absorber los

compuestos antimicrobianos en el aceite de

clavo de olor y por ende la reducción de su

acción sobre los microorganismos.

Los resultados sugieren que el potencial que

posee el aceite de clavos de olor como

sustancia antilisterica en la conservación de

alimentos, puede ser más aceptable para los

consumidores y los organismos

reguladores, en comparación con los

compuestos químicos. Aunque las altas

concentraciones de aceite de clavo pueden

afectar a las propiedades organolépticas de

los alimentos de manera negativa,

concentraciones más bajas pueden ser

suficientes para la seguridad alimentaria en

situaciones reales donde la carga bacteriana

es baja.

REFERENCIAS

Aureli, P., Costantini, A. and Zolea, S.

(1992) Antimi robial activity of some plant

essential oils against Listeria

monocytogenes. J. Food Prot. 55, 344-348.

Bahk, J.,Yousef, A. E. and Marth, E. H.

(1990) Behaviour of Listeria

monocytogenes in the presence of selected

spices. Lebensm.-Wiss.-u.-Technol. 23, 66-

69.

Farber, J. M. and Peterkin, P. I. (1991)

Listeria monocytogenes, a food-borne

pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511.

Hao,Y.Y., Brackett, R. E. and Doyle,M. P.

(1998a) In hibition of Listeria

monocytogenes and Aero monashydrophila

by plant extracts in refrigerated cooked

beef. J. Food Prot. 61, 307^312.

Hao,Y.Y., Brackett, R. E. and Doyle,M. P.

(1998b) Efficacy of plant extracts in

inhibiting Aeromona shydrophila and

Listeria monocytogenes in refrigerated

cooked poultry. Food Microbiol. 15, 367-

378.

Lis-Balchin,M. and Deans, S. G. (1997)

Bioactivity of selected plant essential oils

against Listeria monocytogenes. J. Appl.

Microbiol. 82, 759-762.

NACMCF (1991) Listeria monocytogenes:

recommendations by the National Advisory

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Foods. Int. J. Food vbMicrobiol. 14, 185-

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Pruthi, J. S. (1980) Spices and condiments:

chemistry, microbiology, technology. New

York, Academic Press.

Smith-Palmer, A., Stewart, J. and Fyfe, L.

(1998) Antimicrobial properties of plant

essential oils and essences against ¢ve

important food-borne pathogens. Lett.

Appl.Microbiol. 26, 118-122.

Subrahmanyan,V., Sreenivasa Murthy, V.,

Krishna murthy, K. and Swaminathan, M.

(1957) Studies on the antimicrobial activity

of spices. J. Scient. Ind. Res. 16C, 240-244.