efecto del tratamiento tÉrmico, …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20080496_5680.pdf ·...
TRANSCRIPT
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DEL TRATAMIENTO TÉRMICO, ENZIMÁTICO Y TERMICO-ENZIMATICO SOBRE LOS PIGMENTOS Y MICRO
ESTRUCTURA DE LA FLOR DE CALABAZA.
DIRECTORA DEL PROYECTO: Dra. Ma. Eugenia Jaramillo Flores
1. INTRODUCCIÓN
En la Industria alimentaría se tienen varios parámetros para definir la calidad de
un producto y uno de los más importantes es el color. Este es un atributo que
los consumidores asocian con el sabor, olor e incluso con el dulzor de los
alimentos (Griffiths, 2005). Muchos colores artificiales se emplean para darle
uniformidad a los alimentos en cada estación y para cada lote. También se
usan colorantes naturales los cuales son consumidos en nuestra dieta diaria.
Estos se pueden obtener de animales, vegetales y minerales; por ejemplo:
frutas (mango, piña, sandia, uva, entre otras); flores (flor de calabaza,
zempoalxochitl) y verduras (zanahoria, camotes, jitomate). Estos colorantes
son sensibles a las condiciones adversas del ambiente (Downham y Collins,
2000).
Una característica importante de los colores derivados de fuentes naturales
que tienen muchas frutas y vegetales es que son compuestos bioactivos como
el efecto antioxidante demostrado en pigmentos como carotenoides (carotenos,
astaxantina, licopeno, luteína); antocianinas, entre otros. (Rodríguez-Amaya,
2001; Griffiths, 2005).
Los carotenoides son más de 600 pigmentos, responsables de los colores
amarillos, naranjas y rojos, de animales, flores, frutas y vegetales, tal es el caso
de la flor de calabaza, que se cultiva en los estados de Querétaro, Toluca,
Hidalgo y Puebla, entre otros. La flor de calabaza presenta un color amarillo
característico y pertenece a la familia de las cucurbitáceas. Por cada 100
gramos de flor aporta 47 g de calcio, 86 mg de fósforo y 67 µg de retinol (Ferriol
y col., 2003).
El color amarillo característico de la flor de calabaza se debe a que contiene
carotenoides, los cuales son utilizados como colorantes naturales en alimentos.
Los compuestos susceptibles al calor, como los carotenoides pueden ser
procesados y conservados a través de un método útil como es la
microencapsulación por secado por aspersión (Büchi, 2002; Alamilla, 2004),
que tiene la finalidad de proporcionar un medio de protección a materiales
sensibles a la luz, oxígeno y temperaturas altas y así facilitar los procesos
posteriores como es la adición de los colorantes a alimentos.
Considerando lo mencionado anteriormente se plantea realizar un estudio del
efecto protector del proceso de microencapsulación por secado por aspersión
sobre los pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.
3. JUSTIFICACIÓN La flor de calabaza se cultiva en varios lugares de la República Mexicana y
tradicionalmente el pueblo mexicano la consume como alimento en diferentes
formas. Desafortunadamente, el período de vida de esta flor después de su
cosecha, es corto, por lo que el tiempo disponible para su consumo es limitado.
Una característica importante que presentan estas flores es un intenso color
amarillo, pigmentación debida al contenido de carotenoides, los cuales
presentan propiedades como antioxidante, benéfica para la salud, misma que
ha sido ampliamente documentada. Sin embargo, estos pigmentos son
altamente sensibles a luz, temperatura, oxígeno, por lo que, cualquier método
utilizado para su conservación, deberá considerar evitar en lo posible, la
degradación de los pigmentos presentes. Una opción que se ha utilizado para
proteger la actividad de fármacos, aromas, pigmentos, entre otros, es la
microencapsulacion a través de secado por aspersión. Emplearemos este
método de conservación con el fin de aumentar la vida media de la flor de
calabaza; conservar los pigmentos y sus propiedades y así, promover su uso
en sopas, cremas, sazonadores, etc. Dada las pocas investigaciones sobre los
pigmentos de la flor de calabaza, en este trabajo se plantea el estudio del
efecto del proceso de microencapsulación por secado por aspersión sobre los
pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.
4. HIPÓTESIS La microencapsulación por secado por aspersión de la flor de calabaza tendrá
un efecto protector sobre el color, actividad antioxidante y contenido de
pigmentos.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Estudiar el efecto del proceso de microencapsulación por secado por
aspersión sobre los pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.
5.2 Objetivos Particulares
1. Identificar y cuantificar contenido de carotenoides en Flor de Calabaza.
2. Evaluar el efecto del proceso de microencapsulación sobre el contenido de
carotenoides, color, actividad antioxidante y actividad enzimática de lipasa y
lipoxigenasa.
3. Determinar diferentes condiciones de microencapsulación por secado por
aspersión de la Flor de calabaza.
4. Determinar la morfología de las partículas de polvo obtenidas y algunas
características relacionadas con rehidratación de polvos.
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Acondicionamiento de la materia prima A la flor de calabaza se le corta el tallo dejándola libre del pistilo,
posteriormente se lava con agua para eliminar las impurezas (tierra), se tritura
en mortero hasta homogeneidad y finalmente se almacena en congelación
hasta su uso.
La materia prima se dividió en 4 lotes para someterlos a diferentes tratamientos
el primero es la flor de calabaza deshidratada y triturada, el segundo se trató
primero con la mezcla de pectinasa y celulasa (MACEREX PM) en una
proporción de 100 mL/Ton a 15°C y posteriormente con una mezcla de
celulasa-hemicelulasa y β-glucanasa (CELLUZYME) al 0.5% en base seca a
50 °C, se dejan actuar por espacio de 2 h; el tercero se sometió a un
tratamiento térmico a 93°C durante 3 minutos y el último se sometió a
tratamiento enzimático, descrito para el segundo lote y un tratamiento térmico.
6.2 Determinación de color en la flor de calabaza La medición de color se realiza mediante la lectura directa de la muestra en el
Espectrofótometro Color Mate HDS (marca Milton Roy, Diano Color Products),
utilizando el sistema Cie-Lab y CIE. Con Iluminación C dando los siguientes
parámetros: L*, a* y b* del sistema Cie-Lab, y los parámetros X, Y; y Z del
sistema CIE, donde L* corresponde a la claridad y a* y b* a la cromaticidad,
definiendo el componente rojo-verde con el parámetro a*; rojo para valores
positivos y verde para valores negativos. El parámetro b* define el componente
amarillo- azul; amarillo para los valores positivos y azul para los valores
negativos. Los colores son tanto más saturados cuanto más separados se
encuentren del centro del gráfico los puntos que los definen.
Para evaluar la cromaticidad se definen las llamadas coordenadas de
cromaticidad: x, y, z; las cuales se obtienen al expresar los valores tríestimulo
(X, Y, Z) como fracciones de su suma total. Matemáticamente se expresa por:
ZYXZz
ZYXYy
ZYXXx
++=
++=
++= ;
Posteriormente se grafican “x” y “y” en el diagrama de cromaticidad para
obtener la longitud de onda predominante de la muestra, el % de saturación y
la claridad esta dada por “Y”.
6.3 Extracción de carotenoides en la Flor de Calabaza La extracción de los carotenoides se lleva a cabo mediante el método de
Rodríguez- Amaya (1999). Los carotenos se extraen ya homogeneizados,
triturando las muestras en un mortero añadiendo acetona a 10°C.
Posteriormente, se realiza la saponificación de las muestras agregando en
forma estratificada a la fase etérea un volumen de 1:1 de solución de hidróxido
de potasio al 10% en metanol, se agita y se deja en reposo durante 18 horas.
Una vez hecha la saponificación, los carotenoides se transfieren a éter de
petróleo, luego se separa la fase etérea (color) de la fase grasa. La fase etérea
es lavada con agua destilada varias veces para remover la acetona residual y
el agua residual es removida con sulfato de sodio anhidro y el extracto es
concentrado con nitrógeno gaseoso de alta pureza. Las muestras se guardan
en el refrigerador y protegidas de la luz.
6.4 Determinación de carotenoides totales en la flor de calabaza Se pesan de 2 a 5g pétalos de flor de calabaza, se extraen los carotenoides
como se mencionó en el punto anterior. Se mide el volumen de la fase etérea y
se lleva a 10mL con éter de petróleo. Se toma una alícuota de 0.25mL y se
afora a 10mL en un matraz aforado. Finalmente se lee en el espectrofotómetro
a 450 nm y aplica la siguiente formula:
)100*%()10**()(
6
cmAyAgx =µ
x = concentración de carotenoides
y = volumen de la solución que da una absorbancia de A en una longitud de
onda específica
A%cm = es el coeficiente de absorción del carotenoide en el disolvente usado,
según especificaciones (Para éter de petróleo es 2592)
6.5 Determinación de la actividad antirradical con el radical ABTS El ABTS +• se genera mezclando el reactivo 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolina-
6-ácido sulfónico) (ABTS) (SIGMA, A1888) a una concentración 7mM con
peroxidisulfato de potasio (SIGMA,P5592) 2.45mM (concentración final en 10
mL de agua) y se mantiene en un cuarto oscuro de 12-16 horas antes de su
uso. La solución acuosa de ABTS se diluye en etanol (1:100) teniendo una
absorbancia de 0.7 ( ± 0.02) a 734 nm en una celda de 1cm a 30 ºC.
Las muestras se someten al proceso de extracción de carotenoides (ver 6.3) y
se resuspenden en 500µL de acetona. Se adiciona 990mL de solución ABTS +
a las muestras (10µL). Se mezclan y después de 1 minuto se mide la
absorbancia de cada muestra a 734nm, durante 7 minutos. Se debe correr un
testigo. Los valores de absorbancia son corregidos de la siguiente forma:
)(0)(0)(0
)(5)(0
/)()(
solventetsolventetmuestrat
muestratmuestratmuestra AAA
AAA
===
==
−
−=∆
%inhibición= muestraA∆ *100
Las determinaciones se hacen por triplicado tanto de muestras como del
estándar (Charurin y col., 2002).
6.6 Determinación de actividad de lipasa en la flor de calabaza fresca La flor de calabaza previamente acondicionada se tritura con Tris 50mM–
CaCl2 7.5mM (pH= 8.0), posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a
10000 rpm para obtener el extracto enzimático de la Flor de Calabaza. Se
preincuba el substrato (0.05% de tributirina, previamente sonicado durante
10min) en Tris 100mM-CaCl2 25mM (pH= 8.0), a 37 °C durante 5 minutos.
Se agregan 0.3mL del extracto enzimático de la Flor de Calabaza a 2.4mL de
substrato (tributirina) en tubo de ensayo y 0.6mL de la solución Tris 50mM–
CaCl2 7.5mM (pH= 8.0), se incuba a 37°C durante 30 min en agitación
constante y se lee la densidad óptica a 450nm de longitud. Finalmente se
interpola en la curva de actividad enzimática de lipasa.
6.7 Determinación de actividad de lipoxígenasa (LOX) en la flor de calabaza fresca
La flor de calabaza previamente acondicionada se tritura con Regulador de
Borato de Sodio 0.2M (pH=9.0), posteriormente se centrifuga durante 10
minutos a 10000 rpm para obtener el extracto enzimático de la Flor de
Calabaza.
Se agrega 0.05mL del extracto enzimático a 0.1mL de Ac. Linoleico 7.5mM,
0.1mL de EtOH y 2.75mL de de regulador de Borato 0.2M (pH 9.0) y se lee el
incremento de absorbancia a 234nm durante 3 min cada 30 segundos.
Finalmente se interpola en la curva de actividad enzimática de LOX.
6.8 Identificación y cuantificación de carotenoides en la Flor de Calabaza Las muestras concentradas se resuspenden en 500 µL de acetato de etilo
grado HPLC (1mL), se filtran a través de una membrana de nylon con poro de
0.45µm y después se inyectan en una columna C18 de HPLC.
Se utiliza un sistema de elución en gradiente con acetato de etilo 100% como
fase móvil A y metanol: agua (9:1) como fase móvil B y una velocidad de flujo
de 1.0 mL/min, y una longitud de onda de 450nm Todos los disolventes son de
grado HPLC. Se observará el perfil de las muestras.
6.9 Acondicionamiento de la Flor de calabaza antes de su deshidratación por aspersión. Se pesa la Flor de calabaza y se trata primero con la mezcla de pectinasa y
celulasa (MACEREX PM) en una proporción de 100 mL/Ton a 15°C y
posteriormente con una mezcla de celulasa-hemicelulasa y β-glucanasa
(CELLUZYME) al 0.5% en base seca a 50 °C, se dejan actuar por espacio de 2
h, después del cual se filtran, se escaldan y se adicionan al agua con el agente
encapsulante.
6.10 Preparación de la suspensión Se prepara la suspensión con flor de calabaza, acarreador y/o película
protectora, en las diferentes relaciones y concentraciones siguiendo el modelo
experimental, de Box-Behnken, de superficie de respuesta para el proceso de
secado, con el Software Design-Expert versión 7.03 (Stat-
Ease,Inc.,Minneapolis,Min.,2006).
A esta dispersión se le determina color, carotenoides totales y actividad
antioxidante, y actividades enzimáticos (lipasa y lipoxigenasa) como se
describió en los puntos 6.2, 6.6 y 6.7.
7. RESULTADOS y DISCUSION Las muestras se obtuvo de Texcoco Estado de México; y fue almacenada a
temperatura ambiente cubiertas con papel estraza posteriormente se dividió en
cuatro lotes de acuerdo al tipo de tratamiento al que se sometieron:
Muestra deshidratada a temperatura ambiente (cruda)
Tratamiento Enzimático
Tratamiento Térmico
Tratamiento Enzimático y Térmico
7.1Determinación de color de los pétalos de la flor de calabaza
De acuerdo a los resultados mostrados en el Cuadro 3, se observa una ligera
disminución del % de claridad o brillo, es decir que hay un obscurecimiento en
la luminosidad de las muestras con tratamiento enzimático y tratamiento
enzimático-térmico en comparación con la muestra cruda lo cual puede
deberse a la degradación de la clorofila presente, por acción de la luz, oxígeno
y enzimas, desenmascarando así los carotenoides (Suzuki, 2004). Y en la
muestra con tratamiento térmico se observó que aumentan los valores de
porcentaje de claridad, mientras que la longitud de onda correspondiente a
cada una de las muestras puede decirse que permanece entre amarillo y
naranja. En tanto a la diferencia de color con respecto a la muestra
deshidratada y sin tratamiento es mayor en las muestras que se sometieron a
un tratamiento enzimático, lo cual puede deberse al oscurecimiento que se
presenta por el largo periodo de exposición al oxígeno mientras se lleva a cabo
la hidrólisis enzimática.
Según Rodríguez Amaya (1997), es probable que existan las condiciones
necesarias para la isomerización y oxidación de los carotenoides en el proceso
de almacenamiento de alimentos, causando la pérdida de color entre otras
características, lo que explica la diferencia de color en las muestras con
tratamiento tanto enzimático como térmico.
Cuadro 3. Color Total de las muestras de Flor de Calabaza
MUESTRA λ nm
% saturación
Y (claridad o brillo)
%
∆E* Diferencia de color
CRUDA 585 (amarillo) 41.8 24 ----
ENZ 585 (amarillo) 34.5 22.8 9.6± 0.1
TERM 584 (amarillo) 38.9 27.9 4.4± 0.04
ENZ+TERM 584 (amarillo) 31.5 22.7 9.6± 0.1
Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar
7.2 Carotenoides Totales
En las muestras con tratamiento tanto enzimática como térmica y enzimático-
térmico se observa un aumento de cantidad de carotenoides (Cuadro 4), lo
cual puede deberse a que por el tipo de tratamiento exista una liberación de los
carotenoides presentes en la flor, ya que las carbohidrasas ayudan a hidrolizar
la fibra, mientras que la temperatura modifica la estructura de la fibra y en
consecuencia de la pared celular, probablemente haciéndola más permeable,
así como provoca la precipitación de algunas proteínas.
Cuadro 4 Contenido de Carotenoides Totales en Flor de Calabaza con diferentes tratamientos
Muestras sin saponificar
Muestras saponificadas
Muestra (µgcarot/gpeso seco) Muestra (µgcarot/gpeso seco) cruda 3092.391±0.003 cruda 518.278±0.002
Enzimática 3227.436±0.009 Enzimática 643.770±0.001 Térmica 4189.009±0.003 Termica 752.840±0.002
Enz.+ Term. 5044.764±0.005 Enz.+ Term. 934.937±0.001 Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar
Lo anterior se puede corroborar ya que en las imágenes tomadas en el
microscopio Óptico de Barrido (SEM) se puede observar que la muestra
deshidratada a temperatura ambiente (Figura 3) tiene una estructura más
completa y rígida que la muestra con tratamiento térmico-enzimático (Figura 6)
la cual tiene una estructura en forma de red mostrando el rompimiento causado
por el tratamiento térmico (Figura 5) y el tratamiento enzimático (Figura 4),
teniendo un menor tamaño, comparándola con las muestras anteriores,
causando un efecto sinérgico reflejándose en una mayor cantidad de
carotenoides presentes en dicha muestra.
+
Figura 3 Muestra sin tratamiento (cruda) observada en el SEM
Figura 4 Tratamiento Enzimático observada en el SEM
Figura 5 Tratamiento Térmico observada en el SEM
Figura 6 Tratamiento Enzimático-Térmico observada en el SEM
En cuanto a las muestras saponificadas, podemos decir que el proceso de
saponificación daña notablemente a los carotenoides en todas las muestras,
sin embargo el hidrolizar los ésteres de carotenoides facilita la identificación de
los carotenoides en el perfil cromatográfico (Fernández, 2007).
7.3 Actividad Antirradical a) Muestras sin saponificar
Se puede observar (Cuadro 5) que en la muestra con tratamiento tanto térmico
como enzimático disminuye la actividad antioxidante, lo cual se debe a que
dichos tratamientos causan la oxidación de los carotenoides y por lo tanto la
isomerización de estos (Paiva y col., 1999). Mientras que la muestra sometida
al tratamiento enzimático-térmico tienen un aumento en dicha actividad.
Cuadro 5 Equivalentes Trolox en Flor de Calabaza con diferentes tratamientos con ABTS en relación con carotenoides totales
Muestras sin saponificar Muestra (mM)Eq.Trolox
ABTS µg carot/gpeso seco
cruda 15.3±0.2 3092.391±0.003 Enzimática 13.0±0.2 3227.436±0.009
Termica 14.1±.0.1 4189.009±0.003 Enz.+ Term. 22.0±0.2 5044.764±0.005
Muestras Saponificadas Muestra (mM)Eq.Trolox
ABTS µgcarot/gpeso seco
cruda 35.3±0.2 518.278±0.002 Enzimática 32.2±0.003 643.770±0.001
Termica 25.0±0.3 752.840±0.002 Enz.+ Term. 32.3±0.3 934.937±0.001
Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar Lo anterior se puede explicar al observar los cromatogramas de las muestras
cruda (Figura 7), con tratamiento enzimático (Figura 8) y térmico (Figura 9), ya
que existe un cambio en los perfiles que se puede asociar con la aparición de
isomeros y nuevos compuestos que posiblemente tengan una menor actividad
antirradical debido a la interacción que tienen entre ellos, mientras que en el
perfil cromatográfico de la muestra con tratamiento enzimático-térmico (Figura
10) se observan los picos más definidos que en las muestras anteriores, así
como un pequeño incremento del pico de Luteína.
Cruda
Figura 7 Perfil cromatográfico muestra deshidratada y sin tratamiento (cruda)
Figura 8 Perfil cromatográfico muestra sometida a un tratamiento enzimático
Figura 9 Perfil cromatográfico muestra sometida a un tratamiento térmico
Trat. Enzimático
Trat. Térmico
7.4 Actividad de lipasa En la Figura 15 podemos observar que la actividad de lipasa es mayor en
muestras que se sometieron a tratamiento térmico que en la muestra sin
tratamiento (deshidratada), lo cual nos indica que el tiempo del proceso térmico
no fue el suficiente para su inactivación, ya que por el contrario se incrementó
su actividad enzimática, por lo que se requiere efectuar una cinética de
inactivación de la enzima. Así mismo, la actividad de la muestra sometida al
tratamiento enzimático también aumento en comparación con la muestra
deshidratada; teniendose la mayor actividad de lipasa en la muestra sometida
al tratamiento enzimático-térmico debido a un efecto sinérgico de ambos
tratamientos.
Trat. Enzimático+Térmico
Act. Lipasa
0.00E+00
2.00E-06
4.00E-06
6.00E-06
8.00E-06
1.00E-05
1.20E-05
1.40E-05
cruda enz term enz+term
Muestras
U/ g
pes
o se
co
Figura 15 Actividad de Lipasa del Extracto de Flor de Calabaza
con diferentes tratamientos
7.5 Actividad de LOX En la Figura 16 podemos observar que la actividad de LOX es mayor en las
muestras que se sometieron al tratamiento térmico con respecto a la muestra
sin tratamiento, lo que indica que el tiempo del proceso térmico no fue
suficiente ya que se activaron las enzimas presentes en la flor de calabaza.
Por el contrario, la muestra sometida al tratamiento enzimático tal vez esté
produciéndose algún compuesto que inhibe o inactiva a la enzima LOX por lo
que disminuye la actividad de dicha enzima, así podemos ver el efecto
antagónico que tiene la actividad de LOX en la muestra enzimático-térmico.
Esto tomando como referencia el perfil cromatográfico de las muestras
saponificadas sometidas a tratamiento enzimático o enzimático térmico.
Actividad LOX
0.000E+00
5.000E-05
1.000E-04
1.500E-04
2.000E-04
2.500E-04
3.000E-04
3.500E-04
cruda enz term enz+term
Muestras
U/m
gpro
t
Figura 16 Actividad de LOX de Extracto de Flor de Calabaza
con diferentes tratamientos
8. CONCLUSIONES • Las muestras tienen una longitud de onda predominante
correspondiente al amarillo, las muestras con tratamiento tanto térmico
como enzimático disminuyen tanto en su porcentaje de saturación como
en el porcentaje de claridad con respecto a la muestra sin tratamiento.
• La diferencia de color es mayor en la muestras con tratamiento
enzimático con respecto a la muestra sin tratamiento
• El contenido de carotenoides totales aumentó en las muestras con
tratamiento tanto térmico como enzimático teniendo un efecto sinérgico
en el tratamiento enzimático-térmico.
• En las imágenes de flor de calabaza tomadas en SEM se puede
observar que la hidrólisis de la fibra tuvo mayor efecto en el tratamiento
enzimático-térmico.
• La actividad antirradical disminuye en las muestras que se sometieron al
tratamiento térmico y al tratamiento enzimático en comparación con la
muestra deshidratada, lo que se ve reflejado en los perfiles
cromatográficos en los que se observan picos no definidos.
• La actividad antirradical aumenta en la muestra sometida al tratamiento
enzimático-térmico en comparación con le muestra deshidratada, lo que
se ve reflejado en el perfil cromatográfico en el que se observan picos un
poco más definidos que los tratamientos enzimático y térmico por
separado.
• La actividad antirradical aumenta en las muestras sometidas al proceso
de saponificación.
• Las muestras sometidas al tratamiento enzimático tiene mayor actividad
antirradical que la muestra sometida al tratamiento térmico.
• La actividad antirradical de las muestras sometidas al tratamiento
enzimático se deben a 3 compuestos representados en los perfiles
cromatográficos durante el tiempo 3-8 minutos
• El proceso de saponificación dañó severamente a los pigmentos
reflejándose en una fuerte disminución en la concentración de
carotenoides totales.
• La actividad de lipasa es mayor en las muestras con tratamiento
enzimático y térmico que la muestra deshidratada, causandio un efecto
sinérgico en el tratamiento enzimático-térmico.
• En las muestras con tratamiento enzimático se inhibe o inactiva a la
enzima LOX por lo que disminuye la actividad de LOX.
• En las muestras con tratamiento térmico aumenta la actividad de LOX
por efecto de la temperatura.