efecto del pre-condicionamiento de cÉlulas …
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EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO DE CÉLULAS ESTROMALES
MULTIPOTENTES EQUINAS OBTENIDAS DE MÉDULA ÓSEA, SOBRE SU
CAPACIDAD DE INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS
TESIS MÁGISTER
VALERIA CAMILA CAFFI PIZARRO
VALDIVIA – CHILE
2019
EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO DE CÉLULAS ESTROMALES
MULTIPOTENTES EQUINAS OBTENIDAS DE MÉDULA ÓSEA, SOBRE SU
CAPACIDAD DE INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile
en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencias
mención Salud Animal
VALERIA CAMILA CAFFI PIZARRO
VALDIVIA – CHILE
2019
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGÍSTER
La Comisión Evaluadora informa al Dr. Gabriel Morán R. Director de la Escuela de Graduados de la
Facultad de Ciencias Veterinarias que la Tesis de Magíster presentada por la candidata
VALERIA CAMILA CAFFI PIZARRO
Ha sido evaluada en su escrito y aprobada en el Examen de Grado rendido en Valdivia el día 30 de
mayo del 2019 como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencias con mención en Salud
Animal y, para que así conste para todos los efectos, firman:
Patrocinante ________________________
Prof. Claudio Henríquez S.
Comisión evaluadora ________________________
Prof. Hugo Folch V.
________________________
Prof. Gabriel Morán R.
________________________
Prof. Rafael Burgos A.
DECLARACIÓN DE AUTORÍA
Yo, VALERIA CAMILA CAFFI PIZARRO, declaro que soy la autora del presente trabajo, que lo he
realizado en su totalidad y no lo he publicado para obtener otros grados o títulos.
Declaro también que he contado con la colaboración de las siguientes personas: Dr. Claudio
Henríquez S., Dr. Hugo Folch V., Dr. Gabriel Morán R.
El trabajo contó con el financiamiento del proyecto de investigación FONDECYT Iniciación
Regular N° 11160418 de CONICYT, Chile.
Valdivia, abril de 2019
A mi familia, amigos, docentes y funcionarios
por su paciencia, apoyo y permitir la realización
de este proyecto
I
ÍNDICE DE CONTENIDOS
ÍNDICE DE CONTENIDOS…………………………………………...………………… I
ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………… ...IV
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………..V
ABREVIATURAS…………………………………………….…………….………… VII
RESUMEN…………...……………………………………………………………....IX
SUMMARY …………………………………………………………………………...X
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………2
2.1. MODULACÍON DE LA RESPUESTA INMUNE………………………………………....6
2.1.1. MSCs y su interacción con linfocitos T…………………………………………..…..8
2.2. EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO EN EL POTENCIAL INMUNOMODULADOR……...11
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………………………….13
3.1. HIPÓTESIS…………………………………………………………………...13
3.2. OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………...13
3.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………14
4. MATERIALES Y MÉTODOS………….…………………………………………...15
4.1. MATERIALES……………………………………………………………….....15
II
4.1.1. Animales…………………………………………………………………….15
4.2. MÉTODOS…………………………………………………………………....16
4.2.1. Aislamiento de MSCs desde médula ósea………........................................................................16
4.2.2. Separación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)……..……………...17
4.2.3. Determinación del efecto de las MSCs sobre la proliferación de linfocitos………………...17
4.2.4. Determinación de los mecanismos relacionados con la capacidad de las MSCs de inhibir la
proliferación de linfocitos …………………………......................................................................19
4.2.5. Determinación de la expresión de moléculas inmunomoduladoras………………..……19
4.2.5.1. Extracción de ARN de MSCs……………………………………………………...19
4.2.5.2. Síntesis de ADNc de MSCs (RT)…………………………………………………...20
4.2.5.3. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR)…………………………...20
4.2.6. Efecto del pre-condicionamiento sobre la capacidad de las MSCs de inhibir la proliferación de
linfocitos …………………………………………………………………………...21
4.2.7. Análisis estadístico ……………………………………………………………....22
5. RESULTADOS…………………………………………….………………………..23
5.1. CAPACIDAD DE LAS MSCS SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE PBMC…………………………23
5.2. MOLÉCULAS IMPLICADAS CON EL EFECTO INHIBITORIO DE LAS MSCs SOBRE LA
PROLIFERACIÓN DE PBMC……………………………………………………………25
5.3. EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO CON MOLÉCULAS PRO-INFLAMATORIAS, SOBRE LA
EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS INMUNO-MODULADORAS POR MSCs…………………………..27
5.4. EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO CON MOLÉCULAS PRO-INFLAMATORIAS, SOBRE LA
CAPACIDAD INHIBITORIA DE LA PROLIFERACIÓN DE LAS MSCs…………………………..…32
6. DISCUSIONES……………………………………………………………………..34
III
7. CONCLUSIONES………………………………………………………………....…44
8. REFERENCIAS………………………………………………………………….… 45
IV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Secuencia de partidores…...……………………………………………………21
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de las células madre (SCs), de acuerdo a su potencialidad ………………....3
Figura 2. Capacidad de auto-renovación y de potencialidad de las células estromales multipotentes
(MSCs).…..……………………………………………………………….…………5
Figura 3. Moléculas producidas por las células estromales multipotentes (MSCs) involucradas en la
modulación de la respuesta inmune……………………………………………………...8
Figura 4. Efecto de las células estromales multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea sobre
la proliferación de PBMC…………………………………………………………….....24
Figura 5. Mecanismo de inhibición de la proliferación de PBMC mediada por células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea……………………………………26
Figura 6. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea, sobre la expresión de interleuquina-6
(IL- 6)……………………………………………………………………….......….28
Figura 7. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea, sobre la expresión de indolamina 2,3-
dioxigenasa (IDO)…………………………………………………………………....29
VI
Figura 8. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea, sobre la expresión de óxido nítrico sintasa
(iNOS)……………………………………………………………………………..29
Figura 9. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea, sobre la expresión de cicloxigenasa-2
(COX- 2) …………………………………………………………………………...30
Figura 10. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en células estromales
multipotentes (MSCs) equinas derivadas de medula ósea, sobre la expresión del factor de crecimiento
de hepatocitos (HGF) y el factor de crecimiento transformante -β1 (TGF-β1) …………………...31
Figura 11. Efecto del pre-condicionamiento de células estromales multipotentes (MSCs) con moléculas
pro-inflamatorias, sobre su capacidad de inhibir la proliferación de PBMC……………………...32
VII
ABREVIATURAS
1-MT: 1-Metil-D-triptofano
ASC: Células madre adultas
ConA: Concanavalina A
CFSE: Éster de succinimidil-carboxifluoresceína
DC: Células dendríticas
eIF2α: Factor de iniciación de la traducción eucariótica 2α
ESC: Células madre embrionarias
HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos
HSC: Células madre hematopoyéticas
HO-1: Hemooxigenasa-1
IDO: Indoleamina 2,3 dioxigenasa
IFN-γ: Interferón-γ
IL-1α: Interleuquina -1α
IL-1β: Interleuquina-1β
IL-2: Interlequina-2
IL-6: Interleuquina-6
IL-10: Interleuquina-10
iNOS: Óxido nítrico sintetaza inducible
IP-3: Inositol 1,4,5-trifosfato
ISCT: Sociedad internacional de terapia celular
MHC II: Complejo mayor de histocompatibilidad clase II
MSC: Célula madre mesenquimal
VIII
MSCs: Células madre mesenquimales
NET´s: Trampas extracelulares de neutrófilos
NK: Células natural killer
NO: Óxido nítrico
ODC: Ornitina descarboxilasa
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica
PGE2: Prostaglandina E2
RT: Retrotranscripción reversa
SBF: Suero bovino fetal
SC: Células madre
TCR: Receptor de células T
TGF-β1: Factor de crecimiento transformante β1
Th-2: Linfocitos T helper -2
TNF-α: Factor de necrosis tumoral-α
TSG-6: Proteína del gen 6 estimulado por TNF
IX
RESUMEN
Efecto del pre-condicionamiento de células estromales multipotentes equinas obtenidas
de médula ósea, sobre su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos
Las células madre mesenquimales (MSCs) son utilizadas cada día de manera más común tanto
en ensayos clínicos humanos como en medicina veterinaria para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias. Las MSCs modulan la inflamación a través de la secreción de mediadores. Sin embargo,
a pesar del uso clínico generalizado, el conocimiento relativo a los mecanismos efectores de las MSCs
equinas y por consecuencia su efectividad en el tratamiento de enfermedades aún es desconocida. El
presente estudio, tuvo como objetivo evaluar el efecto del pre-condicionamiento de MSCs equinas
derivadas de médula ósea, con distintas moléculas pro-inflamatorias, sobre la capacidad de estas para
inhibir la proliferación de linfocitos. Se pudo determinar que las MSCs fueron capaces de inhibir
significativamente la proliferación de linfocitos, y que para dicho efecto la producción de
prostaglandina E2 (PGE2) y la actividad de indoleamina 2, 3 dioxigenasa (IDO) eran necesarias. Por
otra parte el el pre-condicionamiento con de las MSCs con TNF-α, IFN-γ o su combinación incrementó
significativamente la expresión de importantes moléculas inmuno-moduladoras como IL-6, IDO, iNOS
y COX-2. Sin embargo esto no se correlacionó con un incremento en la capacidad de las MSCs de inhibir
la proliferación de linfocitos.
Palabras claves: Células estromales mesenquimales, equinos, pre-condicionamiento, inflamación.
X
SUMMARY
Effect of preconditioning equine multipotent stromal cells obtained from bone marrow
on their ability to inhibit lymphocyte proliferation
Mesenchymal stem cells (MSCs) are more commonly used every day in both human clinical
trials and in veterinary medicine for the treatment of inflammatory diseases. MSCs modulate
inflammation through the secretion of mediators. However, despite widespread clinical use, knowledge
regarding the effector mechanisms of equine MSCs and consequently their effectiveness in the treatment
of diseases is still unknown. The objective of this study was to evaluate the effect of preconditioning of
equine MSCs derived from bone marrow, with different pro-inflammatory molecules, on the capacity of
these to inhibit the proliferation of lymphocytes. It could be determined that the MSCs were able to
significantly inhibit the proliferation of lymphocytes, and that in order to achieve, the production of
prostaglandin E2 (PGE2) and the activity of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) were necessary. On the
other hand, the pre-conditioning of the MSCs with TNF-α, IFN-γ or their combination significantly
increased the expression of important immunomodulatory molecules such as IL-6, IDO, iNOS and
COX- 2. However, this did not correlate with an increase in the ability of MSCs to inhibit lymphocyte
proliferation.
Key words: Mesenchymal, equine stromal cells, pre-conditioning, inflammation.
1
1. INTRODUCCIÓN
El concepto de células madre (SC) se originó a finales del siglo XIX como un postulado teórico
para explicar la capacidad de ciertos tejidos para autorrenovarse durante la vida (Bianco y col 2008).
Hoy en día se sabe que estas células están presentes en todos los tejidos y órganos, siendo su función
principal la sustitución de las células muertas en los procesos fisiológicos de renovación celular y en
situaciones patológicas en las cuales se incremente la muerte celular (Markoski 2016). La investigación
sobre SCs y sus potenciales usos ha evolucionado rápidamente durante la última década (Marigo y
Dazzi 2011). Actualmente sabemos que las SCs no sólo cumplen su función en la renovación y
homeostasis celular, sino que además pueden migrar a sitios de inflamación y ejercer potentes efectos
inmuno-moduladores y anti-inflamatorios. Junto con estas propiedades terapéuticas, su facilidad de
obtención y expansión sugieren que el uso de SCs puede tener un enfoque terapéutico útil para diversos
trastornos (Kim y Cho 2013). Sin embargo, a pesar de que gran parte de la biología y potencial
terapéutico de las células madres ha sido explorado en los últimos años, aun ese potencial no se ha
traducido en tratamientos salvo contadas excepciones (Chagastelles y Nardi 2011). Las principales
causas radican en la falta de estandarización en las dosis utilizadas, fuentes de obtención, manejo de
las células ex vivo y vías de administración, así como la ausencia de la caracterización de las
poblaciones celulares utilizadas lo que conlleva a una gran variabilidad de los resultados demostrados.
A pesar del cada vez más común uso de las SC en terapias para distintas patologías en medicina
veterinaria, particularmente en equinos, la mayor parte de los estudios relativos a los mecanismos
involucrados en los efectos de las SC se han centrado en humanos y ratones, obviando la demostrada
variabilidad en dichos mecanismos de acuerdo a la especie en estudio.
2
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Una SC, para ser considerada como tal, requiere que posea dos propiedades; auto-renovación y
potencialidad (Chagastelles y Nardi 2011). La auto-renovación implica la capacidad de pasar
numerosos ciclos de división celular dando origen a células de iguales características. Por otro lado, la
capacidad de diferenciación o potencialidad hace referencia a la capacidad de diferenciarse en uno o
más tipos celulares diferentes a la célula madre de origen (Lee y col 2016).
Como se muestra en la figura 1, las SCs se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de
diferenciación como totipotentes, pluripotentes y multipotentes. En los mamíferos únicamente el cigoto
y los primeros blastómeros son totipotentes, lo que quiere decir que pueden dar origen a cualquier célula
de las 3 capas germinales del organismo (ectodermo, mesodermo y endodermo) y además a los tejidos
extraembrionarios de la placenta (Jaenisch y Young 2008). Por otro lado, las células obtenidas del
macizo celular interno del blastocisto, se consideran células pluripotentes, ya que poseen la capacidad
de formar células de todos los linajes del organismo exceptuando la placenta (Ratajczak y col 2008).
Por último, las células multipotentes, a diferencia de las anteriores, pueden diferenciarse únicamente
a las células pertenecientes a la capa germinal de origen (Jaenisch y Young 2008).
3
Figura 1. Clasificación de las SCs, de acuerdo a su potencialidad.
Otra clasificación descrita de SC es de acuerdo a su origen, según si estas son células madre
embrionarias (ESC) o células madre adultas (ASC) (Chagastelles y Nardi 2011). Las ESC son
pluripotentes hasta el estado de blastocisto, luego del cual se pueden aislar células multipotentes. Las
ASC son células multipotentes indiferenciadas que se encuentran en todo el cuerpo, en todos los tipos
de órganos y tejidos, y se dividen para reponer las células que están muriendo y regenerar el tejido, ya
sea debido a procesos fisiológicos o patológicos (Chagastelles y Nardi 2011).
En la médula ósea exiten dos subtipos de ASCs; las células madre hematopoyéticas (HSC) y las
células madre mesenquimáles (MSC). Las HSC se encuentran principalmente en el nicho
hematopoyéctico de la médula ósea, y dan origen a las células de la línea mieloide (monocitos y
macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas y algunas células
4
dendríticas) y de la línea linfoide (células T, células B, células NK y algunas células dendríticas). Por
otro lado, las MSCs o también denominadas células estromales progenitoras multipotentes (también
abreviadas como MSC) (Phinney y Prockop 2007), se encuentran siempre asociadas al lecho vascular,
cumpliendo roles asociados a la homeostasis de órganos, particularmente importante en el caso de la
médula ósea formando parte del nicho hematopoyético y también participan en la regeneración de
tejido (Williams y Hare 2011). Lo anterior es debido a que las MSCs tienen el potencial de diferenciarse
en varias células del linaje mesodérmico como adipocitos, condrocitos y osteoblastos, lo cual les entrega
la capacidad de regenerar dichos tejidos. Adicionalmente, algunos estudios han demostrado que
también pueden trans-diferenciarse en células ectodérmicas como cardiomiocitos, células endoteliales,
células del músculo liso o incluso células nerviosas (Yu y col 2017) (figura 2). Si bien las MSCs se
encuentran en una amplia variedad de tejidos, estas se han aislado exitosamente a partir la médula
ósea, tejido adiposo, del cordón umbilical y su sangre, líquido sinovial, pulpa dental, glándulas
salivales, fluído menstrual, entre otros tejidos (Yang y col 2018).
5
Figura 2. Capacidad de auto-renovación y de potencialidad de las células estromales multipotentes
(MSC).
En la actualidad los tratamientos que utilizan MSCs han conseguido amplia difusión tanto en
medicina humana como en el tratamiento de alteraciones en animales. Sin embargo, muchos de
dichos tratamientos se realizan sin una adecuada caracterización de las células administradas, lo cual
ha tenido como consecuencia resultados ampliamente dispares al momento de evaluarse la efectividad
del tratamiento (Lindner y col 2010). Con el fin de regular el estudio y el potencial uso de las MSCs, la
Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) propuso criterios mínimos para poder tipificar una
célula como MSC, los cuales comprenden: (1) adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar;
(2) expresión de las moléculas de superficie CD73, CD90 y CD105 y carecer de la expresión de las
moléculas de superficie CD34, CD45, HLA-DR, CD14 o CD11b, CD79α o CD19; (3) capacidad de
6
diferenciación a osteocitos, adipocitos y condrocitos in vitro (Dominici y col 2006, Behr y col 2010).
Estos criterios se establecieron para estandarizar el aislamiento de MSCs humanas, pero es posible que
no se apliquen uniformemente a otras especies (Williams y Hare 2011).
Las MSCs poseen poderosos mecanismos protectores y reparativos, lo cual las vuelve atractivas
para la terapia clínica en diversas patologías como infarto agudo al miocardio, diabetes tipo 1, lesiones
de médula espinal, artrosis, entre otros (Caplan 2011, Maxson y col 2012, Phinney y Prockop 2007,
Wang y col 2014), debido a su fácil aislamiento, expansión in vitro y su capacidad para diferenciarse
en una variedad de tejidos, además de proporcionar soporte trófico y modular la respuesta inmune
(Williams y Hare 2011, Bobis y col 2006, Chagastelles y Nardi 2011). Esto las convierte en una
herramienta prometedora para nuevos enfoques terapéuticos dirigidos a la regeneración tisular, así
como para alteraciones en las cuales exista una desregulación de la respuesta inflamatoria (Spaggiari
y col 2008). Adicionalmente, otra característica de las MSCs que las vuelve atractivas desde el punto de
vista terapéutico es que poseen la capacidad de migrar hacia tejidos inflamados. Otra ventaja de las
MSCs es que se pueden utilizar células alogénicas sin presentar un problema significativo de inmuno-
reacción, lo cual permite administrarlas a pacientes que presenten alteraciones genéticas que impidan
el uso de las células propias en el tratamiento (Yu y col 2017).
2.1 MODULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE
Las células que forman parte del sistema inmune pueden clasificarse en: (1) células inmunitarias
innatas (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células dendríticas (DC), células natural killer (NK), células
linfoides innatas, mastocitos y macrófagos, y (2) células inmunes adaptativas (linfocitos T y B), las
7
cuales son capaces de generar una respuesta inmune específica, además de mantenerse durante un
largo periodo mediante la producción de células de memoria (Williams y Hare 2011).
La función inmuno-moduladora de las MSCs está relacionada con su capacidad de revertir la
inflamación a través de la regulación negativa de la secreción de mediadores pro-inflamatorios y la
liberación de moléculas y vesículas con actividad anti-inflamatoria (Markoski 2016), consiguiendo
modular muchas funciones efectoras tanto en las células del sistema inmune innato como del
adaptativo (Uccelli y col 2008). Ejemplos de esta función moduladora de la respuesta inmune son
(figura 3); su capacidad de regular la presentación antigénica por parte de las DC, ya que son capaces
de inhibir la diferenciación desde monocito a DC, así como la expresión de moléculas del complejo de
histocompatibilidad de clase II (MHC II) y la secreción de IL-12 (Jiang y col 2005). Adicionalmente, las
MSCs han mostrado modular la citotoxicidad de las NK, mediante la inhibición en la expresión en su
membrana de receptores de activación DNAM1 y NKG2D (Spaggiari y col 2008). Por otra parte, los
neutrófilos son otra población celular cuya función ha mostrado ser inhibida por las MSCs,
particularmente la producción de especies reactivas de oxígeno, así como la generación de trampas
extracelulares neutrofílicas, también conocidas como NET´s (Jiang y col 2016, Raffaghello y col 2008,
Yang y col 2018).
En relación a la modulación de la respuesta inmune adaptativa, las MSCs han mostrado modular
la respuesta in vitro de los linfocitos B. Si bien los resultados parecen ser contradictorios, la mayor parte
de los estudios muestran que estas células son capaces de inhibir la proliferación de estos linfocitos
(Augello y col 2005), así como su diferenciación (Corcione y col 2006), mientras que otros estudios
indican que las MSCs promoverían la sobrevida de las células B y la producción de anticuerpos
(Traggiai y col 2008). Sin embargo, es importante puntualizar que la función in vivo de los linfocitos
B, está fuertemente influenciada por las células T, por lo que los resultados descritos pudiesen variar
8
considerablemente (Uccelli y col 2008). Por último, y quizás el efecto más dramático de las MSCs sobre
algún componente del sistema inmune es su efecto sobre los linfocitos T, siendo capaces de inhibir su
proliferación (Bartholomew y col 2002, Di Nicola y col 2002), influyendo además sobre su polarización
(Sun y col 2007).
Figura 3. Moléculas solubles producidas por las MSCs involucradas en la modulación de la respuesta
inmune. a) efecto de las MSCs sobre las células NK; b) neutrófilos y células presentadoras de antígeno
y c) linfocitos.
2.1.1 MSCs y su interacción con linfocitos T
Aunque una gran cantidad de estudios han documentado los efectos de las MSCs sobre los
linfocitos, los mecanismos implicados son parcialmente conocidos, especialmente en especies diferentes
al humano y ratón. No obstante, se han descrito una gran variedad de vías a través de las cuales logran
afectar las funciones de estas células, variando en importancia entre las diferentes especies (Ren y col
2008). En general, dichos mecanismos pueden agruparse en aquellos dependientes del contacto célula-
9
célula (Kim y Cho 2013), y aquellos independientes del contacto, relacionados con la secreción de
moléculas solubles y vesículas extracelulares (Bruno y col 2015, Di Trapani y col 2016).
En relación a los mecanismos dependientes del contacto célula-célula, se describe la producción
de óxido nítrico (NO) e indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), mientras que en los mecanismos
independientes del contacto celular se ha descrito secreción de factor de crecimiento transformante-β1
(TGF-β1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interleuquina-10 (IL-10), prostaglandina - E2
(PGE2), hemooxigenasa-1 (HO-1), interleuquina-6 (IL-6) y HLA-G5 soluble. Sin embargo, ninguna de
estas moléculas tiene un papel exclusivo ya que la inmuno-regulación mediada por las MSCs es un
sistema que está mediado por la acción de varias moléculas (Uccelli y col 2008).
Es importante mencionar, que para que las MSCs sean capaces de inhibir la proliferación de
linfocitos, éstas deben haber sido expuestas a un entorno inflamatorio (Marigo y Dazzi 2011),
específicamente el interferón-γ (IFN-γ), y al menos otra citoquina, como el factor de necrosis
tumoral- α (TNF-α), interleuquina-1α (IL-1α) o interleuquina-1β (IL-1β) (Ren y col 2008).
Estudios han demostrado que la inmunosupresión mediada por MSCs, podría ser mediada por la
combinación de las citoquinas mencionadas anteriormente, a través de la expresión de IL-10, TGF-β,
NO, IDO, PGE2 y la proteína del gen 6 estimulado por TNF (TSG-6) (Li y Hua 2017, Li y col 2012). Sin
embargo, la relevancia de cada una de las moléculas depende de la especie de la cual se obtenga la
molécula (Ren y col 2009).
En humanos, las MSCs regulan los procesos inflamatorios a través de, proteínas como, óxido
nítrico sintetasa inducible (iNOs), PGE2, TSG-6 e IDO (Liu y col 2016, Spaggiari y col 2008), siendo
10
esta última una de las moléculas clave en el proceso inmuno-modulador (Ren y col 2009). IDO es una
enzima intracelular inducible por IFN-γ que cataliza la degradación de triptófano a kinurenina. El
triptófano es un aminoácido esencial para la proliferación linfocitaria (Uccelli y col 2008), por lo que
producto de la actividad enzimática de IDO se produce la depleción del triptófano y varios metabolitos
de la vía de kinurenina que conducen a la detención de las células T y su apoptosis, proceso conocido
como disrupción metabólica (François y col 2012).
En ratones se ha descrito que PGE2 y TSG-6 son moléculas reguladoras secretadas por MSCs
(Ghannam y col 2010, Prockop y Oh 2012), destacando a la iNOs como una molécula trascendental
(Ren y col 2009). La iNOS cataliza la producción de NO, que es inmunosupresor a altas concentraciones
(Ren y col 2009) e inhibe las respuestas de las células T (Niedbala y col 2006). El NO se difunde
rápidamente desde su fuente, pero la concentración de la forma activa cae bruscamente. Por lo tanto,
el NO puede actuar solo en las proximidades de las células que lo producen (Ren y col 2008). Además,
las MSCs expresan quimioquinas como CXCL9 y CXCL10 que a su vez, complementan la actividad del
NO en los co-cultivos con células inmunes, ya que inducen la migración de las células T hacia la
proximidad de las MSC, donde los altos niveles de NO suprimen su proliferación (Li y col 2012).
Por otro lado, TSG-6, IDO, TGF-β, HGF y PGE2 son moléculas producidas por MSCs caninas
(Kang y col 2008). Mientras que en MSCs equinas, Colbath y col (2017) encontraron que la PGE2 era
un mediador importante en la inmunosupresión de células mononucleares de sangre periférica (PBMC,
por sus siglas en inglés) alogénicas equinas cuando lograron revertir la proliferación linfocitaria al
aplicar un inhibidor para la síntesis de PGE2. La PGE2 es un producto del metabolismo del ácido
araquidónico que actúa como un poderoso supresor inmunológico, inhibe la mitosis de las células T y
la producción de interlequina-2 (IL-2), y es un cofactor para la inducción de la actividad de los
11
linfocitos T-helper 2 (Th- 2) (Ghannam y col 2010). Adicionalmente Colbath y col (2017), observaron
que el NO y la IDO no jugaban un rol en la supresión de la proliferación de PBMC por parte de las MSCs.
Sin embargo, la capacidad inmunosupresora de las MSC ha mostrado ser constitutiva cuando se
refiere a otras células del sistema inmune. Sin embargo, en lo que respecta a linfocitos esta no siempre
se evidencia, ya que depende del tipo y cantidad de señales inflamatorias que reciben. Esta plasticidad
de las MSCs en la inmuno-modulación se demostró en un estudio que investigó cómo las diferentes
concentraciones de IFN-γ y TNF-α afectaban las funciones de las MSCs en la regulación inmune, donde
los niveles bajos de citoquinas pro-inflamatorias condujeron a una pobre producción de NO de MSCs
murinas, mientras que los niveles altos de citoquinas pro-inflamatorias dieron como resultado una
producción adecuada de NO y garantizaron sus efectos inhibidores sobre las células T. Esta plasticidad
de las MSCs murinas también fue aplicable a las MSC humanas (Li y col 2012).
2.2 EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO EN EL POTENCIAL
INMUNOMODULADOR
Muchos autores se han esforzado en mejorar la supervivencia, capacidad de diferenciación o
inmuno-modulación de las MSCs, modificando o pre-condicionando el ambiente de estas ex vivo (Li y
col 2013). Las estrategias de pre-condicionamiento incluyen el cultivo de las células con agonistas, la
exposición de las células a hipoxia, choque térmico, estrés oxidativo mecánico, entre otros (Yu y col
2017). El pre-condicionamiento de MSCs in vitro por hipoxia antes de su uso terapéutico, es una
estrategia adaptativa que busca preparar a las MSCs para sobrevivir en un entorno hostil y mejorar su
función reguladora de la respuesta inmune local (Saparov y col 2016). Se ha demostrado que las MSCs
12
pre-condicionadas poseen una mejor sobrevida, mayor capacidad de diferenciación, incremento en la
secreción de moléculas con efectos paracrinos y una mejor llegada a los sitios de lesión (Hu y Li 2018).
El pre-condicionamiento de MSCs con citoquinas pro-inflamatorias potencia sus efectos inmuno-
moduladores en humanos (Hemeda y col 2010) y en ratones (English y col 2007). Sin embargo, esta
mejora y los mecanismos mediante los cuales estas células ejercen su efecto en caninos (Yang y col
2018) y equinos (Colbath y col 2017) aún no están claramente dilucidados.
El uso terapéutico de MSCs en distintas patologías ha cobrado gran importancia en los últimos
años, tanto en medicina humana como veterinaria, particularmente en la medicina del equino. Sin
embargo, en la actualidad no existen estudios que analicen los mecanismos a través de los cuales las
MSCs del equino inhiben la proliferación linfocitaria, así como tampoco si el efecto del pre-
condicionamiento involucra el incremento de dichos mecanismos.
13
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1. HIPÓTESIS
El pre-condicionamiento de las MSCs equinas obtenidas de médula ósea con moléculas pro-
inflamatorias, incrementa su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos mediante la sobre
expresión de moléculas inmuno-moduladoras.
3.2. OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto del pre-condicionamiento de las MSCs equinas con citoquinas pro-
inflamatorias (TNF-α, IFN-ϒ y su combinación), sobre la proliferación linfocitaria.
14
3.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•Determinar el efecto de las MSCs sobre la inhibición en la proliferación de linfocitos.
•Determinar si el efecto inhibitorio de MSCs sobre la proliferación, depende de la actividad de las
enzimas IDO o iNOS, o de la producción de PGE2.
•Determinar el efecto del pre-condicionamiento de MSCs (TNF-α, IFN-γ o su combinación),
sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras.
•Determinar el efecto del pre-condicionamiento de las MSCs con moléculas pro-inflamatorias
(TNF-α, IFN-γ o su combinación), sobre su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos.
15
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. MATERIALES
El presente estudio se llevó a cabo en las dependencias del Hospital Clínico Veterinario y del
Laboratorio de Farmacología y Fisiopatología Pulmonar, ambos pertenecientes a la Facultad de
Medicina Veterinaria de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
4.1.1. Animales
Para la obtención de las MSCs y leucocitos de sangre periférica se utilizaron caballos adultos, sin
distinción de sexo, entre 13 y 17 años de edad, mestizos, con un peso entre 300-400 kg. Para evidenciar
el estado de salud de los animales, se realizó un examen clínico general previo al ensayo. Los animales
se mantuvieron en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Fueron
alimentados a pastoreo directo en pradera natural suplementado con heno y disponibilidad de agua ad
libitum durante el tiempo en que se llevó a cabo el estudio.
16
4.2. MÉTODOS
4.2.1. Aislamiento de MSCs desde médula ósea
El aislamiento de las MSCs a partir de una muestra de médula ósea se realizó según el protocolo
descrito por Haeger y col (2017). Brevemente, a los animales se les realizó una ventana de tricotomía
entre la segunda y séptima esternebras. Una vez identificado el sitio de punción mediante ecografía, se
procedió a realizar la antisepsia de la zona mediante un lavado con clorhexidina 2% y etanol 70%.
Luego, el animal fue sedado con xilacina 10% (DragPharma) en una dosis de 0,5 mg/kg de peso, en
combinación con acepromacina (DragPharma) en una dosis de 0,02 mg/kg por vía endovenosa. En el
área preparada anteriormente para la punción, se realizó un bloqueo anestésico con 10 mL de lidocaína
al 2% (DragPharma). La punción se hizo utilizando una aguja Komiyashiki de acero quirúrgico de 10
cm de largo y 11 G de diámetro. Posteriormente, se procedió al aspirado de la médula ósea mediante la
utilización de 3 jeringas de 20 mL previamente cargadas con 8 mL de buffer fosfato salino PBS (NaCl
0,13 M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,76 mM a un pH 7,4) con 5.000 UI de citrato de Na
3,8% (p/v). Una vez obtenidas las muestras, se separaró la fracción de células mononucleares de la
médula ósea mediante una gradiente de Percoll (GE Healthcare Life Sciences). Estas células
mononucleares se transfirieron a botellas de cultivo T175 (BD Biosience) agregándoles medio de cultivo
completo (DMEM incompleto GIBCO, ThermoFisher) suplementado con 10% de SBF y
Penicilina/estreptomicina a una concentración final de 100 UI/mL y 0,1 mg/mL respectivamente),
hasta completar 25 mL por botella. Las botellas se mantuvieron en estufa de cultivo a 37ºC con 5% de
CO2 hasta que se observó la formación de colonias de células adherentes al plástico con aspecto
fibroblastoide con una confluencia del 70%, momento en el cual se procedió a la criopreservación.
17
4.2.2. Separación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
Para la separación de PBMC, se obtuvo una muestra de 20 mL sangre por venopunción yugular.
La muestra se obtuvo en un tubo cónico de 50 ml (Falcon) con 2 mL de citrato de sodio 3,8%.
Posteriormente se realizó la separación de las PBMC mediante una gradiente de Percoll, para lo cual se
preparó 30 mL de sctock Percoll, agregando 27 mL de esta solución más 3 mL de PBS-citrato 10X (NaCl
1,4 M; KCl 27 mM; Na2HPO4 80 mM; KH2PO4 14,7 mM; Na3C6H5O7 155 mM a un pH 7,4). A partir de este
stock se prepararon dos soluciones. La primera agregando 13,6 mL del stock percoll más 2,4 mL de PBS-
citrato obteniendo una solución con una densidad de 85%. La segunda se preparó agregando 11.2 mL
del stock percoll más 4.8 mL PBS-citrato 1X, obteniendo así una solución con una densidad de 70%.
Con estas soluciones se preparó una gradiente de percoll en 6 tubos cónicos de 15 mL, donde se depositó
2,5 mL de la solución de 85% y luego 2,5 mL de la solución de 70%. Posteriormente se depositó 3 mL de
la sangre sobre cada gradiente, para inmediatamente ser centrifugados a 400 x g durante 25 minutos.
Luego se transfirió la banda superior de la gradiente, correspondiente a las PBMC, a otro tubo cónico
de 50 mL y se realizó un lavado con 20 mL de PBS-citrato 1X centrifugando durante 7 minutos a 400 x
g. Finalmente, una vez terminada la centrifugación, se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el pellet
en 2 mL de PBS-citrato y se procedió al conteo de las células usando una cámara de Neubauer.
4.2.3. Determinación del efecto de las MSCs sobre la proliferación de linfocitos
Con el fin de determinar el efecto de las MSCs sobre la proliferación linfocitaria se realizó un
ensayo de dilución de éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE). Para realizar el marcaje 1x107
PBMC se re-suspendieron en 1 mL PBS, agregándosele un volumen 110 μL de PBS con CFSE (100 mM).
Las células fueron incubadas en oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se le agregó 4 mL de RPMI completo (RPMI 1640 GIBCO (ThermoFisher),
suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) y Penicilina/estreptomicina a una concentración
final de 100 UI/mL y 0,1 mg/mL respectivamente) y se incubó durante 5 minutos en hielo. Una vez
18
finalizada la incubación, se realizaron 3 lavados con 5 mL de RPMI 1640, resuspendiendo finalmente
las células en 4 mL de RPMI con 10% SBF y una solución de penicilina/estreptomicina (a una
concentración final de 100 U/ml y 0,1 mg/ml respectivamente).
Para inducir la proliferación de linfocitos, se dispusieron 100 μL de PBMC (1x106/mL) por pocillo
en una placa de cultivo de 96 pocillos y se estimularán agregando 100 μL de concanavalina A (ConA,
Sigma-Aldrich) a una concentración de 5 μg/mL, incubándose durante 4 días a 37ºC con un 5% de
CO2. Como controles de la técnica se utilizaron células sin marcar con y sin ConA, y células marcadas
sin estimular.
La dilución de la marca de CFSE se evaluó mediante citometría de flujo (BD FACS Canto II), para
lo cual las células se transfirieron a tubos de citometría. Posteriormente, las células fueron lavadas con
1 mL buffer de citometría (PBS con 1% de SBF). Con el fin de evaluar las células vivas, estas fueron
marcadas con un marcador de viabilidad LIVE/DEAD® (FixableNear-IR Dead Cell Stain,
ThermoFisher), para lo cual las células se incubaron con el marcador en una concentración de
1 μL/mL, durante 15 min, en oscuridad a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, las
células fueron lavadas 2 veces con 1 mL de buffer de citometría y resuspendidas en 200 μL del mismo
y luego analizadas en el citómetro de de flujo.
Para determinar el efecto de las MSCs sobre la proliferación de linfocitos, se realizó el co-cultivo
de PBMC (previamente marcadas con CFSE) con MSCs en diferentes relaciones (1:1, 4:1, 16:1, 32:1 y
64:1). Estas 5 condiciones fueron agregadas al ensayo de proliferación descrito anteriormente.
19
4.2.4. Determinación de los mecanismos relacionados con la capacidad de las MSCs de inhibir la
proliferación de linfocitos
Con el fin de determinar cuáles son los mecanismos que utilizan las MSCs equinas para inhibir
la proliferación, se inhibió la producción de las moléculas más comúnmente descritas como
responsables de dicho efecto en otras especies como PGE2, IDO y NO. Para lo anteriormente descrito, se
inhibió la producción de PGE2 mediante la adición al co-cultivo de MSCs y PBMC de indometacina
(Sigma-Aldrich) en una concentración 10 μM, que es un inhibidor de la enzima cicloxigenasa.
Adicionalmente se realizaron ensayos en los que se busca determinar el efecto de IDO, utilizando un
inhibidor especifico de esta molécula, el 1-Metil-D-triptofano (1-MT) en una concentración de 2 μM.
Por último, para poder evaluar el rol de ON en la inhibición de la proliferación linfocitaria, se utilizó
aminoguanidina (Sigma-Aldrich) en una concentración 1.5 μM.
4.2.5. Determinación de la expresión de moléculas inmuno-moduladoras
4.2.5.1. Extracción de ARN de MSCs:
MSCs de diferentes animales se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos a una concentración
de 5 x 103 células/mL en medio DMEM GIBCO (ThermoFisher) suplementado con 10% de SBF y
Penicilina/estreptomicina a una concentración final de 100 UI/mL y 0,1 mg/mL respectivamente. Las
placas fueron incubadas a 37ºC con un 5% de CO2, hasta alcanzar un 70% de confluencia. Una vez
alcanzada la confluencia esperada, se pre-condicionaron las células con IFN-γ, TNF-α o su
combinación a distintas concentraciones: 0,1; 1 y 10 ng/mL durante 24 horas, manteniendo células sin
estimular como control. Pasada las 24 horas, se extrajo el ARN de cada condición mediante kit E.Z.N.A.
Total RNA Kit I (OMEGA), siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante y se cuantificó el ARN
20
extraído mediante espectrofotometría utilizando un Nanodrop. Finalmente, estas muestras se
mantuvieron congeladas a -80°C hasta su uso.
4.2.5.2. Síntesis de ADNc de MSCs (RT):
La reacción de retrotranscripción reversa (RT) se realizó en un volumen final de 40 μL, para lo
cual las muestras obtenidas del proceso de extracción de ARN fueron descongeladas y se les agregó a
cada una 4 μL de M-MLV reverse transcriptase 5X buffer y 0.8 μL de enzima DNAsa para eliminar
alguna posible contaminación con ADN genómico. Estas muestras se incubaron a 37°C en baño
termorregulado durante 30 minutos y luego se les agregó 4 μL de inactivante para evitar que la enzima
continúe su acción. Pasado 5 minutos de incubación se centrifugó a 10.000 g durante 1 minuto y 30
segundos. El sobrenadante obtenido se transfirió a microtubos de 1,5 mL independientes y se cuantificó
el ARN de cada muestra mediante espectrofotómetro Nanodrop. De cada muestra se tomó 1 μg de ARN
total y se incubó con 2 μL de oligonucleótidos poli dT (Promega), completando con agua un volumen
final de 10 μL, durante 5 minutos a 70°C en el termociclador. Acabado este proceso, a cada tubo se le
adicionó 5μL de buffer, 2 μL de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Promega)), 1 μL de la enzima
transcriptasa reversa E7RT, completándose un volumen final de 20 μL con agua. También se preparó
un tubo control que no posea la enzima E7RT. Cada mezcla se incubó en un termociclador
(StepOnePlus, Applied Biosystem) a 42°C durante 60 minutos y luego a 95°C por 5 minutos.
4.2.5.3. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR):
El ADNc obtenido fue amplificado mediante la RT-PCR, utilizando 2 μL de la reacción de
transcripción reversa como templado, 1 μL de partidor sentido y 1 μL partidor antisentido (Tabla 1),
5 μL SYBER GREEN (Bio-Rad) y 2,6 μL de agua libre de nucleasas. El programa de amplificación
21
consistió en una denaturación inicial y 40 ciclos, de denaturación y extensión, para finalmente realizar
una curva de melting.
Tabla 1. Secuencia de partidores. S: primer sentido. A: primer antisentido.
4.2.6. Efecto del pre-condicionamiento sobre la capacidad de las MSCs de inhibir la proliferación de
linfocitos
Para determinar el efecto del pre-condicionamiento de la MSCs con moléculas pro-inflamatorias
sobre su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos, se pre-condicionaron estas células con TNF-
α, IFN-γ y la combinación de ambas citoquinas a distintas concentraciones (0.1, 1 y 10 ng/mL),
incubándose 37ºC con un 5% de CO2 durante 24 horas. Posteriormente, fueron lavadas con 200 μL de
buffer fosfato salino PBS y co-cultivadas con PBMC marcadas con CFSE (100 mM) y estimuladas con
ConA a una concentración de 5 μg/mL para luego incubarlas durante 4 días a 37ºC con un 5% de CO2.
Una vez trascurrido el tiempo de incubación la proliferación celular fue evaluada mediante citometría
de flujo realizando el protocolo descrito anteriormente.
Gen Nombre Secuencia primer 5'→3' Tamaño Amplicón
S: GATCCTAAGCGAGGTCCAGC
A: AGGCGCAGTTTATGCTGTCT
S: TGCATTCAAGGTCAAGGAGA
A: TTTTGGAATTTGGGAGCAGT
S: ACAACATCAGGACCAGGACAC
A: TCCAGACGCCTTCATAGAG
S: ATGAGTGGCTGAAGAACACAACAAC
A: AGGAATGCCCATGAACTACAACAAT
S: CCAACAATGGCAACATCAGGT
A: TGAGCATTCCAGATCCGGA
S: GGGAGCAATAAGAAAACGAAGC
A: CTTGGAGGAGACATTGTGAGC
S: GGAATGGCTGTCCTTTGATG
A: CGGAGTGTGTTATCTTTGCTGTC
RPL 32 Protepina ribosomal L32 138
IDOIndolamine 2,3 -
dioxigenasa197
HGF
COX-2 Ciclooxigenasa 2 101
Factor de crecimiento
hepático234
IL-6 Interlequina -12A 131
Factor de crecimiento
transformante-β120TGF-β
iNOS Óxido nítrico sintasa 2 85
22
4.2.7. Análisis estadístico
Los datos obtenidos en los diferentes ensayos fueron registrados en una planilla Excel y
posteriormente analizados descriptivamente con el fin de obtener variables como media, mediana,
desviación estándar. Adicionalmente, la distribución de los datos fue determinada a través del test
Shapiro-Wilk. Para la comparación entre grupos en los diferentes ensayos, se realizó la prueba
estadística para datos con distribución no paramétrica Kruskal-Wallis, seguido de un test de
comparaciones múltiples de Dunnet, utilizando un nivel de significancia de p<0.05 para ambos casos.
23
5. RESULTADOS
5.1. CAPACIDAD DE LAS MSCs SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE PBMC
El efecto de las MSCs equinas derivadas de médula ósea sobre la proliferación de linfocitos se
evaluó mediante el co-cultivo de MSCs con PBMC, previamente marcadas con CFSE y estimuladas con
ConA. Como muestra la figura 4a, mediante la evaluación de la dilución de la marca de CFSE se pudo
determinar el efecto del estímulo sobre la proliferación, observándose en todos los casos la aparición de
picos de fluorescencia en los histogramas, los cuales están asociados a la proliferación de los linfocitos.
Por otra parte, cuando las PBMC se co-cultivan con MSCs se observa una disminución en la aparición
de estos picos de fluorescencia, lo que se asocia con la disminución en la proliferación. Este efecto
inhibitorio de la proliferación, fue estadísticamente significativo cuando las PBMC fueron co-cultivadas
con MSCs en relaciones de 1:1; 4:1 y 16:1 (PBMC:MSCs). El máximo efecto inhibitorio se obtuvo en la
relación 1:1, donde el 80% de las células perdieron su capacidad proliferativa. En las relaciones
PBMC:MSCs 32:1, se produjo una leve inhibición de la proliferación linfocitaria, sin embargo no fue
significativa (figura 4b).
24
Figura 4. Efecto de las MSCs equinas derivadas de medula ósea sobre la proliferación de PBMC. a)
Figura representativa de las citometrías de flujo en las diferentes condiciones del ensayo de proliferación
de PBMC cultivadas solas o co-cultivadas con MSCs en distintas relaciones. b) El panel de la izquierda
muestra el porcentaje de proliferación linfocitaria inducida con 5 μg/mL de concanavalina A (ConA)
en PMBC cultivadas solas o co-cultivadas con MSCs en distintas relaciones. En el gráfico de la derecha
se indica el índice de proliferación obtenido normalizando los datos de cada experimento con la
25
proliferación de la población de PBMC cultivadas solas y estimuladas con ConA (n= 12; **p<0.01
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
5.2. MOLÉCULAS IMPLICADAS CON EL EFECTO INHIBITORIO DE LAS MSCs SOBRE LA
PROLIFERACIÓN DE PBMC
Para determinar los mecanismos involucrados en el efecto de las MSCs sobre la proliferación
de PBMC, se realizó la inhibición farmacológica de moléculas que han mostrado mediar dicho efecto
en otras especies tales como; COX que sintetiza PGE2, IDO que metaboliza el triptófano necesario para
la expansión clonal, y por último iNOS, que sintetiza NO a partir de arginina. Con el fin de inhibir
dichas moléculas se trataron los co-cultivos de PBMC y MSCs con fármacos que producen una
inhibición especifica de PGE2, IDO e iNOS, que son indometacina (10 μM), 1-MT (2 μM) y
aminoguanidina (1.5 μM), respectivamente. En la figura 5, se muestran los resultados de los ensayos
realizados con indometacina y 1-MT, en los cuales se observó una reversión significativa del efecto
inhibitorio de las MSCs sobre la proliferación de linfocitos. Por otra parte, el tratamiento con
aminoguanidina no mostró tener un efecto sobre la capacidad inhibitoria de las MSCs, lo que sugiere
que el NO no es necesario para dicha capacidad.
26
Figura 5. Mecanismo de inhibición de la proliferación de PBMC mediada por MSCs equinas derivadas
de medula ósea. a) En el panel izquierdo se muestra un histograma que indica el efecto de
27
indometacina (10 μM) sobre la proliferación inducida con 5 μg/mL de concanavalina A (ConA). En
los paneles medio y central, se muestra el efecto de indometacina sobre porcentaje e índice de
proliferación de PBMC. En las figuras b) y c) se muestran los resultados obtenidos en los ensayos
realizados con 1-MT (2 μM) y aminoguanidina (1.5 μM), respectivamente (n= 6; **p<0.01).
5.3. EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO CON MOLÉCULAS PRO-
INFLAMATORIAS, SOBRE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS INMUNO-MODULADORAS POR
MSCs
Con el fin de determinar el efecto del pre-condicionamiento con citoquinas pro-inflamatorias
sobre las MSCs, se les incubó durante 24 horas con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de
TNF-α, IFN-γ o su combinación, y evaluó la expresión de moléculas inmuno-moduladoras mediante
RT-qPCR. Interleuquina-6 mostró un aumento estadísticamente significativo cuando las MSCs se
trataron con IFN-γ o con TNF-α más IFN-γ en las concentraciones 1 y 10 ng/mL. Este aumento, en su
expresión fue mayor cuando las células se incubaron con TNF-α, en relación al producido frente al
estímulo con IFN-γ, y aún mayor cuando se estimuló con la combinación de ambas citoquinas
(figura 6). La expresión de la enzima IDO por su parte, se incrementó significativamente cuando las
células se trataron con IFN-γ, incremento que fue considerablemente mayor cuando se estimularon las
células con la combinación de las citoquinas (figura 7). Similar al efecto obtenido con IL-6, fueron los
resultados de la evaluación de la expresión de iNOS, determinándose un mayor efecto de la estimulación
con TNF-α y la combinación de citoquinas, con respecto al estímulo con IFN-γ (figura 8). En el caso
de COX-2 únicamente cuando las células se trataron con la concentración más alta de TNF-α por si
solo o en combinación con IFN-γ se produjo un incremento significativo de esta molécula (figura 9).
28
En relación a la expresión HGF y TGF-β1, esta tuvo un comportamiento inverso a los genes
descritos anteriormente, ya que su expresión fue disminuyendo en la medida que se aumentó la
concentración de TNF-α, alcanzando un valor estadísticamente significativo en la concentración más
alta de esta citoquina (figura 10).
Figura 6. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en MSCs equinas derivadas
de medula ósea, sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras. La figura muestra el efecto del
pre-condicionamiento de MSCs con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de factor de necrosis
tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación, sobre la expresión de interleuquina-6
(IL-6), (n= 6; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
29
Figura 7. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en MSCs equinas derivadas
de medula ósea, sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras. La figura muestra el efecto del
pre-condicionamiento de MSCs con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de factor de necrosis
tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación, sobre la expresión de indolamina 2,3-
dioxigenasa (IDO), (n= 6; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Figura 8. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en MSCs equinas derivadas
de medula ósea, sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras. La figura muestra el efecto del
pre-condicionamiento de MSCs con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de factor de necrosis
30
tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación, sobre la expresión de óxido nítrico
sintasa (iNOS), (n= 6; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Figura 9. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en MSCs equinas derivadas
de medula ósea, sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras. La figura muestra el efecto del
pre-condicionamiento de MSCs con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de factor de necrosis
tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación, sobre la expresión de cicloxigenasa 2
(COX-2), (n= 6; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
31
Figura 10. Efecto del pre-condicionamiento con moléculas pro-inflamatorias en MSCs equinas
derivadas de medula ósea, sobre la expresión de moléculas inmuno-moduladoras. La figura muestra el
efecto del pre-condicionamiento de MSCs con distintas concentraciones (0,1; 1 y 10 ng/mL) de factor
de necrosis tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación, sobre la expresión del factor
de crecimiento de hepatocitos (HGF) y el factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) (n= 6;
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
32
5.4. EFECTO DEL PRE-CONDICIONAMIENTO CON MOLÉCULAS PRO-
INFLAMATORIAS, SOBRE LA CAPACIDAD INHIBITORIA DE LA PROLIFERACIÓN DE LAS
MSCs
Para determinar el efecto del pre-condicionamiento con citoquinas pro-inflamatorias sobre las
MSCs equinas, se les incubó durante 24 horas previo al co-cultivo con 10 ng/mL TNF -α, IFN-γ, o su
combinación, y se evaluó su capacidad de inhibir la proliferación de PBMC mediante un ensayo de
dilución de CFSE. Como se muestra en la figura 11, el pre-condicionamiento de las MSCs no produjo
un cambio estadísticamente significativo en su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos en
ninguna de las condiciones.
Figura 11. Efecto del pre-condicionamiento de MSCs con moléculas pro-inflamatorias, sobre su
capacidad de inhibir la proliferación de PBMC. En el panel izquierdo se muestra el porcentaje de
33
proliferación linfocitaria en PBMC cultivadas solas o co-cultivadas con MSCs (16:1) y estimuladas con
Concanavalina A (ConA). Adicionalmente se muestra el efecto de pre-condicionar las MSCs con
10 ng/mL de factor de necrosis tumoral-α (TNF –α), interferón-γ (IFN-γ), o su combinación. El panel
derecho indica el índice de proliferación de linfocitos obtenido normalizando los datos de cada
experimento con la proliferación de la población de PBMC cultivadas solas y estimuladas (n= 6;
**p<0.01).
34
6. DISCUSIÓN
Para determinar el potencial inmuno-modulador de las MSCs equinas, evaluamos su capacidad
de inhibir la proliferación de linfocitos. En relación a ello, observamos que las MSCs derivadas de
médula ósea, mostraron ser capaces de inhibir fuertemente su proliferación, lo que concuerda con la
capacidad de dichas células reportada en otras especies de mamíferos, independientemente del sitio de
aislación. En humanos, células obtenidas de diversos tejidos como médula ósea, gelatina de Warton o
tejido adiposo (Cutler y col 2010, Di Nicola y col 2002, François y col 2012, Girdlestone y col 2009,
Giuliani y col 2011, Le Blanc y col 2003, Najar y col 2009, Nasef y col 2007, Plumas y col 2005,
Ramasamy y col 2008, Rasmusson y col 2004, Tse y col 2003), han mostrado ser capaces de inhibir la
proliferación de linfocitos, tanto frente a estímulos específicos como inespecíficos. En otros mamíferos
como caninos y felinos, las MSCs también se han mostrado capaces de inhibir fuertemente la
proliferación (Lee y col 2012, Kim y col 2010, Parys y col 2017). En el caso del equino, las MSCs también
han mostrado poseer dicha capacidad, independientemente del sitio de obtención, encontrándose en la
literatura reportes de células obtenidas de médula ósea, tejido adiposo, tejido o sangre del cordón
umbilical y sangre periférica (Carrede y col 2012, Carrede y col 2014, Longhini y col 2019).
Los mecanismos involucrados en la capacidad de las MSCs para inhibir la proliferación de
linfocitos, parecen variar dependiendo del sitio de obtención de las células, así como de la especie. Sin
embargo, un mecanismo común parece ser la producción de PGE2, la cual es producida por MSCs,
independientemente de la especie o tejido del cual se obtengan (Aggarwal y Pittenger 2005, Hsu y col
2013). La PGE2, es un producto del metabolismo del ácido araquidónico que actúa como un potente
supresor inmunológico (Ghannam y col 2010). Posee diversos efectos sobre la regulación y la actividad
35
de las células T como en la modulación de la proliferación y producción de citoquinas (Harris y col
2002).
Las poliaminas (putrescina, espermidina y espermina), están presentes en todos los seres vivos y
desempeñan un papel importante como cofactores en varios procesos bioquímicos asociados con
actividades celulares, como la sintesis de proteínas relacionadas con la tasa de crecimiento (Ruggerri y
col 2010). Los eventos de activación y proliferación de linfocitos parecen estar asociados con un
aumento de la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC), una enzima limitante de la velocidad en
la biosíntesis de poliaminas y con un aumento concomitante de los niveles de AMP cíclico, que a su vez
aumenta sustancialmente la biosíntesis de poliaminas (Pollok y col 1991). Los resultados reportados
por Ruggeri y col (2000), demuestran que un breve tratamiento de linfocitos T humanos con PGE2
fueron capaces de aumentar la actividad de ODC a través de la acumulación de AMPc, así como de
afectar los niveles de poliaminas. Sin embargo, otros estudios han determinado que la inhibición de la
proliferación celular producido por la PGE2 se podría deber a una inhibición de la la proteína tirosina-
kinasa p59 (FYN), la cual conduce a la fosforilación de la enzima inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y la
consecuente liberación de calcio intracelular, cuyo aumento sostenido es considerado crítico para la
activación de las células T y su posterior proliferación (Choudhry y col 1999).
Al igual que los resultados obtenidos en el presente estudio, Carrade y col (2014), demostraron
que la inhibición de la síntesis de PGE2 por parte de las MSCs equinas obtenidas de médula ósea,
mediante la utilización de indometacina, restaura la proliferación de linfocitos, específicamente células
T. Adicionalmente, en dicho estudio los autores evaluaron este mecanismo en MSCs obtenidas de tejido
adiposo y de cordón umbilical, demostrando que la producción de PGE2 también es necesaria para su
capacidad de inhibir la proliferación linfocitaria. En este contexto, Aggarwal y Pittenger (2005)
sugieren que la PGE2 es responsable también de dicho efecto mediado por MSCs humanas sobre las
36
células T. Sin embargo, Tse y col (2003) no observaron una reversión significativa en la proliferación
de células T en cultivos con MSCs humanas al usar indometacina como inhibidor de la síntesis de PGE2,
a pesar de que esta disminuyó en una proporción inversa a las concentraciones utilizadas de
indometacina. Esta disparidad con los resultados obtenidos por Tse y col (2003), podrían deberse a
diferencias en el diseño experimental. Una variable podría tratarse del tiempo en el cual se realizó la
determinación, siendo 4 días en nuestro caso y el de Aggarwal y Pittenger (2005), o el estímulo utilizado;
otra variable podría tratarse del estímulo utilizado, ya que dicha estimulación en el estudio de Tse y col
(2003) se realizó con una combinación anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, mientras que en nuestro
estudio y el de Aggarwal y Pittenger (2005) el estímulo fue realizado con ConA o PHA respectivamente.
Sumada a la secreción de PGE2 por parte de las MSCs, otro mecanismo que ha mostrado
participar en la inhibición de la proliferación de linfocitos, es la actividad de la enzima IDO (François
y col 2012, Meisel y col 2004, Ren y col 2009). La IDO es una enzima intracelular, inducible por IFN-γ
que metaboliza el triptófano a kinurenina y por lo tanto, puede conducir a la inhibición de la
proliferación de células T (François y col 2012, Meisel y col 2004), ya que el triptófano es un aminoácido
indispensable para la biosíntesis de proteínas (Ternnes y col 2002), por lo tanto, la presencia de este es
esencial para la proliferación celular (Tse y col 2003). Se ha demostrado que el agotamiento del
triptófano y varios metabolitos de la vía de la kinurenina conducen a la detención de las células T y la
apoptosis (Fallarino y col 2006). Actualmente se desconoce cómo las células T detectan los
metabolitos tóxicos de la kinurenina, pero el triptófano bajo es censado por dos vías de señalización
sensibles a los aminoácidos: la vía de señalización mTOR (abreviación en inglés de “mammalian
Target of Rapamycin”) y la vía del sensor de estrés GCN2. La vía de mTOR, es importante para la
señalización del factor de crecimiento y las células T son particularmente sensibles a los inhibidores
de esta via. En el caso del sensor GCN2, este contiene un dominio de unión que es activado por la
privación de cualquier aminoácido, lo que resulta en la fosforilación del Factor de Iniciación de la
Traducción eucariótica 2α (eIF2α) y la consecuente represión de la traducción (Mellor y Munn
37
2004). Esto último fue evaluado en un estudio de Munn y col (2005), donde observaron que las
células T que carecen de GCN2, proliferaron normalmente en presencia de IDO, tanto in vitro como in
vivo, y no fueron susceptibles a la anergia inducida por IDO.
En el presente estudio, demostramos que la inhibición farmacológica de la actividad de IDO,
revierte la capacidad de las MSCs equinas de inhibir la proliferación, sugiriendo que este mecanismo es
también necesario para la mantención de dicha capacidad. François y col (2012), establecen a IDO
como el único mecanismo directo de inhibición de proliferación de células T, y que el bloqueo de esta
enzima produce una inhibición completa del efecto inmuno-supresor de las MSCs en humanos. En
apoyo de esta hipótesis, Cuerquis y col (2014) mostraron que la inhibición de la actividad de IDO en
co-cultivos de células T activadas y MSCs humanas, ya sea pre-condicionadas o no, resulta en niveles
de inhibición de la proliferación de células T más altos que los niveles observados en ausencia de MSCs.
En caninos, Kang y col (2008), observaron que el bloqueo de IDO en MSCs obtenidas de medula ósea y
tejido adiposo, restauró la proliferación de linfocitos, lo que indica que en esta especie IDO podría tener
una función inmuno-supresora. Por el contrario, otros estudios realizados en equinos muestran que
esta enzima parece no tener un efecto en la función inmuno-moduladora de las MSCs, ya que Carrede
y col (2012), determinaron que las MSCs equinas obtenidas tanto de tejido adiposo, medula ósea, sangre
de cordón umbilical y tejido de cordón umbilical no expresan IDO. Adicionalmente, Colbath y col
(2017) no encontraron efectos significativos sobre la proliferación, al utilizar 1-MT como inhibidor de
IDO en co-cultivos de MSCs con células T.
Otra molécula descrita como importante en la función inmuno-moduladora de las MSCs es el
NO (Ren y col 2008). Se han descrito algunas funciones del NO en el sistema inmune, demostrándose
que afecta la señalización del receptor de las células T (TCR), la expresión de receptores de citoquinas
y el fenotipo de las células T (Niedbala y col 2006). En ratones, la función inmuno-moduladora de las
38
MSCs es inducida por IFN-γ en conjunto con TNF-α, IL-1α o IL-1β. Esta combinación de citoquinas
pro-inflamatorias produce la expresión de altos niveles de quimioquinas e iNOS por parte de las MSCs,
moléculas necesarias para promover la migración de las células T a la proximidad de las MSCs, donde
el NO suprime la proliferación de estas células (Ren y col 2008). Esta vía, ha demostrado ser esencial
para dicha capacidad en MSCs murinas, pero no en las células obtenidas de humanos (Sato y col 2007,
Ghannam y col 2010). Carrede y col (2012) observaron que MSCs equinas obtenidas de medula ósea y
sangre de cordón umbilical co-cultivadas con PBMC son capaces de producir NO. Sin embargo, en el
presente estudio, y al igual que lo obtenido por Carrede y col (2014), la inhibición de la iNOS no fue
suficiente para restaurar la proliferación de linfocitos en presencia de MSCs. Estos datos sugieren que
en el equino, al igual que en las MSCs obtenidas de humano, el rol del NO sobre la capacidad de
inhibición de la proliferación de células T es limitado.
A pesar del gran potencial que han demostrado las MSCs en ensayos preclínicos como tratamiento
para diversas patologías inmuno-mediadas (Jones y McTaggart 2008, Keating 2008, Parekkadan y
Milwid 2010, Wang y col 2016), los ensayos clínicos a gran escala en humanos no han mostrado
resultados igual de alentadores. Esto puede deberse a diversos factores, como la dosis utilizada, la vía
de administración, el estado de avance de la patología, la baja sobrevida de las células trasplantadas o
la baja actividad o potencia in vivo de las células (Silva y col 2018). Además de mejorar el manejo de
estas variables biológicas y farmacológicas, se han desarrollado algunas estrategias para mejorar la
sobrevida y potencia de las MSCs una vez trasplantadas. Una de esas estrategias es el pre-
condicionamiento, el cual busca de preparar las células al ambiente que se encontrarán cuando lleguen
al tejido injuriado. Una alternativa de pre-condicionamiento es el uso de moléculas pro-inflamatorias
(Hu y Li 2018). Dentro de las moléculas más comúnmente utilizadas para dicho tratamiento están
TNF-α e IFN-γ , buscando así incrementar los mecanismos moduladores por parte de las MSCs.
39
En el presente estudio, se pre-condicionaron MSCS equinas con TNF-α, IFN-γ o su combinación,
para luego evaluar su efecto sobre la expresión de IL-6, IDO, iNOS, COX-2, HGF y TGF-β1. Remacha y
col (2015), describieron por primera vez que las MSCs equinas, derivadas de médula ósea expresaban
constitutivamente IL-6, resultado que concuerda con el estudio publicado por Cortés-Araya y col (2018),
donde también coinciden con la expresión constitutiva de IL-6, en este último caso, no solo de MSCs
obtenidas de medula ósea, sino que también de endometrio y tejido adiposo. Cuando se produce daño
tisular o inflamación debido a infecciones o lesiones, la síntesis de IL-6 se induce rápidamente, lo que
contribuye a la defensa del huésped mediante la estimulación de una respuesta inmune de fase aguda
y la hematopoyesis. La producción de IL-6 termina cuando se restablece la homeostasis del tejido, sin
embargo, si la síntesis continua de forma desregulada puede conducir al desarrollo de diversas
enfermedades, incluyendo enfermedades inflamatorias autoinmunes crónicas y cánceres (Tanaka y
Kishimoto 2014). El potencial inmuno-modulador de la IL-6, pudiese estar dado porque se ha
demostrado que la producción de PGE2 por parte de las MSCs, la cual como se explicó anteriormente es
una importante molécula inmuno-moduladora, es dependiente de IL-6, ya que esta última modula la
actividad de la COX-2 (Bouffi y col 2010). Carrede y col (2012), establecieron que la secreción de IL-6
en MSCs equinas obtenidas de medula ósea, tejido adiposo, tejido de cordón umbilical y sangre de
cordón umbilical fue significativamente mayor cuando las MSCs se incubaron con células T
estimuladas con PHA en comparación a los resultados que obtuvieron con células T sin estimular, lo
que sugiere que las MSCs necesitan de mediadores pro-inflamatorios para ejercer un efecto inmuno-
supresor. Esto se correlaciona con los resultados de nuestro estudio, ya que la expresión de IL-6 aumentó
en la medida que aumentamos la concentración tanto de TNF-α, IFN-γ como de su combinación,
observándose el mayor efecto en el caso del estímulo con la combinación de citoquinas, seguido por
aquellas estimuladas con TNF-α.
40
Hemeda y col (2010) demostraron que las MSCs humanas obtenidas de sangre periférica
expresan IDO de forma constitutiva, y que la expresión de esta molécula aumenta al pre-condicionar
con IFN-γ pero no con TNF-α. De la Rosa y col (2009), determinaron que IFN-γ es un mediador clave
para la expresión de IDO en MSCs obtenidas de tejido adiposo humano. Esta información se respalda
con lo observado en nuestro trabajo, donde IDO aumentó su expresión de forma significativa cuando
las MSCs se trataron con IFN-γ, particularmente este incremento fue considerablemente mayor cuando
las células se estimularon con la combinación de TNF-α mas IFN-γ. Esto, al determinar previamente
que IDO es una molécula importante para la capacidad de las MSCs de inhibir la proliferación de
linfocitos, pudiese significar que el pre-condicionamiento con la combinación de estas moléculas
incremente la potencia de las MSCs. Por otro lado, Carrede y col (2012), muestran que las MSCs equinas
obtenidas de tejido adiposo, medula ósea, sangre de cordón umbilical y tejido de cordón umbilical no
produjeron IDO basalmente, ni luego de ser estimuladas con aloantígenos o células T estimuladas con
PHA. La expresión basal de IDO por parte de las MSCs ha mostrado ser considerablemente baja, esto
pudiese explicar la no determinación si es que no se utiliza una concentración alta de RNA al momento
de evaluar su expresión.
Si bien el NO parece no tener un papel en el mecanismo inmuno-regulador de las MSCs equinas,
debido a la ausencia de reversión de la proliferación de linfocitos T al utilizar un inhibidor especifico
de la enzima iNOS, su expresión se vió significativamente incrementada en respuesta al tratamiento
con citoquinas pro-inflamatorias, ya sea solas o combinadas. En apoyo a esta hipótesis Carrede y col
(2012) observaron que MSC equinas obtenidas de medula ósea y sangre de cordón umbilical co-
cultivadas con PBMC son capaces de producir NO. Sin embargo, en otro estudio determinaron que la
inhibición del NO con L-NAME (un inhibidor especifico de iNOS) no revertió el efecto inmuno-
modulador de las MSCs en las células T activadas (Carrede y col 2014). En humanos, los estudios
también indican que iNOS parece no tener una participación importante en la inmuno-modulación.
41
Ren y col (2009), determinaron que las MSCs humanas estimuladas con IFN-γ expresaban niveles muy
bajos de iNOS en cultivo y que esta molécula no desempeña un papel importante en la
inmunosupresión mediada por MSCs humanas al no producirse una reversión de la proliferación de
los linfocitos cuando utilizaron L-NAME. Contrario a lo descrito en equinos y humanos, Sato y col
(2007), demostraron que la supresión de las células T por MSCs de ratón esta mediada por NO, ya que
encontraron altas concentraciones de NO en medios de MSCs co-cultivadas con esplenocitos activados
y además lograron revertir la proliferación de linfocitos T al utilizar L-NAME.
El ácido araquidónico se convierte en PGH2 por las enzimas COX-1 y COX-2 que posteriormente
se transforma en prostaglandinas como la PGE2. COX-1 se expresa de forma constitutiva en la mayoría
de las células del cuerpo y participa en los procesos homeostáticos, mientras que COX-2 es una enzima
inducible y está involucrada en los procesos inflamatorios (Harris y col 2002). Yañez y col (2010), en
su estudio determinaron que la producción de PGE2 mediante la vía de COX-2, desempeña un papel en
el efecto inmuno-modulador mediado por MSCs humanas obtenidas de tejido adiposo en la
proliferación de linfocitos T, en una relación dependiente de la dosis de MSCs, donde a mayor
proporción MSCs:PBMC, mayor fue la inhibición de la proliferación y producción de PGE2. Se ha
descrito la variabilidad en la implicancia de moléculas inmuno-moduladoras en especies veterinarias,
considerando a PGE2 como el mediador principal responsable de la inhibición de la proliferación de
linfocitos en el equino (Carrade y col 2012, Colbath y col 2017). En el presente estudio, COX-2 presentó
un aumento estadísticamente significativo en su expresión en la concentración más alta de TNF-α y
en la combinación de ambas citoquinas. En caninos, el pre-condicionamiento de MSCs con TNF-α e
IFN-γ, ha mostrado aumentar la expresión de COX-2, con un consecuente incremento en la
concentración de PGE2 en el sobrenadante, mejorando con ello su efecto antinflamatorio, en
comparación a las MSCs sin pre-condicionar, debido a que disminuyeron las concentraciones de las
citoquinas pro-inflamatorias IL-1β, IL-6 e iNOS de las células de macrófagos de ratón (RAW 264.7)
42
estimuladas con LPS (Yang y col 2018). Resultados similares encontraron English y col (2007) en MSCs
murinas, donde tanto COX-2 como PGE2 presentan un alza en su expresión, al pre-condicionar las MSCs
con estas moléculas pro-inflamatorias.
Tanto HGF como TGF-β son consideradas moléculas inmuno-moduladoras. Di Nicola y col
(2002), describieron que es posible que HGF y TGF-β, medien la inhibición de la proliferación de
linfocitos T de una manera sinérgica, ya que la adición de anticuerpos contra ambas citoquinas a las
células T purificadas en co-cultivo con MSCs humanas, fue capaz de revertir completamente el efecto
inhibitorio de las MSCs sobre la proliferación de células T. Sin embargo, Le Blanc y col (2004),
observaron que la supresión de la proliferación de linfocitos inducidos por las MSCs no se restauró
cuando se inhibieron cada una de las moléculas de forma independiente agregando anticuerpos anti-
HGF y anti-TGF-β. Esto concuerda con lo descrito por Ryan y col (2007), donde demostraron que MSCs
humanas pre-condicionadas con IFN-γ, a pesar de inducir el incremento en la expresión de TGF-β1 y
HGF no modificaron la capacidad de inhibir la proliferación de las células T. En nuestro estudio, si bien
HGF se expresó en todas las condiciones, no se observó un patrón correlacionado a la concentración de
las citoquinas pro-inflamatorias utilizadas. Por otro lado, la expresión de TGF-β fue mayor en las MSCs
control que en aquellas pre-condicionadas con citoquinas pro-inflamatorias. Le Blanc y col (2004),
observaron que en los sobrenadantes obtenidos de ensayos de reacción cruzada de linfocitos (MLR por
sus siglas en inglés), estaban presentes HGF y TGF-β, pero la concentración era similar en cultivos con
o sin MSCs humanas. Esto indicaría que tanto HGF como TGF- β derivaron de linfocitos y no de las
MSCs. Por lo que resulta poco probable que la secreción de HGF o TGF-β por parte de las MSCs sea
responsable de la supresión de la proliferación de linfocitos.
43
Diversos autores señalan que las MSCs en presencia de un estímulo inflamatorio inhiben
significativamente la proliferación de células T (Barminko y col 2013, Carrede y col 2012, Hsu y col
2013). El mecanismo de esta inmunosupresión sigue siendo controversial, sin embargo, se han
descritos algunos mediadores inmuno-supresores implicados (IL-10, TGF-β, PGE2, NO, IDO y HGF). La
expresión de varias de estas moléculas inmunosupresoras, así como de quimioquinas y moléculas de
adhesión, es estimulado en las MSCs por IFN-γ en conjunto con IL-1α, IL-1β o TNF-α, que son
mediadores presentes en entornos inflamatorios, por lo tanto, la actividad supresora de las MSCs
depende la exposición de éstas en un entorno inflamatorio (Cuerquis y col 2014). Se ha descrito que el
IFN-γ es crítico para inducir la inmuno-supresión de las MSCs tanto en ratón como en humanos. En
las MSCs de ratón, la inducción de la principal molécula efectora, NO, requiere la presencia de IFN- γ
en conjunto de TNFα o IL-1 (Ren y col 2008). En cambio, en las MSCs humanas, el IFN-γ por si solo
es capaz de inducir la expresión de IDO, ya que la adición de TNF-α o IL-1 no tiene efecto (Ren y col
2009). Esta información concuerda con lo descrito por Crop y col (2010), donde en su estudio
determinaron que las MSCs humanas derivadas de tejido adiposo pre-tratadas con IFN-γ y TNF-α
inhiben la proliferación de células T más que las MSCs no tratadas. Estos datos sugieren que las MSCs
requieren la activación de mediadores pro-inflamatorios para volverse inmunosupresoras. En nuestro
estudio el pre-condicionamiento de las MSCs, no modificó su capacidad de inhibir la proliferación de
linfocitos a pesar de incrementar significativamente muchas de las moléculas consideradas relevantes
en dicha capacidad. Esto puede deberse a diversos factores, tanto de diseño experimental como de
propiedades relacionada con la potencia de las MSCs. El tiempo en el que se evalúa la proliferación (4
días en el presente estudio) pudiese influir en la determinación del efecto del pre-condicionamiento.
Sin embargo, a pesar de evaluar la proliferación en distintos tiempos (datos no mostrados) el efecto no
mostró diferencias con respecto al co-cultivo con MSCs no pre-condicionadas. Se hace necesario
explorar la concentración de moléculas en el medio de cultivo (PGE2 o kinurenina), con el fin de
determinar si el significativo incremento en la expresión de dichas moléculas posterior al pre-
condicionamiento, se traduce en un incremento en sus concentraciones en el medio.
44
7. CONCLUSIONES
Las MSCs equinas aisladas de médula ósea, son capaces de inhibir la proliferación de linfocitos,
estimulada con un estímulo inespecífico.
El efecto inhibitorio de las MSCs sobre la proliferación de linfocitos depende de la enzima IDO y
de la producción de PGE2, pero no de la actividad de iNOS.
El pre-condicionamiento de las MSCs con citoquinas pro-inflamatorias TNF-α, IFN-γ o su
combinación, induce el incremento en la expresión de IL-6, IDO, iNOS y COX-2.
El pre-condicionamiento de las MSCS con las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α, IFN-γ o su
combinación, no modifica la capacidad de estas de inhibir la proliferación de linfocitos.
45
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