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Efecto del pH y la temperatura
Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos
Semestre 2014-1
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Cooperatividad y alosterismo
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Alostería
Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación
Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad
Alo (otro) Steria (forma)
Kd1Kd2
Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva
Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa
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¿Como medirla?
max1.0_][
max9.0_][
VVaqueproduzcS
VVaqueproduzcSRs
===
Rs = Factor de cooperatividad
max1.0_][ VVaqueproduzcS =
Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81
Demostrar esto
Ejercicio:
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Michaelis Menten
][
][9.0
max
max9.0
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][1.0][1.0
][
][1.0
max
max1.0
SKmS
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][9
][1.09.0
][9.0][9.0
SKm
SKm
SKmS
==
=+
][9
1
][9.01.0
][1.0][1.0
SKm
SKm
SKmS
=
==+
81
9
1
9 ==Km
KmRs
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Efecto del pH
pepsina peroxidasa tripsina fosfatasa alcalina
pH
Vo
2 6 8 10
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¿Porqué?
• ¿Porqué pH optimos diferentes?• ¿Porqué la forma de campana?• ¿Porqué a veces son asimétricos?• ¿Qué controla la anchura?• ¿Qué controla la anchura?Explicación:1. estabilidad de la enzima2. ionización del sustrato, cofactor, buffer, etc.3. Ionización de los grupos de la enzima que
alteran el Km o Vmax
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Estabilidad
• Almacenar a condiciones experimentales (diferentes pH’s, diferentes tiempos), luego hacer el ensayo en condiciones óptimas (sirve para monitorear la óptimas (sirve para monitorear la desnaturalización)
• Duración del comportamiento lineal a [S]>>>Km
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[S]>>>Km
Perdiendo producto
Desviación de lo lineal
Perdiendo
actividadproducto
tiempo
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Posibles resultados
constante
decreciente
creciente
V residualVo
decrecientecampana
pH de almacenamiento
Vo
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¿El pH óptimo dependiente del tiempo?
pH
vEnsayo corto
Ensayo largo
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Ionizaciones
• Buffer• Sustrato• Cofactor• Enzima
HPO4-2 PO4
-3 + H+
SH2 SH- + H+
CoFH CoF- + H+• Enzima
El caso mas interesante, puede ser
o de la enzima libre o del complejo ES
Las proteinas tienen muchos grupos ionizables,
pero solo algunos pocos afectan la actividad,
los que se encuentran en el sitio activo
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Ionizaciones de la enzima
1) Estos son los que se ionizan a pH neutro• Grupo pKa ∆H ionización (Kj)• Cys 8.33 6.5-7.0• Asp 3.86• Asp 3.86• Glu 4.25• Lys 10.53• Arg 12.48 12-13• His 6.0 6.9-7.5� α-carboxilo 2.1-2.3 0� α-amino 9.1-10.8 10-13
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Los pKa se alteran por la polaridad del ambiente
• Ambiente hidrofóbico� forma no cargada
• Cadenas laterales cargadas vecinas �forma cargada�forma cargada
pKa2pKa1
pH
Vo
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2 H+ removibles
S+EH2 EH2S EH2+P
- H+
Posible diagrama de equilibrio
S+EH- EH- S EH- +P
S+E-2 E-2 S E-2 +P
- H+
- H+
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Primero ver catálisis
Vmax
ESH-
¿Cómo?Hacer un experimento a [S]>>>Km, la velocidad es igual a Vmax
ES-2ESH2
pH
Vmax
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Luego ver la unión
Vmax/Km
EH-
Igual hacer un experimento con [S]<<<Km, la velocidad es igual a Vmax/Km
E-2EH2
pH
Vmax/Km
Regla: Una ionización tiene que ver o con catálisis o con unión, no con ambas
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Resultado
S+EH2 EH2S EH2+P
- H+
S+EH- EH- S EH- +P
S+E-2 E-2 S E-2 +P
- H+
- H+
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Efectos de la Temperatura
• Estabilidad de la enzima• Cambios en la solubilidad (sólidos más
solubles a >temp, gases menos solubles a >temp)>temp)
• Ionizaciones de los buffers (Tris varía cerca de 0.03 unidades de pK/oC)
• Efectos en el equilibrio• Efectos en el paso catalítico ES ����E+P
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Dependencia de la temperatura• Aun a pH const y ausencia de
ionizaciones, la vel de la Rx depende de la Temperatura
¿Porqué?
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Gráfica típica de Vo vs T
T optima
desnaturalizacion
Vo
T (oC)
La rx se aceleraAl incrementar T
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Estimación de velocidades a otras temperaturas de las del
ensayo
Q10 = velocidad a (T +10)/ velocidad a T
Predice la velocidad de la reacción a 10, 20, 30 grados,
siempre y cuando no se pase del óptimosiempre y cuando no se pase del óptimo
Para intervalos diferentes de 10 se usa:
∆log velocidad = T/10 log Q10
Enzimas 1.4 <Q10<3.0
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Interpretacion del Q10
T 2 3 4
0 1 1 1
10 2 3 410 2 3 4
20 4 9 16
30 8 27 64
40 16 81 256
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Una rx química
Ea
Energia
Rx
Cambio neto de energia
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Grafica de Arrhenius
-Ea/R
k=Ae -(Ea/RT)
1/T (1/ oK)
ln k
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Catalizada por enzimas
Ed/R
-Ea/R
1/T
ln k
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Magnitud de la velocidad de Rx
Ea(Kcal/mol)
catalizador Velocidad relativa(25oC)
18 ninguno 1
13.5 I- 2.07 x 103
6.4 catalasa 3.47 x 108
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La Ea se relaciona un poco con el Q10
Ea(Kcal/mol)
Q10
6 ≈1.46 ≈1.4
12 2
18 3
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Para determinar Ea• Usamos• Sacamos log de cada lado
k=Ae -(Ea/RT)
ln k= ln A - (Ea/RT)
• Por lo que una gráfica de ln k contra 1/T, nos dará una línea recta con pendiente –Ea/R
• La constante de los gases (R) está en energía/mol °, por lo que Ea/RT es sin unidades (Ea es energía/mol)
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Uso
• la ecuación de Arrhenius predice las tasas de reacción a diferentes temperaturas y usa un parámetro para entender de manera intuitiva la dependencia de la manera intuitiva la dependencia de la reacción en la temperatura, pero no nos dice cómo…
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Teoría de colisiones
• Donde P representa la probabilidad de que una colisión tenga la correcta orientación para producir una reacción y zes la energía cinética
k=Pz e -(Ea/RT)
es la energía cinética• No todas las colisiones son productivas• De donde viene la dependencia de la
temp?– La energía cinética es proporcional a la temp
absoluta– A 0°K la energía cinética es 0
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Intermedio “la ecuación de Boltzman”
Es idéntica a la ecuación de Arrhenius, solo que la kB está en energía/molécula gradoEn lugar de energía /mol grado
Entonces, la constante k es proporcional a la población de moléculasque tienen cierta energía (Ea), por encima del estado basal
Esta energía proviene de las COLISIONES activadas por la temperatura
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De donde viene la dependencia de la temperatura?
– La energía cinética es proporcional a la temp absoluta
– A 0°K la energía cinética es 0– Conforme se incrementa la temperatura se dá – Conforme se incrementa la temperatura se dá
un incremento fraccional – De 20°a 30° 10/293 cerca de 3% – (muy poco)
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Que tal del exponente? Asumir Ea = 12 Kcal/mol
Un incremento del doble!!
Obviamente, la dependencia de la temperatura de debe al términoexponencial
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Teoría de Eyring
K= (KBT/h)e(-∆G*/RT)
KB constante de Boltzmann= 1.38 x 10-16 erg/o
h constante de Planck = 6.624 x 10 –27 erg sR constante de los gases = 1.98 cal/mol o
∆G* es la energia libre de activacion
kBT/h tiene unidades de (erg/o)o / erg s = 1/s “por segundo”Unidades de frecuencia vibratoria o Hertz“La velocidad a la cual el estado de transicion desaparece yse convierte en producto”
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¿Cómo calcular los parámetros termodinámicos?
-(∆H*/R)y ∆S* se calcula de
∆S*=(∆H*-∆G*)/T
∆G*= ∆H*-T ∆S*
1/T
ln k/T
∆S*=(∆H*-∆G*)/T
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Breve paréntesis termodinámico
∆G°=-RT ln Keq∆G°= ∆H°-T ∆S°Por lo que:
∆ ∆-RT ln Keq= ∆H°-T ∆S°y ln Keq= (∆H°/ RT)- ( ∆S°/R), así que se
puede graficar ln Keq vs 1/T y la pendiente será -∆H°/ R
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-(∆H*/R)
1/T
ln Keq