efecto del consumo de soja en la longevidad de
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FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA
EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA EN LA
LONGEVIDAD DE RATONES OF1 MACHOS
TESIS DOCTORAL
Presentada por:
Kheira Mohamed Abdelaziz
Dirigida por:
Prof. D. Jos Via Ribes
Prof. Da. Consuelo Borrs Blasco
Prof. D. Juan Gambini Buchn
Valencia, 2013
La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiacin obtenida
del siguiente proyecto y beca:
Ministerio de Ciencias e Innovacin. Plan Nacional de I+D+I 2008-
2011. Proyectos de Investigacin Fundamental (113819516-19516-4-10).
Titulado: Modulacin de los genes de longevidad y su importancia en la
prevencin de enfermedades asociadas al envejecimiento.
Beca de la Agencia Espaola de Cooperacin Internacional para el
Desarrollo (AECID).
FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA
Prof. D. Jos Via Ribes, Catedrtico del Departamento de Fisiologa de la
Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de Valencia.
Prof. Da. Consuelo Borrs Blasco, Profesora del Departamento de
Fisiologa de la Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de
Valencia.
Prof. D. Juan Gambini Buchn, Profesor del Departamento de Fisiologa de
la Facultad de Medicina y Odontologa de la Universidad de Valencia.
CERTIFICAN:
Que Da Kheira Mohamed Abdelaziz, Graduada en Nutricin Humana y
Diettica por la Universidad de Alicante, ha realizado bajo su direccin la
presente tesis titulada:
EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA EN LA
LONGEVIDAD DE RATONES OF1 MACHOS
Para la obtencin del ttulo de Doctor
Y para que conste a los efectos oportunos, firman la presente certificacin.
Valencia, 2013
Fdo. D. Jos Via Ribes Fdo. Da. Consuelo Borrs Blasco Fdo. D. Juan Gambini Buchn
A MI FAMILIA EN PARTICULAR
AL PUEBLO SAHARAUI EN GENERAL
Me hara falta el espacio equivalente a esta tesis para poderle agradecer a tanta gente, con sus nombres propios, el haberme
brindado su apoyo.
As que simplemente, de todo corazn, gracias a todos los que de alguna manera habis hecho posible la realizacin de este
sueo.
En definitiva, gracias a Dios por la oportunidad y la bendicin de contar con las mejores personas tanto en lo personal
como en lo profesional.
NDICE GENERAL
ndice
III
1 INTRODUCCIN ...................................................................................... 1
1.1 LONGEVIDAD .................................................................................................... 3
1.2 EL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ....................................................... 7
1.2.1 Concepto de envejecimiento ............................................................................ 7
1.2.2 Consecuencias del envejecimiento ................................................................... 9
1.3 TEORAS DEL ENVEJECIMIENTO ........................................................... 10
1.4 TEORA DE LOS RADICALES LIBRES EN EL ENVEJECIMIENTO11
1.4.1 Radicales libres .................................................................................................. 12
1.4.1.1 Concepto y origen de radical libre ........................................................ 12
1.4.1.2 Clases de Radicales libres ....................................................................... 14
1.4.2 Gnesis de ROS ................................................................................................ 17
1.4.3 Estrs oxidativo ................................................................................................ 18
1.4.3.1 Concepto .................................................................................................. 18
1.4.3.2 Estrs oxidativo y dao a biomolculas ............................................... 19
1.4.3.3 Indicadores de estrs oxidativo ............................................................. 22
1.5 TEORA MITOCONDRIAL DE LOS RADICALES LIBRES EN EL
ENVEJECIMIENTO ....................................................................................................... 24
1.5.1 Historia ............................................................................................................... 24
1.5.2 La mitocondria .................................................................................................. 26
1.5.2.1 La mitocondria: estructura y funcin ................................................... 26
1.5.2.2 Produccin de radicales libres en los distintos estados
mitocondriales ............................................................................................................ 29
1.5.2.3 Otras acciones de las mitocondrias ...................................................... 31
1.6 ANTIOXIDANTES FISIOLGICOS ........................................................... 32
ndice .
IV
1.6.1 Antioxidantes enzimticos .............................................................................. 34
1.6.1.1 Superxido dismutasa (SOD) ................................................................ 34
1.6.1.2 Glutatin peroxidasa (GPx) ................................................................... 35
1.6.1.3 Catalasa ..................................................................................................... 35
1.6.2 Antioxidantes no enzimticos ........................................................................ 35
1.6.2.1 Flavonoides .............................................................................................. 36
1.6.3 Efecto de los antioxidantes sobre la longevidad ......................................... 37
1.7 ESTRGENOS ................................................................................................... 38
1.7.1 Definicin, tipos y mecanismo de accin ..................................................... 38
1.7.2 Accin de los estrgenos sobre las mitocondrias ........................................ 40
1.7.3 Propiedades antioxidantes de los estrgenos ............................................... 41
1.7.4 Teraputica hormonal sustitutiva ................................................................... 43
1.7.5 La doble cara de los estrgenos: efectos beneficiosos y perjudiciales ..... 43
1.7.6 Estrgenos y longevidad ................................................................................. 45
1.7.7 SERMs: moduladores selectivos del receptor de estrgeno ...................... 46
1.8 FITOESTRGENOS ......................................................................................... 47
1.8.1 Definicin y clasificacin ................................................................................ 47
1.8.2 Isoflavonas ......................................................................................................... 49
1.8.3 Historia ............................................................................................................... 49
1.8.4 Epidemiologa ................................................................................................... 50
1.8.5 Mecanismo de accin ....................................................................................... 51
1.8.6 Farmacocintica de los fitoestrgenos .......................................................... 53
1.8.7 Fitoestrgenos como antioxidantes ............................................................... 56
ndice
V
1.8.8 Potenciales efectos de los fitoestrgenos sobre la salud ............................ 57
1.8.9 Fitoestrgenos y longevidad ........................................................................... 62
2 OBJETIVOS ...............................................................................................63
2.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................... 65
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................ 65
3 MATERIALES Y MTODOS ...................................................................67
3.1 MATERIALES ..................................................................................................... 69
3.1.1 Animales de experimentacin ......................................................................... 69
3.1.2 Aparatos ............................................................................................................. 71
3.1.3 Reactivos ............................................................................................................ 76
3.2 MTODOS ........................................................................................................... 78
3.2.1 Curva de longevidad en ratones OF1 machos ............................................. 78
3.2.2 Control de la ingesta de comida y del peso corporal .................................. 78
3.2.3 Sacrificio de los animales. Extraccin y conservacin de muestras ......... 79
3.2.4 Determinacin de la concentracin de isoflavonas en plasma .................. 80
3.2.5 Aislamiento de mitocondrias hepticas ......................................................... 83
3.2.6 Determinacin del perfil metablico en plasma y en mitocondrias
hepticas aisladas, mediante resonancia magntica nuclear (1H RMN) ................. 85
3.2.7 Determinacin de la tasa de produccin mitocondrial de perxido de
hidrgeno ......................................................................................................................... 88
3.2.8 Determinacin de los niveles de peroxidacin lipdica en mitocondrias
hepticas aisladas ............................................................................................................ 92
3.2.9 Determinacin de la concentracin de protenas ........................................ 96
3.2.9.1 Mtodo de Lowry .................................................................................... 96
ndice .
VI
3.2.9.2 Mtodo de Bradford ............................................................................... 98
3.2.10 Western blotting .................................................................................................... 99
3.2.11 Western blotting de protenas oxidadas ........................................................... 104
3.2.12 Aislamiento de RNA ...................................................................................... 107
3.2.13 Retrotranscripcin-Amplificacin del RNA (RT-PCR) en tiempo real. 109
3.2.13.1 Sntesis de cDNA: Retrotranscripcin (RT) ..................................... 110
3.2.13.2 Amplificacin cuantitativa del RNA (RT-PCR a tiempo real) ....... 112
3.2.14 Actividad enzimtica ...................................................................................... 117
3.2.14.1 Glutatin peroxidasa ............................................................................. 117
3.2.14.2 Manganeso superxido dismutasa ...................................................... 120
3.2.15 Determinacin del consumo de glucosa in vivo mediante Tomografa de
Emisin de Positrones (PET) .................................................................................... 123
3.2.16 Test de Tolerancia a la Glucosa Oral (TTGO) .......................................... 128
3.2.17 Aclaramiento heptico ................................................................................... 129
3.2.18 Test de reconocimiento de objetos nuevos ................................................ 130
3.2.19 Coordinacin motora ..................................................................................... 132
3.2.20 Fuerza de agarre de los miembros anteriores............................................. 133
3.2.21 Anlisis estadstico de los resultados ........................................................... 135
4 RESULTADOS......................................................................................... 137
4.1 CURVA DE SUPERVIVENCIA DE RATONES OF1 MACHOS
ALIMENTADOS CON DIETA RICA O SIN SOJA .............................................. 139
4.2 CONCENTRACIN DE ISOFLAVONAS EN PLASMA ..................... 142
4.3 PERFIL METABLICO EN PLASMA Y MITOCONDRIAS
HEPTICAS MEDIANTE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR (1H
RMN) ................................................................................................................................ 145
ndice
VII
4.4 CONSUMO Y PESO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS
CON DIETA RICA EN SOJA O SIN SOJA ............................................................ 147
4.5 PRODUCCIN DE PERXIDO DE HIDRGENO EN
MITOCONDRIAS AISLADAS DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS
ALIMENTADOS CON O SIN SOJA ........................................................................ 149
4.6 NIVELES DE PEROXIDACIN LIPDICA EN MITOCONDRIAS
AISLADAS DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS
CON O SIN SOJA ........................................................................................................... 153
4.7 PROTENAS CARBONILADAS EN MITOCONDRIAS AISLADAS
DE HGADO DE RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN
SOJA ................................................................................................................................ 156
4.8 ANLISIS DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN HGADO DE
RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN SOJA..................... 159
4.8.1 Glutatin peroxidasa ...................................................................................... 159
4.8.1.1 Niveles del mRNA de la GPx ............................................................. 159
4.8.1.2 Niveles de la protena GPx .................................................................. 161
4.8.1.3 Actividad de la enzima GPx ................................................................ 164
4.8.2 Superxido dismutasa .................................................................................... 166
4.8.2.1 Niveles del mRNA de MnSOD .......................................................... 166
4.8.2.2 Niveles de la protena MnSOD ........................................................... 169
4.8.2.3 Actividad enzimtica de MnSOD ....................................................... 171
4.9 DETERMINACIN DEL CONSUMO DE GLUCOSA CEREBRAL IN
VIVO MEDIANTE PET .............................................................................................. 173
4.10 TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL EN RATONES OF1
MACHOS ALIMENTADOS CON DIETA CON O SIN SOJA .......................... 176
4.11 ACLARAMIENTO HEPTICO EN RATONES OF1 MACHOS
ALIMENTADOS CON O SIN SOJA ........................................................................ 177
ndice .
VIII
4.12 RECONOCIMIENTO DE OBJETOS NUEVOS DE RATONES OF1
MACHOS ALIMENTADOS CON O SIN SOJA .................................................... 179
4.13 COORDINACIN MOTORA DE RATONES OF1 MACHOS
ALIMENTADOS CON DIETA CON O SIN SOJA .............................................. 181
4.14 FUERZA DE AGARRE DE LOS MIEMBROS ANTERIORES DE
RATONES OF1 MACHOS ALIMENTADO CON O SIN SOJA ....................... 182
5 DISCUSIN ............................................................................................. 183
5.1 JUSTIFICACIN DEL ESTUDIO ............................................................... 185
5.2 CONCENTRACIN DE ISOFLAVONAS EN PLASMA ..................... 187
5.3 PERFIL METABLICO ................................................................................. 188
5.4 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA LONGEVIDAD . 189
5.5 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA INGESTA DE
ALIMENTOS Y EL PESO CORPORAL .................................................................. 191
5.6 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE
PARMETROS DE ESTRS OXIDATIVO ........................................................... 193
5.6.1 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la produccin de H2O2 en
mitocondrias hepticas aisladas .................................................................................. 193
5.6.2 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la peroxidacin lipdica en
mitocondrias hepticas aisladas .................................................................................. 194
5.6.3 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre la oxidacin proteica en
mitocondrias hepticas aisladas .................................................................................. 196
5.7 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE
ANTIOXIDANTES ENZIMTICOS ....................................................................... 197
5.7.1 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre los niveles del mRNA
niveles proteicos y actividad enzimtica de GPx .................................................... 197
5.7.2 Efecto de la edad y el consumo de soja sobre los niveles del mRNA,
niveles proteicos y actividad enzimtica de MnSOD ............................................. 198
ndice
IX
5.8 EFECTO DE LA EDAD Y LA SOJA SOBRE EL CONSUMO
CEREBRAL DE GLUCOSA IN VIVO ..................................................................... 200
5.9 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA TOLERANCIA A
LA GLUCOSA Y LA FUNCIN HEPTICA ........................................................ 201
5.9.1 Efecto de la edad y la soja sobre la tolerancia a la glucosa ...................... 201
5.9.2 Efecto del consumo de soja sobre la funcin heptica ............................ 202
5.10 EFECTO DE LA EDAD Y EL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA
MEMORIA Y EL APRENDIZAJE ............................................................................. 203
5.11 EFECTO DEL CONSUMO DE SOJA SOBRE LA COORDINACIN
MOTORA Y FUERZA MUSCULAR ......................................................................... 204
5.12 LIMITACIONES DEL ESTUDIO ................................................................ 205
6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSSION .................................... 207
6.1 BACKGROUND AND JUSTIFICATION OF STUDY .......................... 209
6.2 PLASMA CONCENTRATION OF ISOFLAVONES .............................. 210
6.3 METABOLIC PROFILE BY NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE
(1H NMR) .......................................................................................................................... 213
6.4 THE EFFECT OF LIFELONG SOYA FEEDING ON LONGEVITY216
6.5 FOOD INTAKE AND BODY WEIGHT ................................................... 217
6.6 EFFECT OF AGING AND SOYA INTAKE ON OXIDATIVE
DAMAGE ......................................................................................................................... 220
6.6.1 Hydrogen peroxide production by isolated liver mitochondria .............. 221
6.6.2 Oxidative damage to macromolecules ........................................................ 223
6.7 EFFECT OF AGING AND SOYA INTAKE ON ANTIOXIDANT
DEFENSE......................................................................................................................... 229
6.7.1 Glutathione peroxidase .................................................................................. 230
6.7.2 Manganese superoxide dismutase ................................................................ 235
ndice .
X
6.8 EFFECT OF AGING AND SOYA CONSUMPTION ON GLUCOSE
UPTAKE BY THE BRAIN IN VIVO ....................................................................... 240
6.9 EFFECT OF SOYA ON GLUCOSE TOLERANCE AND HEPATIC
FUNCTION...................................................................................................................... 243
6.9.1 Oral glucose tolerance ................................................................................... 243
6.9.2 Hepatic function ............................................................................................. 245
6.10 BEHAVIORAL AND MOTOR FUNCTION TESTING........................ 246
6.10.1 Novel objects recognition ............................................................................. 246
6.10.2 Motor coordination and grip strength ........................................................ 247
6.11 LIMITATIONS OF THE STUDY ................................................................. 249
7 CONCLUSIONES ................................................................................... 251
7.1 CONCLUSIN GENERAL ........................................................................... 253
7.2 CONCLUSIONES ESPECFICAS ................................................................ 253
8 CONCLUSIONS ...................................................................................... 255
8.1 MAIN CONCLUSION ..................................................................................... 257
8.2 SPECIFIC CONCLUSIONS ........................................................................... 257
9 ANEXOS .................................................................................................. 259
9.1 ACRNIMOS Y ABREVIATURAS ............................................................. 261
10 BIBLIOGRAFA ...................................................................................... 265
NDICE DE TABLAS
ndice de tablas
XIII
1 INTRODUCCIN
Tabla 1.1.- Vida media de radicales libres. ............................................................................. 13
Tabla 1.2.- Especies activadas del oxgeno y nitrgeno. ..................................................... 14
Tabla 1.3.- Tipos de SOD y localizacin celular mayoritaria. ............................................ 34
Tabla 1.4.- Clasificacin y origen de los principales fitoestrgenos. ................................. 48
3 MATERIALES Y MTODOS
Tabla 3.1.- Composicin de las dietas. ................................................................................... 70
Tabla 3.2.- Resumen del procesamiento de los animales de la curva de longevidad. ..... 78
Tabla 3.3.- Reactivos utilizados para la realizacin de la recta patrn del nivel de
perxidos. .......................................................................................................................... 91
Tabla 3.4.- Descripcin de los anticuerpos utilizados para Western blotting. ................... 104
Tabla 3.5.- Secuencia de los oligos utilizados en la RT-PCR. .......................................... 115
Tabla 3.6.- Condiciones del termociclador para la RT-PCR. ........................................... 116
Tabla 3.7.- Recta estndar de la SOD. ................................................................................. 122
4 RESULTADOS
Tabla 4.1.1.- Concentracin de genistena, daidzena y equol en plasma de ratones
alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ............................................................. 143
Tabla 4.1.2.- Concentracin total de genistena, daidzena y equol en plasma de ratones
alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ............................................................. 144
6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSION
Table 6.1.1.- Concentration of isoflavones in plasma of male OF1 mice fed with soya-
free or soya-rich diet. ..................................................................................................... 211
Table 6.1.2.- Total concentration of isoflavones in plasma of male OF1 mice fed with
soya-free or soya-rich diet. ............................................................................................ 212
NDICE DE FIGURAS
ndice de figuras
XVII
1 INTRODUCCIN
Figura 1.1.- Modificada de CUTLER RG (1990). ................................................................... 4
Figura 1.2.- Perfil de supervivencia en distintas especies (Kaeberlein et al., 2001)............ 6
Figura 1.3.- Teoras del envejecimiento. Clasificacin (Vina et al., 2007a) ...................... 10
Figura 1.4.- Control de la longevidad por el estrs oxidativo mitocondrial (Sastre et al.,
2003). .................................................................................................................................. 25
Figura 1.5.- Esquema de la cadena de transporte electrnico mitocondrial. ................... 28
Figura 1.6.- Control respiratorio mitocondrial. .................................................................... 30
Figura 1.7.- Estructura bsica de los flavonoides. ................................................................ 37
Figura 1.8.- Distribucin de receptores estrognicos (Setchell et al., 1999). ................... 40
Figura 1.9- Mecanismo de accin propuesto por Borrs et al (Borras et al., 2005). ....... 42
Figura 1.10- Efectos beneficiosos y perjudiciales de los estrgenos. ................................ 44
Figura 1.11.- Modulador selectivo ideal del receptor estrognico. .................................... 46
Figura 1.12.- Similitud estructural entre el 17-estradiol y la isoflavona genistena. ...... 48
Figura 1.13.- Estructura qumica de las tres principales isoflavonas y sus conjugados. . 54
Figura 1.14.- Mecanismo de sobre-expresin de genes antioxidantes por fitoestrgenos.
............................................................................................................................................. 57
3 MATERIALES Y MTODOS
Figura 3.1.- Esquema de deteccin de perxido de hidrgeno. ......................................... 88
Figura 3.2.- Esquema de western blotting. ............................................................................... 103
Figura 3.3.- Modelo de amplificacin de PCR a tiempo real. ........................................... 114
Figura 3.4.- Esquema del ensayo Superxido Dismutasa. ................................................ 120
Figura 3.5.- Molcula de 18F-FDG y esquema de su consumo en la clula. .................. 124
Figura 3.6.- Esquema de deteccin de coincidencias por el equipo PET-CT Albira ARS.
........................................................................................................................................... 125
Figura 3.7.- Test de reconocimiento de objetos nuevos. .................................................. 130
Figura 3.8.- Coordinacin motora. ....................................................................................... 132
Figura 3.9.- Test de fuerza de agarre. ................................................................................... 134
ndice de figuras .
XVIII
4 RESULTADOS
Figura 4.1.- Curva de longevidad de ratones OF1 machos alimentados con dieta rica en
soja o sin soja. ................................................................................................................. 141
Figura 4.2.1.- Puntuaciones del PCA realizado para comparar el metaboloma del plasma
de ratones alimentados con dieta rica en soja o sin soja. ......................................... 146
Figura 4.2.2.- Puntuaciones del PCA realizado para comparar el metaboloma de las
mitocondrias hepticas de ratones alimentados con dieta rica en soja o sin soja. 147
Figura 4.3.- Diferencias en la ingesta semanal de ratones que consumen dieta rica en
soja o sin soja. ................................................................................................................. 148
Figura 4.4.- Diferencias en el peso de los ratones alimentados con o sin soja. ............. 149
Figura 4.5.1.- Produccin de perxido de hidrgeno en mitocondrias aisladas de hgado
de ratones alimentados con dieta sin soja. ................................................................. 151
Figura 4.5.2.- Produccin de perxido de hidrgeno en mitocondrias aisladas de hgado
de ratones alimentados con dieta rica en soja. ........................................................... 151
Figura 4.5.3.- Produccin de perxido de hidrgeno en mitocondrias aisladas de hgado
de ratones alimentados con y sin soja. ........................................................................ 152
Figura 4.6.1.- Niveles de MDA en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 153
Figura 4.6.2.- Niveles de MDA en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 154
Figura 4.6.3.- Niveles de MDA en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con y sin soja............................................................................................. 155
Figura 4.7.1.- Protenas carboniladas en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 157
Figura 4.7.2.- Protenas carboniladas en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 157
Figura 4.7.3.- Protenas carboniladas en mitocondrias aisladas de hgado de ratones
alimentados con y sin soja............................................................................................. 158
ndice de figuras
XIX
Figura 4.8.1. a.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 160
Figura 4.8.1. b.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 160
Figura 4.8.1. c.- Niveles del mRNA de la GPx en hgado de ratones OF1 machos. .... 161
Figura 4.8.2. a.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 162
Figura 4.8.2. b.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 162
Figura 4.8.2. c.- Niveles de la protena GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con o sin soja. ........................................................................................... 163
Figura 4.8.3. a.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 164
Figura 4.8.3. b.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 164
Figura 4.8.3. c.- Actividad enzimtica de GPx en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con o sin soja. ........................................................................................... 165
Figura 4.8.4. a.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 166
Figura 4.8.4. b.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 167
Figura 4.8.4. c.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos.
........................................................................................................................................... 168
Figura 4.8.5. a.- Niveles de la protena MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 169
Figura 4.8.5. b.- Niveles de la protena MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 169
Figura 4.8.5. c.- Niveles del mRNA de la MnSOD en hgado de ratones OF1 machos.
........................................................................................................................................... 170
ndice de figuras .
XX
Figura 4.8.6. a.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta sin soja. ..................................................................................... 171
Figura 4.8.6. b.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica en soja. .............................................................................. 172
Figura 4.8.6. c.- Actividad enzimtica de MnSOD en hgado de ratones OF1 machos
alimentados con o sin soja ............................................................................................ 172
Figura 4.9.1.- Consumo cerebral de glucosa in vivo de ratones OF1 machos alimentados
con dieta sin soja. ........................................................................................................... 174
Figura 4.9.2.- Consumo cerebral de glucosa in vivo de ratones OF1 machos alimentados
con dieta rica en soja. ..................................................................................................... 175
Figura 4.9.3.- Consumo cerebral de glucosa in vivo de ratones OF1 machos alimentados
con o sin soja. ................................................................................................................. 175
Figura 4.10.1.- Test de Tolerancia a la Glucosa Oral en ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica o sin soja. .......................................................................... 176
Figura 4.10.2.- Test de Tolerancia a la Glucosa Oral en ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica o sin soja. .......................................................................... 177
Figura 4.11.- Tiempo de parlisis muscular con Zoxazolamina de ratones OF1 machos
alimentados con dieta rica o sin soja. .......................................................................... 178
Figura 4.12.1.- Reconocimiento de objetos nuevos a la hora. .......................................... 180
Figura 4.12.2.- Reconocimiento de objetos nuevos a las 24 horas. ................................. 180
Figura 4.13.- Coordinacin motora de ratones OF1 machos alimentados con o sin soja.
........................................................................................................................................... 181
Figura 4.14.- Test de fuerza de agarre de los miembros anteriores. ................................ 182
ndice de figuras
XXI
6 SUMMARY OF RESULTS AND DISCUSION
Figure 6.1.1.- Scores plot for the Principal Components Analysis of NMR spectra of
plasma of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. ............................. 214
Figure 6.1.2.- Scores plot for the Principal Components Analysis of NMR spectra of
hepatic mitochondria of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. .... 215
Figure 6.2.- The survival curve of male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet.
........................................................................................................................................... 216
Figure 6.3.- Differences in weekly food intake between male OF1 mice fed with soya-
free or soya-rich diet. ..................................................................................................... 218
Figure 6.4.- Differences in body weight between male OF1 mice fed with soya-free or
soya-rich diet. .................................................................................................................. 219
Figure 6.5.1.- Hydrogen peroxide production in isolated mitochondria from liver of
male OF1 mice fed with soya-free diet. ...................................................................... 222
Figure 6.5.2.- Hydrogen peroxide production in isolated mitochondria from liver of
male OF1 mice fed with soya-rich diet. ...................................................................... 222
Figure 6.5.3.- Hydrogen peroxide production in isolated mitochondria from liver of
male OF1 mice fed with soya-free or soya-rich diet. ................................................ 223
Figure 6.6.1.- Lipid peroxidation levels (MDA) in hepatic mitochondria from male OF1
mice fed with soya-free diet. ......................................................................................... 225
Figure 6.6.2.- Lipid peroxidation levels (MDA) in hepatic mitochondria from male OF1
mice fed with soya-rich diet. ......................................................................................... 225
Figure 6.6.3.- Lipid peroxidation levels (MDA) in hepatic mitochondria from male OF1
mice fed with soya-free or soya-rich diet. ................................................................... 226
Figure 6.7.1.- Protein carbonylation in hepatic mitochondria from male OF1 mice fed
with soya-free diet. ......................................................................................................... 227
Figure 6.7.2.- Protein carbonylation in hepatic mitochondria from male OF1 mice fed
with soya-rich diet. ......................................................................................................... 227
Figure 6.7.3.- Protein carbonylation in hepatic mitochondria from male OF1 mice fed
with soya-free or soya-rich diet. ................................................................................... 228
ndice de figuras .
XXII
Figure 6.8.1. a.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free diet.
........................................................................................................................................... 230
Figure 6.8.1. b.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-rich diet.
........................................................................................................................................... 231
Figure 6.8.1. c.- mRNA levels of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free or
soya-rich diet. .................................................................................................................. 233
Figure 6.8.2. a.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free
diet. ................................................................................................................................... 231
Figure 6.8.2. b.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-
rich diet. ........................................................................................................................... 232
Figure 6.8.2. c.- Protein expression of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free
or soya-rich diet. ............................................................................................................. 234
Figure 6.8.3. a.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free
diet. ................................................................................................................................... 232
Figure 6.8.3. b.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-rich
diet. ................................................................................................................................... 233
Figure 6.8.3. c.- Enzymatic activity of GPx in liver of male OF1 mice fed with soya-free
or soya-rich diet. ............................................................................................................. 234
Figure 6.8.4. a.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-free
diet. ................................................................................................................................... 235
Figure 6.8.4. b.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-rich
diet. ................................................................................................................................... 236
Figure 6.8.4. c.- mRNA levels of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-free
or soya-rich diet. ............................................................................................................. 236
Figure 6.8.5. a.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with
soya-free diet. .................................................................................................................. 237
Figure 6.8.5. b.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with
soya-rich diet. .................................................................................................................. 237
Figure 6.8.5. c.- Protein expression of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with
soya-free or soya-rich diet. ............................................................................................ 239
ndice de figuras
XXIII
Figure 6.8.6. a.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-
free diet. ........................................................................................................................... 238
Figure 6.8.6. b.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with
soya-rich diet. .................................................................................................................. 238
Figure 6.8.6. c.- Enzymatic activity of MnSOD in liver of male OF1 mice fed with soya-
free or soya-rich diet. ..................................................................................................... 239
Figure 6.9.1.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-free diet. . 241
Figure 6.9.2.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-rich diet. . 241
Figure 6.9.3.- in vivo brain glucose uptake of male OF1 mice fed with soya-free or soya-
rich diet. ........................................................................................................................... 242
Figure 6.10.1.- Blood glucose curves during OGTT in male OF1 mice fed with soya-
free and soya-rich diet, at 50% survival. ..................................................................... 244
Figure 6.10.2.- Blood glucose curves during OGTT in male OF1 mice fed with soya-
free and soya-rich diet, at 10% survival. ..................................................................... 244
Figure 6.11.- Time of recovery from the muscular paralysis male OF1 mice fed with
soya-free and soya-rich diet. ......................................................................................... 245
Figure 6.12.1.- Percentage of visits in NOR test after 1 hour. ......................................... 246
Figure 6.12.2.- Percentage of visits in NOR test after 24 hours. ..................................... 247
Figure 6.13.- Muscular coordination in male OF1 mice fed soya-free diet o soya-rich
diet. ................................................................................................................................... 248
Figure 6.14.- Grip strength in male OF1 mice fed soya-free diet o soya-rich diet. ...... 248
INTRODUCCIN1
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 3
1.1 LONGEVIDAD
El trmino longevidad hace referencia a la esperanza de vida que tienen
los individuos de una determinada especie al nacer. ste incluye dos conceptos
diferentes: longevidad media y longevidad mxima (Lopez-Torres et al., 1991).
La longevidad media corresponde a un dato estadstico en el cual el 50% de la
poblacin permanece viva y la longevidad mxima corresponde a la edad del
individuo ms longevo de dicha especie.
Si nos referimos a la especie humana vemos que, mientras la longevidad
mxima ha permanecido sustancialmente sin cambio durante los ltimos
100.000 aos (en~125 aos), la longevidad media ha aumentado sensiblemente
(~27 aos a lo largo del siglo pasado) especialmente en los pases occidentales
(Hayflick 2000). Este aumento en la vida media, figura 1.1, se debe
principalmente, a los hbitos saludables, la adecuada nutricin e higiene, el
diagnostico precoz de enfermedades y el descubrimiento de los antibiticos y las
vacunas (Hayflick 2000).
Como consecuencia de ello se ha producido un crecimiento del
segmento poblacional de avanzada edad, hecho por el que cobran gran
importancia actual las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad
de Alzheimer, los cnceres, la aterosclerosis, y en general, todas aquellas
enfermedades que afectan con ms probabilidad a este sector de la poblacin.
Introduccin -
4 Tesis Doctoral
Figura 1.1.- Modificada de CUTLER RG (1990).
En este sentido, desde que el hombre es consciente de su evolucin ha
intentado prolongar su vida e incluso inmortalizarla. Sin embargo, una vez
desechada la quimera de la inmortalidad, se ha centrado en el objetivo de
incrementar su supervivencia con mejores condiciones fsicas y mentales.
Hasta la actualidad, existen tres regmenes conocidos que pueden
incrementar la expectativa de vida animal: (1) disminucin de la temperatura
ambiente en poiquilotermos (animales de sangre fra) y mamferos que hibernan
y (2) una disminucin de la actividad fsica en los poiquilotermos, ambos
disminuyen la tasa metablica, y (3) la restriccin calrica (Sohal et al., 1996; Lee
et al., 1999). De modo que un descenso de un 10% de la temperatura ambiente,
o bien la eliminacin de la capacidad de vuelo en la mosca comn, incrementan
la expectativa de vida en un 2.5 veces (Farmer et al., 1987). Ambas
modificaciones consiguen rebajar el consumo metablico y se acompaan de un
descenso en la produccin de radicales libres y del dao oxidativo que puedan
sufrir las protenas y el DNA.
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 5
Respecto a la restriccin calrica, ya en 1934, McCay y colaboradores,
revisado por Swan en 1997 (Swan 1997), describen este fenmeno. Ms
recientemente, Weindruch y Walford en 1982 descubren que se puede aumentar
la longevidad mxima con una restriccin calrica que no necesariamente debe
darse desde el nacimiento, sino que puede comenzar tardamente en la vida,
siempre y cuando no llegue a la desnutricin, mantenindose unos niveles
adecuados de vitaminas, minerales y protenas (Weindruch et al., 1982; Colman
et al., 2009). Los animales sometidos a la restriccin calrica, siempre y cuando
no presenten ningn dficit en macro ni micronutrientes, ven incrementada su
supervivencia hasta en un 50% en ratones, y en primates produce una reduccin
de la temperatura corporal y del gasto energtico (Walford et al., 1995;
Weindruch 1996b; Bordone et al., 2005). La restriccin calrica tambin podra
reducir la incidencia de enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo
diabetes, cncer, enfermedades cardiovasculares, atrofia cerebral, deficiencias
inmunitarias en los monos Rhesus (Roth et al., 2004; Colman et al., 2009).
Un estudio reciente realizado por el grupo de Rafael de Cabo rechaza el
efecto beneficioso de la restriccin calrica sobre la longevidad, al menos en
monos Rhesus. No obstante, s destaca sus efectos positivos sobre parmetros
asociados con enfermedades tpicas del envejecimiento, como las metablicas
(diabetes, obesidad), las cardiovasculares y el cncer (Mattison et al., 2012).
Posibles razones de la variacin en el efecto de la restriccin calrica
sobre la longevidad de los monos son la composicin de la dieta y la gentica de
los monos estudiados (Mattison et al., 2012).
Los investigadores que estudian la restriccin calrica en ratones se han
acostumbrado a resultados contradictorios, que atribuyen a la diversidad
gentica entre las cepas (Harper et al., 2006).
As, cabe destacar que existen factores intrnsecos y extrnsecos que
pueden afectar a las diferentes longevidades entre individuos. De modo que los
factores extrnsecos afectaran principalmente a la vida media, por ejemplo un
hbito de vida saludable est correlacionado con una mayor probabilidad de
Introduccin -
6 Tesis Doctoral
supervivencia. Sin embargo, en la vida mxima estn ms implicados los factores
intrnsecos, eso lo podemos observar en la figura 1.2 que representa la
supervivencia como un parmetro especfico de cada especie, en el que
claramente existe una implicacin gentica que explicara las diferentes tasas de
supervivencia.
Figura 1.2.- Perfil de supervivencia en distintas especies (Kaeberlein et al., 2001).
Incluso, dentro de la misma especie el factor gentico es el que
condiciona la respuesta del individuo frente a las influencias exgenas,
conduciendo a una mayor predisposicin frente a patologas y finalmente la
muerte, determinando as la longevidad del individuo (Ginaldi et al., 2000). De
ah la idea de que la alteracin de la homeostasia en el organismo envejecido es
una consecuencia gentica.
No obstante, aunque en un principio el componente gentico recibi la
mayor atencin en las diferencias de longevidad entre individuos (Begun et al.,
2000), los mecanismos epigenticos han emergido contribuyendo claramente a
Hombre Ratn
Gusano LevaduraDas Generacin
Das Das
Su
per
vive
nci
a (%
)
Su
per
vive
nci
a (%
)S
up
ervi
ven
cia
(%)
Su
per
vive
nci
a (%
)
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 7
las alteraciones de la estructura y funcin del genoma que acompaan al
envejecimiento (Gonzalo 2010).
En nuestro laboratorio observamos que las hembras en muchas especies,
como ratas o humanos, viven ms que los machos debido a que el estrgeno
induce la sobre-expresin de genes asociados a la longevidad (Vina et al.,
2005b).
1.2 EL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO
1.2.1 Concepto de envejecimiento
Hasta el momento no existe una definicin nica ampliamente aceptada
para este trmino. Denham Harman (Harman 1981) lo define como la
acumulacin de diversos cambios deletreos que ocurren en las clulas y los
tejidos con la edad avanzada que son responsables del aumento del riesgo de la
enfermedad y la muerte. Las principales teoras del envejecimiento son
especficas de una causa en particular, proporcionando informacin til e
importante para la comprensin de los cambios fisiolgicos relacionados con la
edad. Sin embargo, una visin global de ellas es necesaria al debate de un
proceso que todava est oscuro en algunos de sus aspectos. En este contexto, la
bsqueda de una nica causa del envejecimiento ha sido sustituida por el punto
de vista del envejecimiento como un proceso extremadamente complejo y
multifactorial. Por lo tanto, las diferentes teoras del envejecimiento no deben
considerarse como mutuamente excluyentes, sino complementarias entre s en la
explicacin de algunas o todas las caractersticas del proceso normal de
envejecimiento.
Segn Bernard Strehler (Strehler 1985), reconocido gerontlogo
americano, el envejecimiento normal se define a travs de cuatro postulados:
Introduccin -
8 Tesis Doctoral
El envejecimiento es universal, es decir, un fenmeno dado asociado al
proceso de envejecimiento debe darse en menor o mayor medida en todos
los individuos de una especie.
El envejecimiento es intrnseco, es decir, las causas que lo provocan
deben de ser de origen endgeno, no dependiendo de factores externos o
de origen ambiental.
El envejecimiento es progresivo, los cambios que conducen a envejecer
se dan de manera paulatina a lo largo de la vida.
El envejecimiento es deletreo, es decir que un determinado fenmeno
slo se considerar parte del proceso de envejecer si es daino.
Antes de examinar los factores biolgicos en la hiptesis de base del
proceso de envejecimiento, es fundamental subrayar que el envejecimiento no es
una enfermedad. Con base en este supuesto, Hayflick estima que una posible
cura de las principales causas de muerte en la tercera edad (como son,
enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares, cncer) slo
llevara a un aumento de 15 aos de la esperanza de vida humana (Hayflick
2000). Por lo tanto, incluso en esta condicin hipottica, no vamos a ser
inmortales, pero tal vez seremos capaces de experimentar cmo la muerte se
produce en ausencia de la enfermedad. Debido a que el envejecimiento se asocia
negativamente con la capacidad de responder al estrs, y positivamente
relacionado con el desequilibrio homeosttico y la incidencia de la patologa, la
muerte sigue siendo la ltima consecuencia del envejecimiento (Kowald et al.,
1996).
La idea de que envejecer requiere tratamiento se basa en la creencia de
que ser viejo no es deseable. En las ltimas dcadas, el envejecimiento ha
recibido una connotacin negativa y convertida en sinnimo de deterioro,
acercndose a la patologa, y la muerte. Si nuestra sociedad aprendiese a valorar
la vejez a la misma medida que llevan a cabo actualmente para la juventud, la
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 9
investigacin dirigida a frenar, detener o revertir el proceso de envejecimiento
sera tan impensable como la intervencin en los procesos de desarrollo de la
juventud. En su lugar, lo que es deseable y posible demostrar en todo momento
en la vida, es la prevencin o resolucin de la patologa (Hayflick 2004).
1.2.2 Consecuencias del envejecimiento
El proceso de envejecimiento se acompaa de una disminucin de la
capacidad para mantener la homeostasis con una prdida progresiva de
rendimiento de cada uno de los rganos, aparatos y sistemas, provocando una
mayor vulnerabilidad, que conlleva finalmente al fallecimiento del organismo
(Hayflick 1998; de Magalhaes 2005).
Por ejemplo, la mayora de los rganos vitales van a sufrir fenmenos de
atrofia o degeneracin. Esto es ms notable en aquellos rganos compuestos
por clulas postmitticas como son las neuronas, clulas miocrdicas,
musculares o las del parnquima renal (Terman et al., 2010). Adems se da una
degradacin con la edad de los materiales que se encuentran entre las clulas.
Esto ocurre debido al descenso en el nmero de fibras de elastina o al
entrecruzamiento de las fibras de colgeno en la dermis (Naylor et al., 2011).
Tambin se puede apreciar asociado al envejecimiento, un aumento en la
sensibilidad a los traumatismos, las infecciones y muchas formas de estrs, as
como un funcionamiento deteriorado del sistema inmunitario que da lugar a
enfermedades autoinmunes o amiloidosis (Alonso-Fernandez et al., 2011).
En definitiva, se dan ms casos de cncer y de enfermedades
degenerativas en ancianos, que son la mayor causa de muerte y de prdida de
una buena calidad de vida (Gilad et al., 1995).
Introduccin -
10 Tesis Doctoral
1.3 TEORAS DEL ENVEJECIMIENTO
Hay muchas teoras que tratan de explicar el complejo proceso de
envejecimiento (ver Figura 1.3) (Vina et al., 2007a). En 1990, Medvedev
(Medvedev 1990), en una excelente revisin indic que haba ms de 300 teoras
del envejecimiento y el nmero va en aumento. En dicha revisin, Medvedev
afirmaba lo siguiente: casi cada descubrimiento importante en biologa celular y
molecular ha dado lugar a una nueva familia de teoras del envejecimiento o
nuevas versiones avanzadas de teoras ms antiguas.
Figura 1.3.- Teoras del envejecimiento. Clasificacin (Vina et al., 2007a)
Sin embargo, ninguna ha sido generalmente aceptada por los
gerontlogos. Por lo contrario, estn de acuerdo con la conclusin de Medvedev
de que no es realista la expectativa de que surja una teora verdaderamente
unificada, o causa nica del envejecimiento (Medvedev 1990).
MUTACIN
GENTICA
ACUMULACIN
DE PRODUCTOS
DE DESECHO
DESGASTE
Teoras Evolutivas
Inmunologa
Regulacin Circadiana
Errores Catastrficos
Telmeros y Hayflick
Resistencia a la Insulina
Teora de Radicales
Libres
Acumulacin de Productos de Desecho
Teora Pleiotrpica Antagnica
Glicacin Avanzada
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 11
As, la actual investigacin gerontolgica incluye desde el anlisis de las
curvas de supervivencia de las poblaciones y la prdida de rendimiento de los
sistemas fisiolgicos hasta un creciente inters en los mecanismos del control
gentico del envejecimiento y su relacin con la longevidad.
El desarrollo de la presente tesis, se sustenta principalmente en la Teora
de envejecimiento por los Radicales Libres, por ello nos centraremos en la
misma.
1.4 TEORA DE LOS RADICALES LIBRES EN EL
ENVEJECIMIENTO
La Teora de los Radicales Libres enunciada por Denham Harman en
1956 (Harman 1956), propone que los radicales libres derivados de oxgeno son
los responsables del dao oxidativo que se produce con la edad a nivel celular y
tisular. Los sistemas antioxidantes no son capaces de hacer frente a todas las
especies reactivas de oxgeno que se generan continuamente a lo largo de la vida
de la clula, lo que acaba provocando un dao oxidativo en ella, y por extensin
sobre los tejidos.
En su interpretacin ms estricta, esta teora predice que una reduccin
del estrs oxidativo, sea mediante la reduccin de la carga prooxidante o el
aumento de las defensas antioxidantes, o alguna combinacin de ambas,
deberan aumentar la vida til (Salmon et al., 2010).
Existen muchas pruebas experimentales a favor de esta teora. Los
animales viejos presentan mayores ndices de oxidacin (se acumulan protenas
oxidadas, formas oxidadas del DNA y de lpidos) que los jvenes (Stadtman
1992; Sohal et al., 1993; Hamilton et al., 2001; Bokov et al., 2004). En principio,
esto podra atribuirse a una tasa mayor de radicales libres generados por los
organismos viejos.
Introduccin -
12 Tesis Doctoral
Tambin, a favor de esta teora son los descubrimientos de numerosos
estudios realizados en diversos organismos, que sugieren que la reduccin del
estrs oxidativo o el aumento de la resistencia al mismo, estn relacionados con
la prolongacin de la vida (Harman 1978; Miquel et al., 1979; Harrington et al.,
1988; Phillips et al., 1989; Orr et al., 1994; Parkes et al., 1998; Finkel et al., 2000;
Melov et al., 2000; Ruan et al., 2002; Ishii et al., 2004; Huang et al., 2006; Zou et
al., 2007; Kim et al., 2008; Quick et al., 2008; Dai et al., 2009; Shibamura et al.,
2009).
A pesar de que la teora de radicales libres est dentro de las ms
estudiadas y aceptadas de todas las hiptesis del mecanismo de envejecimiento,
varios estudios han generado ambigedad y controversia de la misma (Muller et
al., 2007; Perez et al., 2009a; Perez et al., 2009b; Lapointe et al., 2010; Salmon et
al., 2010). Por ejemplo, la gran mayora de los estudios en ratones no muestran
ningn cambio en la vida til despus del incremento o reduccin de enzima
antioxidante (Huang et al., 2000; Perez et al., 2009b). Tampoco ha sido
demostrado que prolongue la vida en ensayos clnicos en humanos, a los que se
les administraba sustancias antioxidantes (Howes 2006; Bjelakovic et al., 2007)
Para entender la Teora de los Radicales Libres en el Envejecimiento
pasamos, a continuacin, a definir algunos conceptos y trminos bsicos.
1.4.1 Radicales libres
1.4.1.1 Concepto y origen de radical libre
Radical libre es aquella especie qumica que contiene uno o ms
electrones desapareados en su capa de valencia (Halliwell et al., 1989), esto hace
que estas especies presenten una gran reactividad. Se caracterizan por su gran
poder oxidante y porque su vida media es normalmente muy corta. La tabla 1.1
muestra ejemplos de la vida media de algunos radicales libres.
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 13
Tabla 1.1.- Vida media de radicales libres.
Estas especies qumicas son abundantes en los sistemas vivos. Es ms,
algunos autores, como Denham Harman en su estudio sobre el origen y
evolucin de la vida, proponen a los radicales libres como una de las causas del
origen de la vida en nuestro planeta (Harman 2001).
En la naturaleza los radicales libres son mayoritariamente compuestos
derivados del oxgeno y se denominan especies reactivas del oxgeno (ROS).
Aunque tambin existen otras especies radicales no derivadas del oxgeno que
ests tomando inters en los ltimos aos, como las derivadas del nitrgeno
(RNS).
El oxgeno, por una parte da origen a la vida y por otra, por su capacidad
de formar distintos radicales libres, es capaz de daar estructuras esenciales para
el desarrollo de sta, tales como DNA, protenas, carbohidratos y lpidos (Sies
1983; Gutteridge 1995; Dean et al., 1997; Cadenas et al., 1998). Adems, los
radicales libres intervienen en procesos fisiopatolgicos como la diabetes y
algunos tipos de cncer (Takada et al., 1982; Okamoto 1985; Klaunig et al.,
2004). Tambin intervienen en procesos fisiolgicos como el envejecimiento
(Harman 1956) y el ejercicio fsico agotador (Davies et al., 1982; Sastre et al.,
1992).
El oxgeno diatmico es una forma muy abundante en la naturaleza
debido a que es una molcula estable. Sin embargo, existe un gran nmero de
especies derivadas del oxgeno que, o bien son muy reactivas, o bien son capaces
Radical Sustrato Concentracin Vida media (a 37C)
HO
LHC 1 M 10
-9 seg.
RO LH 100 mM 10
-6 seg.
ROO LH 1 mM 7 seg.
L O2 20 M 10
-8 seg.
Q- - Das
Introduccin -
14 Tesis Doctoral
de dar lugar a especies reactivas (ver Tabla 1.2). Algunas de estas especies son
autnticos radicales libres derivados del oxgeno, como el radical hidroxilo.
Otras como el perxido de hidrgeno, no son en realidad radicales.
Tabla 1.2.- Especies activadas del oxgeno y nitrgeno.
Tal y como veremos a continuacin, las especies clave en la
fisiopatologa del oxgeno y de los radicales libres son el mismo oxgeno, el
radical superxido, el perxido de hidrgeno, los iones de metales de transicin
y el radical hidroxilo, entre otros. ste ltimo es producto de formacin de una
multitud de reacciones en las que participan los cuatro primeros compuestos
mencionados.
1.4.1.2 Clases de radicales libres
Como se ha mencionado antes, existen muchas clases de radicales libres,
tanto especies reactivas derivadas del oxgeno (ROS) como las especies reactivas
del nitrgeno (RNS). Algunos de los radicales libres ms importantes son:
Anin superxido (O2-)
Radical hidroxilo (OH)
Especie Smbolo
Radical superxido O2-
Radical hidroperxido HO2
Perxido de hidrgeno H2O2
Radical hidroxilo HO
Radical alxido RO
Radical peroxilo ROO
xido ntrico NO
Dixido de nitrgeno NO2
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 15
Radical peroxilo (ROO)
Oxgeno singlete (1O2)
xido ntrico (NO)
Dixido de nitrgeno (NO2)
Radicales de tomos derivados de carbono (R)
Radicales de tomos derivados de azufre (RS)
Dada su relacin con la presente tesis slo destacar a los dos primeros y
al perxido de hidrgeno que aunque no sea radial libre s es especie reactiva de
oxgeno.
a) Anin superxido (O2-)
Estado de reduccin del oxgeno de un electrn, formado en reacciones
catalizadas enzimticamente, como producto en las reacciones de las
deshidrogenasas flavoprotenicas: xantina oxidasa, aldehdo oxidasa, purina
oxidasa, etc. (Korycka-Dahi et al., 1981), en las oxidasas e hidroxilasas (diamino
oxidasa, galactosa oxidasa, citocromo p450, etc.), tambin en reacciones no
enzimticas del oxgeno con la cistena (Via et al., 1983) o la riboflavina
(Barton et al., 1970). Asimismo en la cadena respiratoria mitocondrial (Boveris
et al., 1972), siendo potencialmente txico, ya que puede iniciar reacciones que
den lugar a otros intermediarios a su vez muy reactivos.
Se ha estimado que una clula del cuerpo humano produce alrededor de
unas 1010 molculas de anin superxido por da (Ames et al., 1993). Sin
embargo, el 99% de las molculas que se producen se dismutan hacia perxido
de hidrgeno (Cheeseman et al., 1993).
2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2
Introduccin -
16 Tesis Doctoral
b) Radical hidroxilo (OH)
Estado de reduccin de tres electrones de la molcula de oxgeno. Es la
especie ms reactiva con una vida media estimada de alrededor de 109 s
(Liochev et al., 1994). Puede generarse in vivo como consecuencia de radiaciones
de alta energa (rayos X, rayos ) que puede provocar rotura homoltica del agua
corporal. La luz UV no tiene suficiente energa como para escindir una molcula
de agua, pero puede dividir el agua oxigenada en 2 molculas de radical
hidroxilo. Otro proceso todava ms importante en la formacin del radical
hidroxilo es la llamada reaccin de Fenton (Fenton 1894).
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH
Tambin a partir de agua oxigenada y del radical superxido puede
formarse el radical hidroxilo, por la reaccin de Haber-Weiss (Haber et al.,
1934).
H2O2 + O2- O2 + OH
- + OH
Esta reaccin es catalizada por metales como hierro o cobre.
c) Perxido de hidrgeno (H2O2)
El perxido de hidrgeno no es un radical libre como tal, pues no posee
electrones desapareados en su capa de valencia. Es la forma menos activa de las
especies reactivas del oxgeno. Su importancia recae en el hecho de que atraviesa
fcilmente las membranas biolgicas, con lo que puede dar lugar a reacciones de
oxidacin en puntos de la clula ms alejados de su lugar de produccin.
Se puede originar a partir de diversas fuentes:
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 17
Por reduccin directa de una molcula de oxgeno por dos
electrones (Sawyer 1988; Fridovich 1997).
2 O2 + 2 e - + 2 H+ H2O2
Por dismutacin del O2- (Cheeseman et al., 1993; Frei 1994).
Como producto de algunas enzimas (glucosa oxidasa,
uricasa, etc.) (Fridovich 1986).
Por reacciones qumicas de autooxidacin (Korycka-Dahi et
al., 1981).
La detoxificacin del perxido de hidrgeno se lleva a cabo por accin
de la catalasa (con formacin de agua), un proceso que determina su vida media.
Por otro lado, parece que el H2O2 est implicado en la regulacin de la
transduccin de la seal de expresin de genes a travs del NFB y AP-1.
Ambos son factores de transcripcin capaces de inducir la transcripcin de
genes tales como el de la manganeso superxido dismutasa (MnSOD) (Yi et al.,
2002), interleukina 2 (IL-2), factor de necrosis tumoral (TNF-), antgenos del
complejo mayor de histocompatibilidad y c-fos (Schreck et al., 1994).
1.4.2 Gnesis de ROS
Las especies reactivas de oxgeno pueden producirse de forma endgena
o exgena (Freeman et al., 1982; Frei 1994).
Algunas de ellas surgen como accidentes qumicos, es decir, reacciones
secundarias no deseadas entre las biomolculas o en la detoxificacin de
xenobiticos, pero otras especies activadas de oxgeno se generan in vivo con un
fin determinado, como en el caso de los fagocitos activados, que producen O2-
y H2O2 (Halliwell 1991).
Introduccin -
18 Tesis Doctoral
La va exgena incluye a los radicales libres procedentes de fuentes
externas tales como la dieta (en la que son ingeridos muchos compuestos de
naturaleza prooxidante), xenobiticos, el ozono, el humo del tabaco, la polucin
ambiental, iones, metales y radiacin. (Ames 1983; Cadenas 1989; Valko et al.,
2006).
Mientras que la va endgena incluye la reaccin de Fenton-Haber-
Weiss, microsomas o peroxisomas, la membrana plasmtica, enzimas solubles y
protenas, los sistemas de transporte electrnico del retculo endoplsmico,
metabolismo del citocromo P450, activacin de clulas inflamatorias y la cadena
de transporte electrnico mitocondrial (Inoue et al., 2003).
La cadena de transporte electrnico mitocondrial es una de las
principales fuentes generadoras de radicales libres en el interior de la clula. Est
compuesta por una serie de protenas con capacidad redox que reducen al
oxgeno molecular hasta la formacin de una molcula de agua. Esta reaccin
est acoplada a la fosforilacin oxidativa, en la cual se produce energa en forma
de ATP.
Este sistema enzimtico se comentar detalladamente en el captulo 1.5
de la introduccin de la presente tesis.
1.4.3 Estrs oxidativo
1.4.3.1 Concepto
El estrs oxidativo se define como una alteracin del equilibrio entre las
especies prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras (Sies 1985).
A pesar del papel fisiolgico que desempean algunas especies activadas
de oxgeno, tambin pueden dar lugar a reacciones de oxidacin indeseadas,
contra las cuales los organismos han tenido que desarrollar defensas
antioxidantes (Halliwell 1996).
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 19
La formacin de cierta tasa de radicales libres es un proceso normal e
inevitable, ya que son producto de infinidad de reacciones qumicas
imprescindibles para la vida celular (Slater 1984). Estas especies tan reactivas, no
causan dao oxidativo en condiciones normales debido a que la clula est
provista de gran cantidad de mecanismos antioxidantes.
As pues, el estrs oxidativo puede originarse por un exceso de
sustancias prooxidantes, una deficiencia de agentes antioxidantes, o por ambos
factores a la vez.
Como consecuencia de lo mencionado anteriormente, se sabe que el
estrs oxidativo conlleva consigo daos a las biomolculas, principalmente
lpidos, protenas y DNA (Bokov et al., 2004).
1.4.3.2 Estrs oxidativo y dao a biomolculas
a) Dao oxidativo a lpidos
Los lpidos son el componente principal de las membranas biolgicas y
pueden influir en muchos procesos biolgicos que afectan a la supervivencia
celular.
El dao oxidativo a lpidos puede ocurrir directamente a travs de la
reaccin directa con ROS o indirectamente por la interaccin con aldehdos
reactivos.
Los lpidos, y sobre todo los cidos grasos poliinsaturados, son los ms
susceptibles de ser atacados por radicales libres (Cheeseman et al., 1993), siendo
el radical hidroxilo (HO), el perxido (ROO), el alcoxilo (RO) y el alqulico
(R) los principales generadores de dao oxidativo a lpidos.
El proceso de ataque oxidativo a lpidos, denominado peroxidacin
lipdica, comienza cuando un radical libre ataca a un carbono de la cadena
aliftica de un cido graso, se desprende un tomo de hidrgeno, y se forma un
radical alqulico (Halliwell 1994; Krinsky 1994). Esta reaccin se produce
Introduccin -
20 Tesis Doctoral
preferentemente en los carbonos contiguos a enlaces dobles de los cidos grasos
poliinsaturados, ya que los radicales formados se pueden estabilizar por
resonancia con el enlace doble. Los radicales perxido pueden reaccionar con
cadenas laterales de otros cidos grasos poliinsaturados, con lo que se propaga la
reaccin en cadena radicalaria (Halliwell 1994).
De esta manera, un slo ataque por un radical libre da lugar a la
formacin de un gran nmero de productos de oxidacin, sobre todo aldehdos
como malondialdehdo y 4-hidroxinonenal, e hidrocarburos de cadena corta
como etano y pentano (Freeman et al., 1982; Halliwell 1991; Cheeseman et al.,
1993; Halliwell 1994). Muchos de los aldehdos formados reaccionan
rpidamente con los componentes celulares, con lo que causan mutaciones en el
DNA, y producen daos estructurales y funcionales al reaccionar con protenas
(Krinsky 1994). La peroxidacin lipdica se considera un factor muy importante
en el envejecimiento de clulas aerbicas y en la disminucin de la fluidez de las
membranas celulares (Lippman 1985; Shigenaga et al., 1994; Spiteller 2002).
En una revisin realizada por Hulbert y colaboradores, observan un
incremento de la peroxidacin lipdica con la edad y la susceptibilidad de los
lpidos a la peroxidacin en relacin con la composicin de la membrana en
varias especies de vertebrados (Hulbert et al., 2007).
b) Dao oxidativo a protenas
Las protenas llevan a cabo importantes funciones biolgicas y son las
macromolculas ms abundantes presentes en las clulas. La oxidacin de
protenas por ROS u otras especies reactivas, conduce a la fragmentacin de las
cadenas polipeptdicas, oxidacin de cadenas laterales de aminocidos, y/o
generacin de enlaces cruzados protena-protena (Stadtman 2006).
Se calcula que casi un tercio de las protenas celulares, tanto enzimas
como protenas estructurales, de los animales viejos son disfuncionales como
consecuencia del dao oxidativo (Poon et al., 2004).
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 21
Por ello, la estimacin de la oxidacin proteica, ligada a una variedad de
modificaciones en los aminocidos, podra ser un factor importante a la hora de
predecir el proceso de envejecimiento y las enfermedades asociadas a ste. Una
revisin detallada de las modificaciones de los distintos aminocidos alterados,
los mtodos especficos para determinarlos y el impacto que provocan en el
metabolismo celular ha sido realizada por Requena et al (Requena et al., 2003) y
por Stadtman y Levine (Stadtman et al., 2003).
El dao oxidativo suele ser irreversible y puede conducir a la
desnaturalizacin de la protena (Dean et al., 1993).
c) Dao oxidativo al DNA
El DNA tambin es susceptible al dao oxidativo en todos sus
componentes. Se sabe que el oxgeno es capaz de adicionarse a las bases o al
azcar del DNA formndose radical peroxilo. Las posteriores reacciones de
estas especies radicalarias en el DNA dan lugar a un gran nmero de productos.
La alteracin de este tipo que ms se observa es la 8-hidroxi-
2desoxiguanosina (8-oxodG). Su importancia reside en su poder mutagnico ya
que durante la replicacin producir transversiones G-T (Kasai et al., 1984). La
cantidad del nuclesido 8-hidroxi- 2desoxiguanosina se utiliza como ndice del
dao oxidativo al DNA (Barja et al., 2000).
El dao oxidativo asociado a protenas y DNA no debe ser considerado
de manera independiente. La acumulacin de formas inactivas de enzimas
reparadoras puede aumentar la acumulacin de dao oxidativo en el DNA, por
lo que se pueden potenciar uno a otro. Cuando la replicacin del DNA daado
tiene lugar antes de la reparacin o cuando un DNA daado se repara de
manera incorrecta, tiene lugar una mutacin (Halliwell et al., 1991; Breen et al.,
1995). Por ello, las lesiones oxidativas al DNA parecen estar implicadas no slo
en el envejecimiento celular (Fraga et al., 1990), sino tambin en la patognesis
de las enfermedades asociadas a la edad avanzada (Cui et al., 2012). Sin
embargo, otros investigadores no han detectado un incremento en la oxidacin
Introduccin -
22 Tesis Doctoral
del DNA (8-oxodG) con la edad, ni en roedores (Anson et al., 1999) ni en
personas ancianas (Sacheck et al., 2003).
El DNA daado es reparado por enzimas que cortan la parte afectada,
que es entonces excretada por la orina (Viguie et al., 1993). Puesto que las
enzimas reparadoras no llegan a eliminar todas las lesiones, algunas se acumulan,
con lo que el nmero de mutaciones aumenta con la edad (Viguie et al., 1993).
El DNA mitocondrial sufre mucho ms dao oxidativo que el nuclear
(Richter et al., 1988; Linnane et al., 1989), ya que presenta ciertos rasgos que le
hacen especialmente susceptible de ser atacado por agentes oxidantes: carece de
histonas que puedan recibir el ataque en lugar del DNA (Donald et al., 1995); el
sistema de reparacin es menos efectivo (Shen et al., 1995; Suter et al., 1999) y,
por ltimo, se encuentra muy cerca de la cadena de transporte mitocondrial, uno
de los sistemas principales de produccin de especies reactivas del oxgeno
(Giulivi et al., 1993). Otro factor distintivo del DNA mitocondrial es que no
posee intrones, de manera que la modificacin de cualquier base afecta
usualmente a una zona de DNA codificante (Linnane et al., 1989; Ames et al.,
1993) y su repercusin suele ser, por tanto, ms importante (Zastawny et al.,
1998).
1.4.3.3 Indicadores de estrs oxidativo
Como ya hemos podido observar, el estrs oxidativo es de gran
importancia para las clulas y el organismo por el dao que ste puede causar.
Por lo que se han intentado encontrar indicadores que determinen el dao que
este estrs oxidativo puede causar a nivel general (citosol) o en particular a nivel
de lpidos, DNA o protenas. Los principales indicadores son: el cociente
GSSG/GSH para determinar el dao en el citosol, MDA como indicador de
dao a los lpidos, el 8-hidroxi-2-deoxiguanosina como ndice de dao
oxidativo al DNA y los grupos carbonilos como un indicador de dao oxidativo
a protenas (Hageman et al., 1992).
Introduccin
Kheira Mohamed Abdelaziz 23
En la presente tesis se detallar con mayor profundidad los dos
siguientes, por ser objetivos de nuestro estudio.
a) Malondialdehdo (MDA)
El malondialdehdo es un indicador de dao oxidativo a lpidos. Se han
descrito varios mtodos de deteccin (Bird et al., 1984; Esterbauer et al., 1991),
pero la mayora son poco especficos ya que detectan todos los aldehdos de la
muestra al utilizar el cido triobarbitrico. Gracias al desarrollo de la
cromatografa lquida de alta resolucin, se consigue la separacin del aducto
malondialdehdo-cido triobarbitrico de otras sustancias que pueden interferir
en la determinacin (Knight et al., 1988).
En la presente tesis se ha medido el MDA ya que numerosos estudios
revelan su incremento con el envejecimiento (Inal et al., 2001; Sverko et al.,
2002; Mutlu-Turkoglu et al., 2003; Gil et al., 2006).
b) Grupos carbonilo
En los procesos de dao oxidativo a protenas, algunos aminocidos
como la lisina, la prolina y la arginina, se oxidan dando lugar a grupos carbonilo,
de modo que el contenido en carbonilos de las protenas se puede emplear
como un indicador de dao oxidativo a las mismas (Stadtman 1992; Dalle-
Donne et al., 2003). Otros aminocidos como la histidina, la cistena y la
metionina, tambin sufren dao oxidativo, pero no forman derivados d