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Efecto de la compartimentalización en la biotinilación de VHHs y generación de VHH

biespecíficos

Lucía Alfaya Bianchi

Tutor: Gualberto González-Sapienza Co-Tutor: Martín A. Rossotti

Cátedra de Inmunología; Instituto de Higiene;

Facultad de Química, UdelaR

Tesina Final Licenciatura en Bioquímica, Facultad de Ciencias

Universidad de la República (UdelaR) Montevideo, Uruguay, Diciembre 2015

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Lucía Alfaya

Tesina Final Licenciatura en Bioquímica

Diciembre 2015

CONTENIDO

1-Resumen ............................................................................................................. 4

2-Introducción ....................................................................................................... 5

2.1: VHHs como alternativa a anticuerpos convencionales:

Características y Ventajas ....................................................................................... 5

2.2: Generación y selección de VHHs por metodología de Phage Display ........... 10

2.3: Tag de Biotina: Un método de marcado selectivo .......................................... 15

2.4: Nanobodies multivalentes: Diabodies y más .................................................. 18

2.5: Nuevas aplicaciones biotecnológicas: VHHs y virus ...................................... 20

3-Objetivos ........................................................................................................... 23

4-Materiales y Métodos ....................................................................................... 25

Generación de Vectores ........................................................................................ 25

Colony PCR ........................................................................................................... 26

Expresión de VHHs en vectores pET28a+ modificados ........................................ 27

Protocolos de ELISA ............................................................................................. 28

Estudios de porcentaje de biotinilación ................................................................. 30

Producción y purificación de VHHs ....................................................................... 31

Generación de una biblioteca de fagos ................................................................. 32

Panning contra AAV5 y screening en pComb3X ................................................... 34

Clonado en vector de expresión pINQ.Bt.H6......................................................... 36

PCR de overlap para generación de nanobodies biespecíficos ............................ 37

Citometría de flujo ................................................................................................. 37

Interferometría de Biocapa .................................................................................... 38

5-Resultados y discusión ................................................................................... 39

Efecto de la compartimentación en la biotinilación de los VHHs ................... 39

Clonado de VHH T9 para expresión citosólica ..................................................... 40

Expresión citosólica y periplasmática de T9 ......................................................... 41

Co-expresión de BirA y efecto de la compartimentación celular .......................... 43

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Estudios de porcentaje de biotinilación ................................................................ 49

Producción y caracterización de un VHH biespecífico (BiAb) ........................ 53

Título de anticuerpos y panning contra AAV5 ..................................................... 53

Clonado en vector de expresión pINQ.Bt.H6 y selección de clones .................... 56

Generación de un BiAb ....................................................................................... 60

Estudios de funcionalidad.................................................................................... 62

I) Actividad de VHH-42 (anti-AAV5) ............................................................. 62

I) Actividad de VHH-V36 (anti-CD11b) ......................................................... 64

6-Conclusiones .................................................................................................... 66

7-Referencias Bibliográficas .............................................................................. 69

Anexos A: Vectores Utilizados ........................................................................... 75

Anexo B: Primers Utilizados .............................................................................. 77

Anexo C: Bibliografía generada ......................................................................... 78

Agradecimientos ................................................................................................. 79

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1-RESUMEN

La respuesta inmune en camélidos es singular debido a la generación

natural de anticuerpos funcionales carentes de cadena liviana (HCAbs). En

estos, el parátope está conformado únicamente por el dominio variable de la

cadena pesada, denominado VHH. La versión recombinante de este dominio

se conoce como Nanobody, el cual por sus características: reducido tamaño

(~15kDa), estabilidad fisicoquímica, fácil producción en sistemas heterólogos

sencillos (como en E.coli), y el hecho de que retienen la capacidad de

reconocimiento y afinidad del anticuerpo del que derivan; son una valiosa

herramienta en usos terapéuticos, diagnósticos, de investigación, etc. Como

parte de la estrategia para generar tecnología local para el desarrollo de

distintas aplicaciones de los nanobodies, el presente trabajo describe (I) la

optimización de las condiciones para lograr la biotinilación metabólica sitio

específico de los VHH durante su producción en E. coli, y (II) la generación

de nanobodies biespecíficos (BiAbs) para modificar el tropismo de partículas

virales.

En el primer punto, el proceso se basa en la inclusión de una secuencia

optimizada mínima de 15 aminoácidos (pepBiot, AviTag™), que fusionada a

la proteína de interés conduce a su biotinilación in vivo en el extremo C-

terminal a través de la actividad de la biotin ligasa (BirA) de E. coli. El estudio

se enfocó en evaluar la eficiencia de biotinilación in vivo de los nanobodies

mediante la co-expresión de un nanobody modelo y la enzima BirA en

distintos compartimientos de la bacteria y su efecto sobre el grado de

biotinilación obtenido. En el segundo punto, se seleccionaron nanobodies

contra proteínas de la cápside de vectores virales asociados a adenovirus

(AAV) y se combinaron utilizando una secuencia espaciadora flexible con un

nanobodies específico para el receptor del complemento Mac-1 previamente

seleccionado en la cátedra. La reactividad de este nanobody biespecífico se

verificó por ELISA y citometría de flujo.

Palabras clave: Nanobodies, VHHs, biotinilación, anticuerpos biespecíficos

(BiAbs), AAVs, targeting viral.

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2-INTRODUCCIÓN

2.1: VHHs como alternativa a los anticuerpos convencionales:

Características y Ventajas.

La tecnología de anticuerpos recombinantes ha sido ampliamente

desarrollada durante las últimas décadas, principalmente debido a su

aplicación terapéutica en humanos, por lo cual la búsqueda de nuevos

sistemas óptimos de expresión, selección y purificación es un gran campo de

investigación.

Las inmunoglobulinas (anticuerpos) en mamíferos se componen de cinco

clases o isotipos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, algunas de las cuales poseen a

su vez subclases específicas. La diferencia entre dichos isotipos está

determinada por la secuencia aminoacídica y la estructura de la cadena

pesada, lo cual les confiere a las diversas clases funciones efectoras

diferenciales (activación del complemento, unión específica a receptores

celulares, etc).Dentro de la molécula pueden reconocerse tres regiones, dos

dominios Fab ( Fragment Antigen-Binding o fragmento de unión al antígeno)

idénticos compuestos por la cadena liviana y los primeros dos dominios de la

cadena pesada, y la región Fc (Fragment Crystallizable por fragmento

cristalizable), compuesto de los dominios C-terminales constantes de las

cadenas pesadas. Estas regiones están unidas por una región bisagra, que

varía en tamaño y flexibilidad según la clase de anticuerpo. La cadena

liviana consta de dos dominios, mientras que la pesada se conforma de

cuatro o cinco, en ambos casos los primeros dominios (denominados

dominios variables o VH y VL según corresponden a la cadena pesada o

liviana, respectivamente) conforman al aparearse el fragmento variable (o

Fv) del anticuerpo, siendo este la región que reconoce al antígeno

(parátope). El resto de los dominios de ambas cadenas son considerados

como constantes (CL en el caso del único dominio de la liviana y CH 1-3 en el

caso de la pesada) (Figura 1) [1, 2].

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Si bien esta estructura de los anticuerpos está ampliamente distribuida en

los vertebrados, a principios de los noventa el grupo de Hamers-Casterman

en Bruselas descubrió la existencia de anticuerpos completamente

funcionales carentes de cadena liviana en el suero de especies de la familia

Camelidae (Camélidos), compuesta de llamas (Lama glama y Lama

guanicoe), vicuñas (Vicugnia pacos y Vicugna vicugna), y camellos

(Camelus ferus, Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) [3].

A diferencia de descubrimientos previos, este tipo de anticuerpos no son el

resultado de mutaciones [4] o de una patología subyacente [5, 6], sino que

tendrían un rol fisiológico activo en la defensa del organismo. Estudiando los

anticuerpos presentes en el suero de camellos, se constató la presencia de

tres clases de IgG (denominadas IgG1, IgG2 e IgG3, de acuerdo a su

abundancia relativa) obtenidas a partir de su unión diferencial a proteína G y

proteína A. Lo sorprendente fue que al realizar estudios de SDS-PAGE y

exclusión molecular, de estas tres, solo la primera (IgG1) correspondía a una

IgG convencional (dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas), las otras

dos estaban conformadas únicamente por dos cadenas pesadas idénticas

entre si [3] (Figura 1). Estudios posteriores mostraron que ambos tipos de

anticuerpos atípicos (IgG2 e IgG3) carecían del dominio CH1 y que además

poseían una región bisagra extensa, particularmente en el caso de isotipo

IgG2 [3].

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Figura 1: Clases de IgG presentes en

camélidos (Camelus dromedarius), Observar

que IgG2 y 3 carecen de cadena liviana. A su

vez, está marcado el mínimo fragmento capaz de

reconocer el antígeno (scFV en caso de

anticuerpo convencional y VHH en caso de

anticuerpo de cadena pesada). Modificado de [7].

El porcentaje de estos anticuerpos en la

familia Camelidae es variable y depende

de la especie, llegando a ser entre 25-

40% en llamas, lo cual denotaría su

importancia como parte de la respuesta

adaptativa del organismo y no

simplemente como una mutación neutra

[8].

Ni bien descubiertos, estos anticuerpos de solo cadena pesada,

denominados HCAbs según sus siglas en inglés (Heavy-Chain-only

Antibodies) se destacaron por su potencial como nuevas moléculas de

reconocimiento para diagnostico, aplicaciones terapéuticas y usos

biotecnológicos. Al carecer de cadena liviana, es únicamente el dominio

variable de la cadena pesada el encargado de reconocer el antígeno. Algo

particular es que este mecanismo de reconocimiento del antígeno más

simple no compromete la afinidad de reconocimiento de antígenos, ya que

alcanzan valores de afinidad similar a la obtenida por el fragmento Fv de un

anticuerpo convencional. Esta naturaleza de único dominio (denominado

VHH o Nanobody, Figura 1) ha llevado a que se los denomine anticuerpos

monodomino (o sdAb por sus siglas en inglés, Singe Domain Antibodies) y

que al componer la mínima unidad conocida capaz de unir con alta afinidad

el antígeno se transformo desde su descubrimiento en una versátil

herramienta de investigación.

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Cabe destacar que estos HCAbs no son los únicos anticuerpos carentes de

cadena liviana que se encuentran en la naturaleza, sino que también se han

descripto en ciertas especies de tiburones inmunoglobulinas, denominadas

Ig-NAR (Immunoglobulin-New-Antigen-Receptor) [9] carentes de cadenas

livianas, con sus dominios variables o V-NAR que son homólogos a los VHH

de los HCAbs de camélidos. Si bien no se encuentra homología de

secuencia entre las regiones variables, su similar estructura y función

parecen ser un indicio de evolución convergente [10, 11].

Estas IgG no convencionales conservan la región Fc y por consiguiente son

capaces de mantener las funciones efectoras típicas de una IgG

convencional, siendo capaces de reclutar efectivamente células del sistema

inmunes [12]. La falta de cadena liviana y CH1 hacen que su peso sea

disminuido a unos ~90 kDa en lugar de los ~150 kDa de las IgGs

convencionales. Se especula que este tamaño más pequeño y compacto les

permite penetrar más fácilmente dentro de los tejidos [3]. Se confirmaron tres

subisiotipos dentro de las IgG2 y dos dentro de las IgG3, si bien no está del

todo claro cuál es la diferenciación funcional dentro de estos [13].

El dominio VHH, este parece seguir la estructura de los VH convencionales.

Adoptan un pliegue del tipo inmunoglobulina, con nueve hojas beta

organizadas en dos grupos conectados por loops y un puente disulfuro. Una

de las mayores diferencias se encuentra a nivel de la segunda región

constante dentro del dominio variable, sobre el FR2 (Framework 2); que en

los anticuerpos convencionales contiene aminoácidos hidrofóbicos muy

conservados (Val 42, Gly 49, Leu 50, Trp 52) directamente involucrados en

la interacción con la región variable de la cadena liviana (VL). En los VHH,

estos aminoácidos durante la evolución fueron sustituidos por aminoácidos

hidrofílicos (en general Phe 42, Glu 49, Arg 50, Gly 52), lo cual confiere

estabilidad del domino variable frente a la ausencia de la cadena liviana [14-

16] (Figura 2). Este adaptación también se observa sobre el dominio V-NAR

en las Ig-NAR [17]. Otra de las adaptaciones que surgieron a lo largo de la

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evolución sobre los VHH y V-NAR, en parte para compensar la variabilidad

generada por la combinación del VH con el VL es la aparición de regiones

hipervariables más largas (CDRs, Complementary-Determining-Regions),

principalmente a nivel de la tercer región (CDR3) que es la que

principalmente intereractúa con el antígeno. El CDR1 se extiende hacia el

extremo N-terminal, y es más variable que su análogo en los anticuerpos

convencionales. El CDR3 además de ser más largo (llegando a alcanzar

hasta 30 aminoácidos) presenta cisteínas adicionales que permite la

formación de nuevos puente disulfro, principalmente con otra cisteína

presente en el CDR1 o en el FR2, lo cual ayuda a estabilizar la estructura

del VHH [14,18, 19].

Figura 2: Esquema de domino VHH (izquierda modificado de [7]) y representación

tridimensional del mismo (derecha, PDB, 1I3V). En la imagen de la derecha se

representan las 9 hojas betas interconectadas que forman el VHH; a su vez, se encuentran

marcados los aminoácidos que varían al compara con los VH convencionales (Phe 42, Glu

49, Arg 50, Gly 52). Los CDRs están marcados en colores (CDR1=Azul, CDR2=Verde,

CDR3=Rojo, izquierda).

El pequeño tamaño de los nanobodies (~15 kDa) junto a la conservación de

la capacidad de unir a sus antígenos con alta afinidad, han convertido a los

VHH en poderosas herramientas biotecnológicas. Su dominio único permite

una fácil manipulación genética, lo que a su vez facilita su producción en

formatos multivalentes (discutido más ampliamente en el punto 2.4). A su

vez, el dominio VHH presenta una gran estabilidad tanto térmica como

química [20, 21]. Por otro lado, la generación de bibliotecas de VHH está

enormemente facilitada debido a la falta de recombinación entre las cadenas

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pesadas y livianas, y por tanto la representación de la especificidad original

se preserva mucho más que en el caso de los anticuerpos convencionales.

Sumado a esto, tienen la capacidad de reconocer sitios antigénicos

diferentes a la de los anticuerpos convencionales, que normalmente están

escondidos o forman parte de cavidades de proteínas. Esto es posible en los

nanobodies debido a la existencia de un CDR3 largo y flexible, como ya fue

mencionado [22].

Por todas estas razones, es sencillo entender entonces por qué desde su

descubrimiento se ha intentado desarrollar y optimizar métodos que permitan

generar, aislar, seleccionar y clonar dichos VHHs a modo de poder

producirlos eficientemente de forma recombinante en sistemas sencillos,

llegando, hasta la fecha, a ser expresados en altos niveles tanto en diversos

microorganismos como también en células de mamíferos, e incluso de

plantas [23-26]. Por lo general el rendimiento de producto soluble y funcional

es bastante elevado, en el orden de mg/L de cultivo bacteriano; gracias a la

inclusión de una señal de direccionamiento periplasmático, lo cual favorece

la formación de los puentes disulfuro necesarios para mantener su

estructura. Para la purificación se prefiere recurrir a diversos tag que faciliten

el proceso, típicamente a través de la inclusión de una cola de histidina C-

terminal [7].

2.2: Generación y selección de VHHs por metodología de Phage

Display:

El primer paso para obtener los VHHs de forma recombinante consiste en la

inmunización de llamas (usualmente camélidos de más fácil acceso), la cual

puede llevarse a cabo con con más de un antígeno a la vez. El proceso se

realiza por ~ tres meses (1 dosis cada 15 días en adyuvante incompleto en

todos los casos) o por el tiempo necesario para que el animal genere un

titulo de anticuerpos elevado. Una vez determinado esto último, la

generación de la biblioteca de anticuerpos de cadena pesada de llama;

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expresados sobre la superficie del bacteriófago M13; comienza con la

extracción de sangre, a partir de la cual se purifican los PBMC (células

mononucleares de sangre periférica donde se encuentran los linfocitos B). A

partir de este material se obtiene el RNA mensajero total y se realiza RT-

PCR para amplificar con primers específicos los VHH y luego clonar todo el

repertorio de VHHs del animal en el vector fagémido, el cual va a permitir la

expresión de los VHHs fusionados al gen de la proteína pIII de la cápside

viral bacteriófago M13. Este pool de VHHs clonados en dicho vector se

conoce como biblioteca de nanobodies, la cual posteriormente es

electroporada en bacterias E.coli, la cual va a generar partículas de virus

cada una de las cuales muestrea sobre su superficie un VHH diferente. La

generación de las partículas virales recombinante es posible gracias a la

ayuda de un fago auxiliador, o helper que proporciona el resto de proteínas

necesarias para que se arme la cápside viral. Esta población de fagos que

contiene el repertorio completo de anticuerpos del animal inmunizado es

utilizada para la selección de clones (nanobodies) específicos a través del

uso de la técnica de panning [27] (Figura 5 para un esquema del proceso

mencionado). Una alternativa a la inmunización de animales para la

generación de bibliotecas de nanobodies consiste en el uso de la sangre de

animales no inmunizados o naive [28-30]. No obstante, a pesar del ahorro de

tiempo, algo muy importante a considerar de esta estrategia es que los

anticuerpos que se seleccionan usualmente tienen baja afinidad, debido a

que no han sufrido el proceso de maduración de afinidad in vivo que sucede

cuando se inmunizan los animales.

La estrategia de selección se basa en la capacidad de fagos filamentos de

presentar proteínas y péptidos unidos a su superficie, un sistema

comúnmente conocido como Phage Display. Esta herramienta, desarrollada

en los 80´ [31] y muy utilizada durante los 90´, se basa en el principio de que

en fagos (virus que infectan bacterias) hay una asociación del genotipo con

el fenotipo entre la proteína expresada en la cápside y el gen que la codifica

contenido en el ADN. Por lo tanto, insertando un ADN foráneo adyacente a

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alguno de los genes que codifican para proteínas de la cápside

(comúnmente pIII) permite formar una nueva proteína de fusión con la

secuencia foránea expuesta en el extremo N-terminal. Esta se incorpora al

virión, que puede entonces “presentar” la proteína incluida (Figura 4). Es

esta propiedad la que permite que una población de moléculas clonadas (ej.:

biblioteca inmune o naive de VHHs) pueda ser enriquecida por afinidad

sobre un ligando inmovilizado, un proceso conocido como panning [32, 33].

Los bacteriófagos filamentosos usados (Inovirus) contienen ADN simple

hebra circular encapsidado en un cápside cilíndrica, infectando la célula

(normalmente E.coli conteniendo plásmido F) a través del pili. La clase Ff ha

sido la más estudiada (f1, fd y M13, 98% homología entre ellos). Su genoma

codifica 10 proteínas, 5 de las cuales forman la cápside del virión. De ellas

comúnmente se usa pIII (5 copias) y pVIII (proteína mayoritaria, 2700 copias,

(Figura 3) pare expresar péptidos foráneos [33]. La diferencia en el número

de copias/partícula viral permite que se usen para aplicaciones distintas:

alta afinidad (pIII) o alta avidez (pVIII).

Figura 3: Estructura Fago M13: Proteínas de la cápside

marcadas. Notar la presencia de pVIII (mayoritaria) y de pIII

(minoritaria, en un extremo) normalmente usadas pare el

proceso de Phage Display. Modificado de [34].

Para el caso de la proteína pVIII, los insertos están

limitados a péptidos entre 6-8 aminoácidos [35, 36].

En el caso de pIII, quimeras con insertos grandes

pueden ser bien empaquetados. Para esto se debe

clonar entre la secuencia señal y el principio del

primer dominio (N1), lo cual no interfiere con el

ensamblaje del virión y a su vez causa menos

impedimento estérico. Cuanto mayor es el inserto

clonado, menor es la inefectividad del fago

obtenido [32]. Esto puede evitarse usando fagos

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híbridos, en los cuales solo algunas de las proteínas de la cápside usadas

para presentar contiene el inserto. Pare esto se expresa el inserto deseado

en vectores fagémidos, logrando allí la fusión inserto-pIII/VIII mientras que

la mayoría de pIII (u pVIII) son nativas y están codificadas por un fago helper

que co-infecta la bacteria.

Estos vectores fagémidos consisten en un plásmido con origen de

replicación, una señal de empaquetamiento, gen de resistencia a antibiótico

(permite selección y propagación) y los genes codificantes de la proteína de

la cápside que se usará para la fusión (pIII o pVIII según sistema de

expresión deseado) bajo el control de un promotor adecuado. A su vez en el

3’ adyacente al sitio de clonado de los VHH poseen secuencias péptidicas

que facilitan los procesos de producción y detección de la proteína generada

en los subsiguientes pasos (Figura 4). Todo esto permite que el vector

multiplique como plásmido en bacterias receptoras que luego son infectadas

por el fago helper, el cual provee de proteínas y enzimas necesarias para

activar el origen de replicación (propio y del vector fagémido) a la vez que

aporta las proteínas estructurales necesarias para poder ensamblar los

genomas. De este modo el ADN se empaqueta usando estas cápsides

“hibridas” de proteínas codificadas por ambos genomas (presentando ~2400

copias de la proteína deseada con pVIII y 1-5 copias con pIII) [32].

Figura 4: Esquema de vector fagémido: En la imagen mostrada se realiza display de

scFV y Fab, no de VHH aunque este sigue el mismo mecanismo. Epítopes marcados en el

vector: HA (detección), lacZ (promotor del operón lac, induce expresión al agregar inductor

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análogo a la lactosa), sitos Sfi I, Sac I y Spe II (clonado en vector), H6 (Cola de histidina,

permite purificación). En este caso el vector fagémido expresa en pIII. Modificado de [32].

Una vez clonados los VHHs en un vector fagémido, se realiza la

electroporación en células E.coli de la cepa ER 2738 (la cual contienen el

pilli F y permiten la infección por el fago helper); y se prepara la biblioteca

de fagos “súper- infectando” con el fago helper (M13KO). Para la selección,

en las sucesivas rondas de panning, se expone el fago conteniendo la

proteína de fusión (en nuestro caso los VHHs) a su ligando (antígeno) en

fase sólida, se lava para descartar interacciones no específicas y por último

se eluye (mediante pH acido o digestión tríptica) y amplifican los fagos que

muestrean VHH específicos para el antígeno en cuestión (Figura 5). Luego

de varias rondas de enriquecimiento mediante panning, la especificidad de

los clones (nanobodies monoclonales) seleccionados se verifica mediante

ELISA a partir de colonias de bacterias individuales escogidas de la placa de

petri al azar, haciendo uso del sistema de inducción de la expresión de los

nanobodies por IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). La unión de los

nanobodies al antígeno adsorbido en la placa de ELISA se evidencia

utilizando un anticuerpo que reconoce el péptido HA derivado de la

Hemaglutinina del virus de influenza, el cual esta codificado en el vector

fagémido y se expresa en el extremo C-terminal de los nanobodies.

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Figura 5: Esquema de generación biblioteca de fagos y proceso de panning. Observar

que el proceso desde la extracción hasta la producción de VHHs específicos lleva apenas

un mes. El fago en este caso presenta el VHH fusionada a la proteína de cápside pIII.

Modificado de [37].

2.3: Tag de Biotina: Un método de marcado selectivo.

Como ya se mencionó, una de las modificaciones aplicadas al producir

VHHs es su unión covalente a tags de diversa índole que facilitan su

purificación y aplicaciones posteriores (ELISA, citometría, microscopía, etc).

Un método muy útil para esto es hacer uso de la reacción avidina-biotina.

La avidina es una glicoproteína de la clara de huevo que consta de cuatro

subunidades iguales de ~16.400 Dalton (peso total 66000 Dalton) [38], cada

subunidad une a una molécula de biotina (vitamina H, ~244 Da), con una Kd

=1.3 X 10-15 M [39], siendo esta afinidad una de las interacciones no

covalentes más fuertes que se conocen. A su vez, esta interacción es capaz

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de soportar condiciones extremas (pH, buffers, sales, agentes

desnaturalizantes, etc..) [40]. Todas estas ventajas hacen muy atractivo al

uso de la biotina como sistema de detección , sin embargo se presenta un

problema: el bajo punto isoeléctrico y alta carga en carbohidratos de la

avidina hace que en ciertas condiciones esta se una inespecíficamente a

otros blancos [41]. Como alternativa, tenemos es el uso de estreptavidina,

una proteína aislada del microorganismo Streptomyces avidinii, que posee

un punto isoeléctrico neutro [42], y una estructura (4 subunidades, cada una

con sitio unión a biotina, peso total ~60.000 Dalton) y fuerza de unión a la

biotina similar a las de la avidina [42, 43].

Otro punto atractivo del uso de la biotina como tag es la independencia de

anticuerpos convencionales secundarios para su detección; que

generalmente son caros y poco versátiles. Los reactivos de

avidina/estreptavidina son de fácil acceso y económicamente favorables

frente a otros más específicos (anticuerpos conjugados a

enzimas/fluoróforos).

La conjugación química de biotina a proteínas requiere de diversos pasos y

soluciones y posee la desventaja de no ser sitio específica y de generar una

poblaciones de moléculas con distinto grado de biotinilación [41]. La

conjugación de esta molécula por su grupo carboxilo conlleva una reducción

de su interacción con las avidinas (avidina o estreptavidina), aunque la

afinidad resultante es todavía muy alta [44]. La biotinilación química conlleva

además posibles modificaciones en la proteína que pueden afectar su

conformación, función biológica y actividad. En el caso de los VHHs esto

puede llevar a la pérdida de reconocimiento de su antígeno, por lo cual un

procedimiento más específico sería recomendable.

Como alternativa, en los 90´ se descubrió una proteína en E.coli, la BirA

(mas genéricamente conocida como BHS o Biotin Holoenzime Synthetase

[45] o simplemente como ligasa de biotina), capaz de realizar el proceso de

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biotinilación in vivo de modo específico. El blanco natural de esta enzima en

E.coli es la BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein), subunidad de la acetyl

co-a carboxylasa [46]. La reacción catalizada por las BHS esta conservada

evolutivamente en distintos organismos [45, 47] encontrándose una

homología de secuencia en la región blanco a ser biotinilada por la enzima

(en especial un residuo de lisina) [48].

Fue este descubrimiento el que llevo a desarrollar vectores que permitieran

la biotinilación de proteínas en el sistema E.coli in vivo [49].Esto fue posible

utilizando métodos combinatorios que permitieron encontrar una secuencia

optimizada consenso de biotinilación, es decir, una serie de péptidos de

entre 14-23 aminoácidos derivada de la BCCP que son sustratos de la ligasa

de biotina . De esta forma se consiguió una secuencia optimizada de 15

aminoácidos (pepBiot, GLNDIFEAQKIEWHE, AviTag™) que contiene un

residuo de lisina que adopta una conformación especial capaz de ser

biotinilado in vivo de forma dirigida específicamente por la enzima [50, 51]

(Figura 6). Cuando la secuencia codificante para este péptido es clonada en

fase con la de una proteína de interés (por ejemplo un nanobody), la

proteína recombinante resultará biotinilada en forma sitio-específica si se

expone a la acción de la BirA tanto in vivo como in vitro en presencia de D-

biotina [52-56]. En condiciones basales, la actividad de biotinilación de la

BirA es muy baja, por lo que es necesario sobreexpresarla para lograr un

alto porcentaje de biotilinalción. Esto se logra co-transformado la bacteria

con un vector que sobre-exprese la BirA o incluyendo este gen como parte

del operón del plásmido de expresión para lograr aumentar el proceso in vivo

[55]. Recientemente este sistema de marcado ha llegado exitosamente a los

nanobodies [57-59].

En esta tesina, el primer objetivo consistió en optimizar las condiciones para

obtener el máximo de biotinilación de los nanobodies in vivo en simultáneo a

su expresión, estudiando algunas condiciones de expresión, entre ellas los

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compartimientos celulares en donde se expresan los nanobodies y la enzima

encargada de la biotinilación.

Figura 6: Esquema de péptido consenso de biotinilación. Posiciones importantes

marcadas. El péptido usado en el trabajo parte de este y posee dos aminoácidos extra en

los extremos (pepBiot; AviTagTM

. Modificado de[51].

2.4: Nanobodies multivalentes: Diabodies y mas

Los anticuerpos biespecífios (BiAbs, Biespecific Antibodies) han irrumpido

como una herramienta con múltiples aplicaciones en los últimos años, tanto

diagnosticas como biotecnológicas y médicas [60],al punto de llegar

recientemente a ser aprobados para su uso en terapias (Catuxomab, anti-

EpCam y anti CD3 [61], aprobado por la EMD en 2009). Inicialmente estos

anticuerpos se generaban por medio de tecnología de hibridomas,

fusionando dos hibridomas primarios para generar un híbrido que secretaba

una mezcla de anticuerpos de cadenas pesadas y livianas, logrando así que

algunas combinaciones darán lugar a las dos especificidades iníciales,

aunque en baja proporción [62] (Figura 7). En 1984 se logro exitosamente

un BiAb capaz aumentar la acción de linfocitos T citotóxicos contra células

tumorales combinando especificidades anti TCR y anti tumor [63]. Los

resultados exitosos en el campo llevaron a un amplio desarrollo de esta

tecnología hasta la fecha, logrando desarrollar exitosamente diversas

estrategias para lograr generar BiAbs [64], al punto que hasta la fecha haya

varios en ensayos clínicos (Ertumaxomab, anti CD3 y HER2/neu [65]).

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Figura 7: Esquema de Anticuerpo Biespecífico

Convencional: Los dos parátopes son distintos;

pudiendo as reconocer distintos epítopes. Modificado de

[66].

Por otro lado, estos anticuerpos son útiles en otros campos como ser el de

la histoquímica [62], o en diagnóstico, incluyendo: ensayos de aglutinación

de glóbulos rojos [67], detección de patógenos en alimentos [68]o

inmunodiagnóstico de infecciones [66, 69, 70]. Otro campo en el que se han

destacado es en el de la imagenología para el diagnostico in vivo de cáncer,

debido a su capacidad de realizar un “pre-marcado” del tumor ,y posterior

captura del radionucleótido inyectado, cuando se combinan las

especificidades por un antígeno tumoral ya un radionucleótido [71, 72].

Cuando los BiAbs combinan dos o más anticuerpos contra distintos epítopes

del mismo antígeno se logra un aumento de la avidez de la interacción. Un

claro ejemplo de esto es la mejora en la capacidad de BiAbs para neutralizar

toxinas [73, 74]. Una de los formatos más usados en el caso de anticuerpo

convencionales es el de “diabodies”, combinaciones en tándem de dominios

variables de cadenas livianas y pesadas unidas por una secuencia

separadora corta que evita la asociación en cis y fuerza la asociación (en

trans) con el dominio variable complementario de otra cadena [75]. En el

caso de los nanobodies, los anticuerpos biespecíficos se obtienen mediante

la unión en tándem de anticuerpos monodomino (VHHs) con especificidades

distintas (Figura 8).Una ventaja de los nanobodies biespecíficos es que

mantienen la alta solubilidad y buen nivel de producción en E.coli, de forma

semejante a su contraparte monomérica [76].

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Figura 8: Esquema de un BiAb generado a partir de la unión de dos Nanobodies: El

spacer utilizado, un repetido de glicinas y serinas flexibles, le da la suficiente movilidad a la

molécula. Modificado de [37].

Debido al pequeño tamaño estas construcciones tienen una rápida

biodistribución y alto clearence renal, lo cual representa una gran ventaja en

aplicaciones como la neutralización de toxinas o aplicaciones de

imagenología molecular [73]. Otro rasgo de los VHH que los hace muy

atractivos para su uso en el tratamiento de patologías humanas es la alta

similitud con los dominios variables de la cadena pesadas de los anticuerpos

humanos de la familia VH3, por lo que poseerían una baja imunogenicidad

[74].

2.5: Nuevas aplicaciones biotecnológicas: VHHs y virus

Una de las principales aplicaciones pare el uso de los VHHs ha sido la

actividad de estos contra elementos virales. Estos pueden ser utilizados

tanto para la neutralización del virus, usualmente por medio de la unión del

VHH a un co-receptor de la cápside viral [77, 78], como con las posibles

herramientas terapéuticas y diagnosticas asociadas, así como herramientas

en el estudio del ciclo de dicho virus [79]. En los últimos años, la lista de

VHHs generados anti-virus ha crecido, habiéndose generado anticuerpos

contra los virus del RSV (Virus Respiratorio Sincicial), Rabia, Polioviurs,

FMDV (Foot-and-mouth disease virus), HBV (Virus de la Hepatitis B), e

incluso anti-HIV, entre otros. [80]. Cabe destacar que en muchos de estos

casos el uso de los VHHs multivalentes (mencionados en la sección anterior)

aumenta la eficacia de la neutralización. En algunos casos el uso de estos

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Diciembre 2015

anticuerpos podría ser vehiculizado median terapias génicas basadas en

vectores virales. En este sentido se han realizado experimentos exitosos

utilizando los genes de VHHs neutralizantes de virus incluidos en vectores

virales de terapia génica como una forma de inmunización pasiva [81].

Por otro lado, las ventajas ya mencionadas tanto en tamaño y fácil

manipulación genética de los VHHs los hacen un blanco más que óptimo

para lograr la posible modificación natural del tropismo viral [82]. Si bien

existen distintas aplicaciones que utilizan VHH para cambiar el tropismo de

vectores basados en adenovirus y lentivirus, no hay aun trabajos sobre los

AAVs (Adeno Associated Virus). Estos son virus de la familia parvovirus

conteniendo un genoma lineal de 4.7 kb que codifica para cuatro proteínas

de replicación y tres de la cápside. Para que estos pequeños virus puedan

replicarse se requiere de la infección de un virus helper asociado, en

ausencia de este, el genoma puede integrarse al cromosoma del hospedero

y mantenerse allí en estado latente [83]. Fueron descubiertos en 1965, en

células de primates infectadas con adenovirus de simio (SV15) [84]. Si bien

al principio se pensó que estos eran subunidades del propio SV, se

comprobó más tarde que es un virus independiente [85]. Se han encontrado

hasta la fecha (2004), 11 serotipos distintos [86].

El virus posee diversas ventajas que lo hacen ser óptimo como vector, como

la de ser no patogénico a la vez que se integra en sitos específicos del

cromosoma 19 [87, 88], sin embargo, en los vectores virales utilizados en

terapia génica esta funcionalidad ha sido removida y los genes transferidos

se expresan en forma extra cromosómica, disminuyendo su actividad con la

replicación celular. Otra ventaja a tener en cuenta es que el tropismo viral

varía según el serotipos utilizado [89], logrando de este modo realizar un

targeting relativamente específico a distintos blancos celulares. Hasta el

momento se han realizados diversos ensayos clínicos (fase I y II) con dicho

virus, en el marco de tratar diversas enfermedades como ser la hemofilia,

Parkinson, etc [89] (Figura 9).

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Figura 9: Porcentajes de ensayos clínicos que han hecho uso de rAAVs según

categorías de enfermedades hasta la fecha. Notar que en su mayoría los tratamientos se

han centrado en enfermedades monogenéticas y cáncer. La gran mayoría de estos estudios

requieren del AAV2. Modificado de [90].

Si bien, como se ha comentado, la estructura de adenovirus y lentivirus

soporta la modificación de las proteínas de cápside o envoltura,

respectivamente, para lograr modificar el tropismo original del virus [82, 91-

97]. En el caso de AVVs, la cápside no parece permitir modificaciones de

sus proteínas constituyentes sin que esto termine en dificultades de

ensamblaje de la misma. En base a esto uno de los objetivos de este trabajo

apunta a construir nanobodies biespecíficos que puedan por un lado unirse a

las partículas de AAV y por otro a las células de interés para lograr su

direccionamiento específico.

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3-OBJETIVOS

Los dos principales objetivos a desarrollar serán:

Estudiar el efecto de la compartimentación celular en la biotinilación de

VHHs.

Para esto se co-expresaron en E.coli (I) un VHH modelo contra el herbicida

TCC (nanobody T9) y (II) la enzima BirA. Para esto se evaluó: a) la co-

expresión de ambas proteínas en el citoplasma, b) la expresión de la BirA en

el citosol y el VHH en el periplasma, o c) la co-expresión de ambas proteínas

en el periplasma, analizando en cada caso el nivel de expresión de ambas

proteínas y el nivel de biotinilación in vivo del VHH.

Figura 10: Esquema para la biotinilación in vivo del nanobody: Notar la co-transfección

con dos vectores (expresión de VHH y BirA) junto a la presencia de biotina para lograr el

VHH biotinilado de manera sitio-específica. A su vez se muestran diversas aplicaciones

posibles a esta modificación.

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Obtener VHHs contra proteínas de la cápside de AVV5 y generar

nanobodies biespecíficos combinándolos con un nanobodies contra el

receptor CD11b.

Para esto se construyó una biblioteca de VHH expresados en fagos

generada a partir de un animal inmunizado con el virus AAV5, se realizó un

panning contra AAV5 adsorbido en placa de ELISA y se seleccionaron los

clones más promisorios. Uno de estos clones se combinó utilizando una

PCR de overlap, con un VHH previamente producido en el grupo de trabajo,

denominado V36, que reconoce al receptor CD11b murino, el cual

representa la subunidad α del complejo Mac-1 de 170 kDa [98]. Como parte

de este segundo objetivo se optimizaron las condiciones de expresión del

anticuerpo biespecífico y se verificó la funcionalidad del mismo mediante la

evaluación de la capacidad de reconocimiento de los antígenos individuales.

El objetivo final sobre este punto se esquematiza en la Figura 11, y es

utilizar los nanobodies biespecíficos aquí generados para modificar el

tropismo viral hacia células CD11b+ (dendríticas, macrófagos, neutrófilos,

etc.).

Figura 11: Esquema BiAb anti CD11b/ AAV5: Observar como el BiAb generado funciona

como nexo entre las dos especies (célula y virus). A la vez, notar la existencia de tag de biotina

agregado, a modo de ayudar a la detección de la proteína.

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4-MATERIALES Y MÉTODOS

Generación de vectores:

-pINQ.Cit.Bt.H6: Este vector permite la expresión citoplasmática de los

nanobodies. El DNA codificante para el nanobody modelo T9 (específico

para el herbicida Triclocarban) previamente seleccionado en el grupo de

trabajo [99] se amplificó desde el vector pINQ.Bt.H6 [98, 99] usando primers

específicos para el nanobody que además poseen los sitios de restricción

Nco I (primer “forward” o FW) y Xho I (primer “reverse” o RV) (Ver Anexo

B).El amplicón se digirió con ambas enzimas (ThermoScientific) por dos

horas a 37ºC, se separo en gel de agarosa 1% y la banda de 400 pares de

bases se purificó usando un kit comercial (ThermoScientific) y se ligó al

vector de expresión citosólica pET28a+ (Novagen) previamente digerido y

purificado en las mismas condiciones. De este modo se logró clonar el

cassette de expresión del VHH T9 sin la secuencia periplasmática OmpA

(contenida en el pINQ.Bt.H6) pero reteniendo el péptido de biotinilación. Se

ligó haciendo uso de la enzima T4 ligasa (ThermoScientific) relación inserto:

vector de 3:1 (en pares de bases) por media hora a 25ºC seguido de una

inactivación de 5 minutos a 70ºC luego de la cual se electroporó en la cepa

de E.coli BL21 (DE3) (Novagen). Esquema de región de clonado de ambos

vectores presente en Anexo A.

-Vectores de expresión de la enzima ligasa de biotina BirA: Para la expresión

citoplasmática de la BirA se utilizo el vector pCY216 [100] (de aquí en más

denominado como pBir) el cual está regulado por la L-arabinosa y presenta

resistencia a cloranfenicol.

Para la expresión periplasmática de la enzima, el gen de la BirA se amplificó

con primers específicos desde el vector pCY216, y se digirió y clonó en el

vector pBAD18 (Life Technology), con resistencia a ampicilina (vector

pBir.peri). Este vector contiene upstream al gen de la BirA la secuencia señal

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pelB de direccionamiento periplasmática. Este vector también regula la

expresión de la BirA por L-arabinosa.

A su vez, el gen de la BirA sin y con péptido de direccionamiento

periplasmático se clonó en el vector pAE [101], una modificación del vector

pET32a (Novagen) dando lugar a los vectores pBir.IPTG y pBir.IPTG.peri,

respectivamente. Estos dos vectores permiten la expresión fuerte de la BirA

bajo el control de la T7 polimerasa frente a la inducción con IPTG.

-protocolo de electroporación: Se usó el electroporador BioRad MicroPulse®.

Luego de la aplicación el pulso eléctrico, las bacterias se resuspendieron en

1 ml de medio de recuperación SOC(Super Optimal Broth 2% w/v triptona,

0.5 w/v extracto de levadura, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2 y 20

mM glucosa) y se incubaron a 37ºC en con agitación a 300 rpm (shaker AG

CH-4104 Bottmingen, InforsHT, Ecotron) para que las células se recuperen

del pulso y comiencen a expresar la resistencia dada por el vector con el que

se las transformó. Luego de 1 hora, se prepararon diluciones de las

bacterias (directas y seriadas al décimo) y fueron plaqueadas en placas de

LB (Luria-Bertani)-agar (Sigma-Aldrich) conteniendo el antibiótico

correspondiente según los plásmidos usados (cloranfenicol 35 µg/mL, o

kanamicina 40 µg/mL, o ampicilina 100 µg/mL en todos los casos de la

marca Sigma-Aldrich). Las placas se incubaron en estufa a 37ºC O.N para

lograr obtener colonias aisladas.

Colony PCR

Colonias individuales crecidas en placas de LB-agar se seleccionaron al

azar, se resuspendieron en 10 µL de agua calidad biología molecular

(Sigma-Aldrich) y se utilizaron directamente como molde (1-2 µL) para una

reacción de PCR convencional de 30 ciclos usando la enzima Taq

polimerasa (ThermoScientific) en termociclador GeneTouch Thermal Cycle

(Bioer Technology) con los primers previamente utilizados para amplificar el

inserto deseado (Ver Anexo B). Se eligió una temperatura de annealing

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entre 55-65ºC (según secuencia de primers a usar) para permitir la correcta

unión selectiva de estos al molde. Tomando en cuenta el largo del fragmento

a amplificar (400 u 800 pb) se realizaron 30 o 60 segundos de extensión,

respectivamente. Esta PCR se corrió luego en geles de agarosa

1%(ThermoScientific) en buffer TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1X por 30 minutos,

visualizándose las bandas debido a la presencia del agente intercalante

bromuro de etidio en el gel (Sigma-Aldrich). Se comparó con el marcador de

peso molecular GeneRuler DNA LadderMix (Fermentas).

Expresión de VHHs vectores pET28a+ modificados:

Se tomaron clones individuales de los VHHs clonados en los vectores pET

modificados (positivos por Colony PCR) y se crecieron en tubos; cada uno

con dos mL de LB (Sigma-Aldrich) suplementado con kanamicina 40 µg/mL

y D-biotina 100 µM (Amresco) a 37ºC con agitación, hasta una OD600~0.6.

Se indujo la expresión del VHH adicionando IPTG (isopropil-β-

tiogalactósido, Sigma-Aldrich); comenzando con 1000 µM y realizando

diluciones al tercio; dejando el último tubo como control de inducción basal

(0 µM IPTG). En caso de ser una cepa co-transfectada con los vectores que

contienen la BirA, se adicionó además, ampicilina (100 µg/mL) y

cloranfenicol (35 µg/mL).Se agregó también L-arabinosa 0,04% (Sigma-

Aldrich) al inicio en caso de ser necesaria (expresión BirA regulada por

operón arabinosa). Siempre que se trabajo con alguno de los vectores

derivados de pET se utilizaron bacterias E.coli de la cepa BL21 (DE3)

(Novagen).

La inducción se llevo a cabo por tres horas en las mismas condiciones, luego

de las cuales se extrajo una alícuota de 1 mililitro a los efectos de evaluar la

influencia de la concentración de IPTG sobre la producción del VHH y sobre

la biotinilación del mismo. Se centrifugó dos veces a 6000 g (temperatura

ambiente), y se resuspendió el pellet bacteriano en 200 µL de B-PER®

(Bacterial Protein Extraction Reagent; ThermoScientific); se vortexeó por 5

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minutos, y se deja ON (overnight, toda la noche) a -80 ºC. Al día siguiente se

continúo con el protocolo del reactivo con el fin de separar las fracciones

proteicas solubles e insolubles. Alícuotas de las mismas se separaron por

SDS-PAGE 12.5% en running buffer 1X (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0.1%

SDS) y tiño con solución de azul de coomasie.

Protocolos de ELISA

-Evaluación de la respuesta de anticuerpos de la llama inmunizada con los

AVVs: Se sensibilizó una placa de ELISA (Greiner Bio-One) con 3 µg/mL de

cada antígeno (AAV5) en PBS (Buffer Fosfato Salino) 1X O.N (overnight,

toda la noche) a 4ºC (100 µl/pocillo). Al otro día se bloqueó con BSA 1%

(300 µL/pocillo), por una hora a 37 ºC, luego de la cual se incubó con

diluciones seriadas del suero de la llamas obtenido luego de cada

inmunización (se empezó con una dilución 1/100 y al medio desde allí en

PBS-BSA 1%, 100 µL/pocillo), por 1 hora a temperatura ambiente con

agitación. Luego se incubó con un suero policlonal de ratón anti-

inmunoglobulinas de llama desarrollado en la cátedra (1/5000) en PBS-BSA

1% (100 µL/pocillo) por una hora a temperatura ambiente y con agitación. Se

incubó después con una dilución de un anticuerpo anti-ratón (hecho en

cabra) conjugado a la peroxidasa (ThermoScientific; 0,8 mg/mL) diluido

también en PBS-BSA 1%, al que se le agregó 1/1000 de suero naive de la

misma llama (100 µL/pocillo). Esto último es necesario para disminuir el

background de la técnica. Esto se dejó una hora a temperatura ambiente con

agitación. Entre cada paso se lavó con PBS-Tween 20 (Poly ethylene glycol

sorbitan monolaurate, Sigma-Aldrich) 0.05% (PBS-T).

-Determinación del grado de biotinilación de los VHH por ELISA: Se

sensibilizaron placas de ELISA (con TCC-BSA 1 µg/mL (reactivo generado

en el laboratorio) en PBS O.N a 4ºC (100 µL/pocillo). Al otro día se bloqueó

con BSA 1% en PBS por una hora a 37ºC (300 µL/pocillo), luego de la cual

se incubó con diluciones seriadas de los VHHs; ya sea sobrenadantes o

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preparaciones purificadas, en PBS-BSA 0,1% (100 µL/pocilo) una hora a

temperatura ambiente. Se incubó luego con estreptavidina-peroxidasa 0,1

µg/ml (ThermoScientific), mismas condiciones que en el paso anterior (100

µL/pocillo). Entre cada paso se lavó con PBS -T.

-Selección de clones positivos anti-AVVs por ELISA y título: Se

sensibilizaron placas de ELISA con 3 µg/mL de AAV5 (o AAV8) en PBS O.N

a 4ºC (100 µL/ pocillo). Al otro día, se bloqueo con BSA 1% (300 µL/pocillo)

por una hora a 37 ºC. Luego se incubó con diluciones del los sobrenadantes

o preparaciones purificadas en PBS-T/BSA 0.1% (100 µL/pocillo) por una

hora a temperatura ambiente y con agitación. Posteriormente se incubó con

un anticuerpo monoclonal especifico para el tag de HA (Hemaglutinina de

influenza) conjugado a la peroxidasa (Roche, 25 mU/mL) en caso de haber

sido producido desde el vector pComb3X; o con streptavidina conjugada a

peroxidasa (0.1 µg/mL) en caso de proceder del vector pINQ.Bt.H6, o ser

nanobodies purificados; en PBS -BSA 0.05% (100 µl/pocillo) por una hora a

temperatura ambiente y con agitación. Entre cada paso se lavó con PBS -T.

En todos los casos de los ELISAs descriptos la actividad de la peroxidasa se

determino (100 µL/pocillo) utilizando una solución sustrato de la enzima que

consistió en 0.4 mL 6 mg/mL de TMB (3,3'5,5' tetrametil-bencidina), 0.1 mL

de 1% H2O2 en 25 mL buffer acetato pH 5,5. La reacción se detuvo con

H2SO4 2N (50 µL/pocillo) a los 15 minutos para leer a 450nm en equipo

FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Germany). Una vez que se obtuvieron los

datos, se graficaron en el programa Microcal Origin 6.0 las diluciones

utilizadas o los clones evaluados en función de la absorbancia a 450nm

(datos crudos o normalizados según caso). En caso de realizarse diluciones

seriadas, los datos se ajustaron a una curva sigmoidea (en función de la

dilución o de la concentración de los VHHs) y se calculó un valor medio que

consideraremos como el Título, siendo este el 50% del valor inicial de la

seña.

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Estudios del porcentaje de Biotinilación:

Para la purificación por mini-columnas de estreptavidina conjugada a

agarosa (Pierce), se incubaron las fracciones solubles de los VHHs

biotinilados in vivo, in vivo+in vitro o controles (100% y 0% biotinilado);

previamente purificados por columna de Níquel-NTA como se verá en el

punto Producción y purificación de VHHs.

Estos controles se generaron produciendo el nanobody T9 en las

condiciones ya mencionadas en Expresión de VHHs vectores pET 28a+

modificados. Brevemente, se indujo únicamente con 10 µM de IPTG; se

realizó el proceso sin el agregado de D-biotina (control negativo; 0%

biotinilación) o con el agregado de D-biotina; y se purificó la proteína

obtenida en dos pasos; el primero por resina de agarosa-streptavidina-

muteina (Pierce) con lo que se obtiene únicamente la fracción biotinilada

(control positivo; 100% biotinilación). El uso de esta estreptavidina-muteina

permite la elusión del VHH biotinilado a través de la competencia con D-

biotina libre. Esta competencia es posible debido a que la estreptavidina-

muteina presenta una afinidad por la biotina del orden nM, en comparación a

la afinidad fM de la avidina convencional lo cual impide que sea imposible

romper la interacción biotina-avidina en condiciones nativas.

Los ensayos de captura para la determinación del porcentaje de biotinilación

con la agarosa-estreptavidina se realizaron según instrucciones del

fabricante. La resina se incubo con 10 µg del VHH previamente purificado

por Níquel-NTA (crecido en las condiciones descriptas), se permitió la

interacción por treinta minutos, ce centrifugo la resina a 3000 g por 5 minutos

y se guardo el “sobrenadante” (fracción no retenida) con la estreptavidina-

agarosa. La resina se sometió a 5 lavados con PBS, y finalmente la resina

se resuspendió en 30 µL de buffer de corrida de SDS-PAGE y se hirvió por

50 minutos para eluir la fracción de nanobody biotinilado (fracción retenida).

Las diferentes fracciones (fracción retenida; no retenida y la muestra inicial)

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se separaron en gel de SDS-PAGE 12.5% para evaluar el porcentaje de

biotinilación.

Para estudiar cómo afecta la concentración de D-biotina sobre la biotinilación

in vivo de los nanobodies; se produjo el T9 de la misma forma descrita

anteriormente (Ver Expresión de VHHs vectores pET 28a+ modificados) y

se indujo únicamente con 10 µM de IPTG, en cepa E.coli BL21 (DE3)

electroporada con los vectores pINQ.Bt.H6 y pBir, en medio LB-

kanamicina/cloranfenicol y arabinosa Se fraccionó la producción total

obtenida, y se realizó la post-biotinilación con distintas concentraciones de

D-biotina final (1 mM-0.3 µM), incubando dos horas a 37 º con movimiento

de rotación Se centrifugó y el pellet se resuspendió en B-PER®; se

realizaron los procesos ya descritos para separa las fracciones soluble e

insoluble (Expresión de VHHs vectores pET 28a+ modificados) y se

estudió la reacción por ELISA de la fracción soluble.

Producción y purificación de VHHs.

Se preparó por cada clon medio litro de LB en un matraz de 2 L y se

suplementó con kanamicina, cloranfenicol, D-biotina y arabinosa a las

concentraciones ya mencionadas. Se crecieron del mismo modo ya descrito

en Expresión de VHHs vector pET 28a+ modificados y se indujo

únicamente con 10 µM de IPTG (30 µM en caso de biespecífico). Luego de

tres horas se centrifugó a 6000 g por 20 minutos a 4ºC, se descartó el

sobrenadante y se resuspendió el pellet obtenido en 25 mL de PBS

suplementado con 100 µM de D-biotina. Para post-biotinilar, se procedió a

sonicar el extracto obtenido en sonicador Omni-Ruptor 400, por 15 minutos a

máxima potencia y pulsos de 30% y luego se dejó en estufa a 37ºC por dos

horas con movimiento de rotación. Luego de estas dos horas, se guardó

todo a -80 O.N. El día siguiente se realizó la purificación por columna de

Níquel-NTA en equipo AKTA Purification Sistem (GE Helthcare, Uppsala,

Sweden).Para esto; el extracto obtenido se descongeló y se centrifugó a

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Lucía Alfaya


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18000 g y 4ºC, dos veces por media hora; el sobrenadante obtenido se filtró

por 0.22 µm (MILLEX® GV Filter Unit).Esto se pasó entonces por columnas

de Níquel-NTA (GE Helthcare, Uppsala, Sweden), y se eluyó con gradiente

de imidazol (20 mM, 30 mM y 500 mM) para lograr despegar el anticuerpo

unido por completo. Se evalúo la corrida por medio de la medida de

absorbancia a 280nm. Las fracciones en las cuales el VHH eluyo (picos) se

juntaron y se pusieron a dializar en membranas de celulosa (Sigma-Aldrich)

contra PBS durante un día entero, con agitación y a 4ºC, realizándose 3-4

cambios de buffer entre medio .Al otro día se midió la concentración de los

clones en Nanodrop (NanoDrop 100 Spectophotometer, ThermoScientific),

por medio de la absorbancia a 280nm.

Generación de biblioteca de fagos:

Una llama (Llama glama) macho adulta (#1115) pertenecientes al parque

Lecoq de la Intendencia Municipal de Montevideo se inmunizó siguiendo

protocolos aprobados de experimentación animal, por vía intramuscular con

1 mg de cápside viral AAV5 inactivada por luz ultravioleta, en adyuvante

incompleto de Freund (Simga-Aldrich) al día 0 seguido por 3 boosters cada

~3 semanas. Un mes luego del último booster se extrajo sangre (~250 mL)

con anticoagulante. Se separaron 10 mL de esta sangre en tubos falcon de

15 mL (Greiner Bio-One) para poder extraer el suero por medio de

centrifugación (con el cual se realiza el título de anticuerpos, Ver Protocolos

de ELISA).

Se purificaron las células mononucleares de sangre periférica por

centrifugación en gradientes de Ficoll-Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich)

siguiendo instrucciones del fabricante. Las células se contaron por cámara

de Neubauer, debiendo llegar a ~107 para la correcta generación de la

biblioteca. Con estas células se realizó la extracción del ARN total usando el

reactivo de Trizol®, (ThermoScientific) y determinó la concentración por

absorbancia a 260nm en Nanodrop y se evalúo la calidad de la extracción

mediante electroforesis en gel de agarosa 1%. Mediante la técnica de RT-

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Diciembre 2015

PCR (Retrotranscripción seguida por PCR), se generó el ADN copia (cDNA)

de todos los mensajeros celulares usando como primer el Oligo (dT) 18

(ThermoScientific), el cual tiene una secuencia complementaria a la cola de

poli-adeninas. Para la reacción se utilizaron ~41 µg de ARN total, y se siguió

el protocolo de la enzima RevertAid M-MuLV RT (ThermoScientific). El DNA

copia se se amplificó con la enzima Taq polimerasa con el primer reverso JH

y los primers forward VH1, VH3 y VH4 [102, 103] y se purificaron los genes

de VHHs obtenidos por kit comercial. Estos se digirieron con la enzima de

restricción Sfi I (Thermo Scientific) por 2 horas a 50ºC y se purificaron por

gel para luego ser clonados en el vector fagémido pComb3X cedido por el

Dr. Barbas (Scripts Research Institute, La Jolla, USA) previamente digerido

con Sfi I, purificado y defosforilado (con la enzima rSAP, (New England

Biolabs).La población de VHHs se clono en el vector pComb3X con la T4

ligasa, O.N a 16 ºC (~12 µg de vector con 4 µg de inserto). A la mezcla de

ligación se le adiciono 5 µg de glicógeno (Roche) para facilitar su

visualización y precipitó en etanol 100% y almaceno a -80°C. Al día

siguiente, se centrifugó 30 minutos a 14600 g, se descarto el sobrenadante,

y el pellet se lavo dos veces con etanol 70% dos veces. Finalmente, se

evaporo cualquier remanente de etanol incubando las muestras por 3

minutos en speedVack (Itegrated SpeedVac Sistem, ISS 100, Savant). El

pellet se resuspendió en 20 µL de agua calidad biología molecular (Sigma-

Aldrich).

Con este vector que representa la biblioteca de nanobodies se realizaron 8

elctroporaciones, usando en cada una 3 µL de la ligación con 25 µL de

células electrocompetentes comerciales de la cepa E.coli ER 2738

(F′proA+B+ lacIq Δ (lacZ) M15 zzf: Tn10 (TetR)/fhuA2 glnV Δ (lacproAB) thi-

1 Δ (hsdS-mcrB)5) (Lucigen Corporation, Middleton, WI, USA) en 2 mL de

medio LB conteniendo 0.25% K2HPO4, 0.1% MgSO4, 0.1% glucosa. La

mezcla de electroporación se incubo con agitación a 300 rpm y después de

una hora se transfirió a medio LB conteniendo 100 ug/mL de ampicilina.

Cuando las bacterias alcanzaron la fase de crecimiento exponencial, se

infectaron con el fago helper M13K07 (Pharmacia Biotech), dejando que

34

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

crezcan O.N en presencia de kanamicina 40 µg/mL. Al día siguiente el

cultivo se centrifugó por 20 minutos a 6000 rpm, y se utilizo el sobrenadante

para precipitar la biblioteca de nanobodies expresados en la superficie de

fagos utilizando 0.2 volúmenes de 20% PEG 8000 (Poli Etinel Glicol,

Applichem), 2.5 M de NaCl, e incubo en hielo. Luego de una hora se

centrifugo por 30 minutos a 4°C a 18.000 rpm, descarto el sobrenadante y el

pellet se resuspendió en 15 mL de BSA 1% en PBS, se esterilizo por

filtración por 0.22 µm y se agregó inhibidor de proteasas (Roche Diagnostic)

para mantener la integridad de la fusiones de nanobodies a la proteína a

viral.

Panning contra AAV5 y screening de clones positivos en pComb3X:

Pocillos de ELISA fueron sensibilizados con las partículas AAV5 en PBS

estéril a 10 µg/mL O.N a 4ºC (100 µL c/u, 3 pocillos), y se bloquearon con

BSA 3% en PBS (300 µL c/u) estéril a 37ºC. Luego de una hora los pocillos

se lavaron con PBS-T y se incubaron con 100 µL de la biblioteca (100 µL

c/u) por una hora y media a 25ºC con agitación. Luego de esto se descarto

la fracción de la biblioteca que no interacciono con el antígeno y se

realizaron 5 lavados de 1 minuto con PBS-T, seguido por 4 lavados de 15

minutos con agitación, el último realizado por PBS-BSA 3% estéril para

descartar interacciones con el bloqueante.

Por último, se eluyeron los fagos que interaccionaron con los AAV5 de cada

pocillo con tripsina (Sigma-Aldrich) 10 mg/mL (100 µL/pocillo) por 30 minutos

a 37ºC. Esto es lo que se denominara de aquí en adelante como “Output” u

”Out”). Este material se amplifico siguiendo el protocolo descripto por Barbas

III, Phage Display: A Laboratory Manual, protocol 10.5 [32]. Brevemente,

este paso consistió en infectar células ER 2738 en fase exponencial con 100

µL de los fagos obtenidos en la primera ronda de selección (Out 1). Estas

células se incubaron en LB en presencia de ampicilina 100 ug/mL por dos

horas y luego se “super-infectaron” con fago helper para que sea posible la

formación de partículas virales recombinantes. Al día siguiente, el cultivo se

35

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

centrifugo para remover el pellet y el sobrenadante se utilizo para precipitar

las partículas virales como se describió anteriormente. Este material es lo

que denominamos como “AMP” o “Amplificado”.

Con el amplificado ser realizó una segunda ronda de panning y

enriquecimiento, sobre pocillos de ELISA sensibilizados con 1 µg/mL de

AAV5 en PBS estéril y se incubó con el amplificado 1 diluido al quinto en

BSA 1% en PBS por una hora a temperatura ambiente con agitación. Se

lavó 5 veces con PBS-T estéril por 30 minutos con agitación (el último lavado

con BSA 3% en PBS) y se incubó con el AAV5 soluble (50 µg/mL en PBS

estéril) por 2 horas a temperatura ambiente y con agitación. Luego de esto

se volvieron a realizar los lavados, dejando con PBS-T estéril O.N con

agitación a temperatura ambiente, cambiando el medio cada hora. Se

procedió a eluir y titular al día siguiente (Out 2).

La titulación de partículas virales se realizó infectando 100 µL de células ER

crecidas hasta una O.D600~1 en SB (Super Broth- (3,2 % peptona extracto

de levadura 0,5% NaCl) suplementado con tetraciclina (Sigma-Aldrich) 10

µg/mL, con 10 µL de diluciones seriadas, desde (-7 hasta -10 en medio SB

para la amplificación y desde -1 hasta -4 para el Out).

El screening de clones positivos específicos para los AVV se realizó con diez

de las colonias obtenidas del Out 2 al azar y se crecieron 750 µL/cu en

bloques de cultivo (masterblock, Greiner Bio-One) en medio SB-ampicilina

(100 µg/mL). Los inóculos de bacterias se crecieron a 37 ºC en shaker hasta

una O.D600~0.8, a la cual se indujo la expresión de los nanobodies con IPTG

(1 mM), e incubo O.N en shaker a 37ºC (~16 hs).Al otro día, el bloque se

centrifugó a 4ºC por 30 minutos a 4000 g para bajar el pellet de células (que

se resuspendieron en 100 µL de LB-Glicerol 10% Sigma-Aldrich) y se

guardaron a -80°C como respaldo de las colonias evaluadas).Nos quedamos

con el sobrenadante para realizar un ELISA (Ver Protocolos de ELISA).

36

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Clonado en vector de expresión pINQ.Bt.H6:

Se partió del Out 2 del panning contra AAV5 y se realizó el proceso de

amplificación en ausencia de helper y kanamicina; agregando en su defecto

mas ampicilina (100 µg/mL). Al día siguiente se centrifugó a 4000 g por 30

minutos a 4ºC y nos quedamos con el pellet de bacterias ER que contiene

los genes codificantes de los VHH anti AAV5. Se realizaron minipreps con un

kit comercial (GeneJET Plasmid Miniprep Kit, ThermoScientific) para poder

purificar el plásmido pComb3X (DNA fagémido que contiene la población de

nanobodies del segundo OUT). Cien ng de este DNA se utilizó como molde

para una reacción de PCR convencional con la enzima Taq polimerasa junto

con los primers capaces de unirse a los sitios Sfi I flanqueantes al VHH así

como a las secuencias del inicio o final de los VHHs (Ver Anexo 2). La

reacción de PCR se purificó con kit comercial (GeneJET PCR Purification

Kit, ThermoScientific), y se digirió con la enzima de restricción Sfi I por 2

horas a 50ºC, luego de lo cual se purificó por gel (GeneJET Gel Extraction

Kit, ThermoScientific). Los fragmentos digeridos de aproximadamente 400

pares de bases se clonaron en el vector pINQ.Bt.H6 previamente digerido

por Sfi I, defosforilado y purificado por gel. Esto se realizo utilizando la T7

ligasa en las mismas condiciones anteriormente descriptas. Un µL de la

mezcla se ligación se utilizo para electroporar bacterias electrocompetentes

E.coli de la cepa BL21 (DE3)/pBir (45 µL con 1 µL de ligación).Se plaqueó

en medio LB-agar conteniendo kanamicina (40 µg/mL) y cloranfenicol (35

µg/mL) para obtener colonias aisladas. La cepa BL21 (DE3)/pBir sobre

expresa la enzima BirA bajo el control de L-arabinosa.

Para el screening de clones positivos por AAV5, de las placas obtenidas de

la electroporación y plaqueó, se crecieron 96 colonias elegidas al azar en

masterblock. Se siguió el protocolo descripto en la sección “Expresión de

VHHs vectores pET 28a+ modificados”; usando únicamente la

concentración de 10 µM de IPTG como inductor de la expresión de los

nanobodies. El bloque se incubo con agitación en shaker a 37ºC por ~16 hs,

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

luego de las cuales se centrifugó y se realizó el ELISA con el sobrenadante

obtenido (Ver Protocolos de ELISA).

PCR de overlap para la generación de nanobodies biespecíficos:

Se crecieron 15 mL del clon elegido anti-AAV5 en LB-

kanamicina/cloranfenicol O.N a 37ºC con agitación; al otro día se centrifugó;

quedándonos con el pellet bacteriano, con el cual se realizó una miniprep

con kit comercial (ThermoScientific) seguida por una reacción de PCR

convencional (30 ciclos, T annealing 60ºC) con primers específicos para

realizar el overlap (Ver Anexo B); se usó la enzima Pfu DNA Polimerasa

(ThermoScientific). Se usó el gen del VHH V36 (anti-CD11b), previamente

amplificado por PCR convencional con un segundo juego de primers

especialmente diseñados (Ver Anexo B) para poder realizar la

superposición de los fragmentos mediante la secuencia complementaria de

uno de estos primers con uno de los primers usados para amplificar el VHH

anti-AAV5 elegido. Con los dos insertos amplificados, se hizo PCR de

overlap (protocolo de PCR tradicional pero sin primers) seguido por una

amplificación del fragmento final de 800 pb (pares de bases) generado,

usando primers capaces de unirse a los sitios de inicio y final del inserto y

que a su vez poseen sitios de corte para la enzima Sfi I (Ver Anexo B). Se

purificó este amplificado por kit comercial y se digirió con la enzima Sfi I por

dos horas a 50ºC. Se purificó por gel y se ligó luego en vector pINQ.H6.Bt

por medio de la T4 ligasa. Se electroporó en BL21 (DE3) pBir y se plaqueó

en placas de LB-agar con kanamicina/cloranfenicol. Al día siguiente se

realizó colony PCR con las colonias obtenidas en la electroporación

Citometría de flujo:

Se incubaron ~2x105 macrófagos (línea J744.A1. ATCC) con diluciones

seriadas decrecientes de los VHHs purificados (42-V36, V36, 42 y control

negativo) iniciando en 3 µg/mL y al tercio en PBS-BSA 0,1% desde allí. Se

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

incubó por una hora a 4ºC. Se verificó si hubo unión por medio de la

reacción del tag de biotina presente en los nanobodies con estreptavidina

conjugada a la proteína fluorescente ficoeritrina (PE) (Pierce); se incubó en

las mismas condiciones que en el paso anterior. Entre cada paso se

realizaron 3 lavados con PBS-BSA 0.1% Los parámetros de citometría se

adquirieron en el equipo FACSCalibur (BD Bioscience), en el canal FL2

(emisión PE). Se siguió con un análisis con el programa FlowJo

(TreeStar).Se graficó la fluorescencia media de cada pico (MFI) en función

de la concentración de anticuerpo, se modeló la reacción como una

sigmoidea y se calculó el título como 50% señal inicial usando el programa

Microcal Origin. 6.0.

Interferometría de Biocapa:

La reactividad contra la partícula viral libre se estudió por interferometría de

biocapa-BLItz® (fortéBIO). Para esto se utilizó un sensor con estreptavidina

conjugada (SA), y se hizo uso del tag de biotina que poseen los VHHs

producidos. En este sensor se cargó el VHH 42 biotinilado (monomérico, en

concentración de 100 µg/mL) y una vez cargado se incubó a con una

suspensión de partículas virales de AAV5 (100 µg/mL). Luego de esto, en

forma similar se incubó con el BiAb biotinilado (misma concentración que el

anticuerpo monomérico). Se verificó en cada agregado la correcta unión de

las moléculas agregadas.

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

5-RESULTADOS Y DISCUSIÓN

EFECTO DE LA COMPARTIMENTACIÓN EN LA BIOTINILACIÓN DE LOS VHHs

Como se menciono al inicio del trabajo, el primer objetivo consistió en

optimizar un sistema de biotinilación in vivo de los nanobodies. Para esto

utilizamos un vector de expresión procariota, denominado pINQ.Bt.H6,

basado en la arquitectura del vector comercial pET28a+ (Novagen) [98].

Este vector contiene las siguientes modificaciones (Ver Anexo A):

-Una secuencia de direccionamiento periplasmática o péptido líder,

(OmpA, derivado de una proteína nativa de E.coli (Outer Membrane Protein

A), para que los nanobodies sean dirigidos al espacio perisplasmático de

E.coli, donde el ambiente redox es óptimo para la correcta formación de

puentes disulfuro de los anticuerpos.

-Dos sitios de restricción para la enzima de restricción Sfi I que va a

permitir el clonado direccional de los nanobodies a partir del vector fagémido

pComb3X. Esto es posible debido a que enzima reconoce la secuencia

GGCCNNNNNGGCC, donde N representa cualquiera de las 4 bases. Se

utilizo esta característica de la enzima para que el primer sitio sea diferente

del segundo, y entonces el VHH se clone únicamente en la orientación

correcta.

-Una secuencia de 15 aminoácidos (pepBiot/AviTag), capaz de ser

biotinilada in vivo en un residuo de lisina por acción de la enzima biotina

ligasa (BirA) de E.coli. Esto permite conseguir nanobodies biotinilados sitio

especifica en simultáneo a su expresión.

-Una secuencia de 6 histidinas (“cola de histidinas”) que permite la

purificación de los nanobodies por cromatografía de afinidad (IMAC)

utilizando columnas de Níquel-NTA.

Para trabajar con este sistema propuesto hay que tener dos

consideraciones:

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

1) El nivel de expresión de la enzima BirA endógena de E.coli es muy

bajo, por lo que es necesaria su sobreexpresión para lograr grandes

rendimientos de producto biotinilación.

2) Esta enzima es citoplasmática y los nanobodies son expresados en el

periplasma, lo que dificulta la actividad de la enzima sobre el VHH.

En base a esto, se decidió evaluar diferentes sistemas de expresión con el

objetivo de maximizar la cantidad de anticuerpo biotinilado, expresando

ambas proteínas en el espacio (i) citoplasmático, (ii) periplasmático y (iii)

citoplasmático/periplasmático. Para el estudio de estas combinaciones se

usó como modelo el VHH T9, producido y caracterizado previamente en el

grupo de laboratorio, que es específico para el hapteno triclocarban (TCC) y

se expresa en el periplasma de E. coli con muy buen rendimiento [99].

Clonado de VHH T9 para expresión citosólica

Los vectores utilizados se generaron a partir de la modificación del vector

comercial pET28a+. Este vector es la base de varios de los sistemas de

expresión usados en este trabajo; posee resistencia al antibiótico

kanamicina, y la expresión de la proteína recombinante es inducible por

IPTG (isopropil-β-tiogalactósido). Para la expresión, se eligió la cepa

bacteriana E.coli BL21 (DE3) (Novagen) la cual funciona de modo óptimo

con el sistema de expresión basado en vectores pET. Esta cepa posee

diversas ventajas: una alta eficiencia de transformación, la inclusión en su

genoma del gen de la polimerasa del fago T7 (inducible por operón Lac) que

permite una alta eficiencia de expresión y tiene una menor actividad

proteolíca, entre otras. La principal ventaja, no obstante, es poseer el gen de

la polimerasa T7 del fago lamda clonado en fase con el gen laclq en el

cromosoma bacteriano; al ser la bacteria transfectada con un plásmido que

posea el promotor de dicha polimerasa (como lo es el pET modificado que

utilizamos, ver Anexo A) logramos que al inducir con IPTG se exprese la

proteína en cuestión (T7 polimerasa), la cual reconoce su promotor

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

específico en el vector y permite entonces una mejor trascripción del inserto

deseado (el VHH en este caso).

El punto de partida fue el VHH T9 clonado en el vector pINQ.Bt.H6 para la

expresión periplasmática, ya presente en el laboratorio. A partir de éste se

amplificó el gen del VHH T9 sin el péptido líder y se clonó en el pET28a+

para generar la construcción pINQ.Cit.Bt.H6 (Cit por citoplasmático). La

eficiencia de clonado se consideró aceptable cuando el número de

transformantes era al menos 10 veces superior al control (vector religado en

ausencia del inserto). Posteriormente, la presencia/ausencia del inserto (de

400 bp) en las colonias bacterianas elegidas se verificó directamente sobre

las mismas por colony PCR (Figura 12). Se selección una colonia positiva

para realizar la extracción del DNA plasmídico y posterior secuenciación, y

una vez que se verificó la secuencia se guardó un stock de la misma en LB-

glicerol 10 % a -80 °C hasta posterior uso.

Expresión citoplasmática y periplasmática de T9

Se comparó la expresión del VHH T9 en el citoplasma (pINQ.Cit.Bt.H6) y en

el periplasma (pINQ.Bt.H6) en la cepa BL21 induciendo los clones con el

agregado de IPTG a distintas concentraciones. Se analizó la fracción soluble

por SDS-PAGE (Figura 13) donde sólo se observó expresión significativa de

T9 al expresar el VHH en el periplasma en concentraciones de 1.0-0.03 mM

de IPTG, confirmando necesidad de contar con el ambiente redox de este

compartimiento para un correcto plegamiento del VHH. A partir del agregado

de 30 µM de IPTG se observó presencia de VHH en la fracción insoluble

MPM CN 1 2 3 4 5 6

3000 1000 500

VHH T9

400 pb

Figura 12: Colony PCR de BL21

electroporadas con

pINQ.Cit.Bt.H6: Resultados

positivos marcados en rojo.

CN=Control Negativo,

MPM=Marcador Peso Molecular

(pb=pares de bases)

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

periplasmática. En la fracción citoplasmática no hay producción del VHH en

ninguna de las condiciones estudiadas; tanto de modo soluble como

insoluble, a pesar de estar este correctamente clonado en el vector

(verificado por medio de secuenciando) y electroporado en la bacteria.

Figura 13: Análisis por SDS-PAGE de la expresión de VHH T9 en la fracción soluble

del pellet bacteriano: Expresión periplasmática (arriba) y citoplasmática (abajo).La

flecha roja indica la posición y el peso aparente esperado para el VHH T9 (~20 kDa). Las

condiciones con niveles de expresión satisfactoria se recuadran en rojo. MPM=Marcador

Peso Molecular.

[IPTG] 1000 300 100 30 10 3 1 0 MPM

µM

[IPTG] 0 1 3 MPM 10 30 100 300 1000

µM

62,0 45,0 35,0 25,0 18,4

14,4

62,0 45,0 35,0 25,0 18,4

14,4

VHH ~20 kDa

VHH ~20 kDa

43

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Co-Expresión de BirA y efecto de la compartimentación celular

El hecho de que el nanobody no se exprese en forma soluble en el

citoplasma impide su co-expresión con la BirA en este compartimento que es

el entorno natural de expresión de la enzima. Por otro lado, al producirla BirA

en el periplasma podría afectarse la funcionalidad de la enzima. Sin

embargo, de ser posible expresarla, aun en menor medida, esto permitiría la

interacción directa con el VHH favoreciendo su biotinilación. Para explorar

esta posibilidad nos propusimos sobre-expresar la enzima BirA co-

expresándola con el VHH modelo en el periplasma, y comparar el grado de

biotinilación alcanzada respecto al sobre-expresión de BirA en el citoplasma

y el VHH en el periplasma. A su vez, intentamos controlar el nivel de

expresión de la BirA utilizando diversos sistemas de expresión, acoplado la

expresión de la enzima o no al sistema de la T7 polimerasa ya discutido. La

enzima estará entonces bajo el control de IPTG (operón lac) y de la T7

polimerasa o no (operón ara, regulado por L-arabinosa) variando entonces la

cantidad producida. En el caso de la inducción con arabinosa, esta se realizó

previamente a la inducción del VHH con IPTG, antes de la etapa de

crecimiento exponencial, a modo de dejar el tiempo necesario para que se

produzca suficiente enzima para biotinilar el VHH que se producirá bajo el

control del promotor fuerte del sistema pINQ.Bt.H6 /BL21 (DE3). En el caso

de la inducción con IPTG, esta es llevada a cabo en simultáneo con la

inducción del VHH con distintas concentraciones de inductor. El proceso se

lleva adelante con una suplementación del medio con D-biotina 100 µM para

que se realice correctamente la biotinilación in vivo.

A estos efectos generamos cuatro vectores distintos capaces de expresar la

enzima en los distintos compartimientos y reguladas por un inductor distinto.

Con estos generamos seis modelos de expresión diferencial de la enzima a

evaluar; que en todos los casos están co-transformado con del VHH T9

clonado en el pINQ.Bt.H6 (expresión periplasmática), los cuales son:

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

1) Control Negativo: BL21 (DE3) sin co-expresión de BirA (solo

enzima endógena o “wt”)

2) BirA expresión citoplasmática, inducida por arabinosa

(vector pBir)

3) BirA expresión periplasmática, inducida por arabinosa

(vector pBir.peri)

4) BirA expresión citoplasmática, inducida por IPTG (vector

pBir.IPTG)

5) BirA expresión periplasmática, inducida por IPTG (vector

pBir.IPTG.peri)

6) BirA expresión doble, citoplasmática/periplasmática,

inducida por Arabinosa (vector pBir/pBir.peri).

Se expresaron las proteínas en cada caso siguiendo el proceso visto

anteriormente, y para cada punto de las curva de IPTG, se corrieron geles

SDS-PAGE de las fracciones solubles e insolubles obtenidas para verificar la

presencia de VHH y enzima (en caso de verse esta al estar sobreproducida,

(Figura 14, inferior). Con la fracción soluble a su vez se realizaron curvas

de ELISA con el fin de poder comparar los sistemas de biotinilación de las

distintas condiciones. Sabemos que cuanto más eficiente sea el proceso,

esto generara un mayor marcado con biotina y por lo tanto una mayor señal

–y mayor título- al revelar con estreptavidina-peroxidasa en el ELISA.

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Figura 14: Gel SDS-PAGE 12,5 % para verificar la presencia de VHH y BirA: Control

BL21 wt, BirA endógena: (arriba) BirA expresión citoplasmática, Inducida por IPTG

(abajo): Se corrieron 28 µL de extracto soluble (1X) y 7 µL de extracto insoluble (4X). VHH

marcado en rojo (~20 kDa), BirA marcada en verde (~35 kDa), derecha. Cs=Control soluble,

extracto soluble BL21 control inducido con 30 µM de IPTG Ci= Control insoluble, extracto

soluble BL21, inducido 30 µM IPTG. MPM=Marcador Peso Molecular.

Como se observa en los geles; la producción del T9 se inicia con 3-10 µM

de IPTG y a partir de 30 µM, la producción del VHH se ve aumentada de tal

manera que gran cantidad empieza a agregarse y aparecer en la fracción

insoluble. Este patrón se observa en todas los sistemas de producción

SOLUBLE INSOLUBLE [IPTG] Cs 0 3 10 30 100 300 Ci 0 3 10 30 100 300 MPM

µM

45,0 35,0 25,0 18,4

14,4

SOLUBLE INSOLUBLE [IPTG] 300100 30 10 3 0 300 100 30 10 MPM 3 0

µM 62,0 45,0 35,0 25,0 18,0

14,4

VHH ~20 kDa

BirA ~35 kDa

VHH ~20kDa

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

estudiados. La presencia del promotor lac asociado al sistema T7 polimerasa

(inducción IPTG) genera una mayor producción de BirA (corre a ~35 kDa) al

producirse esta en el compartimento citoplasmático, al punto que la proteína

puede ser visualizada en el gel (rango de inducción de 10-300 uM de IPTG).

Sin embargo, la enzima termina toda en la fracción insoluble. Al expresar la

BirA en el periplasma con este mismo promotor esto no observó, y tampoco

se vio su producción al usar el promotor del operón ara en ambos

compartimientos celulares.

El grado de biotinilación alcanzado en las distintas condiciones se evaluó

mediante curvas de titulación por ELISA; utilizando las fracciones inducidas

con 10-300 µM de IPTG (al ser en estas donde se da el pico de producción

del VHH). En la Figura 15 se muestran el título (dilución del extracto que

produce el 50% de señal) obtenido al estudiar las seis condiciones en

función de la concentración de inductor.

Figura 15: Reactividad de T9 biotinilado frente a TCC-BSA por ELISA. Títulos

obtenidos en función de la concentración de IPTG como inductor para las seis

condiciones estudiadas anteriormente. Datos tomados de los ELISAs realizados;

revelando con estreptavidina-peroxidasa

10 30 100 300

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Tít

ulo

Concentración de IPTG (M)

Control BL21 pBir wt

BirA citoplasmática; arabinosa

BirA periplasmática, arabinosa

BirA citoplasmática, IPTG

Bria periplasmática, IPTG

BirA citoplasmática/periplasmática, arabinosa

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Vemos que las condiciones de expresión citoplasmática (inducida por IPTG

o arabinosa) junto con la doble (expresión periplasmática y citoplasmática

expresada por arabinosa) son las que dan una mayor señal en todas las

concentraciones de IPTG probadas como inductor de VHH. Esto mostró que

el compartimiento periplasmático no es óptimo para la expresión y función de

la enzima encargada del proceso de biotinilación.

A modo de confirmar los resultados; se repitió el experimento para los 6

modelos en las concentraciones de 30 y 10 µM de IPTG (mayores títulos en

general), a los efectos de realizar el estudio en paralelo el mismo día y poder

llegar a una mejor conclusión. El análisis por SDS-PAGE de las fracciones

solubles mostró que la producción de T9 es comparable en todos los

modelos de expresión utilizados (Figura 16; producción con 30 µM de IPTG

(resultados similares se obtuvieron con 10 µM de IPTG).

La fracción soluble se tituló por ELISA (Figura 17), y para comparar más

fácilmente se calculó la relación del título obtenido en función del título del

control negativo, Tabla 1.

MPM Ip Ic Ap Ac Cs Ci Ic*

62,0 ´ 45,0 35,0 25,0 18,4

14,4

BirA

35 kDa

VHH

~20kDa

62,0 45,0 35,0 25,0 18,0

14,4

Figura 16: Gel de SDS-PAGE.

Comparación de producción de T9

en distintos modelos, inducción

con 30 µM de IPTG Ip= IPTG

periplasmática, Ic= IPTG

citoplasmática, Ap= Arabinosa

periplasmática, Ac= Arabinosa

citoplasmática, Cs= Control BL21

soluble, Ci= Control BL21 insoluble,

Ic*= IPTG citoplasmática, fracción

insoluble. VHHs marcados en rojo,

BirA marcada en verde. MPM=

Marcador de Peso Molecular.

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Figura 17: Reactividad de la fracción soluble de VHH T9 biotinilado frente a

TCC-BSA por ELISA en los distintos modelos; cuando BirA se expresa en el

citoplasma (arriba) o periplasma (abajo).La concentración de inducción fue 30

uM de IPTG.

10 100 1000 10000 100000 1000000 1E7 1E8

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2O

.D4

50

nm

No

rma

liza

da

, 1

5 m

inu

tos

Diluciones sobrenadante

Control BL21 pBir wt Título=981

IPTG Título= 14969

Arabinosa Título= 18101

Arabinosa citoplasmática/periplasmática Título= 19022

10 100 1000 10000 100000 1000000 1E7 1E8

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

O.D

45

0 N

orm

ali

za

da

, 1

5 m

inu

tos

Diluciones Sobrenadantes

Control BL21 BirA wt Título= 981

IPTG periplasmática Título= 1223

ARa periplasmática Título= 2007

49

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Tabla 1: Comparación de seis modelos de expresión de BirA utilizando distintos

compartimiento celulares y vectores de expresión.

Se verificó entonces que la mejor condición se da al expresar el VHH de

modo periplasmático y la enzima de modo citoplasmático, inducida por

arabinosa 0.04% (aumento 18.4 veces en función al control BL21 (DE3) con

BirA endógena). El uso de asociar la producción al sistema T7 polimerasa

para la expresión de la BirA no parece afectar favorablemente el proceso. A

su vez, la doble expresión de la enzima en ambos compartimientos tampoco

llegó a dar un aumento significativo en relación a la expresión únicamente

citosólica (aumento de 19.4 en relación al control). Al realizar el mismo

experimento realizando la inducción con 10 µM de IPTG se ve el mismo

comportamiento.

Estudios de porcentaje de biotinilación:

Si bien se pudo seleccionar uno de los seis modelos como el más eficiente

en relación a nuestra condición basal; por medio del ensayo deELISA no

podemos saber realmente que porcentaje del anticuerpo total es biotinilado

durante el proceso. Para determinar la fracción total de VHH biotinilado en el

modelo elegido, se comparó el porcentaje de VHH retenido en mini-

columnas de avidina inmovilizada en agarosa, analizando por SDS-PAGE la

fracción retenida y la que no se retuvo; a la vez, se realizó un ELISA y

comparó el título obtenido por estas tres condiciones.

Vectores usados en modelos de expresión BirA

Compartimiento Título Aumento

- Citoplasma 981 1

pBir Citoplasma 18101 18.4

pBir.peri Periplasma 2007 2

pBir.IPTG Citoplasma 14988 15

pBir.IPTG. Peri Periplasma 1223 1.2

pBir/pBir.peri Citoplasma/ Periplasma

19022 19.4

50

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Se vio que en las condiciones establecidas, el porcentaje de VHH biotinilado

no llega a superar el 35% (comparación de título en ELISA), por lo tanto, a

pesar de ser la mejor de todas las condiciones estudiadas; no es un método

eficiente para la implementación deseada.

Aunque las diversas estrategias empleadas para producir la reacción de

biotinilación de manera eficiente in vivo no fueron exitosas, queda aún la

opción de realizar un paso de “post biotinilación” in-vitro con la misma

enzima sobreexpresada BirA en presencia de D-Biotina. Para esto

precisamos romper la célula (por sonicación) luego de la producción del VHH

a la vez que se le agrega más biotina al medio. De este modo forzamos a la

enzima BirA (sobreexpresada en el vector pBir inducible por arabinosa) y el

VHH (expresado en el vector pINQ.Bt.H6) a interactuar entre sí durante dos

horas a 37 ºC con movimiento de rotación (temperatura óptima para la

VHH 100% biot VHH sin biot VHH biotin vivo

VHH

Avidina

Aplicado NR Eluido NR Eluido NR Eluido

Figura 18: Análisis del porcentaje de biotinilación in vivo: Arriba: Análisis por SDS-PAGE de las distintas preparaciones pasadas por mini-columnas de avidina-agarosa. NR= No Retenido. Abajo: Reactividad del VHH T9 purificado contra TCC inmovilizado revelada con estreptavidina-peroxidasa. Como control de 100% biotinilación, se usó una fracción previamente eludía de la resina avidina-agarosa; como control sin biotinilar una fracción crecida sin biotina

25 18 14

10-2

10-1

100

101

102

103

104

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

OD

45

0 n

m,

15

min

ute

s

ng/ml de T9 purificado

Control Positivo (100% biotinilado) Título= 14 ng/ml

Control Negativo Título= 1100 ng/ml

Biotinilzación in vivo Título= 50 ng/ml

51

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

actividad de la enzima) para completar el 70% restante de biotinilación. Para

optimizar el proceso, estudiamos el efecto de la concentración de botina

adicional agregada durante este paso, mediante un ELISA similar al anterior

(Figura 19).

Figura 19: Reactividad de VHH T9 biotinilado contra TCC en distintas condiciones de

post-biotinilación: Arriba: Realizamos un ELISA cuantitativo (superior), agregamos como

control la biotinilación in vivo (expresión BirA citosólica, inducida por arabinosa, 35%

reacción). Abajo: Graficamos a su vez el aumento en la biotinilación en relación a este control

de solo reacción in vivo.

In vivo (30%)0 uM 0,3 uM 1 uM 3 uM 10 uM 30 uM 100 uM 300 uM100o uM

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Au

me

nto

en

bio

tin

ilacio

n e

n fun

cio

n a

l con

tro

l

(In V

ivo, 30

%)

Biotina agregada In Vitro (uM)

101

102

103

104

105

106

107

108

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

100 - 18.577 (1 mM)

30 - 16.622 (300 uM)

10 - 17.895 (100 uM)

3 - 11.700 (30 uM)

1 - 3,600 (10 uM)

0,3 - 1.800 (3 uM)

0,1 - 303 (1 uM)

0,03 - 167 (0,3 uM)

0 - 110

30% - 8703 in vivo

Dilucion de T9biot (V0=1ml)

52

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Vimos que al realizarse el proceso in vitro, a partir del agregado de 100 µM

de D-biotina se notó un aumento significativo en la biotinilación, logrando

mejorar notoriamente la reacción. Eligiendo esta condición, el porcentaje

alcanzado se verificó en forma similar al mencionado más arriba (Figura 20).

Como se observa tanto en el análisis por ELISA como por SDS-PAGE, la

biotinilación in-vitro (pos-biotinilación) dio lugar a un 100% de conjugación de

biotina sobre el VHH.

Figura 20: Análisis del porcentaje de post-biotinilación: Arriba: Análisis por SDS-

PAGE de las distintas preparaciones pasadas por mini-columnas de avidina-agarosa.

NR= No Retenido. Abajo: Reactividad del VHH T9 purificado contra TCC inmovilizado

revelada con estreptavidina-peroxidasa. Como control de 100% biotinilación, se usó una

fracción previamente eluída de la resina avidina-agarosa; como control sin biotinilar una

fracción crecida sin biotina.

VHH

Avidina

Aplicado NR Eluido NR Eluido NR Eluido NR Eluido

VHH100 % biot VHH sin biot Biot in vivo in vivo +

I n vitro

53

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN VHH BIESPECÍFICO (BiAb)

Ya fueron discutidas previamente las ventajas y posibles aplicaciones de

poder obtener un anticuerpo biespecífico capaz de unir dos epítopes

distintos. Se intentó incorporar esta tecnología al grupo de trabajo, con el fin

de lograr generar un BiAb formado por un dominio VHH capaz de reconocer

al virus AAV5 junto a otro dominio capaz de reconocer un receptor de

membrana presenta en células presentadoras de antígeno, con el fin de ser

usado en el futuro como vector de terapia génica, capaz de dirigir el virus a

dicha célula.

Para esto nos valemos de un anticuerpo ya generado previamente en el

grupo de trabajo [98] (V36, capaz de reconocer la cadena CD11b del

receptor del complemento Mac-1). Por otro lado, se procuró obtener el VHH

contra la cápside del virus Ademo-Asociado del serotipo 5 (AAV5),

inmunizando llamas con cápsides inactivadas de estos, y realizando una

biblioteca de fagos; de la cual se seleccionaron VHHs específicos por la

técnica de Phage Display.

El forzar la unión de dos VHH de manera artificial puede generar la pérdida

de función de uno o ambos anticuerpos que generan el constructo, por lo

cual no solo debemos generar el biespecífico sino también probar la

funcionalidad de ambos parátopes ante sus epítopes específicos.

Título de anticuerpos y panning contra AAV5

En primer lugar se verificó que se hayan generado anticuerpos capaces de

reconocer la cápside del AAV5. Esto se estudió por ELISA usando diluciones

seriadas del suero de las llamas extraído previo a las distintas

inmunizaciones (Figura 21). Se realizó en paralelo una placa sensibilizada

con BSA 1% a la que se le aplica el mismo tratamiento como blanco para

comprobar la especificidad de la reacción.

54

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Es interesante notar que la llama ya presentaba una respuesta de

anticuerpos contra este virus previo a la inmunización. Los títulos alcanzados

son muy buenos, aunque debe tenerse en cuenta que el título obtenido se

100 1000 10000 100000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

O.D

45

0n

m, 1

5 m

inu

tos

Diluciones Suero

Naive IC50

= 36

Inm1 IC50

= 15

Inm2 IC50

= 24

Inm3 IC50

= 7

100 1000 10000 100000

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

O.D

45

0n

m;

15

min

uto

s

Dilución Suero

Naive Título= 2644

Inm1 Título= 6881

Inm2 Título= 7825

Inm3 título= 44880

Figura 21: Título de suero de llamas por ELISA luego de tres inmunizaciones. Control

negativo (BSA) (arriba) y AAV5 (abajo).Se grafican cada una de las tres inmunizaciones

más un control (suero llama naive, no inmunizada). Título=50% de la señal inicial.

55

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

refiere a la cantidad de anticuerpo total y no solo a los HCAbs que deseamos

clonar y seleccionar.

Para realizar el proceso de panning, se partió de la biblioteca #1115

generada con el ARN de las células mononucleares de sangre periférica

(donde se encuentran los linfocitos B) en el vector fagémido pComb3X, con

un título de 1X1013 ufc/mL y una diversidad de 5X108 ufc/mL (buen título y

diversidad). Se hicieron únicamente dos rondas de panning, ya que así

evitamos sesgar la selección de los VHHs contra un número limitado de

epítopes. En la segunda ronda, luego de promover la unión de los fagos, se

incubó con partículas virales AVV5 en solución para promover la selección

de VHH con alta koff. La cantidad de fagos recuperada en cada etapa se

muestra en la Tabla 2 .Si bien se ve una disminución en la recuperación del

Out 2 con respecto al primero, esto es de esperarse debido a las

condiciones tan astringentes que aplicamos para dicho panning.

Tabla 2: Títulos de Out y amplificados obtenidos por panning contra el AAV5 (ufc/mL).

Out Título Recuperación

Out 1 1.7 X 108 1.7 X 10-3

Amplificado Out 1 1 X 1011

Out 2 1.6 X 10 4 8 X 10 -5 *Calculado como (output/input) X 100

Con el Out 2 se infectaron células de E. coli y se aislaron colonias

individuales. Diez de estas se crecieron hasta la fase exponencial y la

expresión del VHH se indujo con IPTG. Los sobrenadantes se analizaron por

ELISA contra el AAV5, contra AAV8 (otro serotipo del AAV que también fue

inmunizado en la misma llama), y contra BSA (Figura 22).

56

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Figura 22: Reactividad por ELISA de clones seleccionados anti AAV5 en vector

pComb3X. Reactividad de los VHH seleccionados evaluada por ELISA mayor a 2,5 UA

(Saturación). Clones 11 y 12=Controles Negativos (PBS, sin sobrenadante).

Clonado en vector de expresión pINQ.Bt.H6 y selección de clones

Una vez que se verificó que nuestro proceso de panning fue exitoso (10/10

clones reconocen específicamente el antígeno deseado), los VHHs se

amplificaron por PCR (Figura 23) y se clonaron en masa en el pINQ.Bt.H6.

Esto es necesario debido a que el pComb3X es un vector fagémido, en el

cual la expresión del VHH soluble es muy baja, y además permite la

producción del VHH biotinilado.

Se seleccionaron 96 colonias individuales y se produjeron los VHH

biotinilados utilizando las condiciones optimizadas como se describió en la

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

O.D

450, 15 m

inuto

s

Clones

AAV5

AAV8

BSA

MPM CP CN AAV5

VHH

400 pB

Figura 23: Corrida en gel de

agarosa para verificar correcta

amplificación del Out 2 por PCR.

CN= Control Negativo (PCR sin

molde) CP=Control Positivo (PCR

VHH genérico), MPM=Marcador

Peso Molecular. Observar el

fragmento de 400 pb correspondiente

a los VHHs.

3000 1000

500

3000 1000

500

57

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

primera parte de este trabajo. La reactividad de los sobrenadantes se verificó

por ELISA (Figura 24).Este screening nos permite no solo verificar el

correcto clonado de la población de VHHs anti AAV5, sino también realizar

una selección primaria de aquellos clones de mayor señal.

Figura 24: Reactividad de clones seleccionados anti AAV5 en vector pINQ.Bt.H6 por

ELISA. De los 96 clones evaluados, la gran mayoría reconocen específicamente el AAV5

con una O.D mayor a 2 UA. Notar que algunos son reactivos contra la BSA.

Si bien se pudo generar un ranking de señales para seleccionar estos

clones, esta depende directamente de la producción del clon específico

(variable según la secuencia individual de cada clon) y no solo de su afinidad

por el antígeno. Una alta producción de un clon poco afín dará como

resultad. Una alta señal a pesar de su poca afinidad ante el antígeno. A su

vez, diferencias en los tiempos de inducción y el crecimiento bacteriano

pueden dar también dar lugar a conclusiones erróneas. Es por esto que de

todos estos clones evaluados, elegimos los 12 que dieron la mayor señal, y

realizamos diluciones de los sobrenadante con el fin de poder titular dicho

10 20 30 40 50 60 70 80 90

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

O.D

450, 15

min

uto

s

Clones

AAV5

BSA

58

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

clones y por consiguiente tener una idea más exacta de aquellos que se

producen en mayor concentración (Figura 25).

A partir de este análisis, se eligieron los 4 clones con mejor título, clones 20,

42, 45 y 66) y se produjeron a gran escala (medio litro de cultivo para cada

uno). Los VHH se purificaron por Ni-NTA, eluyendo con imidazol y

dializando contra PBS; luego de lo cual se cuantificaron por medio de

absorbancia a 280 nm.

Tabla 3: Cantidad total obtenida de VHH anti AAV5, medida por Absorbancia 280 nm.

Clon Cantidad obtenida (mg totales)

20 14

42 11

45 21

66 0,66

A su vez, se procedió a correr las fracciones (el extracto que pasamos por la

columna, fracción no retenida y lo que extraemos luego de dializar contra

3000

1000

500

1 10 100 1000

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

O.D

450, 15 m

inuto

s

Dilución Sobrenadante

Clon 8 Título= 650

Clon 11 Título= 120

Clon 20 Título= NA

Clon 42 Título= NA


Clon 45 Título= NA







CN

Figura 25: Reactividad por ELISA de 12 clones seleccionados anti AAV5 en vector

pINQ.Bt.H6: Utilizamos los sobrenadantes de los cultivos y realizamos diluciones al medio;

graficando en función de la absorbancia. CN= Control Negativo (sin sobrenádate). NA=No se

Aplica, no se llego a la dilución límite necesaria para calcular el título. Clones con mejor

títulos resaltados en negro título

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Lucía Alfaya


Diciembre 2015

PBS 1X) en gel de SDS-PAGE a modo de verificar que la purificación fue

realizada correctamente (Figura 26).

Se vio que en la fracción no retenida la banda perteneciente al anticuerpo ya

no se vislumbra, lo que indica que este se unió correctamente a la columna.

A la vez, vemos que el VHH se purificó correctamente y no co-eluyó con

otros productos celulares. En los cuatro clones producidos se vieron

resultados similares, la cantidad obtenida para cada VHH se muestra en la

Tabla 3. Notar como en las condiciones elegidas, el clon 66 se produce en

muy poca cantidad en comparación a los otros tres. Esto puede ser debido a

un problema secuencia-específico (la propia secuencia del clon dificulta la

producción), a la toxicidad propia del anticuerpo o a que las condiciones en

las que se indujo no fueran apropiadas (las condiciones de inducción son

propias del VHH, el agregado de una concentración mayor o menor de IPTG

a veces es necesario para una producción óptima).

Con los anticuerpos purificados y concentraciones conocidas se realizó una

nueva comparación de reactividad, Figura 27. Por su menor título se eligió el

clon 42, aunque en realidad se trata de valores muy cercanos (todos en el

rango de nM).

116 66 45 35 25 18

14

E NR MPM 42

VHH 42

~20kDa

Figura 26: Corrida de SDS-PAGE

12,5 % de anticuerpo anti AAV5

42: MPM= Marcador Peso

Molecular, E=Extracto VHH (entró

columna), NR= fracción no retenida

a la columna ,42=Anticuerpo

Purificado.

60

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Figura 27: Reactividad de cuarto anti AAV5 producidos y purificados contra AAV5:

Graficamos absorbancia 450 nm en función de concentración (nM de VHH).

Generación de un BiAb

Una vez que se seleccionó el clon anti AAV5; se realizó la construcción del

biespecíficos de tal modo que el V36 se encuentre en el extremo C-terminal

y el anti AAV5 (clon 42) en el N-terminal, separados por un spacer de

repetidos de glicinas y serinas (-G3SG3S-). Ambos VHH se amplificaron por

PCR y se fusionaron por una segunda PCR de overlap, tal como se describe

en Materiales y Métodos. Para amplificar los clones esta vez usamos la

enzima Pfu polimerasa, una polimerasa de alta fidelidad que a diferencia de

la Taq no posiciona residuos de adeninas en los extremos. Esto es de gran

importancia ya que la adición de una base no codificada a esta altura

interfiere con el paso siguiente de overlap.

La correcta amplificación del BiAb se verificó en gel de agarosa 1% (Figura

28).

1E-3 0,01 0,1 1 10 100

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

O.D

405nm, 1

5 m

inu

tos

Concentracion VHH (nM)

Clon 20 Título= 0,147 nM




61

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Si bien se vio que la PCR de overlap no es 100% eficiente (se visualiza una

banda de 400 pb, correspondiente al VHH monomérico), el DNA

correspondiente al BiAb (800 bp) puede aislarse cortando la banda del gel.

El fragmento de 800 pb se digirió con la enzima Sfi I y se clonó en el vector

pINQ.H6.Bt; se electroporó en cepa E.coli BL21 (DE3)/pBir. Al otro día

contaron las colonias y se realizó un screening por Colony PCR con los

primers externos utilizados en la reacción anterior para verificar la presencia

del inserto deseado (800 pb) (Figura 29).

Una vez que se verificó que obtuvimos el clon biespecífico 42-V36, se

procede a confirmar el resultado por secuenciación y pasamos a producirlo

en mayor escala (0.5 L de cultivo) y purificarlo de la misma forma que para el

clon monomérico. También se realizó la post-biotinilación para poseer el tag

de biotina en el biespecífico, a modo de poder realizar los ensayos

3000 1000

500

MPM V36-42

Clon Biesp

800 pb

VHHs

400 pb

CN 1 2 3 4 5 6 7 MPM 3000 1000

500

Clon V36-42

800 pb

Figura 29: Corrida en gel agarosa, Colony PCR, colonias electorporadas con clon 42-

V36: Resultados positivos marcados en rojo (tres de siete colonias evaluadas)

MPM=Marcador Peso Molecular, CN=Control Negativo.

Figura 28: Corrida en gel de

agarosa 1%, PCR overlap de

clon biespecífico 42-V36.

MPM= Marcador de Peso

Molecular. Resultados

marcados en rojo.

62

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

siguientes de ELISA y citometría de flujo. A partir de 0.5 L de cultivo se

obtuvieron 1.6 mg totales del BiAb. Si bien lo obtenido es menor al clon

monomérico 42 usado (11 mg), esto es de esperarse debido al mayor

tamaño del anticuerpo producido. A su vez tener en cuenta que como paso

anteriormente con el clon 66 monomérico, las condiciones óptimas de

inducción nuevamente no fueron estudiadas con anterioridad. Corremos un

gel de SDS-PAGE para verificar la producción y purificación (Figura 30).

Pruebas de funcionalidad En la etapa siguiente se verificó la reactividad del BiAb contra los dos

antígenos, AAV5 y CD11b. La reactividad contra AAV5 se verificó por ELISA

y para el V36 por citometría de flujo.

I) Actividad del VHH-42 (anti AAV5):

El ensayo de ELISA se realizó de modo similar a lo hecho anteriormente,

utilizando el VHH V36 biotinilado como control negativo y el VHH 42

monomérico biotinilado como control positivo (Figura 31). Se observó que

E NT MPM Biesp 42 V36

VHH biesp 42-V36

35 kDa

VHH monomérico

14-18 kDa

Figura 30: Corrida de SDS-PAGE 12,5 % con anticuerpo 42-V36: MPM= Marcador

Peso Molecular, E=Entro Columna; NT=fracción no retenida a la columna; 42= Anticuerpo

monomérico 42 anti AAV5; V36= Anticuerpo monomérico V36 (Controles Negativos).

66 45 35 25 18

14

63

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

tanto el clon monomérico (VHH 42) como el biespecífico (42-V36) generado

reconocen el antígeno, con un título “afinidad” similar.

Se verificó entonces que la porción correspondiente al VHH 42 de nuestro

biespecífico reconoce exitosamente a su antígeno en el formato de ELISA.

Además la reactividad contra la partícula viral libre se estudió por

interferometría de biocapa-BLItz® (fortéBIO). Para esto se utilizó un sensor

de estreptavidina (SA), y se hizo uso del tag de biotina que poseen los VHHs

producidos. En este sensor cargamos el VHH 42; seguido por la cápside del

AAV5 y el BiAb. La unión se verificó por un aumento en la señal, que se no

se pierde al incubar el sensor en PBS (Figura 32).

1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5O

D4

50

nm, 15

min

uto

s

Concentracion de VHH (nM)

42: Título= 0.134 nM

V36

42.V36: Título= 0.188 nM

Figura 31: Reactividad comparativa 42-V36 con clon 42 por ELISA anti AAV5: Observar

que el título del biespecífico es similar al del clon monomérico. A su vez, ver como el V36 no

genera señal (control negativo).

64

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Figura 32: Ensayo de interferometría de biocapa para verificar la unión de clon

monomérico 42 y BiAb a cápside nativa. Unión (nm) en función del tiempo (segundos).

II) Actividad de VHH-V36 (anti CD11b):

Para esto se utilizó la línea de macrófagos J774 que presentan en su

superficie el receptor CD11b/CD18, y la unión de los anticuerpos se verificó

utilizando streptavidina-PE y altas concentraciones de anticuerpos, Figura

33.

.

Figura 33: Reactividad de BiAb

y clon V36 por citometría de

flujo anti macrófagos J744:

Verde=Biespecífico V36-42,

Naranja= V36 monomérico (CP),

Celeste= 42 monomérico (CN),

Rojo= Macrófagos solos (Control).

Datos de medidas geométricas en

recuadro.

Línea de Base:

Chip SA cargado con

VHH 42

Unión de

Cápside AAV5

a VHH 42

Lavado

PBS

Unión de

BiAb a

complejo

42-AAV5

Lavado

PBS

65

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

Como se ve en la figura, el VHH V36 y el BiAb reaccionan en forma similar

produciendo un marcado corrimiento de la señal, mientras que el control

(VHH 42) no genera ningún corrimiento de la señal. Para una mejor

comparación de la reactividad se utilizaron diluciones serias de los

anticuerpos en concentraciones no saturantes, y como se muestra en la

Figura 34, se observa una disminución de la reactividad del VHH V36

cuando éste está formando parte del BiAb. En este caso la perdida de

reactividad equivale a unas cuatro veces (titulo 1.4 vs 5.4 nM). A pesar de la

disminución en la reactividad o “afinidad” causada por la fusión de los dos

anticuerpos, ambos mantienen la capacidad de unirse a sus antígenos con

una afinidad similar a cada VHH en su estado monomérico

0,1 1 10 100

0

50

100

150

200

250

MF

I: F

L2

Concentracion de VHH (nM)

V36: Título= 1.4 nM

42

42.V36 Título= 5.4 nM

Figura 34: Resultados de citometría contra macrófagos J774. Medimos en canal FL2

que es donde se da la emisión de la ficolitrina. Graficamos la media geométrica (MFI) en

función de la concertación molar de anticuerpo y calculamos título. Título= 50% señal

inicial.

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Diciembre 2015

6-CONCLUSIONES Se confirmó que la producción de VHHs en el citosol no es óptima en el

sistema elegido E.coli BL21 (DE3) al utilizar el vector derivado del pET28a+

pINQ.Cit.Bt.H6 generado en el laboratorio. Posiblemente esto sea causa a la

necesidad del ambiente redox presente en dicho compartimiento, el cual no

es propicio para la generación de la proteína recombinante, en especial de

los puentes disulfuros necesarios para mantener su estructura. Sin embargo,

la producción del VHH en este mismo sistema usando el vector análogo

pINQ.Bt.H6, capaz de dirigir el VHH al periplasma por el péptido líder OmpA,

sí logró una producción eficiente de la proteína, llegando a obtener una

cantidad de producto (en el orden de mg) con el agregado de inductor

(IPTG) en un rango de concentraciones entre 3-30 µM. En caso de inducir

con una mayor concentración, si bien se genera más producto, la cantidad

de este llega a ser excesiva para la célula y su culmina como material

insoluble.

Se verificó que la enzima BirA no sobreexpresada de E.coli no logra

totalmente cubrir la cantidad de VHH producido al estar este tan

sobreexpresado, teniendo efectivamente que co-expresarse dicha enzima en

el sistema para cubrir completamente la demanda de producto generado. En

este punto, la co-expresión de la enzima de modo citosólico, regulada por el

promotor arabinosa (sin el sistema acoplado de la T7 polimerasa) es la que

generó una reacción in vivo más eficiente. La localización periplasmática de

dicha enzima hace que, en caso de producirse, se agregue, disminuyendo

por tanto su actividad. La co-expresión de ambas enzimas, reguladas por un

promotor débil, no pareció mejorar significativamente la reacción en

comparación con la expresión única de esta en el compartimiento citosólico.

A pesar de los distintos intentos de optimización, la biotinilación in vivo no

superó el 35%, lo cual, dependiendo de la aplicación, es una importante

limitación. Por ejemplo, el VHH no biotinilado podría competir con la fracción

biotinilada disminuyendo o anulando la señal. En base a esta limitación,

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Lucía Alfaya


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estudiamos como posible alternativa para superarlo la realización de un paso

de “post-biotinilación” mediante una incubación in vitro, luego de la

producción y biotinilación in vivo de los nanobodies. En base a los resultados

mostrados, se determino que este paso es exitoso y debe realizarse con un

exceso de D-biotina (100 µM), permitiendo alcanzar un 100% de biotinilación

de los nanobodies. Aunque no fue parte de mi trabajo, en el grupo se ha

visto que puede alcanzarse un porcentaje de biotinilación del 100%

omitiendo el agregado de biotina durante el cultivo (únicamente in vitro).

Con respecto al segundo objetivo, inicialmente comprobamos que la cápside

viral del virus AAV del serotipo 5 genera una fuerte respuesta inmune en la

llama, partiendo de una respuesta basal, quizás debido a la exposición

natural del animal a este agente infeccioso, más el efecto de las sucesivas

inmunizaciones. La metodología de selección elegida demostró ser más que

eficiente, logrando un alto porcentaje de clones positivos y de alta afinidad

contra este antígeno.

Una vez más, el vector de expresión generado en el grupo de laboratorio

pINQ.Bt.H6 demostró su versatilidad, siendo necesaria una única ronda de

digestión y clonado para hacer el pasaje en masa del pool (la población

completa) de clones positivos del pComb3X (~104 clones).A su vez, a los

efectos de realizar un screening rápido y simple, es posible saltear la etapa

de post-biotinilación y usar directamente los sobrenadantes, donde la

cantidad de VHH biotinilado, aún siendo solo la fracción del 35%, permite

seleccionar de forma fácil y rápida los clones de interés. Sumado a esto se

encuentra en hecho de que, una vez seleccionados, los clones ya se

encuentran en un vector que permite la producción en gran escala de los

VHHs, en cantidades que fácilmente están entre 10-20 mg/L, una gran

cantidad si debido a la simpleza de su producción se los compara con la

producción de anticuerpos monoclonales. Sin embargo, debe también

considerarse que esta producción es secuencia-especifica, según el clon

elegido varía notoriamente la cantidad de anticuerpo producido.

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Diciembre 2015

En cuanto a la generación del biespecífico, el método de PCR overlap probo

su utilidad, a pesar de que se generan también fragmentos de menor

tamaño. Para evitar esto, a partir de este trabajo se vienen desarrollado

vectores en el grupo que contiene dos sitios de clonado, para cada uno de

los VHH, y en el diseño de pares universales de primers para ambos sitios,

de tal forma de facilitar en gran medida la producción futura de BiAbs.

En relación a la funcionalidad de los BiAb, por medio de ELISA logramos

comprobar la reactividad de nuestro clon anti AAV5, verificando que esta se

mantiene. A su vez, vimos por citometría que la reactividad del V36 ante su

antígeno (CD11b), también se preserva, pero con una disminución de ~4

veces. Es interesante notar, que este anticuerpo se encuentra en la porción

C-terminal de BiAb, y que por tanto su extremo N-terminal (que en los VHH

está orientado hacia el sitio de unión) resulta modificado, pudiendo ser la

razón de la afectación de la reactividad observada. El anticuerpo generado

ha sido enviado a un laboratorio de la Universidad de Navarra para que su

eficacia en redirigir la especificidad del AAV5 se ensaye en ratones.

En conclusión, como resultado de este trabajo se han ampliados las

posibilidades en la generación de una plataforma local de nanobodies cuyo

proceso de expansión sigue hasta la fecha; logrando resultados más que

promisorios.

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Lucía Alfaya


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antibody libraries allows isolation of high-affinity antihapten antibodies

that are not favored in the llama immune response. Anal Chem, 2011.

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100. A., C.-S., et al., Expression, biotinylation and purification of a biotin-

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antibodies as a tool for molecular mimicry. J Mol Biol, 2005. 349(4): p.

814-24.

75

Lucía Alfaya


Diciembre 2015

ANEXO A: Vectores Utilizados

pINQ.Bt.H6: Como ya mencionamos, este vector de expresión

periplasmática derivado del pET28a+ posee, entre otros, la secuencia OmpA

en 3´ que permite el pasaje al periplasma, el péptido de biotinilación de

secuencia G L N D I F E A Q K I E W H E en 5´a la vez que mantiene la

cola de histidina y el sistema de expresión dependiente de la T7 polimerasa

del vector original. Observar que el VHH se posiciona entre los sitos Sfi I

adyacentes a la secuencia OmpA y al péptido de biotinilación, haciendo más

fácil el pasaje a partir del vector fagémido pComb3X.

Figura A1: Esquema del sitio de clonado múltiple del vector pINQ.Bt.H6: Marcado en

colores sitos importantes (secuencia OmpA, sitios Sfi I, péptido de biotinilación, cola de

histidina)

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pINQ.Cit.Bt.H6: Este vector es similar al anterior, observar que simplemente

no posee la secuencia señal OmpA a 3´del VHH, de modo que el trasporte al

periplasma está interrumpido.

Figura A2: Esquema del sitio de clonado del vector pINQ.Cit.Bt.H6: Marcado en colores

sitos importantes (sitios Sfi I, péptido de biotinilación, cola de histidina; sitios Nco I y Xho I).

Notar falta de secuencia OmpA.

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ANEXO B: Primers Utilizados

Primers generación de pINQ.Cit.Bt.H6 -FW: AGA AGG AGA TAT ACC ATGATG GCC sAG GTC -RV: ATT TCT CGA GTT CGT GCC ATT CGA TTT TCT GAG CCT CGA AGA TGT CGT TCA GAC CGC CAC CTT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CG Sitios de restricción de Nco I (FW) y Xho I (RV) marcados. Primers unión sitios Sfi I: -Sfi I FW: TTT CGC TAC CGTGGCCCAGGCGGC ATG GCC sAG GTG CAG CTG swGsAGTCk GG -Sfi I RV: CCA CGA TTC TGGCCGGCCTGGCCT GAG GAG Subrayado sitios de corte de la enzima Sfi I Primers para generación biespecíficos: VHH Ct: -Bi-VHH1-Fw: ATG ACT CGC GGCCCAGGCGGC ATG GCC sAG GTA CAG CTG swGsAGTCk GG -Bi-VHH1-Rv: TGA GCC TCC ACC AGA GCC ACC TCC T GAG GAGACr GTG ACC TGG GTC C VHH Nt -Bi-VHH2-Fw: GGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCTCA ATG GCC sAG GTG CAG CTG swGsAGTCk GG -Bi-VHH2-Rv: CCA CGA TTC TGGCCGGCCTGGCCT GAG GAG ACR GTG ACC TGG CTG C -Bi-Overlap-Fw: GTT ACT CGC GGCCCAGGCGGC AGT -Bi-Overlap-RV: CCA CGA TTC TGGCCGGCCTGGCCT GAG Subrayado sitios de corte de la enzima Sfi I. s=G/C,w=A/T,k=G/T Primers Generación Biblioteca de Fagos: -VH1= CAT GCC ATG ACT CGC GGCCCAGGCGGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GGT GCA GTC TGG -VH3= CAT GCC ATG ACT CGC GGCCCAGGCGGC CAT GGC CGA GGT GCA GCT GGT GGA GTC TGG -VH4= CAT GCC ATG ACT CGC GGCCCAGGCGGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCA GGA GTC GGG -JH= CCA CGA TTC TGGCCGGCCTGGCCT GAG GAG ACR GTG ACC TGG CTG

Subrayado sitios de corte de la enzima Sfi I .

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ANEXO C: Bibliografía Generada

El trabajo realizado en esta tesis tuvo como resultado la generación de dos

trabajos bibliográficos:

-“Efecto de la compartimentalización celular en la biotinilación in vivo de

nanobodies “, poster presentado en las XV jornadas de la SUB (Sociedad

Uruguaya de Biociencias), septiembre 2015, Piriápolis, Maldonado, Uruguay

-“Streamlined method for parallel identification of single Domain antibodies to

membrane receptors on whole cells”, paper producido en colaboración con el

grupo de inmunoquímica de la cátedra de Inmunología, publicado en la

revista Biochim. Biophys Acta, julio 2015 (referencia 94 en el trabajo; se

incluye al final).

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AGRADECIMIENTOS:

Agradezco en primer lugar a mi tutor, el Dr. Gualberto González-Sapienza por su apoyo y enseñanzas; por la confianza dada y por darme la chance de entrar y crecer en esta institución. A la Dr. Lucía Vanrell, por la ayuda y los consejos prestados en los inicios, así como por permitir el uso de las cápsides virales. Muy especialmente a mi co-tutor, Martín Rossotti, sin cuya ayuda este trabajo hubiera resultado imposible. Por escuchar, ayudar, apoyar y especialmente por haberme dado la oportunidad de aprender de él. Por la energía y optimismo mostrado en todo este tiempo, y en especial por estar siempre presente para dar una mano en cuando se lo necesita sin pedir nada a cambio. A la cátedra de Inmunología del Instituto de Higiene; por haber compartido años de experiencia y tantos momentos inolvidables. A los compañeros de “la casita del fondo”: por la ayuda, las enseñanzas y la amistad ofrecida; más que nada por hacerme sentir como en casa día a día. A mis compañeros y amigos de distintos grupos; que me han apoyado y cuya presencia me mantiene día a día. A los de siempre (Vanessa Bentancur, Cecilia Cortese, Mariana Fontaiña, Tatiana Gilles y Elizabeth Lancaster), a los de la carrera (Florencia Klein, Ximena Doldán, Agustina Irazusta y Alejandra Kalplanski) y a los de la cátedra (Cecilia Vallejo, Triana Delfín, Lucía del Puerto, Verónica López, Claudio Rodríguez y Cinthia Pendás). A mi familia por haberme permitido este crecimiento y por estar siempre a mi lado en todos los momentos.

A la Universidad de Navarra por haber cedido las cápsides virales y realizar la continuación de los estudios in vivo de los BiAbs. Finalmente a la ANII por la beca de iniciación a la investigación otorgada entre el período 2014-2015 (INI_X_2013_1_101266) por la cual fue posible este trabajo de graduación.

Biochimica et Biophysica Acta 1850 (2015) 1397–1404

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Biochimica et Biophysica Acta

j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /bbagen

Streamlined method for parallel identification of single domainantibodies to membrane receptors on whole cells

Martín Rossotti a, Sofía Tabares a, Lucía Alfaya a, Carmen Leizagoyen b,Gabriel Moron c, Gualberto González-Sapienza a,⁎a Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, Instituto de Higiene, UDELAR, Montevideo, Uruguayb Parque Lecoq, IMM, Montevideo, Uruguayc Centro de Investigación en Bioquímica Clínica e Inmunología, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina

⁎ Corresponding author at: Av. A. Navarro 3051, piso 2Tel.: +598 24874334.

E-mail address: [email protected] (G. González-Sapie

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen.2015.03.0090304-4165/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

a b s t r a c t
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 6 February 2015Received in revised form 19 March 2015Accepted 20 March 2015Available online 26 March 2015
Keywords:In vivo biotinylationFlow cytometryImmunoprecipitationNanobodyPhage displayCell receptor

Background:Owing to their minimal size, high production yield, versatility and robustness, the recombinant var-iable domains (nanobodies) of camelid single chain antibodies are valued affinity reagents for research, diagnos-tic, and therapeutic applications. While their preparation against purified antigens is straightforward, thegeneration of nanobodies to difficult targets such as multi-pass or complex membrane cell receptors remainschallenging. Here we devised a platform for high throughput identification of nanobodies to cell receptorbased on the use of a biotin handle.Methods:Using a biotin-acceptor peptide tag, the in vivo biotinylation of nanobodies in 96well culture blockswasoptimized allowing their parallel analysis by flow cytometry and ELISA, and their direct use for pull-down/MStarget identification.Results: The potential of this strategy was demonstrated by the selection and characterization of panels ofnanobodies to Mac-1 (CD11b/CD18), MHC II and the mouse Ly-5 leukocyte common antigen (CD45) receptors,from a VHH library obtained from a llama immunized with mouse bone marrow derived dendritic cells. By on
and off switching of the addition of biotin, the method also allowed the epitope binning of the selected Nbs di-rectly on cells.Conclusions: This strategy streamlines the selection of potent nanobodies to complex antigens, and the selectednanobodies constitute ready-to-use biotinylated reagents.General significance: This method will accelerate the discovery of nanobodies to cell membrane receptors whichcomprise the largest group of drug and analytical targets.
© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

The generation of potent antibodies for research, diagnosis and ther-apy has been facilitated by the progress in methods for building andselecting large antibody libraries [1,2]. In addition to conventionalheavy/light chain antibody libraries, there has been a growing interestin single domain antibody (sdAb) libraries. These libraries derivedfrom a special type of antibodies that occur in camelids [3] and somespecies of sharks [4]. These camelid heavy-chain-only antibodies are de-void of light chain and their variable domain shows a high degree ofidentity with the human VH3 family [5], which has been regarded asan advantageous property for their application as human therapeuticagents [6]. The sdAb antigen binding site sits entirely in the heavychain variable domain (VHH) and thus the VHH recombinant protein,

, 11600 Montevideo, Uruguay.

nza).

also referred as nanobody (Nb), represents the smallest antibody frag-ment (~15 kDa) that retains the parent functional specificity, beinghalf the size of conventional scFv. Recombinant VHHs can be producedwith high expression yields in Escherichia coli, as soluble and highly sta-ble proteins, which have popularized their applications [7].

Despite the fact that the VHH antigen binding site is formed by onlythree and not six CDRs as in heterotetrameric antibodies, sdAbs bindtheir cognate antigens with similar affinity as conventional antibodies[8]. Although VHHs with specificity for a great variety of antigens havebeen isolated, including all types of macromolecules and haptens [7,9],the convex architecture of the sdAb paratope with an extended CDR3appears to have evolved mainly to interact with cavities on the antigensurface. These are typically found at the active site of enzymes, andhence several sdAbs have been shown to affect the catalytic activity ofenzymes [10,11]. This concave topography is also found inmany cell re-ceptors, which together with the salient properties of nanobodies makeVHH libraries a very attractive source of cell-receptor agonists/antagonists.

http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.bbagen.2015.03.009&domain=pdf

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen.2015.03.009

mailto:[email protected]


http://www.sciencedirect.com/science/journal/03044165

www.elsevier.com/locate/bbagen

1398 M. Rossotti et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1850 (2015) 1397–1404

VHH libraries are easy to build, and in fact a comprehensive rep-resentation of the animal's original pool of specificities can be accom-plished because, conversely to conventional heterodimeric libraries,there is no shuffling of the heavy and light chains [7]. However, a com-mon scenario during the selection of these complex libraries is how tofurther select a particular antibody with the desired attributes fromthe large number of positive clones resulting from the initial enrich-ment. This is more challenging when the antibody target is part of acomplex antigen, such as in the case of a membrane protein on thecell surface. Indeed, due to the fact that VHH antigen recognition ishighly sensitive to conformational changes in the target antigen [12],the conventional approach of using recombinant membrane proteinsfor immunization and selection can often lead to lack of cross-recognition of the native cell receptor if proper measures to replicateits native conformation are not adopted [12]. In addition, for receptordiscovery, whole cells have to be used for immunization and panningand thus there is a need for simple methods that enable the character-ization of a large number of clones in a simple and systematic fashion,facilitating the identification of the cognate cell receptor even whenthis is unknown.

To address these limitations we optimized a methodology for theproduction of in vivo biotinylated nanobodies (BtNbs) that facilitatestheir characterization by ELISA, flow cytometry and pull-down experi-ments, which is amenable for high-throughput screening, Fig. 1. Themetabolic biotinylation of nanobodies has previously been used for di-agnostic applications [13,14] or for their oriented immobilization in mi-croarrays [15]. The binding of biotin to avidins (avidin/streptavidin) insolution is regarded as one of the strongest non-covalent interactions(KD of ~10−15 M). Although the conjugation of biotin through its car-boxyl group is accompanied by a reduction of this affinity [16], the bio-tin tag provides ready and strong binding to acceptor avidins which hasgiven rise to a profusion of avidin/streptavidin bioconjugates for count-less applications [17,18]. Our labeling approach makes use of the biotinligase BirA of E. coliwhich specifically conjugates biotin to the side chainof a Lys residue within a 15mer acceptor peptide (BtAP) tag [19]. Thereis only one natural substrate of BirA, the biotin carboxyl carrier protein(BCCP) of E. coli is a minor component of the bacterial cell extract [20]and does not interfere with the intended use of the BtNb. Besides facil-itating the isolation of nanobodies against complex targets, the selected

Fig. 1. Schematic diagram of the method for the isolation of biotinylated nanobodies to cell recpINQ-BtH6 which adds the biotin acceptor peptide. This sub-library of VHH is then co-transformclones are then culture in 96 deep well blocks and the soluble cell extract containing the biotin

antibodies can straightaway be produced in large amounts as biotin-la-beled ready-to-use reagents.

2. Methods

2.1. Construction of the pINQ-BtH6 vector

A triclocarban (TCC) specific VHH (T7) cloned between the twoSfiI sites of the pComb3 vector [21] was used as template for PCR am-plification of the OmpA-SfiI(1)–VHH-SfiI(2) region using the for-ward aatatctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgaaaaagacagctatcgcgattg and reverse atttctcgagttcgtgccattcgattttctgagcctcgaagatgtcgttcagaccgccaccttggccggcctggcctgaggagacg primers. Upstream ofthe annealing sequence, the forward primer contained the ribosomalbinding site (rbs) of the pET 28a(+) vector (Noavagen) includingthe XbaI restriction site (underlined). Similarly, the 5′ of the reverseprimer contained the coding sequence for the peptide BtAP and theXhoI restriction site (underline). To assemble the pINQ-BtH6 vector,the amplicon was digested with XbaI and XhoI and cloned into thepET 28a(+). The cloning/expression region of pINQ-BtH6 is shownin Fig. S-2 (Supporting information).

2.2. In vivo biotinylation of nanobodies

The VHH genes were cloned in the pINQ-BtH6 vector using the SfiIsites and the resulting plasmid was transformed in E. coli BL21(DE3)(Novagen) carrying the plasmid pCY216 [22]. The transformed cellswere then seeded in LB (Luria–Bertani) agar plates supplementedwith 35 μg/mL of chloramphenicol and 50 μg/mL of kanamycin. Singlecolonies were grown in 96 deep well culture plates (grainer) in 500 μLof LB supplemented with kanamycin/chloramphenicol in the presenceof 0.04% arabinose and 100 μM D-biotin at 250 rpm, 37 °C. When theOD600 reached 0.6 AU, IPTG was added to a final concentration of3 μM.After 4 h the platewas centrifuged and the cell pelletswere resus-pended in 100 μL of PBS (phosphate buffer saline). To extract the solubleVHHs, the cells were disrupted by three cycles of freezing and thawingor with B-PER Bacterial Protein Extraction reagent (Pierce).

eptors. After panning on cells, the VHH output is cloned en masse in the expression vectored in E. coli together with pCY216 for over expression of the biotin ligase BirA. Individualylated Nb can be characterized by different methods in a high throughput fashion.

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2.3 . Generation and culture of bone marrow derived-dendritic cells(BMDC)

Murine bone BMDCs were prepared from Balb/c bone marrow pre-cursors by in vitro differentiation in the presence of GM-CSF using stan-dard methods [23]. Briefly, the bone marrow from mouse tibias andfemurs was disaggregated by passage through a nylon mesh. Redblood cells were flash lysed with sterile water, the remaining cellswere counted and 3 × 106 cells placed in petri dishes (Grainer,Germany) containing 10 mL of DC-media consisting of RPMI supple-mented with 10% heat inactivated fetal calf serum (FCS), 2 mM L-gluta-mine, 500 nM mercapto-ethanol, 100 U/mL penicillin/streptomycin,20 μg/mL gentamycin, and 2 ng/mL of recombinant murine GM-CSFproduced in our lab. Three days later, 10 mL of DC-media was carefullyadded to the dishes, and onday 6, 10mLofmediawas refreshed. Onday7, the purity of the cells was analyzed by flow cytometry as shown inFig. S-1 (Supporting information).

2.4 . Llama immunization and phage display library construction

An adult female llama (Lama glama) from theMontevideomunicipalzoowas immunized subcutaneously with 108 BMDC cells in 1mL of PBS(without adjuvant), which was followed by 6 booster injections every2 weeks. Fifteen days after the last booster 150mL of blood was collect-ed in blood collection bags with anticoagulant. All activities were per-formed in accordance with protocols reviewed and approved by theLecocq Zoo ethical committee. Peripheral blood lymphocytes were iso-lated by centrifugation onHistopaque 1077 gradients (Sigma) followingthe manufacturer's instructions. Ten million cells were then treatedwith TRIZOL reagent (Invitrogen, Carlsbad) to extract total RNA, andafter purification, it was reverser transcribed using the superscript IIIfirst-strand synthesis system (Invitrogen) and the primer JH (cca cgattc tgg ccg gcc tgg cct gag gag acr gtg acc tgg gtc c). The cDNA wasthen used as template for PCR amplification of the VH and VHH genesusing the forward primers, VH1 (catgccatgactcgcggcccaggcggccatggcccaggtgcagctggtgcagtctgg), VH3 (catgccatgactcgcggcccaggcggccatggccgaggtgcagctggtggagtctgg), VH4 (catgccatgactcgcggcccaggcggccatggcccaggtgcagctgcaggagtcggg) and the reverse primer JH [24]. Theseprimers introduce two different SfiI sites (underlined) that are usedfor subsequent cloning of the fragments into the phagemid pComb3Xvector, a kind gift from Dr. Barbas (The Scripps Research Institute, LaJolla, USA). The ligated vector was electroporated in ER2738 E. colicells (F′proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi-1 Δ(hsdS-mcrB)5) (Lucigen Corporation, Middleton, WI,USA). The transformed cells were cultured in LB containing 0.25%K2HPO4, 0.1% MgSO4, 0.1% glucose and 100 μg/mL ampicillin. Afterstarting the exponential growth, bacterial cells were super-infectedwith helper phage M13KO7 (Pharmacia Biotech) and cultured over-night in the presence of 40 μg/mL of kanamycin. Phagewas precipitatedwith 0.2 volumes of 20% polyethylene glycol 8000, 2.5 M NaCl, on iceduring 1 h, centrifuged and the collected phage resuspended in PBS toa final titer of 1012 cfu/mL.

2.5. Library selection

For negative selection, 600 μL of the phage library (1012 cfu) wasadded to 4.4 mL DC-media and was incubated with 107 fibroblast (L-929, ATCC) in 75 cm2 culture flasks at 4 °C for 1 h, with gentle rocking.The supernatant was filtered by 0.2 μm and was further incubatedwith 2 × 107 BMDC at 4 °C for 1 h, and were extensively washed withcold DC-media. The cell surface bound phages were stripped by incuba-tion (10 min) with 100 mM glycine, 0.15 M NaCl, pH 3.0. After neutral-ization with 2 M tris base, the eluted phage was amplified and used foradditional rounds of panning. After the third round of panning, the out-put phagewas used to infect ER2738 E. coli cells to obtain the phagemidDNA. The purified DNA was digested with SfiI at 50 °C for 4 h and the

released VHH fragments were gel purified and cloned en masse intothe pINQ-BtH6 vector. The ligated plasmid was then electroporated inBL21(DE3) containing the pCY216 vector, and the cells were seeded inkanamycin/chloramphenicol LB agar plates. The next day, single colo-nies were picked and grown in 96 deep well culture plates (Grainer)as described above.

2.6. ELISA protocol

ELISA plates (Nunc Maxysorp) were coated with 100 μL/well of1 μg/mL of TCC-BSA, in phosphate-buffered saline (PBS) overnight at4 °C. After blocking for 1 h at room temperature with 1% BSA, dilutionof the biotinylated VHH or bacterial soluble extract were incubated for1 h, followed by washing and incubation with streptavidin HRP for1 h. After extensive washing, the peroxidase activity was developed byadding 100 μL of peroxidase substrate (0.4 mL of, 6 mg of 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine in 1 mL of DMSO + 0.1 mL of 1% H2O2 in water,in a total of 25 mL of 0.1 M acetate buffer, pH 5.5) and incubated for20 min at room temperature. The enzyme reaction was stopped bythe addition of 50 μL of 2 N H2SO4, and the absorbance was read at450 nm on a Fluostar Optima Reader (BMG, Ortenberg, GE).

2.7 . Flow cytometry

Cells (2 × 105 100 μL) were incubated for 1 h 4 °C with the BtNbpresent in the soluble fraction of the freeze/thaw extract. Cellswere then stained with phycoerythrin- or FITC-streptavidin usingstandard protocols and flow cytometry parameters were acquiredon a FACScalibur (BD Bioscience), followed by analysis with FlowJo(TreeStar). All other antibodies used are from BD Bioscience.

2.8. Pull-down experiments and MALDI-TOF identification

A BMDC cell extract was prepared by disrupting the cells with PBS,1% Triton X100 (PBS-Tx). The clean supernatant was then adsorbedwith an excess of streptavidin–agarose (Pierce) and saved for the pull-down experiments. The VHH clones were grown in 96 deep well platesas described and the cell pellet were disrupted with 50 μL of B-PER, di-luted to 500 μL with PBS and centrifuged. The soluble fraction was com-binedwith 50 μL of streptavidin–agarose slurry (Pierce) for 30minwithgentle rocking. After washing with PBS-Tx the streptavidin beads werecombined with 5 mL of the BMDC cell extract (corresponding to 108

cells) and the mix was kept at 4 °C for 4 h with gentle rocking. Afterwashingwith PBS-Tx, the beadswere resuspended in SDS-PAGE loadingbuffer and were run in 10% or 12.5% gels. After staining with coomassieR-250, the bands were excised and trypsin digested for MALDI-TOFanalysis. The tryptic peptides were extracted from the band and ana-lyzed by MALDI-TOF MS with α-cyanocinnamic acid as matrix. AMicroflex LR MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Billerica, MS, USA) with a337nmnitrogen laserwas operated in positive ion reflectronmode. Cal-ibration was performed with the peptide calibration standard mix(Bruker Daltonics). The monoisotopic mass list was then searchedwith Mascot (Matrix Science), with unrestricted proteinsmass and tax-onomy parameters, allowing one missed cleavage, and using a peptidemass tolerance of ±0.1 Da or less.

3. Results and discussion

3.1. Optimization of the metabolic biotinylation of VHHs

Fig. 1 shows the general scheme of the integrated method for thecharacterization of Nb raised against cell receptors. While somephagemids in combination with amber suppressor bacterial strainsallow direct expression of the selected VHHs, it is a common practiceto sub-clone them into strong expression vectors to produce them inlarge amount for their biochemical characterization and final use.


When this step is done after the initial selection of clones, each insert hasto be sub-cloned individually, which is time consuming and non-compatiblewith a high throughputmethod. To overcome this limitation,the initial step in ourmethod consists of the enmasse transfer of the poolof panned VHHs from pComb3 to the receptor vector pINQBtH6. Thebasis for the construction of pINQBtH6 was the pET28a + vector whichallows high levels of expression under the control of the T7 promoter.The pET 28a(+) vectorwasmodified to encode theOmpA signal peptidefor periplasmic expression of VHHs, and the BtAP acceptor peptide forsite-specific labelingwith biotin and a hexa-histidine tag for purification.The conditions for efficient antibody expression were adjusted usingVHH T7, a nanobody against the bactericide triclocarban (TCC), as amodel VHH [9]. The pINQ-BtH6 vector encoding this nanobody waselectroporated into E. coli BL21(DE3) carrying the plasmid pCY216. Ini-tially, the culture conditions (temperature, induction time and IPTG con-centration) were adjusted to maximize the expression of soluble VHH(not shown) and were used as starting point for the optimization ofthe BtNb expression.

Next, we examined the factors affecting the biotinylation of VHH T7.First the concentration of arabinose used for induction of BirA was test-ed in the 0.0008–0.6% range, in the presence of 100 μg/mL of biotin and3 μM IPTG, Fig. 2. High concentrations of arabinose affected the expres-sion of VHH T7. The extent of Nb biotinylation was indirectly assessedassuming similar initial concentrations of VHH T7 in all extracts (nottruewhen 0.2 and 0.6% arabinosewasused) and analyzing the reactivityof VHH T7 against TCC-BSA by an ELISA developed with streptavidin-HRP. The highest peroxidase activity (higher degree of biotinylation)was found when arabinose concentrations of 0.022 to 0.067% wereused, and thus, 0.04% was adopted for all following experiments.Fig. S-3a (Supporting information) shows that, in general, there is agood level of expression when randomly picked VHH clones wereexpressed using these conditions. The expression of VHH T7 (and simi-larly, for other clones)was not affected by the use of the BtAP tag (Fig. S-3b), and thus, the yield of the biotinylated version of the VHHs was es-sentially the same that was obtained when they were expressed withother peptide tags. This yield was typically between 2 and 30 mg/L inshaker flasks, depending on the individual VHH sequence.

To estimate the degree of biotinylation, VHH T7 was similarly pro-duced andwas purified onNi-NTA agarose (T7bt). Out of this, a 100% bi-otinylated fraction (T7100%bt) was also prepared using immobilizedmonomeric-avidin agarose (Pierce, Rockford), which allows gentle elu-tion of biotinylated conjugates. As a negative control VHH T7 was alsoproduced without addition of biotin (T7−bt). The ELISA results shown

Fig. 2. Effect of arabinose in the expression and biotinylation of VHH T7. Different concen-trations of arabinose were used to induce the co-expression of VHH T7 and BirA as de-scribed in the legend. The graph displays the reactivity of serial dilutions of the VHH T7soluble extract with its cognate antigen (TCC-BSA) detected with a streptavidin-HRP con-jugate. The midpoints of the curves are listed for comparison. The SDS-PAGE analysis ofVHH T7 expression in the soluble freeze-and-thaw extract is shown in the insert.

in Fig. 3 revealed that only a fraction, ~22% (Δmidpoint), of T7bt is bio-tinylated, which is in agreementwith the SDS-PAGE analysis of the non-bound and bound fractions obtained from avidin–agarose gel. The ab-sence of added biotin resulted in negligible biotinylation.

The fact that only a fraction of the nanobody is coupled to biotinmay be related to the expression of the VHH and BirA in differentcell compartments. Two strategies were used to investigate thispoint. To examine their cytoplasmic co-expression, VHH T7 wascloned into pET28a(+) including an initial methionine and this plasmidwas transformed into E. coli BL21(DE3) carrying the pCY216 vector.Lacking the oxidative environment of the periplasmic compartment,the expression level of VHH T7 and other VHH clones was significantlyaffected (Fig. S-4, Supporting information) and this option wasdiscarded. For periplasmic expression of BirA, its gene was PCR ampli-fied from pCY216, including the pelB signal peptide sequence in theforward primer, and the amplicon was cloned into the pBAD18 (LifeTechnology), the resulting plasmid was transformed into E. coliBL21(DE3) carrying the pINQ-BtH6 vector. In this case the expressionof VHHT7was normal, but the BirA activity was affected and the degreeof biotinylation was greatly reduced, about 10 fold (Fig. S-5, Supportinginformation). Based on these results we continued with the co-expression of BirA and VHHs in the cytosol and periplasm, respectively,as the best tradeoff for easy production of biotinylated VHHs. Interest-ingly, it was possible to reach 100% biotinylation by including a simplestep of post-biotinylation in vitro, consisting in a brief incubation withbiotin of the freeze-and-thaw extract. In this way BirA and the VHH,properly folded in the cytoplasm and periplasm respectively, get in con-tact allowing the quantitative conjugation of biotin; this step is highlyefficient and does not require biotin during the culture step, Fig. 4.

3.2. Library construction and initial selection of VHH on BMDC

VHH and VH genes were amplified from 108 peripheral blood leuko-cytes from a llama immunizedwith BMDC and cloned into the pComb3Xphagemid vector, producing a library of 2 × 109 transformants. For pan-ning experiments, the librarywas first pre-adsorbed on themouse fibro-blast cell line L-929 (ATCC) to deplete it from ubiquitous cell-receptorbinders, and the unbound fraction was then selected on BMDC at 4 °Cas described. After three rounds of panning the supernatants of 48individual clones containing soluble VHHs were tested on ELISAplates coated with BMDC membrane cell extracts; more than 95%

Fig. 3. Analysis of the extent of the in vivo biotinylation of VHH T7. T7bt: T7 biotinylatedin vivo and purified on Ni-NTA-agarose. T7100%bt: fraction of T7bt eluted from monomericavidin–agarose. T7−bt: VHH T7 expressed without addition of biotin and purified on Ni-NTA-agarose. These three preparation of VHH T7 were titrated against TCC-BSA by ELISAusing streptavidin-HRP for developing; T7bt, circles; T7100%bt, squares; T7−bt, triangles.The insert shows the SDS-PAGE analysis of the different preparations of VHH T7 appliedto avidin–agarose spin columns; Vd, void; Ad, bound fraction eluted with SDS-PAGE sam-ple buffer. The upper (T7) and lower (Av) bands correspond to the VHH, and the avidinmonomer that is released from the avidin–agarose.

Fig. 4. SDS-PAGE analysis of VHH T7 biotinylated in vivo and/or in vitro. T7bt: T7 biotinylatedin vivo; T7bt–pbt: prepared as T7bt, but the cell extractwas further “post-biotinylated” by incu-bation with 100 μM biotin, 30 min, 37 °C. T7pbt: T7 was co-express with BirA, but biotin(100 μM) was only added during the incubation of the cell extract. In all cases VHH T7 waspurified on Ni-NTA-agarose, and was then applied to avidin-agarose spin columns; Vd,void; Ad, bound fraction eluted with SDS-PAGE sample buffer. The upper (T7) and lower(Av) bands correspond to the VHH, and the avidin monomer that is released from the avi-din–agarose.


of clones produced positive results indicating the efficiency of thepanning procedure (not shown). The VHHs of this third outputwere cloned en masse into pINQ-BtH6, and were then transformed

Fig. 5. Flow cytometry analysis using three representative nanobodies selected on BMDC. Each biotusing phycoerythrin–streptavidin, histograms in red. The F1, F2 and F3 representative Nbs were V

into E. coli BL21(DE3) carrying the pCY216 vector. Ninety six individ-ual clones were grown to produce biotinylated VHHs.

3.3. The biotin moiety facilitates the large scale screening of nanobodies byflow cytometry

No other method is better for the isolation of antibodies to cell re-ceptors than their direct screening on cells. While this can be accom-plished by flow cytometry using fluorescent labeled antibodiesagainst nanobody peptide tags, the use of avidins avoids the worriesof unspecific binding of the antibody conjugate (i.e. to Fc receptors),which is a great advantage for high throughput screening. In addi-tion, the broad choice of streptavidin/avidin fluorescent conjugatesallows different combinations, which is particularly useful when amultiparametric flow cytometry screening is needed. In our case, toallow the simultaneous analysis of a high numbers of BtNb by flowcytometry, individual clones were grown in 96-deep well plates, thesoluble cell extracts were prepared by cycles of freezing and thawing,

inylated nanobodywas tested onBMDCand themacrophage cell lines J774.a1 andRaw246.732, p01 and X6, respectively; VHH T7 nanobody was used as negative control (blue).

Fig. 7. Characterization of family F2 and F3 nanobodies. Pulled-down components precip-itated with Nb V36, G7 and X6 (10% SDS-gel stained with coomassie blue). The tableshows the inhibition (%) of the flow cytometry reactivity with BMDC (geometric meanvalue) of the BtNbs (row header) in the presence of non-biotinylated Nbs (produced inthe absence of added biotin) (column header). CD11B, biotinylated Rat IgG to mouseCD11b (BD Pharmingen). Color boxes are used to indicate Nbs that defineoverlapping epi-topes and compete with each other.


and the clean supernatantswere directly used to label the cells. Initially,positive clones were classified in three families according to their reac-tivity with BMDC and two mouse macrophage cell lines (ATCC J774.A1and Raw 246.7); nanobodies that reacted mainly with BMDC (familyF1), and nanobodies that reacted with all cell types with high or lowgeometric mean values (families F2 and F3, respectively), Fig. 5. The se-quences of 12 clones derived from these families are shown in Fig. S-6,Supporting information. We mainly focused our interest in nanobodiesfrom the F1 and F2 families.

3.4. The BtNbs can be directly used to pull down their cognate antigen andcharacterize their reactivity

The soluble extracts containing the BtNbs were directly loaded intostreptavidin agarose, whichwas then used for the immunoprecipitationexperiments to isolate the VHH target receptor from BMDC triton X-100extracts. Notice that in this case the post biotinylation step was not in-cluded to avoid the competition of a huge excess of biotin. The strongbinding of biotin allows for stringent washing conditions helping to re-duce unspecific contaminants; a critical point when the antibody targetis a minor component of the sample. Moreover, conversely to conven-tional antibodies, instead of the heavy (~50 kDa) and light (~25 kDa)chain bands, only the VHH (~15–18 kDa) will occur in addition to theavidin/streptavidin monomer (~14 kDa). Figs. 6 and 7 show the SDS-PAGE analysis of the immunoprecipitated bands and the MALDI-TOFMascot analysis of representative bands is displayed in Fig. S-8,supporting information. As shown in Fig. 6, the family F1 nanobodies,BtNb p01 and N11 (identical results were obtained with Nb 49), pulleddown two components of ~36 kDa (long arrow) and ~30 kDa (shortarrow), which were identified as theMHC A-D alpha and beta chain re-spectively. This is also in agreement with the differential expression of

Fig. 6. Characterization of family F1 nanobodies. a) The protein bands eluted from the streptavidSDS-gel and stainedwith coomassie blue. The bands are labeled as follows: immunoprecipitatedC57bl/6 mouse splenocytes stained with BtNb 49, N11 and p01 or a commercial biotinylated areactivity of the BtNbs with E. coli extracts over expressing the individual chains of the MHC II

MHC II between BMDC and themacrophages cell lines Fig. 5, and the ac-tual size of the bands. These antibodies appear to recognize a non-polymorphic epitope on the MHC II molecule because they also reactedwith splenocytes of C57bl/6 mice that carry the IAb MHC II haplotypeFig. 6. To test the specificity of these VHHs, with regard to alpha orbeta A–D chain recognition, their ectodomains were amplified fromBalb/c mouse cDNA and cloned in the pET28 vector. While expressedat high levels, both proteins were insoluble, and their reactivity couldonly be tested by western blot, Fig. 6. There was no reactivity with thedenatured proteins, except for Nb 49 which strongly reacted with theMHC beta chain.

Surprisingly, six out of the eight family F2 nanobodies (V36, 76, 51,81, B10 and 42) precipitated two bands of about ~170 kDa and

in-agarose used in the pool-down experiments with Nb p01 and N11were run on a 12.5%bands (arrows), nanobodies (*), streptavidinmonomer (st). b) Flow cytometry analysis ofnti-mouse MHC II (I-A/I-E) antibody (IgG2). c) SDS-PAGE and western blot analysis of theA-D.


~97 kDa (showed for V36 in Fig. 7), which according to their peptidefinger print corresponded to CD11b (170 kDa) and CD18 (95 kDa), thealpha and beta subunits of macrophage-1 antigen (Mac-1) [25]. Mac-1is a surface integrin receptor expressed on many innate immune cells,which is involved in different immune cell responses, including adhe-sion, migration, phagocytosis, chemotaxis, cellular activation, and cyto-toxicity [26,27]. Further analysis of their ELISA reactivitywith theMac-1(CD11b/CD18) or the CR4 (CD11c/CD18) receptors, showed that theseantibodies define their epitopes on the CD11b chain of Mac-1, Fig. S-7,Supporting information.

Nbs G7 and 32b immunoprecipitated a 195 kDa band that was iden-tified as the mouse Ly-5, leukocyte common antigen (CD45), a proteintyrosine phosphatase abundantly expressed on all nucleated hemato-poietic cells, an involved in a variety of cellular processes includingcell growth, differentiation, activation, and oncogenic transformation[28]. As expected these Nbs stained all leukocyte populations insplenocyte (not shown). Finally, Nb X6, belonging to family F3, precipi-tated a 92 kDaband. The size of this band and itsMALDI-Mascot analysisstrongly indicated this as the valosin-containing protein (VCP), a highlyabundant (N1%) cytoplasmic protein [29]. VCP is a member of the AAAATPases family, involved in several cellular functions including cellcycle control, the ubiquitin–proteasome degradation pathway, nucleartrafficking, etc. [30]. It was rather unexpected that the main componentpulled-down by Nb X6 was a cytoplasmic protein, because our panningstrategy was design to select for antibodies against cell receptors. Sincethe Nb X6 flow cytometry performance indicates reactivity with a cellreceptor, Fig. 5, the possibility of an artifact due to a fortuitous cross-reactivity with the highly abundant VCP cannot be ruled out.

3.5. On and off switching of biotin addition allows binning of the Nbepitopes

A common problemwhen selecting a panel of antibodies to a partic-ular receptor is how to sort them in terms of their defined epitopes, toavoid functional epitope testing of redundant binders. Interestingly,the versatility of the in vivo biotinylationmethod also facilitates epitopebinning assays for Nbs reacting to a particular target. Indeed, when bio-tin is not added during theNb production, the biotinylation of the biotinacceptor peptide tag is negligible (Fig. 3). This allows having the labeledand unlabeled versions of the sameNbwithout the need of sub-cloning.In this way, it is possible to perform competitive flow cytometry exper-iments to study the eventual overlap of their epitopes. Fig. 7 shows theinhibition percentage of the flow cytometry signal when pairs of BtNbsand non-biotinylated Nbs to CD11b were tested against each other. Themean fluorescence intensity data is shown in Table S-1, Supporting in-formation. Nb 51, 81 and V36, strongly compete with each other, aswell as with a commercial anti-CD11b antibody, but not with Nb 76which appears to react with a non-overlapping epitope on CD11b. Asimilar analysis showed that theNbs to CD45, despite bearing dissimilarCDR1 and CDR2, define overlapping epitopes, which is not surprisingconsidering that they share the same CDR3.

4. Conclusions

We have optimized a method for efficient production of biotin-tagged nanobodies in 96 deepwell plates that allows their rapid charac-terizationwithout the need of purification of individual clones in a highthroughput manner. The more adequate cell compartment for expres-sion of the VHHs and BirA turned out to be the periplasm and cyto-plasm, respectively, which allowed for reaching ~25% of biotinylation.While this is more than enough for direct use of the cell extracts inflow cytometry or ELISA experiments, fully derivatized Nbs could beeasily prepared by a short post-incubation step with biotin, once theygot in contact with BirA after cell disruption. In this study a large scaleanalysis of the reactivity of dozens of Nb clones was carried out againstthree cell preparations. While still tedious, this task was greatly

facilitated by growing and disrupting the E. coli cultures in 96 wellblocks, which allowed the simultaneous labeling of BMDC and themac-rophage cell lineswith BtNbs using amulti-channelmicropipette. In ad-dition, since Nbs consist only of the recognition part of the parentantibody, they lack the effector function regions that may cause unspe-cific binding (i.e. to Fc receptors) making the use of isotypic control an-tibodies unnecessary. The biotin tag also facilitates the identification/discovery of the Nb cognate antigen, tolerating stringent washing con-ditions in the pull-down experiments, and thus producing clean peptidefinger prints for identification. Using BMDC as a model we demonstrat-ed that it was possible to rapidly identify and characterize the reactivityof a panel of Nb raised against whole cells. Once selected the biotinmoi-ety will be a convenient tag for the intended use of the Nbs, notably inflow cytometry applications, with the additional advantage that typical-ly several tens of mg/L can be obtained in shake flask cultures.

Conflict of interest statement

The authors declare no competing financial interest.

Transparency Document

The Transparency document associated with this article can befound, in the online version.

Acknowledgements

This work was supported with funds provided by grants FCE 6812ANII (Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) andTW05718 Fogarty Center NHI. MR, ST and LA are recipients of scholar-ships from ANII.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagen.2015.03.009.

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