efecto bactericida

1www.intramed.net Vol. 1 / Nmero 2

Efecto bactericida de la savia de Musa acuminata (pltano) utilizada individualmente y en asociacin con kanamicina y etionamida contra Mycobacterium tuberculosis multidrogorresistente en modelo animalDr. Ortiz Marn Segundo Helmer - Microbilogo Clnico.

Resumen

Palabras claves: Savia de Musa acuminata, Myco-bacterium tuberculosis MDR

El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto bactericida de la savia de Musa acumina-ta complementado con la kanamicina y etiona-mida. Es un trabajo de investigacin prospectivo, longitudinal, experimental, aleatorizado, con dos grupos de trabajo y uno control. Se utilizaron 18 cobayos jvenes, con 400g de peso corporal, dis-tribuidos en los grupos A, B y C, se los infect por va intraperitoneal, con una cepa del Mycobacte-rium tuberculosis MDR, con la concentracin de 3x107 en 1ml. Despus de 40 das de infeccin, se los observ astnicos y con altos porcentajes de monocitos activos, evidenciando un gran pro-ceso inflamatorio. La savia se extrajo exprimiendo las hojas del pseudotallo y se guard en frascos de vidrio estriles. El Grupo A (6 animales), fueron tratados con 15ml/da de la savia por va oral, el Grupo B (6 animales), fueron tratados con 83.3 mg de kanamicina/da por va intramuscular y 63 mg de etionamida/da por va oral, mas 15ml. de savia por va oral; el Grupo C (6 animales), sin tratamien-to. Se observaron directos, cultivos y anatoma pa-tolgica negativos luego de 30 dosis de savia en el

Abstract

Keywords: Musa acuminata sap, Mycobacterium tuberculosis MDR

The Bactericidal effect of the Musa acuminata sap alone and supplemented with kanamycin and ethionamide against Mycobacterium tuberculosis multidrug resistance in animal model Mg. Segundo Helmer Marn Ortiz. Teacher of Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine of Medicine the National University of Trujillo The aim of the present work were to determine the bacterial effect of the Musa acuminata sap associated with kanamycin and ethionamide. This is a longitudinal, experimental, prospective and random work. It had two working groups and one for control, 18 young guinea pigs weighing 400gr were distributed in groups A, B an C. The were infected with a sample of Mycobacterium tuberculosis MDR with a 3x107 in 1ml, intraperitoneally. After 40 days of infection, the animals became asthenic, had high percentage of active monocytes, evidence of a high inflammatory process. The sap was extracted squeezing the leaves of the pseudostem and kept in sterilized glass bottles. Group A with six animals was treated individually with sap 15 ml/ day orally


IntroduccinLa tuberculosis es una enfermedad infecto contagio-sa, de evolucin crnica y recurrente cuyo agente pa-tgeno es el Mycobacterium tuberculosis, que infecta principalmente los pulmones1,2. La incidencia de tu-berculosis multidrogorresistente (MDR) y extremada-mente resistente (XDR) ha aumentado de forma alar-mante sobre todo en pases del tercer mundo como Per, la pobreza, el uso indiscriminado de drogas anti-tuberculosas, el incumplimiento del tratamiento, entre otras, han propiciado la aparicin de cepas cada vez mas resistentes a frmacos antituberculosos conven-cionales3 En el ao 2007 el Comit d e TBMDR, de-clar que Per es el pas de Amrica Latina con mayor nmero de casos de TBMDR y TBXDR, el 80-90% se encuentran en Lima y la TBMDR existe en casi todas las regiones del Per 4. Entre los pacientes infectados con el bacilo de Kock resistente a cinco o ms drogas, el resultado del tratamiento no fue favorable y su cos-to con drogas de segunda lnea fue de $10,000 por paciente5. Segn un estudio de Bonilla, con un total de 43 pacientes XDR, 37 recibieron ITR, observndo-se la curacin en 17. Lima tiene el 91% de los casos de tuberculosis XDR y en la Provincia de Trujillo ya se diag-nosticaron 5 casos6. Las proyecciones estadsticas de la OMS para el ao 2020 son de mil millones de infectados, 1500 millones enfermarn y 36 millones de moriran7La familia Musaceae presenta los siguientes compo-nentes qumicos no alimenticios: fructosanos, cido fenlico, antocianinas, terpenoides, esteroides alca-loides aislados como la amina alcalidica y alcaloides indlicos, adems la savia de pltano est constitui-da por agua en un 85%, en el extracto de la hoja se encontr una mezcla de polihidroxifenoles y taninos8, adems posee propiedades antibiticas, contra el My-cobacterium phlei y Rhodococcus 9.El uso de la savia ha sido probado desde tiempos re-motos en Mxico, Colombia y Bolivia para curar la enfermedad pulmonar.10 Existen antecedentes no do-

cumentados y aislados de diferentes partes del pas y del mundo, sobre el uso de la savia para curar la TBC, se ha tenido conocimiento por ejemplo que en Pati-vilca, al norte de Lima, algunos pacientes con tuber-culosis usaron la savia del pltano como tratamiento con cierta mejora clnica (comunicacin personal, Dr. Roberto Achinelli).El incremento de la tasa de enfermedad con cepas multidrogorresistentes, ha sido propsito del presente trabajo de investigacin, cuyo objetivo es comprobar la propiedad micobactericida de la savia de Musa acuminata individualmente y asociada con kanamici-na y etionamida.

Material y mtodosEs un estudio de tipo prospectivo, longitudinal, expe-rimental, realizado en el laboratorio de la Seccin de Microbiologa de la Facultad de Medicina, desde el 15 de abril del 2008 hasta octubre del mismo ao.

Clculo de la muestra: n= (Z+Z) E

Z=1.645 = 0.5%;Z=0.84 =0.20%n=6 (6,175)

Se asume que =E por no haber estudios anterioresLa savia de la Musa acuminata se extrajo de las hojas que conforman el pseudotallo, exprimindolas y obte-niendo la savia, esta se deposit en un frasco estril de boca ancha, conservndose en la parte media del refrigerador hasta su uso. Las plantas se encuentran en el vivero de la Ciudad Universitaria de la Universi-dad Nacional de Trujillo.

Modelo ExperimentalMuestra: Constituida por 18 cobayos, cada grupo ex-

Grupo A y 16 dosis de savia mas 16 dosis de kana-micina-etionamida en el Grupo B. Conclusiones: La savia de Musa acuminata elimina los Mycobacte-rium tuberculosis detectables bacteriolgicamente observndose la progresin hacia la curacin his-tolgica y radiogrfica de la tuberculosis pulmonar.

and group B treated with 83.3 mg of kanamycin intramuscularly and 63 mg of ethionamide orally. Group C had no treatment at all. Conclusion: The Musa acuminata sap eliminates al Mycobacterium tuberculosis bacteriologically detectable and is observed progression toward healing histologically and radiologically the tuberculosis.


perimental cuenta con 6 animales. Los cobayos fueron adquiridos de un criador de cuyes.

Los criterios de inclusin fueron:Animales de tres meses de edad, con 400g de peso corporal, consumo normal de alfalfa, sin lesiones ni parsitos intestinales.

Los criterios de exclusin fueron:Animales sin peso normal, astnicos y con parsitos intestinal y ectoparsitos La infeccin se realiz con una cepa joven del Myco-bacterium tuberculosis MDR resistente a rifampicina e isoniacida, esta cepa fue obtenida del laboratorio del Hospital Regional Docente de Trujillo, cuyo cdigo es 1097.Se inyect por va intraperitoneal en 18 cobayos, 1ml. de la suspensin del cultivo en una concentracin de 3 x 107 microorganismos en 1ml mediante una jeringa de 10ml. La dilucin se obtuvo mediante el Nefelmetro de Mac Farland (tubo N2). Los cobayos fueron distribuidos en tres grupos, cada uno de seis animales y ubicados en jaulas de metal en grupos de a dos animales. El tamao muestral se obtuvo usando la frmula de estimacin que se encuentra en el libro de Bioestads-tica de Steel Torrie Pag 115.

Grupo A: Despus de 40 das de infeccin se inici la administracin, diaria de 15ml de savia del pltano mezclada con alfalfa chancada con una piedra. La ex-traccin de la savia, se realiz exprimiendo el pseudo-tallo maduro de la Musa acuminata, guardndose en un frasco estril y almacenndose en el refrigerador.

Grupo B: Con el mismo tiempo de infeccin, se les in-yect diariamente a cada uno de los cobayos 83.3mg (0.08ml) de kanamicina/da por va intramuscular, mediante una jeringa de tuberculina y de 63mg de etionamida/da, diluido en agua destilada y adminis-trado por va oral y 15ml de la savia mezclada con su alfalfa chancada.

Grupo C: Este grupo Control, slo se le administr SSF.

Diez das despus de terminado el tratamiento, 30 do-sis (grupo A) y 16 dosis (grupo B), se procedi a anes-tesiar con cloroformo uno a uno, los cobayos de los Grupos A y B, dejando dos cobayos de estos Grupos

hasta los seis meses. Para autopsiar cada animal se fi-jaron las extremidades de los cobayos en una base de cartn grueso, mediante una pinza y tijera quirrgica se abrieron los tejidos, aplicando las medidas de bio-seguridad16, se extrajeron los pulmones, estos se de-positaron en placas de Petri, para apreciarlos en fres-co y fotografiarlos. Las muestras de tejido pulmonar se tomaron mediante un escalpelo para lo cual se realiz dos incisiones profundas en el pulmn y se extrajeron porciones de tejido de ambos lbulos superior y me-dio pulmn en forma de tringulo, con estos se rea-lizaron frotis para la bsqueda de b.a.a.r mediante la coloracin del Ziehl Neelsen, otros fragmentos de este tejido pulmonar fueron triturados con la ayuda de una bagueta dentro de un tubo 13x100mm con 1ml. de SSF. La suspensin de este tejido se cultiv mediante una pipeta Pasteur, en el medio Lowenstein Jensen y se incubaron durante 30 das a 37C; as mismo se conservaron otros fragmentos de los pulmones en for-mol al 10%, para el estudio histopatolgico, a cargo de la Patloga Dra. Patricia Contreras (Anexos). Este mismo procedimiento se realiz con dos cobayos de los Grupos A y B, transcurrido seis meses del trabajo experimental.Se tomaron placas radiogrficas de trax a dos coba-yos de los grupos A , B y C a los 40 das de infectados y slo a los cobayos de los grupos A y B a los seis meses de finalizado el experimento el experimento.Este trabajo de investigacin tuvo una duracin de 180 das. ticaSe tuvo en cuenta el cuidado, la utilizacin apropia-da y el trato humanitario de los animales empleados en la investigacin, adems se tuvo en cuenta un am-biente fsico y espacio adecuado de acuerdo a la es-pecie y tamao, segn los documentos publicados en la Organizacin Panamericana de la Salud, respecto al animal como sujeto de experimentacin17. Definiciones OperacionalesBacilos del Mycobacterium tuberculosis MDR bien co-loreados y sin alteracin celularCobayo sano. Activo, ingiere alimento de manera continua, con recuento de monocitos inactivos de 2-4%, frecuencia respiratoria entre 90 - 129 resp/min, temperatura entre 37 - 38 C y pesa entre 400 500 g. Radiolgicamente los pulmones del cobayo sano muestran moderada radiolucidez homognea en ambos hemitorax, con escasos patrones intersticiales parahiliares.Cobayo enfermo. Astnico, anorxico, con dificultad


respiratoria, con 12-16% de monocitos activos( cito-plasma amplificado, con pseudpodos). Con pulmo-nes que mostraron mltiples granulomas y bacilosco-pa positiva para b.a.a.r.Cobayo curado. Mayor peso corporal, crecieron, viva-ces, consumieron toda su alfalfa, con 2-4% de mono-citos inactivos. Despus de seis meses de tratados, los frotis de tejido pulmonar y cultivo fueron negativos para B.K. Anlisis Estadstico. Es un trabajo de investigacin principalmente aleatorizado, donde han intervenido dos grupos de trabajo y un control.

ResultadosSe observ un notable aumento del porcentaje y acti-vacin de monocitos durante el tiempo en que el ani-mal estuvo enfermo y disminucin sucesiva y retorno a su estado inactivo conforme transcurrieron los das de tratamiento, hasta la progresiva curacin de los cobayos (esta observacin se tendr que validar con otro trabajo de investigacin); motivo por el cual no se hicieron ms observaciones despus de los 16 y 30 das.El aspecto de los pulmones recin extrados permiti observar la ausencia de granulomas superficiales, evi-denciados mediante las radiografas de trax de los animales curados.

Tabla N 1: Tratamiento de la TB Pulmonar con la savia de Musa acuminata

Con 16 dosis + kanamicna - etionamida

Con 30 dosisde savia

Cobayosenfermos

Cobayoscurados

Grupo A 0 6

Grupo B 0 6

Grupo C 6 0

Foto N1: Pulmones de Cobayo con mltiplesgranulomas

Foto N2: Pulmones sin granulomas cobayodel Grupo A

Foto N3: Pulmn cobayo del Grupo C en fresco con muchos granulomas


Foto N4: Radiografa de trax de cobayo enfermo

Foto N5: Radiografa de trax de cobayo curado

DiscusinEn presente trabajo de investigacin ha comprobado que la va peritoneal no desencaden enfermedad extrapulmonar o generalizada a pesar de la formacin de gran nmero de granulomas; para corroborar este hallazgo se hicieron frotis de todos los rganos y exa-men baciloscpico de heces y orina, cuyo resultado fue negativo en todas la muestras. Ha sido muy no-table la eficaz respuesta del sistema inmune de los cobayos y sin ningn efecto colateral. Segn Basaraba las diferentes especies de modelos animales para tu-berculosis humana difieren en la morfologa de la le-sin pulmonar o extrapulmonar, la cual puede influen-ciar en la respuesta a la terapia10.

Durante la enfermedad y como consecuencia de la replicacin masiva de los bacilos de Koch dentro de los macrfagos, mediante mecanismos de patogeni-cidad como la inhibicin de la apoptosis celular, por la resistencia intracelular al bloquear la accin de la bomba de ATPasa, la cual es la responsable de la aci-dificacin del medio intracelular en el fagolisosoma; la consecuencia de ello es la lisis de los macrfagos, y las micobacterias invaden otros monocitos. Entre los componentes de la pared celular el 6,6 dimicolato de trehalosa estimula la generacin de la formacin del granuloma7.

Una prueba de la gravedad de la TBC pulmonar se pre-senta en la (Foto 1), el pulmn de un cobayo con mltiples granulomas y en contraste el pulmn de un cobayo sin granulomas, al que se le administr la sa-via del pltano (Foto 2).

La muerte bacteriana podra ocurrir por efecto de la sa-via del pltano que estara alterando la estructura de la pared celular permitiendo el ingreso o libre accin de los antibiticos; se podra aseverar que habra una accin sinrgica alcanzando una actividad bactericida altamente letal12,13. La destruccin de los bacilos dejaran en libertad ciertos neoantgenos, los cuales seran fagocitados por las clulas presentadoras de antgenos (CPA), procesando y generando eptopes antignicos inmunodominantes, que seran presenta-dos a los Linfocitos THO, estos a la vez se activaran y sumado a la intervencin de la IL-12, estimularan la diferenciacin de estos linfocitos al subtipo TH1 y estos mediante sus mecanismos efectores como la sntesis del interfern que activa a los monocitos, ocasionando la destruccin intracelular del BK11.


En un estudio prospectivo controlado con 39 pacien-tes con TB pulmonar MDR, se administr kanamicina, etionamida, cycloserina y PAS, observndose en 29 de ellos la conversin del esputo a la negatividad dentro de los seis meses de tratamiento15.

Los animales que recibieron ambos medicamentos y conforme disminuyen los antgenos micobacterianos, empieza a reducirse el proceso inflamatorio y los mo-nocitos disminuyen en nmero y entran en estado de reposo o inactividad. Paralelamente coincide con la recuperacin de la salud de los cobayos, estos consu-men ms alfalfa y aumentan de peso.

La reduccin del tiempo de tratamiento, de poder apli-carse en el futuro sera un beneficio muy importante para los pacientes, esto nos permite inferir, que los antibiticos, kanamicina y etionamida, mas la savia de Musa acuminata causan en tiempo sumamente corto la muerte del Mycobacterium tuberculosis, como lo podemos observar en la (tabla 1 ).

El efecto bactericida de la savia de Musa acuminata contra el Mycobacterium tuberculosis MDR se verifi-c mediante la autopsia que permiti ver en fresco el tejido pulmonar, sin granulomas, de color rosado, pre-servado en formol en los grupos A y B. En cambio los pulmones del grupo control, presentan gran nmero de granulomas, en fresco se observaron con una co-loracin heptica (Foto 3). El cultivo de fragmentos de los pulmones de los grupos A y B fueron negativos ; en cambio el cultivo de fragmentos de los pulmones del grupo C, fueron positivos Las radiografas de trax de los grupos A y B permiten observar, segn el informe del radilogo, una radioluminosidad que denota la au-sencia de opacidades en el pulmn de los cobayos tra-tados (Fotos 4 y 5). En el estudio anatomopatolgico de fragmentos de los pulmones enfermos del cobayo sin tratamiento se observa una neumonitis granulo-matosa altamente caseificante y en el cobayo curado la presencia de focos linfoides aislados, as como un cuadro histopatolgicamente compatible con resolu-cin de TB pulmonar.Se considera como nica limitacin la parte econmi-ca ya que todos los gastos del presente trabajo fueron costeados con recursos propios.

Conclusiones1. La savia de Musa acuminata elimina los Mycobac-terium tuberculosis detectables bacteriolgicamente, observndose una progresin hacia la curacin histo-

lgica y radiogrfica de la tuberculosis pulmonar con 30 dosis.2. La savia de Musa acuminata utilizada en asocia-cin con Kanamicina y Etionamida, elimina los Myco-bacterium tuberculosis con 16 dosis.

Dr. Ortiz Marn Segundo Helmer:[email protected]

Anexo


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