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A. Propiedades generales
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Regulación de la actividad enzimática
Enzimas
En su gran mayoría son proteínas
Catalizadores biológicos: aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones (106 – 1014 veces)
Poseen un elevado grado de especificidad por el sustrato
La actividad catalítica depende de la integridad de la estructura nativa así como del pH y temperatura
Algunas poseen cofactores o grupos prostéticos: grupos no proteícos que colaboran en el mecanismo de catálisis
Su actividad puede ser regulada
A. Propiedades generales
N° Clase Tipo de reacción catalizada
1 Oxidoreductasas Transferencias de equivalentes de reducción de un grupo a otro
2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupos funcionales de un sustrato a otro
3 Hidrolasas Reacciones de hidrólisis (transferencia de grupos funcionales de un sustrato al agua)
4 Liasas Adición o extracción de grupos H2O, NH3 o CO2
5 Isomerasas Reacciones de isomerización
6 Ligasas Formación de enlaces acopladas a la hidrólisis de ATP
Clasificación:
Nomenclatura: generalmente se adiciona sufijo “asa” al nombre del sustrato o de la reacción que cataliza
Ejemplos:
• Glucoquinasa: transferencia de grupo fosfato (kinasa) del ATP a la glucosa
• Ureasa: hidrólisis de la urea
A. Propiedades generales
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Regulación de la actividad enzimática
Enzimas
B. ¿Cómo funcionan?
E + S ↔ ES → E + P
Unen un sustrato lo convierten en un producto y lo liberan
La reacción enzimática tiene lugar dentro de un pequeño lugar en la enzima: el sitio activo
•En condiciones fisiológicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas (estabilidad de biomoléculas)
•Muchas reacciones bioquímicas suponen situaciones poco probables
•Una enzima soluciona estos problemas proporcionando un ambiente tridimensional favorable a la reacción (sitio activo)
B. ¿Cómo funcionan?
Aumenta la velocidad de reacción sin cambiar el equilibrio
Coordenada de reacción
Ener
gía
libre
, G
Reacción no catalizada
Reacción catalizada
Estado de transición
Ener
gía
libre
, G
Coordenada de reacción
A. Propiedades generales
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Regulación de la actividad enzimática
Enzimas
Cinética enzimática
• Es el estudio de la velocidad de las reacciones enzimáticas
La velocidad de una reacción se puede medir como:
I. la cantidad de producto formado por unidad de tiempo
II. la cantidad de sustrato que se consume por unidad de tiempo
S → P
v = d [P] - d[S] dt = dt = k[S]
Velocidad: concentración/tiempo (µM/min)k (de primer orden): tiempo -1 (min-1)
Velocidad de reacción
Modelo de de Michaelis- Menten
E + S ↔ ES → E + P
Michaelis y Menten propusieron un modelo para explicar el comportamiento de las enzimas:
• Postularon que la enzima se combina en primer lugar con el sustrato, de forma reversible
• El complejo se descompone en una reacción más lenta, dando lugar al producto y enzima libre
Modelo de de Michaelis- Menten
+=
SSmaxV
ovmK
Vmax = Velocidad máxima
Km = [S] a la cual la velocidad es igual a ½ de Vmax
Parametros cinéticos:
•La velocidad de la reacción depende de la concentración de sustrato
•La relación entre ambas variables está descrita por una hipérbola rectangular (cinética de saturación)
ES E + S E + Pk2
k-1
k1
• Los parámetros Km y Vmax son característicos para cada enzima y para cada uno de sus sustratos
* Vmax depende de la concentración de enzima
Modelo de de Michaelis- Menten
La velocidad inicial depende de la concentración de enzima: Constante catalítica Kcat
Si [S] >> Km: la enzima se encuentra “saturada”todos sus sitios activos ocupados por el sustrato
Vo = Vmax
Vmax = kcat [E] total
V0 = k2 [ES]
Concentración de enzima
Velo
cida
d in
icia
l (Vo
)
E + S ↔ ES → E + PK1 k2
K-1
ET = E libre + ES
Kcat o número de recambio
Kcat = Vmáx[ET]
Número de recambio
Número de moléculas de sustrato convertidas a producto por una unidad de tiempo por una molécula de enzima cuando la
misma se encuentra saturada por el sustrato
• Es la velocidad medida en
los primeros instantes de
la reacción y cuando se ha
consumido menos de un
10% de sustrato
• Velocidad inicial
¿Cómo se determina experimentalmente la actividad enzimática?
Se mide la velocidad
inicial de reacción
mantentiendo constante
la [E] y variando la [S]
¿Cómo se determina experimentalmente la actividad enzimática?
[ ] max11
max1
VSVmK
ov +⋅=
+=
SSmaxV
ovmK
Linealización de Lineweaver Burk
y = a x + b
Determinación de los parámetros cinéticosGráfico de dobles recíprocos
Determinación de la actividad enzimática en muestras clínicas
Se mide en presencia de concentraciones de sustrato saturantes (> 10 Km)
Se expresan en UI/mL
Se deben estandarizar las condiciones de pH, temp, fuerza iónica, etc.
Algunas enzimas utilizadas en diagnóstico clínico de enfermedades
Enzima Tejido Uso diagnóstico
Creatina fosfoquinasa (CK) Músculo esquelético, corazón
Distrofia muscular, infarto de miocardio
Alanina amino transferasa (ALT) Hígado Hepatopatía (por ej.
hepatitis)
Amilasa Páncreas, glandulas salivales
Pancreatitis aguda, obstrucción biliar
Fosfatasa alcalina Osteoblasto Enfermedad ósea, tumores óseos
Gama-glutamil transferasa (GGT) Hígado Hepatitis, exceso de alcohol
A. Propiedades generales
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Regulación de la actividad enzimática
Enzimas
D. Regulación de la actividad enzimática
La actividad de las enzimas puede ser modulada positiva- o negativamente según las necesidades del organismo
Esta propiedad es la base de muchos fármacos utilizados en la medicina para tratar una enorme diversidad de afecciones
D. Regulación de la actividad enzimática
1. Inhibidores reversibles
a) Inhibidores competitivos
b) Inhibidores acompetitivos
c) Inhibidores no competitivos
2. Inhibidores irreversibles
3. Modulación alostérica
4. Modulación covalente
5. Activación por proteolisis
1. Inhibidores Reversibles
a. Inhibidor competitivoEl inhibidor competitivo interfiere con la unión del sustrato al sitio activo
•Los inhibidores competitivos suelen ser similares al sustrato
Ejemplos de inhibidores competitivos
I. malonato•El malonato es inhibidor de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa.
•Su estructura es muy similar a la del sustrato (succinato) y compite por su unión al sitio activo.
Ejemplos de inhibidores competitivos
II. metotrexato
• Se usa como anti-cancerígeno
• Es un inhibidor de la enzima tetrahidrofolato reductasa
• Tiene una afinidad 1000 veces mayor que el sustrato (ácido fólico) por la enzima
Determinación del tipo de inhibición
KM app > KM
a. Inhibidor competitivo
KM real KM ap
Sin inhibidor
Con inhibidor
Vmáx
Velo
cida
d de
rea
cció
n
½Vmáx
[Sustrato]
Determinación del tipo de inhibición
Con inhibidor
Sin inhibidor
Linealización de Lineweaver Burk
y = a x + b donde: a= pendiente KM/Vmáx b = corte en el eje de las y 1/Vmáx
2. Inhibidores Irreversibles
• Se unen o modifican covalentemente a la enzima y la inhiben
• Ejemplo: penicilina
La penicilina se parece al péptido sustrato de la enzimatranspeptidasa (involucrada en la formación de la pared bacteriana)Al unirse a la enzima reacciona con un aminoácido del sitio activo de la enzima y la inactiva
3. Modulación alostérica
• Implica la unión reversible de un modulador en un sitio diferente al sitio activo.
• Esta unión puede llevar a una disminución o a un aumento de la actividad enzimática (modulación positiva o negativa)
• La misma enzima puede estar sujeta a regulación por varios moduladores diferentes
3. Modulación alostérica
• Las enzimas alostéricas no siguen una cinética de Michaelis Menten
• La relación entre velocidad y [S] está descrita por una curva sigmoidea
3. Modulación alostérica
Problema:
Las enzimas X e Y catalizan la misma reacción y presentan las curvas vo en función de [S] que se muestran en la figura. ¿Qué enzima es más eficiente a baja [S]? ¿Cuál es más eficiente a alta [S]?
4. Modulación covalente
Ejemplos:
• Fosforilación• Adenililación• Uridililación• ADP-ribosilación• Metilación
•En este tipo de regulación una enzima es modificada covalentemente por otra enzima
•La modificación produce un cambio conformacional en la enzima y cambia su actividad.
•La modificación puede ser adicionada o eliminada según las necesidades de la célula