dr. romero isquemia,nutrisim
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ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM
• Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.
• CIBO-IMSS. Guadalajara, México• Dr. en Ciencias. Genaro G. Ortiz.
NUTRISIM• Arginina• Lisina • Colina• Cloruro de Amonio• Cloruro de Calcio• Cloruro de Magnesio
ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM
• 100 ratas (250 g. de peso) de la cepa Wistar
• Grupos de 10 ratas por dosis administrada • La administración será por vía
intraperitoneal
ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM
• Curvas de Kaplan Meyer • Análisis histopatológico y Macroscópico
post- morten– Hígado– Riñón– Pulmón
• Análisis Bioquímico
ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM
• 0.1 ml• 0.2 ml• 0.3 ml• 0.4 ml• 0.5 ml
• 1 ml• 2 ml• 3 ml• 4 ml• 5 ml
Dosis Administrada
ResultadosPor Observación
• No se presentó ninguna muerte. • Ninguna alteración en su patrón de conducta
ResultadosHematología y Bioquímica
• En todos los animales estudiados no se apreció ninguna modificación de los valores normales tanto de la citología hemática como de la química sanguínea.
ResultadosAnálisis Estructural
• Los órganos estudiados: hígado, pulmón y riñón; no mostraron ninguna modificación en el patrón citoestructural como citoarquitectónico
ResultadosAnálisis Morfológico
• No se apreció ninguna alteración en la laparotomía y toracotomía; no encontramos líquidos en cavidades ni datos de degeneración, congestión o edema en ninguno de los grupos estudiados.
Estudio Estructural y Bioquímico del posible efecto
protector del Nutri-Sim en cerebros de Gerbos (Mongolian gerbils - Meriones unguiculatus)
sometidos a isquemia-reperfusión.
Dr. Rolando Romero DávalosLic. Luis Alfredo Romero Tirado.BIO-SIM S. A. de C. V., México
Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.CIBO-IMSS. Guadalajara, MéxicoCoordinador Dr. Genaro G. Ortiz.
La Enfermedad Isquémica Cerebrovascular ( EVC )
• Patología que surge como resultado de la alteración de los vasos sanguíneos que suministran su flujo al cerebro.
• 3° causa de muerte en el mundo.
FACTORES• Hipertensión • Cardiopatías• Tabaquismo• Diabetes mellitus • Consumo de alcohol• La vida sedentaria• La obesidad • Anticonceptivos orales.
ISQUEMIA - REPERFUSION• La isquemia es la ausencia o disminución del aporte
sanguíneo por un determinado tiempo, que lleva a un daño celular, en ocasiones no muy específico y delimitado. Por otro lado, la reperfusión, es el período que sigue a la isquemia, y que se caracteriza por una reoxigenación cerebral acompañada del restablecimiento del aporte sanguíneo. Así pues, durante la isquemia se genera un daño al producirse radicales libres y en la reperfusión el daño puede ser mayor cuando se distribuyen estos radicales libres a través de la sangre.
HIPOTESIS
• El Nutri-Sim protegerá del daño oxidativo al cerebro de gerbos después de la isquemia reperfusión.
HIPOTESIS NULA
• El Nutri-Sim no protegerá al cerebro del daño oxidativo generado al realizar isquemia-reperfusión en gerbos.
OBJETIVO GENERAL
• Estudiar el efecto antioxidante del Nutri-Sim en cerebros de gerbos (Mongolian gerbils: Meriones unguiculatus) despues de realizar isquemia-reperfusión.
Objetivos particulares• Demostrar que existe daño neuronal (agudo
y crónico) al realizar el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos.
• Demostrar que existe estrés oxidativo en el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos.
• Estudiar el papel Nutri-Sim como protector, en los procesos de isquemia-reperfusión cerebral.
VARIABLES• Independientes
– Nutri-Sim• Dependientes
– Peroxidación de Lípidos de Membrana – Oxido Nítrico (Nitratos y Nitritos)– Glutatión Peroxidasa– Estructura celular
MATERIAL
• 120 animales de la especie Meriones unguiculatus (Gerbos)
• Anestésicos – Droperidol – Ketamina
DETERMINACIONES
• Concentración de proteínas totales: Método Bradford.
• Peroxidación de lípidos de membrana, 4- Hidroxialquenos (HA) y malonaldehídos (MDA)
• Oxido Nítrico, método de Griess• Glutatión Peroxidasa
GRUPOS A ESTUDIAR
1. Testigo2. Testigo Manipulado3. Isquemia-Reperfusión4. Isquemia Reperfusión mas Nutri-Sim5. Nutri-Sim
PROCEDIMIENTO
• Grupos 3 y 4 se someterán a una isquemia de 5 minutos
• A los 90, 120 minutos y 7 días de reperfusión se sacrificarán con una N de 8 animales por cada tiempo.
• Rápidamente se extraerá el cerebro y sangre del animal para realizar los estudios experimentales
TECNICAS • Anestesia con droperidol 2.5 mg/Kg S.C• 5 minutos después se inyecta ketamina
50mg/Kg I.M.• Tricotomía de cuello.• Incisión horizontal sobre la base del cuello, se
diseca hasta llegar a carótidas de ambos lados, se separa con una seda (se les colocan pinzas para la isquemia y se retiran a los 5 minutos).
ESTUDIO ESTRUCTURAL • Fijaremos por inmersión con paraformaldehido
al 4 % amortiguado en solución de Fosfatos 0.1M
• Se deshidratarán en alcoholes en forma ascendente y se incluirán en paraplas-plus se cortarán a 6 micras y se teñirán con hematoxilina y eosina.
• Se analizarán en un foto microscopio Zeiss Axioscop del que se tomarán fotografías.
ESTUDIOS BIOQUIMICOS • Se realizarán en homogenizados de cerebro (area hipocampal).• Se utilizarán los kits comerciales de la casa Oxford Biomedical Research
para medir peroxidación lipídica, Glutatión peroxidasa.• Para la determinación de nitritos y nitratos se utilizará el reactivo de
Griess.• Se toma tejido homogenizado descongelado 1:10, se centrifuga 14,000
rpm por 10 minutos a 4º C, se guardan alícuotas a -20ºC para calcular los niveles de nitritos y nitratos (utilizaremos la enzima de la casa Sigma).
• Se incuban en placas a temperatura ambiente por 20 minutos. A 10 ml de muestra se les agrega 10 ml de Griess (sulfanilamida 1%, 5% de ácido fosfórico y NEDA 0.1% en 1:1).
• Se lee a una absorbancia de 550nm. La concentración de nitritos y nitratos ( 0-15 nmol/ml) se calcula por comparación con las absorbancias de las disoluciones estándar, conocidas de nitrato y nitrito sódico en agua.
RESULTADOS
• PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS• ÓXIDO NÍTRICO • GLUTATIÓN PEROXIDASA• MORFOLOGÍA
– ANÁLISIS MACROSCÓPICO – ANÁLISIS MICROSCÓPICO
PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS
LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 90 M IN
0
5
10
15
20
25
30
35
40
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS
LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 120 M IN
0
10
20
30
40
50
60
70
80
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS
LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 7 DIAS
0
2
4
6
8
10
12
14
16
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
ÓXIDO NÍTRICO OXIDO NITRICO, 90 M IN (Nitratos y Nitritos)
0
50
100
150
200
250
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
ÓXIDO NÍTRICOOXIDO NITRICO, 120 M IN (Nitratos y Nitritos)
0
50
100
150
200
250
300
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
ÓXIDO NÍTRICOOXIDO NITRICO, 7 DIAS (Nitratos y Nitritos)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
nM/mg/Pr
GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 90 M IN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparición NADPH / Min /mg/Pr
GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 120 M IN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparición NADPH / Min /mg/Pr
GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 7 DIAS
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM
Desaparición NADPH / Min /m g/Pr
MORFOLOGÍACélulas Piram idales
0
5
10
15
20
25
30
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA5´Perfus ion 90´
ISQUEMIA5´Perfus ion
120´
ISQUEMIA5´Perfus ion 7
días
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 90´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion120´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 7días
MORFOLOGÍACélulas Hipercrom áticas
0
5
10
15
20
25
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA5´Perfus ion 90´
ISQUEMIA5´Perfus ion
120´
ISQUEMIA5´Perfus ion 7
días
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 90´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion120´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 7días
MORFOLOGÍACélulas Gliales
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA5´Perfus ion 90´
ISQUEMIA5´Perfus ion
120´
ISQUEMIA5´Perfus ion 7
días
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 90´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion120´
NUTRI-SIMISQUEMIA
5´Perfus ion 7días
TESTIGO
ISQUEMIA 90´
ISQUEMIA 120´
ISQUEMIA 7 DIAS
ISQUEMIA + NS 7 DIAS
EFECTO PROTECTOR DE NUTRI-SIM