Utilidad del análisis de gota seca en hiperCKemias
Dr. Cristóbal Colón MejerasUnidade de Diagnóstico e Tratamento das Enfermidades Conxénitas do MetabolismoHospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela
Prevalencia conocida en cribado neonatal
1978-2013. Un caso por cada x RN vivos
Patología Prev.
Hipotiroidismo Congénito (CH) 2.472
Fibrosis Quística (CF) 10.763
Fenilcetonuria (PKU) 12.222 Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena media (MCAD) 18.962
Leucinosis (MSUD) 32.591
Acidemia Metilmalónica (MMA) 40.260
Acidemia Glutárica Tipo I (GA I) 40.633
Déficit de Biotinidasa (BIOT) 68.087 Galactosemia (Def. gal-1-P-uridil-transferasa GALT) 68.442
Patología Prev.Déficit 3-OH Acil-CoA Deshidrogenasa cadena larga (LCHAD) 71.107
Acidemia propiónica (PA) 94.809 Déficit Acil-CoA-deshidrogenasa cadena muy larga (VLCAD) 142.214
Tirosinemia tipo I (TYR I) 228.139
Citrulinemia (CIT) 284.428
Homocistinuria Clásica (HCY) 284.428
Deficiencia Primaria de Carnitina (CUD) 284.428 Déficit de 3-OH-3-Metilglutaril-CoA Liasa (HMG) 284.428
Acidemia isovalérica (IVA) 284.428
Polímeros ramificados de glucosa
• Son la vía más antigua de almacenamiento universal de energía en las células y probablemente se sitúe ya en los albores del origen de la vida celular.
• Dos formas claramente diferenciadas:– Glucógeno en animales.– Almidón en plantas.
Glucógeno
• Es la principal vía de almacenamiento de carbohidratos pero no llega al 1% de la energía almacenada en nuestro organismo, ya que ésta es la función del tejido adiposo.
• Sin embargo, es la principal fuente de energía para los músculos.
• Y es crucial para la homeostasis, pues es determinante para el balance glucémico.
Dónde se encuentra el glucógeno
• Hígado en donde puede haber 400 g de glucógeno
• Músculo esquelético con 1200 g de glucógeno
• Cerebro, en los astrocitos• Pulmones fetales, en los
neumocitos tipo 2 (responsables de la producción de surfactante).
Glucogénesis
Glucógeno sintasaque une los monómeros de glucosa
Glucogenina (GYG1 GYG2) que inicia la polimerización de la glucosa y se encuentra en el núcleo del polímero
Enzima ramificanteque crea una nueva rama cada 10-14 glucosas
Glucógeno
Häggström, Mikael. "Medical gallery of Mikael Häggström 2014". Wikiversity Journal of Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.008. ISSN 20018762.
GlucogenolisisGlucógeno-fosforilasa α1-4 Transglicosilasa
Glucogenolisisα 1-6 glicosidasa
LISOSOMA GLUCÓGENO
Enzima desramificante(GSD IIIa, b, c)
Fosforilasa hepática (GSD VI)
Fosforilasa muscular(GSD V)
Enzima ramificanteEnlaces α 1-6
(GSD IV)
Glucógeno sintasaEnlaces α 1-4
(GSD 0)
Fructosa-1,6-BP
GLUCOSA-1-P
Dihidroxiacetona-P
Glucosa
Piruvato
Lactato
Lactato deshidrogenasa
(GSD XI)
α-1,4 y α-1,6 glucosidasa
(GSD II)
Glucosa-6-fosfatasa(GSD Ia)
Transportador Glucosa-6-fosfato(GSD Ib, c, d)
Fosfofructoquinasa(GSD VII)
Fructosa-6-P
GLUCOSA-6-P
Aldolasa A(GSD XII)
Fosforilasa quinasa(GSD IXa1, a2, b, c, d)
Gliceraldehido 3-P
Glicerato 2-P
Fosfogliceratomutasa 2 (GSD X)
1932 Joannes Cassianus Pompe (Holanda) describe la enfermedad en un bebé de 7 meses que fallece por hipertrofia cardiaca idiopática
1955 Christian René de Duve (Bélgica) describe los lisosomas
1963 Henri-Géry Hers (Bélgica) describe la deficiencia de la enzima α-1,4 glucosidasa como causa de la enfermedad
1986-1988 Frank T. Martiniuk (USA) y Arnold J.J. Reuser (Holanda), consiguen la estructura del gen que codifica el enzima y describen numerosas mutaciones
2001 Néstor Chamoles describe técnica analítica en gota seca2006 FDA aprueba Tratamiento enzimático sustitutorio
75 años de Enfermedad de Pompe
CRIBADOS
Retraso en el diagnóstico clínico en la Enfermedad de Pompe
2
4,7
0
1
2
3
4
5
n=168 niños
Edad
med
ia (m
eses
)
PrimerossíntomasDiagnóstico
24
33
0
5
10
15
20
25
30
35
n=255 niños y adultosEd
ad m
edia
(año
s)Kishnani et al. J Pediatr 2006; 148:671-676 Winkel et al. J Neurol 2005; 252:875-884
Herramientas diagnósticas en Pompe
• Cardiacas– Rx. RM– EKG– Eco
• Pulmonares– Espirometría– Rx, RM– Pulsioximetría– Estudios del sueño
• Musculares– EMG– Test de fuerza muscular
Diagnóstico Analítico de Pompe
• Creatina kinasa sérica (CK)• Alanina, aspartato aminotransferasa (ALT/AST)
y lactato deshidrogenasa (LDH)• Glucosa tetrasacárido urinaria (Glc4)• Biopsia muscular: invasiva• Técnicas moleculares: paneles genéticos• Medición actividad α-glucosidasa
Medición de actividad α-glucosidasa
– Fibroblastos: Se requiere biopsia de piel. Los cultivos de fibroblastos tardan 4 semanas y hay que añadir el tiempo de 3 días para medir la actividad α-glucosidasa.
– Linfocitos. Los neutrófilos tienen una α-glucosidasaadicional (maltasa-glucoamilasa) y por eso no valen los leucocitos. Necesario procesar la muestra fresca y enviar en hielo o congelada los linfocitos aislados.
– Gota de sangre seca. Menos invasiva. Si urge, el resultado está en 2 días. Puede ser empleada para cribado neonatal.
Calidad de la muestra
Ejemplos de muestras inválidas
Estado de la Muestra75% motivos de repetición
• Obtención:– Mal impregnadas– Sobreimpregnadas– Empleo de alcohol
• Manipulación:– No secar al sol ni con una fuente de calor*– Efecto “cromatográfico” por secado inadecuado– Contaminación con heces, bacterias, hongos etc.
• Retraso en el envío y/o recepción de las muestras en la Unidad
*Waite, KV et al. 1987 Clin. Chem. 33 (6): 853-855.
Influencia de anticoagulante en gota seca de sangre impregnada en papel
sin aditivo 2,06heparina 2,04
citrato 2,01
EDTA 1,93
1,85
1,90
1,95
2,00
2,05
2,10
alfa-galactosidasa
Reacción enzimática con sustrato marcado
Factores que afectan a la actividad enzimática
• Temperatura• pH• Concentración del sustrato (saturación)• Concentración del enzima (defecto
enzimático)• Inhibición enzimática
Determinación directa
– La más fiable, mejor sobre leucocitos o fibroblastos. Ejemplo: Enf. de Fabry
– Más rápida sobre gota seca.
Enfermedad de Fabry
• Una enzima implicada: alfa-galactosidasa A. • N-acetilgalactosamina como inhibidor de la
alfa-galactosidasa B.• Se intentan reproducir la condiciones
fisiológicas a pH 4,4, 37ºC durante 20 horas.• Se detiene la reacción cambiando a pH 10 y en
donde la 4MU se vuelve fluorescente.• Medición directa sobre una recta de 4MU
Ejemplo determinación enzimáticaCont. Fluorescencia nmol pmol
S3 50282 0,855 855
S3 46127 0,855 855
S4 28490 0,428 428
S4 28490 0,428 428
S5 15681 0,214 214
S5 14164 0,214 214
S6 7453 0,107 107
S6 7538 0,107 107
S7 3855 0,053 53
S7 3923 0,053 53
S8 2095 0,027 27
S8 2041 0,027 27
Muestra Fluorescencia Fluor-blanco pmol umol/L/h
LS-14024 25408 19603 331,39 5,2
LS-14026 11649 10120,5 171,09 2,7
LS-14028 1932 158,5 2,68 0,0
C.LOW 1703 100 1,69 0,0
y = 56,089x + 1769,2R² = 0,9886
0
20000
40000
60000
0 200 400 600 800 1000
Concentración 4MU
Determinación indirecta
– Cuando existe superposición de diversos enzimas. Ejemplo: Enf. de Pompe
Alfa-glucosidasas
• 4 enzimas glucosidasas implicadas:– Alfa-glucosidasa lisosomal (GAA) que es la que nos interesa
medir y se activa a pH 3,5-6,0. Residuo Trp– Dos alfa-glucosidasas que se activan a pH 7,0-7,5.– Maltasa-glucoamilasa (MGA) que se activa a pH 3,0-8,0
superponiéndose a todas las anteriores. Residuo Tyr• Se intentan reproducir las condiciones fisiológicas
trabajando a pH 3,9 y 6,5, incubando 24 h a 37°C.• Se intenta inhibir la MGA con una molécula por la que
tiene más apetencia que la GAA, la acarbosa.• Medición compleja: 8 por muestra sobre recta de 4MU.
Resultados Pompe• Una actividad glucosidasa total baja en medio ácido orienta hacia
cualquiera de estas interpretaciones (no excluyentes):– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,
empleo de EDTA, leucopenia, …)– Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamente
normal.
• Una actividad glucosidasa neutra baja orienta hacia cualquiera deestas interpretaciones (no excluyentes):
– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,empleo de EDTA, leucopenia, …)
– Se trata de una muestra con baja actividad glucosidasa, pero clínicamentenormal.
• Una actividad glucosidasa ácida inhibida baja indica (noexcluyentes):
– Que la muestra es inadecuada (mal impregnada, degradación enzimática,empleo de EDTA, leucopenia, …)
– Que estamos ante un posible caso de E. Pompe.
Interpretación Pompe
Resultados alfa-glucosidasa
0
10
20
30
40
50
60
700% 20% 40% 60% 80% 100%
Inicio infantil
Inicio juvenil
Inicio adulto
Muestras con Historial Clínico Pediátrico
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
500% 20% 40% 60% 80% 100%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
500% 20% 40% 60% 80% 100%
Hiper CKemia
Resultados motores y de supervivencia de los pacientes que fueron diagnosticados por NBS en comparación con los diagnosticados clínicamente. En rojo los casos del cribado (NBS); en verde los casos diagnosticados clínicamente tratados y en azul los casos no diagnosticados clínicamente y no tratados (historia natural). A, curva de supervivencia de Kaplan-Meier ajustada por edad. B, curva de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes sin soporte ventilatorio
Long-Term Prognosis of Patients with Infantile-Onset Pompe Disease Diagnosed byNewborn Screening and Treated since BirthChien, Yin-Hsiu et al. The Journal of Pediatrics ,2015. Volume 166 , Issue 4 , 985 - 991.e2
Conclusiones ensayo en DBS Pompe
• Muestra:– Fácil de obtener– Transporte por correo y a temperatura ambiente (bajos costes de
envío)– Gran estabilidad de la muestra si es correcta y luego se conserva en
nevera.• Técnica analítica:
– Preparación sencilla en el laboratorio– Técnica reproducible– Requiere poca muestra y esto es importante en neonatos– Muestra es menos infecciosa– Coste relativamente barato– Los casos graves son fácilmente detectables– ¡OJO! Las formas del adulto e intermedias pueden resultar falsos
negativos.
Muchas gracias