UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO, AL TÍTULO DE QUÍMICO Y
FARMACÉUTICO
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TITULO:
“ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO DE LAS SEMILLAS DE LOS
FRUTOS DULCES Y AMARGOS DE Nephelium lappaceum L.”
AUTORAS:
GÉNESIS YELITZA FARÍAS DELGADO
YULIANA LILIBETH OLAYA LARROSA
TUTORA: Q. F LAURA VALDEZ LÓPEZ, M.Sc.
CONSULTORA EXTERNA: DRA. MIGDALIA MIRANDA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: CIENCIAS BÁSICAS, BIOCONOCIMIENTO Y
DESARROLLO INDUSTRIAL
SUBLÍNEA DE INVESTIGACIÓN: CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
GUAYAQUIL-ECUADOR
2018
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
II
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO:
ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO DE LAS
SEMILLAS DE LOS FRUTOS DULCES Y AMARGOS DE Nephelium
lappaceum L.
AUTOR(ES)
(apellidos/nombres):
FARÍAS DELGADO GÉNESIS YELITZA
OLAYA LARROSA YULIANA LILIBETH
REVISOR(ES)/TUTOR(ES)
(apellidos/nombres):
Blgo. GUSTAVO ESCOBAR VALDIVIESO, M.Sc. , REVISOR
Q.F LAURA LEONOR VALDEZ LÓPEZ, M.Sc., TUTOR(A)
MIGDALIA MIRANDA MARTÍNEZ, PhD., CONSULTORA EXTERNA
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL – QUÍMICO FARMACÉUTICO
FECHA DE PUBLICACIÓN: 2018 No. DE PÁGINAS: 85
ÁREAS TEMÁTICAS: INVESTIGACIÓN FARMACOGNÓSTICA Y FITOQUÍMICA
PALABRAS CLAVES/
KEYWORDS:
Nephelium lappaceum L., semillas, ácidos grasos, estudio farmacognóstico,
fitoesteroles.
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras):
Nephelium lappaceum es un fruto nativo de Malasia e Indonesia introducida al Ecuador con propósitos
alimenticios. El estudio tuvo como finalidad identificar los metabolitos bioactivos presente en las semillas dulces
y amargas del rambután, a través de un análisis farmacognóstico en base a la evaluación de parámetros físico-
químicos, screening fitoquímico por extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente y cuantificación e
identificación de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas. Los resultados
obtenidos demostraron que las semillas difieren de manera significativa en el contenido de fitoconstituyentes
grasos (ácidos grasos) debido a que la variedad dulce presenta 57.35% en comparación con la variedad amarga con
un 68.88%. En conclusión las semillas amargas contienen un mayor porcentaje de rendimiento pudiendo
corroborarse en el perfil cromatográfico la identificación de compuestos grasos en fracción saponificable e
insaponificable en comparación a las semillas dulces.
ADJUNTO PDF: SI NO
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AUTOR/ES:
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INSTITUCIÓN:
Nombre: SEDE CIENCIAS QUÍMICAS
Teléfono: 04-229-3680
E-mail: [email protected]
X
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
ÍNDICE
RESUMEN .................................................................................................................... XXIII
ABSTRACT .................................................................................................................. XXIV
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1
CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 3
1.1 Planteamiento del problema .................................................................................... 3
1.2 Formulación del problema ....................................................................................... 3
1.3 Justificación ............................................................................................................. 3
1.4 Delimitaciones ......................................................................................................... 4
1.5 Hipótesis .................................................................................................................. 4
1.6 Objetivos .................................................................................................................. 4
1.6.1 Objetivo general ................................................................................................... 4
1.6.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 5
1.7 Variables .................................................................................................................. 5
1.8 Conceptualización e indicadores ............................................................................. 6
CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 7
MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 7
XIII
2.1 Antecedentes ............................................................................................................ 7
2.2 Nephelium lappaceum ............................................................................................. 9
2.2.1 Generalidades ....................................................................................................... 9
2.2.2 Taxonomía y características morfología del fruto ............................................... 9
2.2.3 Composición de la semilla ................................................................................. 11
2.2.4 Aplicación de las semillas a nivel técnico-industrial ......................................... 11
2.3 Compuestos grasos en plantas ............................................................................... 12
2.3.1 Lípidos ............................................................................................................... 12
2.3.1.1 Clasificación ............................................................................................. 13
2.3.1.1.1 Lípidos saponificables o complejos ................................................... 13
2.3.1.1.2 Lípidos no saponificables o simples .................................................. 16
2.3.2 Métodos de extracción de productos naturales .................................................. 18
2.3.2.1 Extracción mecánica ................................................................................. 18
2.3.2.2 Extracción con fluidos supercríticos ........................................................ 18
2.3.2.3 Extracción con disolventes ....................................................................... 19
3.3.2.3.1 Extracción discontinua ...................................................................... 19
3.3.2.3.2 Semicontinuos ................................................................................... 21
XIV
2.3.2.4 Método adicional de extracción ................................................................ 22
2.3.2.5 Método de identificación y cuantificación de ácidos grasos .................... 22
2.3.2.5.1 Cromatografía de Gases acoplado a espectrofotometría de masas
(CG/EM) .................................................................................................................. 22
CAPÍTULO III .................................................................................................................... 23
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 23
3.1. Método de investigación ........................................................................................ 23
3.2. Población y muestra............................................................................................... 23
3.3. Criterio de inclusión .............................................................................................. 23
3.4. Criterio de exclusión .............................................................................................. 23
3.5. Materiales .............................................................................................................. 24
3.5.1 Materia prima ..................................................................................................... 24
3.5.2 Materiales de laboratorio ................................................................................... 24
3.5.3 Equipos .............................................................................................................. 24
3.5.4 Reactivos ............................................................................................................ 25
3.6. Metodología ........................................................................................................... 25
3.6.1 Estudio farmacognóstico .................................................................................... 25
XV
3.6.1.1 Operaciones preliminares del material vegetal ......................................... 25
3.6.1.2 Parámetros físico-químicos aplicados a las semillas ................................ 26
3.6.1.2.1 Ensayo de humedad residual ............................................................. 26
3.6.1.2.2 Ensayo de cenizas totales .................................................................. 27
3.6.1.2.3 Ensayo de cenizas insolubles en ácido .............................................. 27
3.6.1.2.4 Ensayo de sustancias solubles ........................................................... 27
3.6.2 Estudio químico cualitativo ............................................................................... 28
3.6.2.1 Screening fitoquímico .............................................................................. 28
3.6.2.1.1 Método de extracción de grasas ........................................................ 31
3.6.2.2 Análisis de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a
espectrometría de Masas (CG/EM) .............................................................................. 33
CAPÍTULO IV .................................................................................................................... 35
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 35
4.1 Estudio farmacognóstico ....................................................................................... 35
4.2 Estudio químico cualitativo ................................................................................... 37
4.3 Extracción y análisis de compuestos grasos .......................................................... 38
DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 45
XVI
CAPÍTULO V ..................................................................................................................... 49
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................. 49
5.1 Conclusiones .............................................................................................................. 49
5.2 Recomendaciones ...................................................................................................... 50
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 51
ANEXOS ............................................................................................................................. 61
XVII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I Descripción taxonómica del rambután ........................................................................ 10
Tabla II Condiciones cromatográficas ..................................................................................... 33
Tabla III Características macromorfológicas de las dos variedades de semillas del fruto
Nephelium lappaceum. ............................................................................................................. 35
Tabla IV Parámetros físico-químicos de las semillas del fruto Nephelium lappaceum .......... 36
Tabla V Resultados obtenidos del screening fitoquímico realizado a los extractos de las
semillas dulce del fruto Nephelium lappaceum ....................................................................... 37
Tabla VI Parámetros fisicoquímicos del extracto graso de las dos variedades del fruto
Nephelium lappaceum .............................................................................................................. 38
Tabla VII Compuestos identificados en la fracción insaponificable de las semillas de los frutos
amargos y dulces de Nephelium lappaceum. ........................................................................... 40
Tabla VIII Compuestos identificados en la fracción saponificable de las semillas de los frutos
dulces y amargos de N. lappaceum .......................................................................................... 43
XVIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Características morfológicas del rambután .............................................................. 10
Figura 2. Estructura de ácido graso.......................................................................................... 13
Figura 3. Estructuras de los Acilgliceroles .............................................................................. 14
Figura 4.Estructura general de los fosfolípidos ....................................................................... 15
Figura 5. Formación estructural de las ceras ........................................................................... 15
Figura 6. Estructura del isopreno ............................................................................................. 16
Figura 7. Estructura general de los fitoesteroles ...................................................................... 17
Figura 8. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos
insaponificables de los frutos de Nephelium lappaceum variedades amargas y dulces. ......... 39
Figura 9. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos saponificables
de los frutos de N. lappaceum variedades amargas y dulces. .................................................. 42
XIX
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Lavado de frutos amargos y dulces del achotillo ..................................................... 61
Anexo 2. Separación de la cascara de las dos variedades del achotillo ................................... 61
Anexo 3. Despulpamiento del fruto amargo y dulce del achotillo. ......................................... 61
Anexo 4. Secado de las semillas amargas y dulces del achotillo............................................. 62
Anexo 5. Percepción de las semillas amargas y dulces del achotillo. ..................................... 62
Anexo 6. Pesado de las semillas de amargas y dulces del achotillo ........................................ 62
Anexo 7. Proceso de molienda de la semilla amarga del achotillo .......................................... 63
Anexo 8. Proceso de molienda de semillas dulces del achotillo. ............................................. 63
Anexo 9. Semillas molidas y etiquetadas para almacenamiento ............................................. 63
Anexo 10. Peso de las muestras para determinación de humedad ........................................... 64
Anexo 11. Muestras de semillas amargas y dulces en la estufa............................................... 64
Anexo 12. Muestras pesadas para cenizas totales. ................................................................... 64
Anexo 13. Muestras de semillas en la mufla. .......................................................................... 65
Anexo 14. Cenizas de las muestras en desecador. ................................................................... 65
Anexo 15. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico .................................... 65
Anexo 16. Pesado de muestras con disolventes para sustancias insolubles ............................ 65
XX
Anexo 17. Reflujo de la muestra/Residuo de sustancias solubles ........................................... 66
Anexo 18. Screening del extracto etéreo de las semillas amargas achotillo ............................ 66
Anexo 19. Screening del extracto de éter etílico de las semillas dulce de achotillo................ 66
Anexo 20. Prueba de Baljet del extracto etéreo semillas dulces y amargas. ........................... 66
Anexo 21. Prueba de Dragendorff del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ............ 66
Anexo 22. Prueba de Wagner de extracto etéreo de semillas dulces y amargas ..................... 66
Anexo 23. .Prueba de Sudan del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ..................... 67
Anexo 24. Prueba de Lieberman del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ............... 67
Anexo 25. Prueba de Resinas del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............. 67
Anexo 26. Prueba de Cl3Fe del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ................ 67
Anexo 27. Prueba de Fehling del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............. 67
Anexo 28. Prueba de Baljet del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas................. 67
Anexo 29. Prueba de Borntrager del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ......... 67
Anexo 30. Prueba de Buchard del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............ 67
Anexo 31. Prueba de Dragendorff del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ...... 68
Anexo 32. Prueba de Wagner del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ............. 68
Anexo 33. Prueba de saponinas del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ......... 68
XXI
Anexo 34. Prueba de Shinoda del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............ 68
Anexo 35. Screening del extracto de acuoso, de las semillas amargas del achotillo
(Nephelium lappaceum L) ........................................................................................................ 68
Anexo 36. Screening del extracto de acuoso de las semillas dulces del achotillo (Nephelium
lappaceum L). .......................................................................................................................... 69
Anexo 37. Prueba de Dragendorff del extracto acuoso de semillas dulces y amargas ........... 69
Anexo 38. Prueba de Fehling del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69
Anexo 39. Prueba de Espuma del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69
Anexo 40. Prueba de Shinoda del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69
Anexo 41. Prueba de Cl3Fe del extracto acuoso de semillas dulces y amargas ...................... 69
Anexo 42. Prueba de Wagner del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69
Anexo 43. Evaporación del solvente de extracción por medio de rota evaporador. ................ 69
Anexo 44. Extracción de ácidos grasos con hexano por el método de soxhlet. ...................... 69
Anexo 45. Determinación de índice de densidad relativa de los acido grasos de las semillas
dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69
Anexo 46. Determinación de índice de saponificación de los acido grasos de las semillas
dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69
Anexo 47. Determinación de índice de saponificación de los acido grasos de las semillas
dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69
XXII
Anexo 48. Determinación de índice de esterificación de los acido grasos de las semillas dulce
y amarga. .................................................................................................................................. 69
Anexo 49. Saponificación de ácidos grasos de las semillas dulce y amarga ........................... 69
XXIII
RESUMEN
Nephelium lappaceum es un fruto nativo de Malasia e Indonesia introducida al Ecuador con
propósitos alimenticios. El estudio tuvo como finalidad identificar los metabolitos bioactivos
presente en las semillas dulces y amargas del rambután, a través de un análisis farmacognóstico
en base a la evaluación de parámetros físico-químicos, screening fitoquímico por extracción
sucesiva con solventes de polaridad creciente y cuantificación e identificación de ácidos grasos
por cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas. Los resultados obtenidos
demostraron que las semillas difieren de manera significativa en el contenido de
fitoconstituyentes grasos (ácidos grasos) debido a que la variedad dulce presenta 57.35% en
comparación con la variedad amarga con un 68.88%. En conclusión las semillas amargas
contienen un mayor porcentaje de rendimiento pudiendo corroborarse en el perfil
cromatográfico la identificación de compuestos grasos en fracción saponificable e
insaponificable en comparación a las semillas dulces.
Palabras claves: Nephelium lappaceum L., semillas, ácidos grasos, estudio farmacognóstico,
fitoesteroles.
XXIV
ABSTRACT
Nephelium lappaceum is a fruit native to Malaysia and Indonesia introduced in Ecuador with
purposes foodstuffs. The study aimed to identify the metabolites bioactive present in seed sweet
and bitter of rambutan, through an analysis farmacognóstico based on the evaluation of
physical and chemical parameters, Screening phytochemical by removing successively with
increasing polarity solvents, quantification, and identification of fatty acids by gas
chromatography coupled to mass spectrometry. The results obtained showed that the seeds
differ significantly in the content of fatty phytoconstituents (fatty acids) because the sweet
variety presents 57.35% compared to the bitter variety with 68.88%. In conclusion the bitter
seeds contain a higher percentage of performance can be corroborated in the chromatographic
profile the identification of fatty compounds in fraction saponifiable matter and unsaponifiables
in comparison to seed sweets.
Key words: Nephelium lappaceum L., seeds, fatty acids, pharmacognostic study, phytosterols.
1
INTRODUCCIÓN
En Ecuador existe una gran variedad de especies vegetales que tienen importancia en la
sociedad debido a sus propiedades farmacológicas y nutricionales, sin embargo, la mayoría no
cuenta con estudios científicos con respecto a su composición química, por consiguiente incita
a investigadores a emplear la farmacognosia y fitoquímica para dilucidar de manera objetiva
los metabolitos bioactivos propios de cada planta de estudio para luego establecer mediante
técnicas experimentales más avanzadas la posible cuantificación y beneficio terapéutico (Van
Baren, 2015).
Dentro de esta biodiversidad se destaca al rambután un fruto autóctono de la región tórrida de
Malasia. En el año de 1960 el rambután se incorporó al sector agrícola ecuatoriano con la
cualidad de arbusto ornamental, no obstante, en las últimas décadas acrecentó la explotación
nacional por el sabor peculiar de su pulpa; a su vez una cantidad inmensurable de residuos de la
corteza y semillas (Arias y Calvo, 2014).
Tradicionalmente lo definen con el término de “medicina tropical” al considerarlo un alimento
saludable capaz de proporcionar un alto contenido de vitaminas, proteínas, carbohidratos y
minerales, sin embargo, el 60 % de metabolitos con propiedades terapéuticas se encuentran en
las semillas por poseer cantidades altas de ácidos grasos, entre los de mayor relevancia el ácido
oleico y araquidónico alcanzando hasta un 53.76 % en su composición (García, et al.,2016). Por
ende, las convierte en la principal fuente energética para la mayoría de las células del organismo
y promueve el uso para la obtención de sustancias bioactivas que favorezcan el bienestar del
ser humano (Hernandez, Morales, Valenzuela, Morales, y Valenzuela, 2016).
Debido al desarrollo comercial del rambután en el país, las leyes medioambientales
paulatinamente buscan estrategias de eviten la extinción de la especie por la explotación
2
desmesurada por parte del mercado industrial, el cual fomenta un manejo sistémico de los
residuos y los convierte en un recurso sostenible. A su vez, ha permitido que el campo técnico
internacional se involucre en áreas investigativas relacionadas con los metabolitos activos
inmersos en los distintos órganos que conforman el fruto (Rodrigues, De oliviera, y Sousa, 2018).
Cabe destacar que en la literatura científica existen pocos tipos de monografía
farmacognóstica y química sobre las simientes del rambután, en este contexto el propósito de la
presente investigación es realizar un estudio comparativo de los compuestos químicos entre dos
variedades de semillas de la misma especie con la finalidad de aportar bases científicas que
puedan sostener posteriores estudios.
3
CAPÍTULO I
1.1 Planteamiento del problema
El rambután es un fruto con demanda comercial en las últimas décadas en el mercado
nacional e internacional, ancestralmente ha demostrado un amplio espectro de actividad
biológica, convirtiéndose en una herramienta óptima para la obtención de principios activos de
origen natural. A pesar del progreso indudable de estudios sobre la especie, hasta el momento
no muestra evidencia en la literatura científica acerca de los componentes fitoquímicos y ácidos
grasos presente en sus semillas (Rodrigues, et al., 2018).
De manera que el presente estudio procura realizar de forma detallada el análisis
farmacognóstico y químico de las semillas de las dos variedades del fruto Nephelium
lappaceum L.
1.2 Formulación del problema
¿Presentaran los ácidos grasos obtenidos de las semillas de los frutos dulces y amargos de
Nephelium lappaceum L. diferente composición química?
1.3 Justificación
En la naturaleza se encuentra una amplia gama de especies vegetales que destacan por sus
usos tradicionales, debido a la presencia de metabolitos secundarios que se producen dentro de
las mismas. En la actualidad, se ha demostrado que principalmente la mayoría de estas
sustancias portan un mecanismo de defensa para las plantas, estos componentes también
permiten ser utilizados en la agricultura, medicina, industrias farmacéuticas, industria
alimenticia y cosméticas, entre otras.
4
En Ecuador existen poco estudios bibliográficos y/o experimentales que permiten la
caracterización de los compuestos químicos de las semilla del Nephelium lappaceum L., por
tal motivo el presente proyecto de titulación tiene como finalidad realizar un estudio
farmacognóstico y químico de las dos variedades de semillas del rambután con el propósito de
aislar, identificar y cuantificar los ácidos grasos y otro componentes con actividad terapéutico
presentes en las mismas para así conceder la caracterización detallada de las semillas del
fruto y contribuir a futuras investigaciones a nivel farmacológico.
1.4 Delimitaciones
A pesar de que sería de gran interés evaluar de manera detallada las propiedades
farmacológicas de las moléculas bioactivas del fruto Nephelium lappaceum por circunstancias
económicas y de tiempo, el presente estudio se basa únicamente en el análisis farmacognóstico
y químico las dos variedades de semillas del fruto con la finalidad de dar a conocer los
metabolitos secundarios presentes en las simiente, para destacar las posibles diferencias de una
respecto a la otra, enfocándonos principalmente en la identificación y cuantificación de ácidos
grasos presentes en las mismas mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas y así establecer cual posee un mayor grado de calidad.
1.5 Hipótesis
Los ácidos grasos obtenidos de la semilla de los frutos dulces y amargos del Nephelium
lappaceum L. poseen una diferencia significativa de compuestos químicos.
1.6 Objetivos
1.6.1 Objetivo general
Evaluar las características farmacognósticas y químicas de las semillas de los frutos dulces
5
y amargos de Nephelium lappaceum L.
1.6.2 Objetivos específicos
1. Analizar los parámetros físico-químicos de las semillas de los frutos dulces y
amargos de Nephelium lappaceum L.
2. Determinar a partir de las semillas de los frutos dulces y amargos de Nephelium
lappaceum L. ácidos grasos mediante la técnica Soxhlet.
3. Cuantificar los componentes químicos presentes en los extractos de ácidos grasos de
las dos variedades de semillas de la especie Nephelium lappaceum L. por cromatografía de Gases
acoplada a espectrometría de masas (CG-EM).
1.7 Variables
Variables
Independiente Parámetros físicos -químicos, caracterización de compuestos.
Dependiente
Composición química de las variedades (dulce, amarga) de semillas
Nephelium lappaceum L.
6
1.8 Conceptualización e indicadores
Variables Conceptualización Dimensión Indicador
1. Estudio físico-
químico de las
semillas rambután.
2. Extracción de
los ácidos grasos
de la semilla
Nephelium
lappaceum L.
3. Cuantificación
de los
componentes
químicos de la
semilla Nephelium
lappaceum L.
1. Se realiza
mediante varias
técnicas para poder
identificar los
diferentes compuestos
presentes.
2. Determinación
del contenido graso en
las semillas mediante la
separación de la
muestra sólida y un
disolvente.
3. Se realiza la
cuantificación por
medio de una
cromatografía de Gases
acoplada a
espectrometría de
masas.
1. Color, forma,
dimensiones,
Húmeda residual,
cenizas totales,
tamizaje de la
semilla.
2. Realización de
la técnica Soxhlet.
3. Aplicación de
la técnica
Cromatografía de
gases
1. Análisis macro
morfológico, físico-
químico de las
semillas mediante
una muestra.
2. Cantidad
obtenida de ácidos
grasos.
3. Tabla estadística
de los químicos que
componen la semilla
Rambután.
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
El seudónimo rambután procede del vocablo malayo rambut que significa “pelo” en referencia
a los tricomas que rodean la corteza del fruto (Sukasih y Setyadjit, 2015; Arías, Velásquez,
Mateus, Chaparro, y Orduz, 2016), en la década de los 60´s el cultivo de esta especie se extendió
a zonas templadas de Colombia, Costa Rica y Ecuador por la capacidad de adaptación a
diversos suelos (Small, 2012).
Dentro de las propiedades medicinales del fruto en el año 2013 se realizó un estudio en
ratones diabéticos inducidos con alloxan en donde se demostró que la infusión de semillas
maduras de Nephelium lappaceum a concentraciones de 3,12 g/kg durante un periodo de 16
días posee actividad reconstructiva de las células beta-pancreáticas por el alto contenido de
carbohidratos, grasas, proteínas y polifenoles; concluyendo así que la administración oral del
extracto disminuye de manera considerable los niveles hiperglucémicos en sangre (Rahayu,
Zakir, y Andriani, 2013).
Investigadores relacionados con la industria de alimentos a inicios del 2014 optaron por
evaluar la eficacia antioxidante de los extractos de los residuos del rambután (cascara y semilla)
al complementarlo a extractos de aceite de girasol para retardar la rancidez del mismo bajo
condiciones aceleradas, al compararlos con antioxidantes sintéticos (Tocoferol y
Butilhidroxianisol) observaron que no hay diferencias significativas, por tal motivo puede ser
una alternativa de origen natural segura que contribuya a prolongar la calidad, estabilidad y
vida útil de diversos aceites comerciales (Winne, et al., 2014).
8
En el mismo año debido al incremento de la comercialización del fruto se realizó un estudio
in vivo en ratas y conejos sobre la posible toxicidad de los aceites extraídos de las semillas a
partir de ensayos agudos orales, dérmicos e irritantes permitiendo obtener resultados que
sugieren que estos no poseen efectos tóxicos significativos y estableciendo así que son seguros
para su utilización en aplicaciones industriales tanto de alimentos y cosméticos (Eiamwat, et
al., 2014).
El Departamento de alimentos del Thailand Institute of Scientific and Technological
Research en el año 2016 evaluó las propiedades físico-químicas de la harina de la semilla del
rambután desgrasado con la finalidad de manifestar que el tratamiento alcalino con hidróxido
de sodio es un método de gran utilidad para alterar de manera favorable las características
propias de la materia prima, al momento de la extracción de almidón de la misma en conjunto
con el desgrasamiento con dióxido de carbono supercrítico (CO2- SC) para poder mantener la
constitución nutricional y sensorial del producto convirtiéndose así en una alternativa confiable
para el aprovechamiento de residuos del fruto (Wanlapa, Eiamwat, y Kampruengdet, 2016).
Por otro lado, Mahisanunt, Na Jom, y Matsukawa (2017) realizaron estudios comparativos
entre la fracción de grasa sólida y la fracción hidrogenada comercial de las semillas del
rambután mediante técnicas de fraccionamiento isotérmico con disolventes de referencia
(acetona y etanol) e indicaron que ambas poseen un uso viable para productos alimenticios por
la capacidad antioxidante y de preservación sobre las propiedades organolépticas de diversos
productos comestibles motivo que sugiere el desarrollo de estudios con respecto al fruto.
9
2.2 Nephelium lappaceum
2.2.1 Generalidades
La manipulación del rambután para su comercialización se realiza de manera delicada por
experimentar una rápida perdida de humedad y por ser susceptible a la oxidación de los
compuestos antioxidantes principalmente en su cascara lo que lleva a la pérdida de su fruta,
por ello, la industria alimentaria para prolongar su vida útil y disponibilidad del fruto durante
el año se basa en una serie de tratamientos térmicos con la finalidad de inactivar enzimas,
destruir microorganismos y mejorar el color y sabor, no obstante, en ocasiones puede reducir
las cualidades nutritivas del mismo (Nurhuda, et al., 2013; Faizah, et al., 2015).
Las actividades comerciales en el mercado nacional e internacional en la actualidad se han
incrementado debido a la aceptación de esta especie por parte de la población al ser altamente
demandante por su distintiva calidad sensorial y nutricional en relación a otros frutos, dichas
cualidades se las consigue al seguir a cabalidad los parámetros establecidos en la Norma del
Codex para el Rambután 246-2005 para su expendio, entre ellas cabe destacar: Variedad
comercial específica, grados Brix mayor de 18, aspecto apetecible y peso no inferior a 30 g
(Hernández, et al., 2011).
2.2.2 Taxonomía y características morfología del fruto
La taxonómica se describe en la tabla I; lo destacable de la morfología del rambután (figura
1) es que produce bayas de forma ovoide y oblongas, con un pericarpio de color rojo o amarillo
con un espesor entre 0.2-0.4 mm recubierto en su totalidad por espinas blandas que varían en
tonalidad (verde, amarillo y rojo). Consta de un arilo comestible translúcido, dulce y jugoso, la
semilla se caracteriza por su coloración marrón brillante, algo amarga y narcótica, con un alto
10
contenido en grasas, generalmente poseen una longitud de 2.0-3.5 cm y 1.2-2.2 cm de ancho
(Hernández, et al., 2011; Do Sacramento y Aparecida, 2014).
Tabla I Descripción taxonómica del rambután
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Sapindales
Familia Sapindaceae
Género Nephelium
Especie lappaceum
(Vargas, 2003)
Figura 1. Características morfológicas del rambután
(Rodrígues, et al., 2018)
11
2.2.3 Composición de la semilla
Uno de los elementos de mayor relevancia en el rambután es su semilla, por considerarse el
órgano del fruto para su reproducción. El porcentaje proximal de compuestos básicos que se
encuentra en la semilla son: Fibra (2.8 %-11.6 %), carbohidratos (28.7 %-48.1 %), proteína
(7.8 %-14.1 %) y grasa (37.1 % y 38.9 %) (Mahisanunt, et al., 2017; Mariod, Abdalbasit, y
Hussein, 2017).
2.2.4 Aplicación de las semillas a nivel técnico-industrial
En Ecuador se conoce que el rambután es una fruta de sabor agradable y de gran aporte
nutricional para la salud, sin embargo, no es motivo suficiente para una explotación comercial
significativa, cabe destacar que para el mercado industrial de nivel internacional se ha
convertido en una fuente económica sostenible para las diferentes áreas que lo conforman, por
tal motivo industrias farmacéuticas aprovechan la actividad farmacológica demostrada de los
extractos tanto etanólicos como metanólicos de las cascaras y semillas para emplearlo como
precursor en la elaboración de nuevos medicamentos para patologías como hipertensión,
diabetes y cáncer (Rodrigues, et al., 2018).
A su vez se utiliza los desechos del achotillo para la síntesis de nanocristales de óxido de
níquel y óxido de zinc para luego probarlos en bacterias Escherichia coli y Staphylococcus
aureus con la finalidad probar su actividad antibacteriana (Kuma y Rajeshkumar, 2018).
La industria cosmética procura innovar constantemente en el desarrollo de nuevas
formulaciones para reemplazar materias primas sintéticas, de esta manera apertura a una
posible utilización de grasas provenientes de las semillas del achotillo con la finalidad de
transformarlas en material ecológico sostenible, en particular, para productos de higiene
personal como son jabones, shampoo, cremas, entre otros (Lim, 2013; Lourith, et al.2016).
12
Por otro lado la industria alimentaria fue pionera en explotar el fruto por las cualidades de
los componentes empleándolos así como colorante y/o saborizante al ser más seguros que los
sintéticos, por tal motivo se concentran en los avances tecnológicos con la finalidad de potenciar
su recolección y estudios para la caracterización físico-químicas del fruto hacia la cosecha
considerando como criterios primordiales (estado físico, lipofilicidad, estabilidad química y
permeabilidad celular) para garantizar parámetros de seguridad y calidad comercial siendo el
punto partida para el auge en su exportación (Caballero, et al.,2011; Witayaudom y
Klinkesorn, 2017).
2.3 Compuestos grasos en plantas
La vegetación es una parte invaluable y útil del ecosistema, empíricamente en la antigüedad
las culturas chinas, egipcias, romanas y griegas descubrieron las cualidades terapéuticas de un
gran número de plantas por su capacidad de condicionar un estado de salud favorable en los
individuos que lo consumían, principalmente de aquellas ricas en compuestos grasos dando
apertura así a la aromaterapia (Azuola y Vargas, 2007).
Actualmente debido a los avances tecnológicos y científicos se ha podido demostrar que las
plantas posee un conjunto complejo de rutas metabólicas para la síntesis de una amplia variedad
de metabolitos primarios y secundarios responsable de su acción farmacológica, dichos
compuestos son indispensable para la sobrevivencia y de igual manera cotizadas como un
recurso natural propicio para la elaboración de productos rentables en la industria farmacéutica,
alimentaria y cosmética (Muñoz, 2002; Ortuño, Díaz, y Del Río, 2015).
2.3.1 Lípidos
Es un conjunto heterogéneo de moléculas hidrófobas de baja masa molecular que se originan
a partir de condensaciones de tioésteres o unidades de isopreno, cuya característica en común
13
es ser solubles en disolventes orgánicos. No obstante, la propiedad de agruparse e interaccionar
con otras moléculas como las lipoproteinas o glucolípidos generan biomoléculas anfipáticas,
que le permite en medio acuoso unirse al agua por su parte polar, dando lugar a diferentes
formas de agregación en forma de una bicapa lipídica (Cornago, 2013; Hoyos y Rosales, 2014;
Li, et al., 2018).
2.3.1.1 Clasificación
Los lípidos se catalogan de acuerdo con sus propiedades físico-químicas y/o por su
estructura molecular, en:
2.3.1.1.1 Lípidos saponificables o complejos
Ácidos grasos
Los ácidos grasos se definen de manera química como cadenas hidrocarbonadas de longitud
variable, con un grupo carboxilo en su extremo, pueden ser ácidos grasos saturados debido a
que poseen un mayor número de átomos de hidrogeno en la cadena de carbono, presente
generalmente en animales, tienden a solidificarse a temperatura ambiente considerándose así
como grasas. Mientras aquellos que han perdido algunos átomos de hidrogeno son conocidos
como ácidos grasos insaturados, fácilmente de encontrar en especies vegetales en estado
líquido y por lo tanto se denominan aceites (Morcillo, Cortés, y García, 2013).
Figura 2. Estructura de ácido graso (Liu, Ezernieks, Rochfort, & Simone , 2018)
14
Acilgliceroles
Se definen también como acilglicéridos, por tratarse de ácidos grasos unidos a una molécula
de glicerol, tienen la capacidad de esterificar uno, dos o tres grupos hidroxilos (OH) del glicerol
dando lugar a los mono, di y triacilglicéridos (Figura 2A, 2B, 2C), en donde los primeros
poseen una cierta polaridad al encontrarse OH libres sin esterificar, mientras que los últimos
son compuestos no polares, que constituyen una fuente importante de energía (Hoyos y
Rosales, 2014; López, 2017).
Figura 3. Estructuras de los Acilgliceroles (Liu, et al., 2018).
El punto de fusión de este tipo de compuestos se da en función de la cantidad de ácidos
grasos que los componen, es decir, que cuanto mayor sea la longitud de la cadena más elevado
es su punto de fusión (Hou, Lin, Dulay, y Ray, 2017). Generalmente pasan por procesos de
saponificación para la obtención de jabones al hidrolizarse en medio alcalino para separarlos
en glicerol y sales de ácidos grasos. Cuando están puros son incoloros, inodoros e insípidos, en
cambio si presentan coloración se debe a la presencia de otras sustancias orgánicas (Damaceno,
Jesus, y Ceriani, 2018).
Fosfolípidos
Formados por ácidos grasos un alcohol y ácido fosfórico (H3PO4) (Figura 3). Dentro de
este grupo están los glicerofosfolípidos que llevan como alcohol al glicerogol y los
15
esfingofosfolípidos en los que el grupo alcohol es la esfingosina que es un aminoalcohol
(Cornago, 2013).
Figura 4.Estructura general de los fosfolípidos (Lin, et al., 2015).
Ceras
Este tipo de compuesto grasos se puede obtener de fuente vegetal y animal; se forman entre
la unión de ácidos grasos con alcoholes monohidroxilados de alto peso molecular, cuando en
su cadena se ha provocado una hidrogenación que dan como resultado la presencia de ceras
sólido, mientras que cuando hay una insaturación en las cadenas dan origen a los conocidos
aceites o ceras liquidas (Zeisler-Diehl, Müller, y Schreiber, 2018).
Figura 5. Formación estructural de las ceras (Blake y Marangoni, 2015).
En general constituyen un 20 a 60 % en las cutículas de las plantas, además se han
encontrado dentro de su composición una gran cantidad de compuestos fenólicos,
16
triterpenoides, polipéptidos y polisacáridos, lo que ha provocado su explotación en el área
industrial y en la actualidad su explotación comercial se logra mediante la extracción con agua
caliente, hexano o por expoliación de las partes aéreas de las plantas (Marcano y Hasegawa,
2002; Tafolla, Gonzáles, Tiznado, Zacarías, y Báez, 2013).
2.3.1.1.2 Lípidos no saponificables o simples
Isoprenoides
Fitoquímicamente son definidos como alcanos naturales o terpenoides, por presentar una
doble unión entre carbonos, para su síntesis en las plantas derivan del isopentenil pirofosfato o
isómero dimetilalil pirofosfato pudiendo seguir dos tipos de ruta distintas, la primera es la ruta
del ácido mevalónico que se realiza en el citoplasma dando origen a una parte de la clasificación
de los isoprenoides como son los sesquiterpenos, triterpenos y politerpenos; por otro lado los
monoterpenos, diterpenos, tetraterpenos y algunas quinonas preniladas siguen la ruta del 5-
fosfono-1-Desoxi-D-xilulosa (DXP) que se lleva a cabo en los plástidos. La importancia de las
propiedades biológicas de este tipo se compuesto está ligada a la complejidad de sus moléculas,
la cual les confiere una extensa aplicabilidad en innumerables actividades industriales ya sea
como fijador de perfumes, disolvente o materia prima para la producción de grasas, ceras y
tintas e inclusive en ocasiones como fármacos para la elaboración de nuevos productos
terapéuticos (Sepúlveda, Porta, y Rocha, 2003; Felipe y Bicas, 2017).
Figura 6. Estructura del isopreno (Mu, et al., 2018).
17
Fitoesteroles
Se considera como fitoesteroles a los componentes sintetizados en la estructura interna de
la membrana celular de los vegetales denominadas como esteroles; generalmente se encuentran
como compuestos conjugados en donde el grupo 3b-OH del esterol se esterifica principalmente
a ácidos grasos libres y/o ácidos fenólicos aunque en ocasiones puede ocurrir una reacción de
glicosilación (Muñoz, Alvarado, y Encina, 2011).
La biosíntesis ocurre exclusivamente en el citoplasma, a partir de moléculas de acetil-CoA
y por la actividad enzimática de la enzima acetil- CoAcarboxilasa, convirtiendo la Acetil-CoA
en 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA, para reducirse a melovato que mediante procesos sucesivos
de fosforilaciones y descarboxilación es transformado en isoprenoide, el que finalmente da
origen a los esteroles que de acuerdo a su doble enlace en la posición 5 se los considera como
fitoesteroles (sitosterol, campesterol, estigmasterol) y si no posee el doble enlace serán
fitoestanoles (sitostanol, campestanol y estigmastanol); Estos compuestos mayoritariamente
insaturados son esterificados mediante la adición de ácidos grasos para su saturación lo cual
mejora su biodisponibilidad. Particularmente se encuentra en legumbres, cereales, semillas
oleaginosas y aceites vegetales, por ende, a nivel industrial son empleados para enriquecer
ciertos alimentos que por su naturaleza poseen una mínima cantidad de estos componentes
(Rodríguez, et al. 2014; Silva, et al., 2016; Meco, Pascual, y Solá, 2016; Urquiaga, et al, 2017).
Figura 7. Estructura general de los fitoesteroles (Meco, Pascual, y Solá, 2016).
18
2.3.2 Métodos de extracción de productos naturales
La extracción es una operación que permite la separación de compuestos inmersos en el
material vegetal por medio de la utilización de un disolvente puro o en mezclas definidas y de
un proceso de extracción adecuado, donde siempre se obtienen por lo menos dos componentes
que puede ser la solución extraída en su disolvente (extracto) y el residuo o refinado (Van
Baren, 2015).
2.3.2.1 Extracción mecánica
Generalmente para casi todos los aceites fijos se sigue el método conocido como expresión,
que se realiza en equipos que en su interior contiene prensas o tornillos cuya función principal
es ejercer una presión mecánica sobre el material vegetal fresco para extracción de compuestos,
para aquellas sustancias que son excretadas a través de los poros de la especie vegetal se puede
hacer uso del método de exudación que consiste en realizar una incisión en la planta viva o
bien introduciendo un capilar en la corteza para la obtención de los componentes de interés,
por ello, ambos son recomendables para mantener el estado original de los compuestos grasos
y sus constituyentes (Van Baren, 2015).
2.3.2.2 Extracción con fluidos supercríticos
Para llevar a cabo este método se emplean disolventes selectivos denominados como fluidos
supercríticos por su capacidad de extraer ciertos compuestos químicos en matrices porosas bajo
la combinación de temperatura y presión por encima de su punto crítico, este método es
trascendental principalmente para los residuos sólidos de vegetales para la obtención de
sustancias con propiedades antioxidantes, en este tipo de ensayo el fluido más aplicado es el
anhídrido carbónico por ser un gas inocuo lo que contribuye a la obtención de un extracto final
19
limpio y con características especiales en relación a sus componentes de interés (Van Baren,
2015; Villada, et al., 2017).
2.3.2.3 Extracción con disolventes
3.3.2.3.1 Extracción discontinua
Maceración
El vegetal seco y molido o fresco troceado se pone en contacto con un solvente selectivo en
un recipiente de cierre perfecto a temperatura ambiente y con agitaciones frecuentes a lo largo
de tres días. Este tipo de método es útil cuando los principios activos son fácilmente solubles
en frío o cuando la acción de la temperatura los altera, es más recomendable iniciar la
extracción con hexano o con éter de petróleo para separar lípidos para finalmente realizar la
extracción con etanol o metanol al 95 % (Ocaña, 2015).
Digestión
Es una forma de maceración con ligero calentamiento entre 35º a 40º C, por ello, la
temperatura debe ser controlada con rigidez con la finalidad de que no alterar los componentes
volátiles del material vegetal durante el proceso de extracción, se realiza durante un periodo
que puede oscilar entre media hora y veinticuatro horas, es de gran utilidad para aquellas partes
vegetales más duras o que contienen sustancias poco solubles (Cortéz, 2016).
Infusión y/o decocción
El disolvente se hierve y posteriormente se introduce la droga a extraer, dejándose enfriar
el conjunto hasta temperatura ambiente. El extracto recibe el nombre de infusión (Molina,
2012).
20
Microondas
Es un método alterno para la extracción de metabolitos secundarios de plantas,
principalmente compuestos grasos, en donde el material vegetal es expuesto a irradiación de
microondas para generar en el interior de sus tejidos el movimiento de sus moléculas mediante
la migración de iones y rotación de dipolos lo cual contribuye a una mejor extracción de los
compuestos inmersos en el mismo; cabe recalcar que cuando la muestra es fresca no se necesita
adicionar ningún tipo de solvente, mientras que si se trata de una muestra seca deberá ser
rehidratada con una cantidad considerable de agua y drenar el exceso antes de realizar el
proceso por lo cual se considera como un método independiente, sin embargo, puede acoplarse
al sistema tradicional de hidro-destilación (Azuola y Vargas, 2007; Peredo, Palou, y López,
2009).
Ultrasonido
El ultrasonido se lo define como una onda sonora con frecuencias que van desde 20 hasta
100 MHz, no obstante, también se lo considera como un método extractivo que se basa en la
ruptura de la pared celular del material vegetal que contiene los metabolitos de interés mediante
la rehidratación de sus tejidos con un disolvente específico y la cavitación ultrasónica, lo que
favorece la transferencia del soluto a través de difusión y procesos osmóticos, provocando que
pase de la fase sólida al disolvente en un período reducido (Rodríguez, Robaina, Jáuregui,
Blanco, & Rodríguez, 2014). Actualmente, el área industrial recurre a este tipo de método para
la obtención de compuestos bioactivos de calidad a partir de fuentes vegetales, debido a que en
términos de productividad posee una alta reproducibilidad y facilidad de manejo, a su vez que
emplea menos tiempo, dinero y sobre todo reduce los riesgos para el medio ambiental (Pérez,
Hernández, y Barragan, 2017; Valadez, López, García, y Ruíz, 2017).
21
3.3.2.3.2 Semicontinuos
Extracción por aparato Soxhlet
Es el proceso de evaporar una sustancia, condensar los vapores y cogerlos al estado líquido,
el Soxhlet es el proceso más empleado de extracción continua pues tiene la ventaja de requerir
una cantidad pequeña del solvente. El material vegetal se coloca dentro de un dedal de papel
filtro grueso, que se carga en la cámara principal del extractor Soxhlet donde se hace pasar el
solvente que puede ser hexano, metanol o acetona, este ciclo puede repetirse muchas veces,
durante horas o días a una temperatura de 20º- 30º C, al término de éste periodo, observar si
hay un precipitado, en caso de tenerlo, filtrar inmediatamente, evaporar el filtrado y con el
mismo solvente recuperado seguir lavando el precipitado, evaporando nuevamente los filtrados
para recuperar y guardar el solvente mediante un rotaevaporador (Rivas, Oranday, y Verde,
2016).
Percolación
Es un procedimiento que se realiza a temperatura ambiente, la droga es colocada en una
columna y está en contacto permanente con el disolvente que gotea por la parte superior de la
de la misma, atraviesa toda la zona donde se encuentra la droga con los metabolitos de interés,
los va extrayendo y por la parte inferior, se recogen los líquidos extractivos que contienen los
principios activos. La percolación puede llegar a conseguir extracciones prácticamente
completas de las especies vegetales pero con un elevado consumo de disolvente (Molina,
2012).
22
2.3.2.4 Método adicional de extracción
Enfleurage o enflorado
El proceso emplea una mezcla de grasa en frio altamente purificada formada por una parte
de sebo, dos partes de manteca y 0,6 % de benzoína como conservador para ponerla en contacto
por tres a cinco días con flores delicadas en la cual sus aceites esenciales no pueden ser
extraídos por el método de destilación. A continuación el material vegetal es removido y
reemplazado por material fresco de manera continua hasta llegar a la saturación de la grasa y
una vez impregnado del principio activo en la grasa (le pomade), se lava dos veces con alcohol
libre de congéneres, se filtra y se destila a vacío hasta recuperar como mínimo un 80 % del
volumen de alcohol utilizado (Betto, et al.,2016).
2.3.2.5 Método de identificación y cuantificación de ácidos grasos
2.3.2.5.1 Cromatografía de Gases acoplado a espectrofotometría de masas (CG/EM)
La cromatografía es una técnica de separación con gran capacidad para la identificación y
cuantificación de analitos específicos en una matriz compleja, por ende, la GC/EM permite la
separación de compuestos volátiles dependiendo de sus puntos de ebullición, al llegar al
detector las moléculas del analito son bombardeadas por electrones, rompiendo enlaces y
formando fragmentos estables. En la actualidad, al ofrecer una alta sensibilidad de análisis ha
provocado que se considere como el método más idóneo para la identificación y cuantificación
de ácidos grasos una vez convertidos en ésteres metílicos y separarlos por columnas capilares
(López, Arrubla, y Guerrero, 2009).
23
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Método de investigación
El presente trabajo de titulación se realizó de acuerdo con los objetivos propuestos, mediante
la aplicación de una metodología exploratoria-experimental; efectuado en los diferentes
laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, a través de
la extrapolación de datos.
3.2. Población y muestra
La población estuvo comprendida por 2000 frutos entre la variedad dulce y amarga de
Nephelium lappaceum L. los mismos que fueron identificados y recolectados, en el mes de
febrero 2018, en la hacienda del Sr. Steven Roca en la Cuidad de Quevedo – Los Ríos –
Ecuador (latitud 0O16´O 7.2´´S y longitud 79 O11´41.4´´E) de los cuales a 278 se seleccionaron
para la obtención del material vegetal objeto de estudio (semillas) a las que posteriormente se
evaluaron las características farmacognósticas y químicas más relevantes.
3.3. Criterio de inclusión
Las muestras de semillas de Nephelium lappaceum L. clasificadas de acuerdo con su
respectiva variedad.
3.4. Criterio de exclusión
Las Muestras de semillas de Nephelium lappaceum L que no presentaron los parámetros de
maduración óptimas.
24
3.5. Materiales
3.5.1 Materia prima
• Semillas amargas del fruto Nephelium lappaceum
• Semillas dulces del fruto Nephelium lappaceum
3.5.2 Materiales de laboratorio
• Balanza gramera
• Balón de destilación de 1000 mL
• Bureta de 50 mL
• Cápsulas de porcelana
• Condensador de reflujo en espiral
• Crisol de porcelana
• Desecador
• Embudo Buchner
• Embudos de 60 mm
• Frascos de vidrio ámbar 1000 cc
• Frascos de vidrio ámbar 500 cc
• Espátula
• Fundas ziploc pequeñas
• Gradilla
• Kitasato de 1000 mL
• Matraz erlenmeyer
• Mortero
• Papel absorbente
• Papel aluminio
• Papel filtro libre de cenizas
• Picnómetro
• Pinza para mufla
• Pipetas de 1 mL
• Pipetas de 5 mL
• Probeta de 100 mL
• Tamiz n° 10
• Tubos de ensayo
• Vaso de precipitación (400 mL)
• Vaso de precipitación (50 mL)
• Vernier
• Vidrio reloj
3.5.3 Equipos
• Balanza analítica • Bomba al vacío
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• Estufa • Hornilla
3.5.4 Reactivos
• Acetato de etilo
• Ácido Clorhídrico
• Ácido sulfúrico
• Agua destilada
• Alcohol neutralizado 0,5 N
• Baljet
• Borntrager
• Cloroformo
• Cloruro de sodio
• Cloruro férrico
• Dragendorff
• Etanol
• Éter di etílico
• Fehling
• fenolftaleína
• Hexano
• Hidroxamato férrico
• Hidróxido de potasio
• Hidróxido de sodio
• Liebermann-Burchard
• Mayer
• Shinoda
• Sudan III o IV
• Sulfato de sodio anhidro
• Wagner
3.6. Metodología
3.6.1 Estudio farmacognóstico
3.6.1.1 Operaciones preliminares del material vegetal
Recepción y limpieza.- Los sacos que contienen los frutos fueron colocados en un lugar
fresco, se separan los racimos de los frutos y a continuación se lavaron con agua purificada
para eliminar suciedad y otros residuos.
Clasificación y despulpamiento.- Seleccionar los frutos que se encuentran en buen estado y
eliminar aquellos que presentan signos de pudrición u hongos, se considera oportuno retirar la
26
cáscara cuidadosamente y de ahí se procede a la remoción de la pulpa de su semilla de manera
manual.
Secado.- Colocar las semillas en una plancha de papel aluminio a estufa con temperatura de
60°C por un periodo de 12 horas por 3 días. Transcurrido el tiempo necesario de secado se deja
enfriar y se transfiere la materia prima en fundas ziploc.
Percepción de la materia prima.- Se refiere a la evaluación de las características más
relevante de las semillas como son: Características físicas (forma, dimensión, dureza, peso),
color, olor y peculiaridades.
Molienda.- Triturar las semillas en mortero hasta llegar a polvo fino, pasarlo por un tamiz
de n° 10. Transferir el polvo en fundas ziploc.
Pesado.- Con la ayuda de una balanza gramera pesar las fundas ziploc que contienen el
polvo y anotar los valores.
Almacenamiento.- En lugar fresco y seco.
Todos los procedimientos referidos a continuación están basados en el Manual de prácticas
de laboratorio farmacognosia y productos naturales descrito por Miranda y Cuellar (2000)
3.6.1.2 Parámetros físico-químicos aplicados a las semillas
3.6.1.2.1 Ensayo de humedad residual
Pesar 2 g de muestra de semillas, previamente pulverizada en cápsula de porcelana
previamente tarada, trasladar a la estufa y desecar 105 °C por 3 horas hasta masa constante,
dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar. Realizar el ensayo por triplicado y calcular la
humedad residual con la expresión:
27
Hr (%)= M1 (masa de muestra desecada)
M(masa de muestra ensayo)×100 (factor matemático)
3.6.1.2.2 Ensayo de cenizas totales
Pesar 2 g de muestra desecada, transferirla a un crisol previamente tarado e incinerar en una
mufla con temperatura ente 700-750 °C durante 2 horas. Una vez transcurrido el tiempo enfriar
el crisol en un desecador y pesar, repetir el proceso por triplicado hasta masa constante en
intervalos de 30 minutos. Calcular las cenizas totales con la siguiente fórmula:
Ct (%)=M2 (g de cenizas)
M1(g de muestra de ensayo)×100 (factor)
3.6.1.2.3 Ensayo de cenizas insolubles en ácido
A las cenizas obtenidas se le adiciona 20 gotas de HCl al 10 %, se tapa el crisol con vidrio
reloj y se calienta a baño María durante 10 minutos, transcurrido el tiempo lavar el vidrio reloj
con 5 mL de agua destilada caliente, filtrar a través de un papel filtro libre de cenizas. El filtrado
con el residuo se deseca a 105 °C, se transfiere al crisol inicial para incineración en la mufla a
750 °C por 3 horas, dejar enfriar en desecador al menos 20 minutos y pesar; para calcular el
porcentaje de cenizas insolubles en ácido se utiliza la siguiente expresión:
CIA=C1 (Cenizas insolubles en HCl)
M(Masa de la muestra de ensayo)×100 (factor)
3.6.1.2.4 Ensayo de sustancias solubles
Método de extracción en caliente con etanol, hexano y acetato de etilo.-
• Pesar en un matraz erlenmeyer aproximadamente 4 g de muestra. Agregar 100 mL del
disolvente especificado en el procedimiento, pesar, agitar y dejar reposar por 1 hora.
28
• Acople un condensador de reflujo al matraz y hervir suavemente por 1 hora. Enfriar y
pesar, a continuación ajustar al peso inicial con el disolvente; agitar y filtrar por succión a
través de un filtro seco.
• Transferir 25 mL de filtrado a una cápsula de porcelana, evaporar hasta sequedad en un
baño María. Secar en estufa a 105 °C durante 2 horas, enfriar en un desecador durante 30
minutos, luego pesar sin demora. El contenido de materia extraíble se calcula mediante la
expresión:
Ss=R (Residuo de la muestra)
M( masas de muestra ensayada)×100 (factor matemático)
3.6.2 Estudio químico cualitativo
3.6.2.1 Screening fitoquímico
Someter la muestra vegetal a un sistema de maceración sucesiva con éter etílico, etanol y
agua, respectivamente; para conseguir que cada metabolito sea extraído de manera apropiada
según la selectividad por el solvente, medir el volumen obtenido y calcular su concentración.
En cada caso para realizar los ensayos se procede de la siguiente manera:
Ensayo de Sudan.- En un tubo de ensayo colocar una alícuota del extracto del material
vegetal, agregar 1 mL de la solución de Sudán IV y llevar a baño de agua hirviendo hasta
evaporación del solvente, la presencia de una película o gotas de color rojo en la superficie del
tubo es indicativo de un ensayo positivo para compuestos grasos.
Ensayos de Dragendorff, Mayer, Wagner.- Son pruebas cualitativas que permiten identificar
la presencia de alcaloides, para ello, si el extracto es acuoso se deberá agregar para cada ensayo
una alícuota del extracto previamente acidificada con 1 a 2 gotas de HCl concentrado y llevar
29
a calentar, mientras, que si el extracto se realizó con solventes orgánicos se procederá a
evaporar y el residuo redisolverse con 1 mL de HCl al 1 % en agua, por último añadir 3 gotas
del reactivo específico; la presencia de opalescencia se considera (+), turbidez definida (++),
precipitado (+++).
Ensayo de Baljet.- Es ideal para la identificación de coumarinas. Cuando el extracto no es
alcohólico, debe evaporarse el solvente en baño María y redisolverse con 1 mL alcohol; y al
final se agrega 20 gotas del reactivo Baljet, la aparición de coloración o precipitado rojo se
considera positiva.
Ensayo de Borntrager.- Tomar una alícuota del extracto redisuelta en cloroformo adicionar
1 mL de solución de hidróxido de sodio al 5 %, agitar mezclando las fases y reposar. Si la fase
acuosa alcalina se torna rosada o roja el ensayo se considera positivo para quinonas.
Ensayo de Liebermann- Burchard.- Permite reconocer en un extracto la presencia de
triterpenos y/o esteroides por ambos tipos de productos poseer un núcleo del androstano,
generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. A una alícuota del extracto redisuelta
en cloroformo adicionar 1 mL de reactivo, y a continuación observar el cambio rápido de
coloración: Rosado azul (muy rápido); Verde intenso (visible aunque rápido); Verde oscuro
(final de la reacción).
Ensayo de resinas.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de la solución alcohólica y 10 mL
de agua destilada, la aparición de un precipitado sugiere la presencia de resinas.
Ensayo de fehling.- Confirma la presencia de azucares reductores con la aparición de un
precipitado rojo, por ello, al residuo de una alícuota del extracto alcohólico previamente
disuelto con 2 mL de agua destilada, adicionar 2 mL del reactivo de fehling y calentar en baño
30
de agua caliente aproximadamente por 10 minutos, sin embargo, si es un extracto acuoso
agregar directamente el reactivo.
Ensayo de espuma.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de extracto y diluir con 5 veces
su volumen en agua, mezclar fuertemente durante 10 minutos. Al presentar espuma en la
superficie del líquido de más de 2mm de altura y persistencia por más de 2 minutos
inmediatamente el ensayo se considera positivo para saponinas.
Ensayo de cloruro férrico.-Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/ o
taninos en un extracto vegetal, por ello, si el extracto es alcohólico a una alícuota de este se le
adicionan 3 gotas de cloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica. Si el extracto es
acuoso a una alícuota del extracto se añade acetato de sodio para neutralizar y 3 gotas de una
tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede sugerir la
presencia de: Compuestos fenólicos (Rojo-vino); taninos de tipo pirocatecólicos (verde
intenso), taninos del tipo piro pirogalotánicos (azul).
Ensayo Shinoda.- Exclusivo para la identificación de flavonoides en un extracto de un
vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra el alcohol, se diluye con 1 mL de ácido
clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción
se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las bases y se deja reposar
hasta que se separen.
Si la alícuota del extracto se encuentra en agua se procede de igual forma, a partir de la
adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo, con el alcohol
amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos todos los casos.
Ensayo de mucílagos.- Permite identificar estructuras de tipo polisacárido, mediante la
formación de coloide hidrófilo al enfriar entre 0-5 °C una alícuota del extracto acuoso
31
Ensayo de principios amargos y astringentes.- Saborear 1 gota del extracto acuoso y
diferenciar el sabor de cada uno de estos principios al paladar.
3.6.2.1.1 Método de extracción de grasas
Método de extracción por soxhlet.- Pesar 20 g de muestra en un dedal y encima una torunda
de algodón, llevar al extractor soxhlet y extraer con hexano a 69 °C, realizar la extracción en
forma continua unas 15 veces. Separar del soluto de interés del solvente en el rotaevaporador
a temperatura de 70 °C, por diferencia de peso calcular el rendimiento.
En independencia del rendimiento de la grasa que se obtenga realizar los siguientes ensayos
de caracterización:
Densidad relativa.- Primeramente pésese el picnómetro vacío, luego llénese con la porción
de ensayo, manténgalo a la temperatura de 25 °C durante 15 minutos y ajústese el líquido al
nivel empleado. Expresión de los resultados:
D25=P1-P
P2-P
Donde
• P1= Peso del picnómetro con la muestra (g)
• P2= Peso del picnómetro con el agua (g)
• P= Peso del picnómetro vacío (g)
Índice de refracción.- Ajustar el refractómetro empleando agua destilada, posteriormente,
colocar una gota de la muestra de ensayo sobre el prisma de medición, cerrar el termoprisma y
enfocar la luz por el medio del espejo, de modo tal que la misma incida sobre la apertura de
entrada del prisma de medición. Realizar tres lecturas que no difieran en más de 0.002 y
32
calcular el promedio de estas, si las determinaciones no se efectúan a la temperatura de
referencia se emplea la formula siguiente:
Nd25= Nd
t+0.00044 (t-25)
Donde:
Nd25= Índice de refracción a 25 °C
Ndt= Valor leído en la escala del aparato a la temperatura.
t= Valor de temperatura a que se realiza la medición (°C)
0.00044 = Factor de corrección por grado celcios
Índice de saponificación.- Transferir 1,5 g de muestra a un erlenmeyer de 250 mL
previamente tarado, agregar 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y tapar con papel
aluminio; calentar en un baño de vapor durante 30 minutos, agitando frecuentemente, agregar
10 gotas de fenolftaleína y titular el hidróxido de potasio en exceso con ácido clorhídrico 0.5
N. Realizar una determinación con un blanco.
𝐼𝑠 =(V[mL de HCL consumidos del blanco] − V´[mL de HCL consumidos de la muestra]) ∗ 28,05[factor]
g[Peso de la muestra]
Índice de esterificación.- Pesar 1,5 g de muestra en un erlenmeyer de 250 mL previamente
tarado, añadir 20 mL de alcohol neutralizado y 10 gotas de fenolftaleína, a continuación titular
con hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N hasta neutralizar totalmente los ácidos grasos, libres.
Agregar 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y proceder a calentar en un baño
María por 15 minutos, agitando por rotación frecuentemente, titular el hidróxido de potasio en
exceso con ácido clorhídrico 0.5 N. Realizar una determinación con un blanco
𝐼𝐸 =(V[mL de HCL consumidos del blanco] − V´[mL de HCL consumidos de la muestra]) ∗ 28,05[factor]
g[Peso de la muestra]
33
Saponificación.-Al residuo sólido (grasa) añadirle 3 veces el peso del volumen de hidróxido
de sodio alcohólico 1 N, se refluja durante 2 horas. Enfriar, agregar igual volumen de agua
destilada y extraer tres veces con 15 mL de éter di etílico. Las fracciones etéreas reunidas se
lavan con agua destilada hasta pH 7. El extracto etéreo se seca con sulfato de sodio anhidro y
se rótula como fracción insaponificable.
El extracto acuoso se ajusta hasta pH 3 con HCl concentrado y se extrae 3 veces con 15 mL
de éter di etílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavan con agua destilada hasta pH 7, se
seca con sulfato de sodio anhidro y se rótula como fracción de compuestos saponificable.
3.6.2.2 Análisis de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a espectrometría
de Masas (CG/EM)
Una vez liberado los ácidos grasos mediante el procedimiento de saponificación, se procede
a la formación de esteres metílicos añadiendo a la muestra una solución de hidróxido de potasio
en metanol al 10 %, el cual se deja en contacto con la grasa disuelta en hexano durante 1 hora
y posteriormente se toma una alícuota de extracto de hexano para su análisis. Una vez realizado
el tratamiento a la muestra se realiza la identificación y cuantificación por triplicado de la
fracción saponificable e insaponificable de ácidos grasos en el cromatógrafo de gases acoplado
al espectrofotómetro de masas Shidmasu (López, Arrubla, & Guerrero, 2009). Las condiciones
del análisis cromatográficas son:
Tabla II Condiciones cromatográficas
Equipo:
Cromatógrafo de gases Agilent Technologies
acoplado a un espectrómetro de masas (sistema
7890A GC y 5975C inerte XL MSD con detector
de triple eje).
Columna: Columna capilar HP-5, 5 % Phenyl Methyl Siloxan
325° C: 30 m x 320 µm x 0.25 µm.
Espectrómetro de masas Operado a 70eV en modo full scan desde 40-1000 μ
ma.
Temperatura del inyector 280° C
34
Temperatura de horno
Temperatura inicial del horno 70° C durante 2,0
minutos, aumentando a 300° C a 5° C/min, por 6
minutos.
Volumen de inyección 2 uL
Flujo en la columna 1 mL/min
Velocidad lineal del gas 37,2 cm/s
Gas portador Helio a 1 mL/min.
Temperatura de fuente de iones 230 °C
Temperatura del cuadropolo 150 °C
Tiempo de corrida 52 min.
Los compuestos se identificaron mediante la comparación de sus espectros de masas con
los de la biblioteca del equipo Wiley 9th con NIST 2011 MS Library.
(Farías y Olaya, 2018)
35
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este capítulo se expondrán mediante tablas, los resultados de los diferentes análisis
experimentales que se realizaron a las semillas de las dos variedades del fruto Nephelium
lappaceum.
4.1 Estudio farmacognóstico
Las dos variedades del fruto fueron recolectadas de forma manual y posteriormente se
realizó la limpieza, clasificación y despulpamiento a la materia prima. Una vez obtenida la
muestra del material vegetal objeto de estudio se procedió a realizar el ensayo de percepción y
a su vez el secado y almacenamiento.
El análisis macromorfológico de las semillas de los frutos de las dos variedades evidenció
que ambas no poseen diferencias significativas con lo que respecta a su morfología, sin
embargo, cabe recalcar que las semillas de la variedad dulce son más ancha y menos largas que
la variedad amarga (Tabla III).
Tabla III Características macromorfológicas de las dos variedades de semillas del fruto
Nephelium lappaceum.
Características
Semillas
Dulce Amarga
Olor Sui generis Sui generis
Color Marrón claro Marrón claro
Forma Ovaladas Ovaladas
36
Dimensiones
Valor promedio
Largo (cm) S
22.496 3.165 22.678 6.294
Valor promedio
ancho (cm) S
12.884 1.157 12.290 5.750
Peculiaridades Aceitosa al tacto Aceitosa al tacto
(Farías y Olaya, 2018)
El análisis de los parámetros físico-químicos (Tabla IV) manifestó que los valores
obtenidos a partir de los ensayos de humedad residual, cenizas totales y cenizas insolubles en
HCl, en ambas semillas se encuentran dentro de los rangos permitidos para la droga vegetal,
mientras que, el ensayo de sustancias solubles demostró una diferencia marcada en el
porcentaje extracción con hexano encontrándose 14.680 % en semillas dulces y 3.960 % en las
semillas amargas.
Tabla IV Parámetros físico-químicos de las semillas del fruto Nephelium lappaceum
Parámetros Porcentaje (%) S
Semillas dulces Semillas Amargas
Humedad residual 3.997 0.005 2.640 0.01
Cenizas totales 1.469 0,002 1.498 0.001
Cenizas insolubles en ácido
clorhídrico 1.240 0.001 1.34 0.001
Sustancias
solubles en:
Hexano 14.680 0.001 3.960 0.001
Etanol 3.414 0.001 3.528 0.001
Acetato de
etilo 8.660 0.001 7.513 0.001
(Farías y Olaya, 2018)
37
4.2 Estudio químico cualitativo
El screening fitoquímico que se realizó en tres tipos de extractos diferentes permitió
corroborar la existencia de diferentes metabolitos con actividad terapéutica inmersos en las
semillas, la similitud entre ellas es notoria, sin embargo, se evidenció una diferencia marcada
en el ensayo de Cl3FE y Fehling en los extractos alcohólicos y acuosos de ambas semillas con
respecto a las reacciones cromáticas (Tabla V).
Tabla V Resultados obtenidos del screening fitoquímico realizado a los extractos de las
semillas dulce del fruto Nephelium lappaceum
EXTRACTO ETÉREO
Tipo de ensayo Metabolito ensayado Semillas dulces Semillas Amargas
Sudan Compuestos grasos Positivo Positivo
Dragendorff Alcaloides +++ +++
Wagner Alcaloides +++ +++
Baljet Lactonas y coumarinas Positivo (++) ++
Liebermann-
Burchard Triterpenos y/o esteroides
Rosado -muy
rápido Rosado -muy rápido
EXTRACTO ALCOHÓLICO
Dragendorff Alcaloides +++ +++
Wagner Alcaloides +++ +++
Baljet Lactonas y coumarinas NA NA
Liebermann-
Burchard Triterpenos y/o esteroides
Rosado -muy
rápido Rosado -muy rápido
Resinas Resinas Positivo Positivo
Fehling Azúcares reductores +++ ++
Espuma Saponinas +++ +++
Cl3Fe Fenoles y taninos Verde intenso Verde intenso
Borntrager Quinonas Negativo Negativo
Shinoda Flavonoides Positivo Positivo
EXTRACTO ACUOSO
Dragendorff Alcaloides +++ +++
Wagner Alcaloides +++ +++
Fehling Azúcares reductores +++ ++
Espuma Saponinas +++ +++
Cl3Fe Fenoles y taninos Rojo-vino Rojo-vino
Shinoda Flavonoides Positivo Positivo
Mucilagos Estructuras polisacáridos Positivo Positivo
38
Principios
amargos Compuestos astringentes ++ +++
(Farías y Olaya, 2018)
4.3 Extracción y análisis de compuestos grasos
La extracción de compuestos grasos se realizó por el método Soxhlet considerando la
recuperación de hexano (Tabla VI), el proceso permitió confirmar un alto rendimiento de grasa
presentes en las semillas de los frutos del Nephelium lappaceum, de este ensayo se puede decir
que las semillas amargas poseen un mayor porcentaje de compuestos grasos que las semillas
dulces, y que todos los parámetros evaluados como densidad, índice de refracción, índice de
saponificación e índice de esterificación presentan valores más elevado para estas semillas.
Tabla VI Parámetros fisicoquímicos del extracto graso de las dos variedades del fruto
Nephelium lappaceum
Parámetros Porcentaje (%) S
Semillas dulces Semillas Amargas
Rendimiento 57.350 0.080 68.888 0.030
Densidad 0.746 0.001 0.815 0.001
Índice de refracción 1.436 0.001 1.459 0.001
Índice de Saponificación 191.28 0.040 215.05 0.010
Índice de esterificación 146.39 0.050 185.37 0.020
(Farías y Olaya, 2018)
Como se observa existen diferencias en los perfiles cromatográficos de las fracciones de
compuestos insaponificables de las semillas de las variedades amargas y dulces (Figura 8). El
equipo registró un total de 156 picos cromatográficos para el extracto de las semillas amargas
y 185 para el de las semillas dulces. En la (Tabla VII) se describen los compuestos
identificados para estas fracciones.
39
Figura 8. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos
insaponificables de los frutos de Nephelium lappaceum variedades amargas y dulces.
(Farías y Olaya, 2018)
40
Tabla VII Compuestos identificados en la fracción insaponificable de las semillas de los
frutos amargos y dulces de Nephelium lappaceum.
Semillas frutos amargos Semillas frutos dulces
Tr min Compuesto %
abund
Tr
min Compuesto
%
abund
24.83 Octadecano 0.21
25.50 Nonadecano 0.21
27.36 Caprilato de metilo 0.63
28.19 Trans 11-hexadecenoato
de etilo 5.94
28.32
9-hexadecenoato de etilo
(Ácido vaccénico etil
éster)
8.70
28,60 Palmitato de metilo 46.78
30.53
9,12 etadecadienoato de
metilo. (linoleato de
metilo)
0.84
30.67 Estearato de metilo 0.63
31,53 Ácido -9- octadecenoico
(Ácido vaccénico) 6.62
32.84 Ácido Cis-13-
octadecenoico 12.31
34,19 Tricosano 2.76
34.22 Nonadecano 2.76
34.33 Docosano 2.97
34.60 14-β-pregnano 2.33
34.86 Z-12-pentacoseno 3.60
34.96 n-tricosano 2.97
36.88 Pentadecano 6.58
37,42 Pentacosano 31.66
39,26 14-β-pregnano 6.70 37.08 14-β-pregnano isómero 9.34
37.49 Heptadecano 13.37
37.79 3-pentacoseno 6.15
38.19 n-pentacosano 11.46
38.65 n-hexacosano 8.91
44,12 Eicosano 5.53
(Farías y Olaya, 2018)
De los 156 picos registrados en el cromatograma de los frutos amargos, sólo pudieron ser
identificados 6 y de los 185 registrados en los frutos dulces se pudieron identificar 19. Sólo se
encontró una coincidencia entre los compuestos insaponificables identificados en las semillas
41
de ambos frutos, el 14-β-pregnano, que presentó una abundancia de 6.7 % en las semillas
amargas y un 9.34 % en las dulces.
Las fracciones estuvieron fundamentalmente constituidas por ésteres de ácidos grasos e
hidrocarburos. Los componentes mayoritarios de las semillas de los frutos amargos fueron el
palmitato de metilo (46.78 %) y el pentacosano (31.66 %), el resto de los componentes no
alcanzaron abundancias superiores al 10%. Para las semillas de los frutos dulces los
componentes mayoritarios fueron el heptadecano (13.37 %), el ácido Cis-13-octadecenoico
(12.31 %) y el n-pentacosano (11.46 %); este último aunque se encontró en los frutos verdes,
se registró con tiempo de retención diferente.
Para la fracción de compuestos insaponificables de los frutos, no se registra ninguna
información en la bibliografía consultada, por lo que los resultados se informan por primera
vez.
Para la fracción de compuestos saponificables los cromatogramas gaseosos analíticos se
presentan en la Figura 9. Para estos compuestos se observa una mayor coincidencia, en los
cromatogramas, con diferencias en las intensidades de los picos cromatográficos. Para la
fracción de compuestos saponificables de las semillas de los frutos amargos, el equipo registró
un total de 11 picos cromatográficos, mientras que para la de los dulces registró 9. En la Tabla
VIII se relacionan los compuestos identificados para las fracciones de ambas semillas.
42
Figura 9. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos
saponificables de los frutos de N. lappaceum variedades amargas y dulces.
(Farías y Olaya, 2018)
43
Tabla VIII Compuestos identificados en la fracción saponificable de las semillas de los
frutos dulces y amargos de N. lappaceum
Semillas frutos amargos Semillas frutos dulces
Tr
min Compuesto
%
abund Tr min Compuesto
%
abund
18,97 Ácido hexadecanoico
(Palmítico) 4.47 18.97
Ácido hexadecanoico
(Palmítico) 4.27
25,78
Ácido 9,12
octadienoico
(Linoleico)
1.56 25.78
Ácido 9,12
octadienoico
(Linoleico)
1.47
26,15
Ácido 9-
octadecenoico
(Oleico)
38.4 25.90 Ácido 9-
octadecenoico (Oleico 42.25
26.34 Ácido 10
octadecenoico 2.51
27,33
Ácido
octadecanoico
(Esteárico)
5.89 27.33
Ácido
octadecanoico
(Esteárico)
6.38
34,40 Ácido cis -11-
eicosenoico 4.93 34.41
Ácido cis -11-
eicosenoico 4.80
34,67 Ácido -9-
eicosenoico 0.64
34.68 Ácido cis -13-
eicosenoico 0.91
35,62 Ácido eicosanoico
(Araquídico) 31.96 35.95
Ácido eicosanoico
(Araquídico) 35.85
40,95 Ácido docosanoico
(Behénico) 12.15 43.79
Ácido docosanoico
(Behénico) 1.57
(Farías y Olaya, 2018)
En la fracción saponificable de los frutos amargos se pudieron identificar 8 ácidos grasos de
los cuales uno de ellos no se pudo identificar en los frutos maduros. En éstos últimos se
identificaron 9 compuestos, pero dos de ellos no se identificaron en la fracción de las semillas
de los frutos amargos.
El componente mayoritario en ambos frutos fue el ácido oleico (ácido-9-octadecenoico),
con una abundancia de 38.4 % para las semillas de los frutos amargos y un 42.25 % para los
dulces, le continuó en abundancia para ambos frutos el Ácido eicosanoico (Araquídico), con
44
un 31.96 % para los frutos amargos y 35.85 % para los dulces. En el caso particular de la
fracción saponificable de las semillas de los frutos amargos se encontró que el ácido
docosanoico (Behénico) presentaba un 12.15 % de abundancia, mientras que en los dulces sólo
alcanzó un 1.57 %.
45
DISCUSIÓN
Do Sacramento y Aparecida (2014) informaron que las semillas de Nephelium lappaceum
se destaca por poseer forma ovalada, una coloración marron clara, con una longitud entre 20-
23 cm y un ancho de 10 a 12 cm, dichas caracteristicas no difieren en relación a los resultados
obtenidos en el análisis macromorfológicas efectuados a las muestra de nuestro estudio.
Se considera que la humedad residual garantiza la conservación adecuada de las semillas,
cabe destacar que las semillas dulces poseen mayor porcentaje de humedad debido,
presumiblemente, a la mayor cantidad de azucares presente en ellas en comparación con las
semillas amargas.
Las cenizas totales reflejan la presencia de minerales presentes en la planta, los cuales son
absorbidos de los suelos; diversas Farmacopeas señalan porcentajes de cenizas hasta un 5 %
(WHO, 2011), en dependencia del órgano vegetal estudiado. Los valores de cenizas totales
están dentro de los rangos permitidos para droga vegetal y en ambos tipos de semillas no
difieren significativamente por lo que pueden ser consideradas prácticamente iguales. Para las
cenizas insolubles, que fundamentalmente reflejan la presencia de metales pesados, las
Farmacopeas plantean valores no mayores de un 2 %, para la especie estudiada resulta de gran
relevancia el porcentaje de cenizas insoluble en ácido clorhídrico debido que a pesar de estar
dentro de los valores permisibles, son muy próximas a los valores obtenidos para las cenizas
totales. Sin embargo, es importante destacar los resultados obtenidos por Wall (2006) quien
señala que los frutos de la especie son ricos en sales minerales y reportan la presencia de
macroelementos como fósforo, potasio, calcio, magnesio y sodio y dentro de los
microelementos señala la presencia de hierro, manganeso, zinc y cobre; lógicamente la
concentración y presencia en de éstos está en función del tipo de suelo donde crece la especie.
46
La determinación de las sustancias solubles es uno de los parámetros de mayor interés al
momento de seleccionar adecuadamente disolventes en el proceso de extracción. Estas fueron
evaluadas en tres tipos de solventes (hexano, etanol y acetato de etilo), de acuerdo con el
método en caliente recomendado por la WHO (2011), lo cual demostró que el hexano es el
solvente más adecuado para la extracción de sustancias solubles en semillas dulces, por otra
parte el acetato de etilo y el etanol puede emplearse para las dos variedades de semillas
considerando que el segundo presenta un menor rendimiento de extracción de este tipo de
sustancias. Cabe destacar las diferencias encontradas en el porcentaje de sustancias solubles en
hexano entre las semillas dulces y amargas, pueden ser indicativo de una diferencia marcada
en la concentración de sustancias de baja polaridad.
Es considerado de interés el estudio de una droga, conocer de forma preliminar su
composición química cualitativa, la cual se logra mediante métodos de tamizaje fitoquímico.
Cualitativamente los metabolitos que se identificaron de acuerdo a los ensayos realizados
demostraron que ambas variedades de semillas son ricas en metabolitos secundarios que poseen
actividad farmacológica y que las similitudes entre ellas son elevadas, sin embargo, el tamizaje
fitoquímico evidenció una diferencia marcada en cuanto a los ensayos de Cl3Fe y Fehling en
los extractos alcohólico y acuoso de los dos tipos de semillas debido que en los extractos
alcohólicos es de fácil identificación los taninos de tipo pirocatecólicos debido a su coloración
verde intensa en comparación con los extractos acuosos que desarrollaron una coloración rojo-
vino indicativo de compuestos fenólicos en general y a su vez que las semillas amargas poseen
menor cantidad de azúcares reductores frente a las semillas dulces.
La presencia de ácidos grasos es común para las semillas de las especies y su composición
ha sido informada. Rohman (2017) informo primera vez la presencia de diferentes compuestos
fenólicos tales como: geraniina, corilagina y ácido elágico; la presencia de estos y otros
47
compuestos fenólicos, fue ratificada por Perera, et al. (2012), mientras que Maran, et al. (2017)
llegaron a separar antocianidinas, flavonoides y compuestos fenólicos a partir por técnicas de
ultrasonido. Los triterpenoides por lo general, forman parte de la fracción insaponificable de
las grasas, aunque no se han encontrado reportes de su presencia.
Solís et al. (2010) informaron para las semillas de rambután (especie no especificada),
valores de índice de refracción de 1,468 ± 0,001 similar al obtenido para las semillas amargas;
el índice de saponificación informado fue de 1,86, en este caso similar al de las semillas dulces.
Estos autores también obtuvieron valores tales como índice de yodo (47.0); ácidos grasos libres
(1.99) e índice de acidez de 3.95, estos valores no fueron determinados en el presente trabajo.
Debido a la complejidad estructural que posee los ácidos grasos, además, de la dificultad
para la identificación y cuantificación de estos compuestos a partir de métodos tradicionales se
hizo indispensable recurrir a la técnica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de
masas (GC/EM) para establecer el perfil lipídico de los extractos de las semillas dulces y
amargas de manera más simple y precisa; por ello, a la porción grasa obtenida por método
soxhlet se le realizo un tratamiento previo de saponificación para obtener extractos
concentrados (fracción saponificable e insaponificable) con los analitos de interés.
Una vez obtenidas las dos fracciones se prosiguió a realizar su respectivo análisis en el
cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas.
Solís et al. (2010), señalaron que en el aceite de las semillas de rambután los principales
ácidos grasos eran 40.3% de ácido oleico, 34.5 % de ácido araquídico, 6.1 % de ácido
palmítico; 7.1% de ácido esteárico y 2.9% de ácido behénico.
Según Mariod (2017) el aceite estaba constituido principalmente por palmítico (7.39 –
10.33 %), esteárico (12.21 % -16.58 %), araquídico (12.34 % -16.22 %) y behénico (6.53 % -
48
8.91 %) como ácidos grasos saturados, oleico (50.17 % -52.18 %) como ácido graso mono
insaturado y linolénico (2.02 % -3.04 %) como ácido graso poliinsaturado. Por su parte
Mahisanunt et al. (2017), señalaron que el mayor ácido graso de la fracción era el ácido
araquírico con más de un 90 %.
A pesar de que existen diferentes variedades de rambután, en ninguno de los trabajos
científicos consultados se especifica la variedad que ha sido objeto de estudio. No obstante, es
importante señalar que los ácidos grasos mencionados en la literatura se encuentran presentes
y sus variaciones cuantitativas pueden deberse a las condiciones ecológicas-geográficas donde
se desarrolla la especie.
49
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
De acuerdo con los resultados obtenidos se puede concluir que:
• El análisis macromorfológico evidenció que ambas semillas no poseían diferencias
significativas con lo que respecta a su morfología, en los parámetros físico-químicos
sólo se encontraron diferencias en la humedad residual que fue superior para las
semillas de los frutos dulces y las sustancias solubles en hexano que fueron también
significativamente superiores para las semillas de los frutos dulces.
• En el screening fitoquímico permitió demostrar a través de reacciones cromáticas la
existencia del mismo tipo de metabolitos para ambas variedades, no obstante, se pudo
visualizar una discreta diferencia al observar un mayor precipitado en la muestra de
semillas dulce respecto a la muestra de semillas amargas durante el ensayo de Fehling.
• Las semillas de la variedad amarga rindieron un 68.88 % de grasas, mientras que la
variedad dulce alcanzó un 57.35 %. Se observaron también diferencias en las
propiedades fisicoquímicas de las grasas.
• En el análisis por el sistema acoplado cromatografía gaseosa-espectrometría de masas,
se observaron diferencias marcadas entre las fracciones de compuestos
insaponificables, para las cuales no existe información en la literatura.
• Para la fracción de ácidos grasos se encontró mayor similitud cualitativa, estando las
diferencias centradas en lo cuantitativo. Los ácidos grasos identificados coinciden con
lo informado en la literatura.
50
5.2 Recomendaciones
Se recomienda:
• Profundizar en el estudio de las cenizas para establecer la composición en metales de
las variedades estudiadas.
• Evaluar la actividad terapéutica que posee las semillas del rambután a partir de estudios
de fraccionamiento de los constituyentes fitoquímicos de mayor relevancia y así
contribuir con el posible desarrollo de nuevos medicamentos de alta efectividad y
seguridad.
• Profundizar en el análisis de azúcares reductores principalmente en la variedad dulce
del fruto.
• Realizar la validación de un diseño experimental y estadístico enfocado en la
estandarización de los parámetros de calidad de los ácidos grasos para establecer de esa
forma los límites particulares en la especie.
51
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61
ANEXOS
Limpieza, clasificación y despulpamiento de los frutos del achotillo (Nephelium
lappaceum L.) en el Laboratorio de Tecnología Farmacéutica
Anexo 1. Lavado de frutos amargos y dulces del achotillo
Anexo 2. Separación de la cascara de las dos variedades del achotillo
Anexo 3. Despulpamiento del fruto amargo y dulce del achotillo.
62
Secado, percepción, molienda y pesado de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum
L.) en el Laboratorio de Tecnología Farmacéutica
Anexo 4. Secado de las semillas amargas y dulces del achotillo
Anexo 5. Percepción de las semillas amargas y dulces del achotillo.
Anexo 6. Pesado de las semillas de amargas y dulces del achotillo
63
Anexo 7. Proceso de molienda de la semilla amarga del achotillo
Anexo 8. Proceso de molienda de semillas dulces del achotillo.
Anexo 9. Semillas molidas y etiquetadas para almacenamiento
64
Métodos físico-químicos de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum L.) en el
Laboratorio de Alimentos
Ensayo de humedad residual
Anexo 10. Peso de las muestras para determinación de humedad
Anexo 11. Muestras de semillas amargas y dulces en la estufa.
Anexo 12. Muestras pesadas para cenizas totales.
65
Ensayo de cenizas insolubles
Anexo 15. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico
Anexo 16. Pesado de muestras con disolventes para sustancias insolubles
Anexo 13. Muestras de semillas en
la mufla.
Anexo 14. Cenizas de las
muestras en desecador.
66
Anexo 17. Reflujo de la muestra/Residuo de sustancias solubles
Screening de las dos variedades de semillas del achotillo (Nephelium lappaceum L.) en el
Laboratorio De investigación de Productos Naturales
Extracto de éter etílico semillas del achotillo
Anexo 18. Screening del extracto
etéreo de las semillas amargas achotillo
Anexo 19. Screening del extracto de
éter etílico de las semillas dulce de
achotillo
Anexo 20. Prueba de
Baljet del extracto
etéreo semillas dulces y
amargas.
Anexo 21. Prueba de
Dragendorff del extracto
etéreo de semillas dulces
y amargas.
Anexo 22. Prueba de
Wagner de extracto
etéreo de semillas dulces
y amargas
67
Extracto alcohólico de las semillas del achotillo
Anexo 23. .Prueba de Sudan
del extracto etéreo de semillas
dulces y amargas.
Anexo 24. Prueba de
Lieberman del extracto etéreo
de semillas dulces y amargas.
Anexo 25. Prueba de
Resinas del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas.
Anexo 26. Prueba de
Cl3Fe del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas.
Anexo 27. Prueba de
Fehling del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas.
Anexo 28. Prueba de
Baljet del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas
Anexo 29. Prueba de
Borntrager del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas
Anexo 30. Prueba de
Buchard del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas.
68
Extracto acuoso de las semillas del achotillo
Anexo 35. Screening del extracto de acuoso, de las semillas amargas del achotillo
(Nephelium lappaceum L)
Anexo 31. Prueba de
Dragendorff del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas
Anexo 32. Prueba de
Wagner del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas
Anexo 33. Prueba de
saponinas del extracto
alcohólico de semillas
dulces y amargas.
Anexo 34. Prueba de
Shinoda del extracto alcohólico
de semillas dulces y amargas.
69
Anexo 36. Screening del extracto de acuoso de las semillas dulces del achotillo
(Nephelium lappaceum L).
Anexo 37. Prueba de
Dragendorff del
extracto acuoso de
semillas dulces y
amargas
Anexo 38. Prueba de
Fehling del extracto
acuoso de semillas
dulces y amargas.
Anexo 39. Prueba de
Espuma del extracto
acuoso de semillas
dulces y amargas.
Anexo 40. Prueba de
Shinoda del extracto
acuoso de semillas
dulces y amargas.
Anexo 41. Prueba de
Cl3Fe del extracto
acuoso de semillas
dulces y amargas
Anexo 42. Prueba de
Wagner del extracto
acuoso de semillas
dulces y amargas.
70
Extracción y análisis de grasas de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum l.)
Anexo 43. Evaporación del solvente
de extracción por medio de rota
evaporador.
Anexo 44. Extracción de ácidos
grasos con hexano por el método de
soxhlet.
Anexo 45. Determinación de índice
de densidad relativa de los acido grasos
de las semillas dulce y amarga.
Anexo 46. Determinación de índice
de saponificación de los acido grasos de
las semillas dulce y amarga.
Anexo 47. Determinación de índice de
saponificación de los acido grasos de las
semillas dulce y amarga.
Anexo 48. Determinación de índice
de esterificación de los acido grasos de
las semillas dulce y amarga.
71
Análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en las semillas del achotillo
(Nephelium lappaceum l.)
Anexo 49. Saponificación de
ácidos grasos de las semillas dulce
y amarga