UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
TEMA
“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN
ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN
ECUADOR”.
AUTORES:
ESTRADA MEZA BLANCA CAROLINA
LUNA PERALTA ALEX HUGO
TUTORA:
Ph.D. TATIANA ZAMORA ZAMORA
CO-TUTORA:
Ph.D. MERIBARY MONSALVE PAREDES
GUAYAQUIL - ECUADOR
2020
i
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO:
“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN
ECUADOR”.
AUTOR (ES): Estrada Meza Blanca Carolina Luna Peralta Alex Hugo
DOCENTE TUTOR Y DOCENTE REVISOR :
Ph.D. Tatiana Zamora Zamora, (Tutora) Ph.D. Meribary Monsalve Paredes (Co-tutora) Dra. María del Carmen Villacrés (Revisor)
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil
UNIDAD/FACULTAD: Ciencias Químicas
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: Tercer Nivel / Químicos y Farmacéuticos
FECHA DE PUBLICACIÓN: 2020 No. DE PÁGINAS: 82
ÁREAS TEMÁTICAS: Investigación
PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:
Ácidos clorogénicos, 5-CQA, Coffea arábica, Coffea Canephora, UPLC-MS
RESUMEN El presente trabajo de investigación tiene como objetivo identificar y cuantificar el contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café en tres etapas del proceso de maduración del grano, de las especies arábica y robusta cultivadas en Ecuador. A partir de los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración se realizó la determinación de seis isómeros de ácidos clorogénicos, siendo estos 3-CQA, 5-CQA, 4-CQA, 3,4- diCQA, 3,5- diCQA y 4,5-diCQA, mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas utilizando como fase estacionaria una columna C18 (100 mm de longitud, 2.1mm de diámetro interno) y como fase móvil un gradiente de ácido fórmico al 0.1 % (fase A) y acetonitrilo (fase B). Los resultados obtenidos permiten confirmar que el 5-CQA es el compuesto clorogénico de mayor concentración en las especies estudiadas, con valores diferentes para las variedades de ambas especies evidenciando que en C. arábica predomina un contenido menor de estos compuestos en el grano verde con respecto a los granos en estado maduro, y en C. robusta es mayor el contenido de ácidos clorogénicos en el grano verde. Adicionalmente, el estudio realizado ha permitido la optimización y disponibilidad de un método analítico (UPLC-MS) para la determinación de ácidos clorogénicos con resultados satisfactorios de precisión en un tiempo corto de análisis. Esta información es de interés tanto para laboratorios de control, como para la caracterización de las especies estudiadas.
ADJUNTO PDF: X SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0995387811 Teléfono: 0980154846
E-mail: [email protected]
E-mail: [email protected]
CONTACTO CON LA
INSTITUCIÓN:
Nombre: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Teléfono: (04) 2293680
E-mail: www.fcq.ug.edu.ec
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AGRADECIMIENTO
Sobre todas las cosas, a Dios.
Han pasado cinco años y medio desde que empezó este largo camino por
convertirnos en profesionales, el cual hemos recorrido juntos, desde nivelación
hasta la realización de esta tesis. Al final de todo este proceso ambos tenemos
una sola meta, y es, que nuestros padres se alegren al ver en nosotros el fruto
de su esfuerzo. Finalmente, el momento ha llegado y orgullosos podemos decir,
que todo lo logrado se lo debemos enteramente a ustedes.
Es conocido, que la realización de una tesis no es tarea fácil y para ello fue
necesaria la ayuda de muchas personas, a quienes les guardamos el más
sincero cariño y agradecimiento.
Agradecemos en primer lugar a nuestra tutora, Ph. D Tatiana Zamora y co–tutora
Ph. D Meribary Monsalve quiénes bajo su dirección nos supieron guiar en nuestro
proceso de titulación.
Nuestro profundo agradecimiento al QF. Sergio Maquilón y al M.Sc. Jean Carlos
Belandria, quienes, sin tener la obligación nos brindaron su ayuda y tuvieron para
con nosotros la mejor disposición en todo momento.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias, en especial al Ing. Luis
Plaza, por su colaboración brindada.
Por último y no menos importante, a todas las personas que de una u otra
manera nos acompañaron y fueron parte de este proceso, amigos y familia.
A todos ustedes, muchas gracias.
xiii
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ................................................................................................. XX
INTRODUCCIÓN ...........................................................................................1
CAPÍTULO I ...................................................................................................2
PROBLEMA ...................................................................................................2
I.1 Planteamiento del problema ..................................................................2
I.2 Formulación del problema .....................................................................4
I.3 Justificación ...........................................................................................5
I.4 Hipótesis ...............................................................................................6
I.5 Objetivos ...............................................................................................7
I.5.1 Objetivo General .............................................................................7
I.5.2 Objetivos específicos ......................................................................7
I.6 Operacionalización de las variables ......................................................8
CAPÍTULO II ..................................................................................................9
MARCO TEORICO ........................................................................................9
II.1 Café .....................................................................................................9
II.1.1 Producción de café en Ecuador .....................................................9
II.2 Especies de café cultivadas en Ecuador............................................. 11
II.2.1 Café robusta ................................................................................ 11
II.2.2 Variedades................................................................................... 11
II.3 Café arábica ....................................................................................... 12
xiv
II.3.1 Variedades................................................................................... 12
II.4 Composición química del café ............................................................ 14
II.5 Ácidos clorogénicos............................................................................ 15
II.5.1 Estructura .................................................................................... 15
II.5.2 Propiedades ................................................................................. 19
II.6 Análisis cromatográfico ...................................................................... 21
II.6.1 Cromatografía .............................................................................. 21
II.6.2 Detectores de Cromatografía Líquida ........................................... 23
II.7 Análisis de metodologías utilizadas en la determinación de ácidos
clorogénicos en café, derivados y otras especies vegetales. ........................ 26
CAPÍTULO III: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ........................... 37
III.1 Tipo de investigación ......................................................................... 37
III.2 Equipos, aparatos, materiales y reactivos .......................................... 37
III.2.1 Reactivos .................................................................................... 37
III.2.2 Materiales ................................................................................... 37
III.2.3 Equipos y Aparatos ..................................................................... 38
III.3 Muestras ........................................................................................... 38
III.4 Diseño experimental .......................................................................... 39
III.4.1 Selección de muestras ................................................................... 40
III.4.2 Determinación de Humedad ........................................................... 42
III.4.3 Análisis cromatográfico de los ácidos clorogénicos ........................ 42
III.4.3.1 Preparación de soluciones stocks (3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-
xv
diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA) ................................................................. 43
III.4.3.2 Preparación de la curva de calibración .................................... 43
III.4.3.3 Condiciones cromatográficas ................................................... 44
III.4.3.4 Método de extracción del ácido clorogénico............................. 44
III.4.3.5 Preparación de muestras para el análisis cromatográfico......... 45
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................ 46
IV.1 Determinación del porcentaje de humedad ....................................... 46
IV.2 Optimización de condiciones cromatográficas .................................. 46
IV.3 Curva de calibración ......................................................................... 48
IV.4 Análisis del contenido de ácidos clorogénicos .................................. 51
IV.4.1 Análisis del contenido de Mono-isómeros de ácidos clorogénicos
en Coffea arábica y Coffea canephora. ..................................................... 53
IV.4.2 Análisis del contenido de Di-isómeros de ácidos clorogénicos en
Coffea arábica y Coffea canephora ........................................................... 56
CONCLUSIONES ........................................................................................ 59
RECOMENDACIONES ................................................................................ 60
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 61
GLOSARIO .................................................................................................. 66
ANEXOS ...................................................................................................... 67
xvi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Taxonomía del café .......................................................................... 9
Tabla II. Composición química (Arábica y Robusta). .................................... 14
Tabla III. Isómeros de ácidos clorogénicos .................................................. 15
Tabla IV. Diferencias entre HPLC y UPLC. .................................................. 22
Tabla V. Comparación de la metodología utilizada en diferentes estudios para
la determinación de ácidos clorogénicos. ..................................................... 26
Tabla VI. Identificación de especies, variedades y código de muestras que
fueron objeto de estudio. .............................................................................. 38
Tabla VII. Volúmenes de trabajo de la curva de calibración ......................... 43
Tabla VIII. Elución en modo gradientes de las fases A y B ......................... 44
Tabla IX. Porcentaje de humedad de acuerdo a las especies de café ......... 46
Tabla X. Tiempo de retención de los isómeros de ácidos clorogénicos. ....... 48
Tabla XI. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y
áreas obtenidas de los compuestos MonoCQA ............................................ 49
Tabla XII. Linealidad de la curva de calibración de los MonoCQA ............... 49
Tabla XIII. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y
áreas obtenidas de los compuestos diCQA .................................................. 50
Tabla XIV. Linealidad de la curva de calibración de los diCQA .................... 50
Tabla XV. Rango de valores de concentración para cada isómero de ácido
clorogénico .................................................................................................. 53
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.Zonas productoras de café en Ecuador ......................................... 10
Figura 2. Estructura química de los ácidos cafeoilquínicos 3-CQA, 4-CQA y
5-CQA .......................................................................................................... 17
Figura 3.Estructura química de los ácidos dicafeoilquinícos 3,4-diCQA, 3,5-
diCQA y 4,5-diCQA ...................................................................................... 18
Figura 4. Estructura química de los ácidos feruoilquínico 3-FQA, 4-FQA y 5-
FQA ............................................................................................................. 19
Figura 5. Componentes del espectrómetro de masas.................................. 24
Figura 6. Flujograma de la metodología aplicada ........................................ 39
Figura 7.Caracterización de los estados de maduración del café ................ 40
Figura 8. Muestras seleccionadas de acuerdo al grado de maduración ....... 41
Figura 9. Cromatograma obtenido mediante UPLC-MS de un mix de
estándares a una concentración de 1 ppm ................................................... 47
Figura 10. Curva de calibración de los estándares MonoCQA ..................... 49
Figura 11. Curva de calibración de los estándares diCQA ........................... 50
Figura 12. Contenido de mono-CQA y di-CQA en especies de café cultivadas
en Ecuador. ................................................................................................. 52
Figura 13.Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea arábica.54
Figura 14. Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea canephora
..................................................................................................................... 55
Figura 16. Cromatograma de la muestra de café robusta: A) Elución de los
monoCQA; B) Elución de los diCQA ............................................................ 57
Figura 15. Cromatograma de la muestra de café arábica: A) Elución de los
monoCQA; B) Elución de los diCQA ............................................................ 58
xviii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexos A. Muestreo, junio de 2019 ............................................................ 67
Anexos B. Muestras seleccionadas de Coffea arábica ................................ 68
Anexos C. Muestras seleccionadas de Coffea canephora ........................... 69
Anexos D. Resultados obtenidos en la determinación de humedad ............ 70
Anexos E. Maceración hidroalcohólica de las muestras .............................. 71
Anexos F. Extractos hidroalcohólicos en viales. ......................................... 71
Anexos G. Cromatógrafo UPLC Waters (modelo ACQUITY) con detector de
espectrometría de masas (QDa). ................................................................ 71
xix
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
CQA Ácidos Clorogénicos
MONO-CQA Mono-ácidos clorogénicos
DI-CQA Di-ácidos clorogénicos
ULPC Cromatografía liquida de ultra rendimiento
MS Espectrómetro de masas
QDa Detector de masas
CIE Comission Internationale de l´Eclairage
DDA Días después de la antesis
3-CQA 3-cafeoilquínico
5-CQA 5-cafeoilquínico
4-CQA 4-cafeoilquínico
3,4-diCQA ácido 3,4-dicafeolquínico
3,5-diCQA ácido 3,5-dicafeolquínico
4,5-diCQA ácido 4,5-dicafeolquínico
xx
“DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS, EN
ESPECIES DE CAFÉ (Coffea arábica, Coffea canephora) CULTIVADO EN
ECUADOR”.
Autores: Blanca Carolina Estrada Meza
Alex Hugo Luna Peralta
Tutora: Ph.D Tatiana Zamora Zamora
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tiene como objetivo identificar y cuantificar el
contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café en tres etapas del
proceso de maduración del grano, de las especies arábica y robusta cultivadas en
Ecuador. A partir de los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración se realizó
la determinación de seis isómeros de ácidos clorogénicos, siendo estos 3-CQA, 5-CQA,
4-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA y 4,5-diCQA, mediante cromatografía de líquidos
acoplada a espectrometría de masas utilizando como fase estacionaria una columna
C18 (100 mm de longitud, 2.1mm de diámetro interno) y como fase móvil un gradiente
de ácido fórmico al 0.1 % (fase A) y acetonitrilo (fase B). Los resultados obtenidos
permiten confirmar que el 5-CQA es el compuesto clorogénico de mayor concentración
en las especies estudiadas, con valores diferentes para las variedades de ambas
especies evidenciando que en C. arábica predomina un contenido menor de estos
compuestos en el grano verde con respecto a los granos en estado maduro, y en C.
robusta es mayor el contenido de ácidos clorogénicos en el grano verde.
Adicionalmente, el estudio realizado ha permitido la optimización y disponibilidad de un
método analítico (UPLC-MS) para la determinación de ácidos clorogénicos con
resultados satisfactorios de precisión en un tiempo corto de análisis. Esta información
es de interés tanto para laboratorios de control, como para la caracterización de las
especies estudiadas.
Palabras claves: Ácidos clorogénicos, 5-CQA, Coffea arábica, Coffea robusta,
UPLC-MS.
xxi
"DETERMINATION OF THE CONTENT OF CHLOROGENIC ACIDS, IN
COFFEE SPECIES (Coffea arabica, Coffea canephora) CULTIVATED IN
ECUADOR".
Authors: Blanca Carolina Estrada Meza
Alex Hugo Luna Peralta
Tutor: Ph.D Tatiana Zamora Zamora
ABSTRACT
The purpose of this investigation is to identify and quantify chlorogenic acids in
isomers of Ecuadorian arabic and robust species coffee beans, in three stages of
maturity. From the hydroalcoholic extracts obtained by maceration, was determined six
isomers of chlorogenic acids: 3CQA, 5CQA, 4CQA, 3,4DiCQA, 3,5DiCQA and
4,5DiCQA, by liquid chromatography /mass spectrometry, using as a stationary phase a
C18 column (100 mm long, 2.1 mm internal diameter) and as a mobile phase a gradient
of 0.1% formic acid (phase A) and acetonitrile (phase B). The results obtained confirm
that 5-CQA is the chlorogenic compound with the highest concentration in the studied
species, with different values for the varieties of both species, evidencing that a smaller
content of these compounds in green grain predominates in Coffea Arabica, compared
to grains in mature state; and in Coffea Robusta the content of chlorogenic acids in the
green grain is greater. Additionally, the study has allowed the optimization and availability
of an analytical method (UPLC-MS) for the determination of chlorogenic acids with
satisfactory and precise results in a short time of analysis. This information is of interest
both for quality control and for the characterization of the species studied.
Keywords: Chlorogenic acids, 5-CQA, Coffea arabica, Coffea robusta, UPLC-
1
INTRODUCCIÓN
Para Ecuador el café es un bien agropecuario de exportación de alta
relevancia. Ecuador es uno de los pocos países en el mundo que cultiva y
exporta las dos principales especies comerciales en el contexto mundial, Coffea
arabica (café arábica) y Coffea canephora (café robusta).
Los ácidos clorogénicos, uno de los compuestos químicos del café, son
compuestos fenólicos producidos por una amplia variedad de organismos en la
naturaleza, a los cuales se les atribuyen variedad de beneficios y propiedades,
tales como, actividad anti-hipertensiva, antioxidante, mejoramiento en el
metabolismo de lípidos y glucosa, entre otros (Mainheart, A. 2017).
Además de las propiedades terapéuticas, se ha reportado que los ácidos
clorogénicos tienen una marcada influencia en la calidad del café, debido a que
la concentración de estos ácidos incide directamente en el aroma y sabor del
mismo (Chaves-Ulate & Esquivel-Rodíguez, 2019).
En este sentido, y por los diferentes beneficios que se adjudican a los ácidos
clorogénicos, la determinación de estos compuestos fenólicos en el café
ecuatoriano, constituye un valor agregado a uno de los recursos vegetales de
mayor importancia socioeconómica para el país.
El presente trabajo evalúa el contenido de compuestos bioactivos conocidos
como ácidos clorogénicos en granos de café seleccionados de las especies
Coffea arábica y Coffea canephora, en diferentes estados de maduración, para
posteriormente establecer comparaciones y ponderar así, la calidad que el
producto nacional presenta.
A partir de las muestras, se aplicaron metodologías que permiten una
satisfactoria obtención de los ácidos clorogénicos en el extracto de café para
posteriores ensayos de análisis; además de técnicas cromatográficas como
UPLC-MS que, en función del tipo de muestra y compuesto, además de la
información espectral que proporciona dicho sistema, se definió como la más
adecuada.
2
CAPÍTULO I
PROBLEMA
I.1 Planteamiento del problema
El café es considerado un recurso agrícola de gran importancia
socioeconómica en Ecuador; constituyendo uno de los sectores productivos con
mayor potencial de desarrollo en generación de divisas a lo largo de muchas
décadas.
Actualmente la caficultura ecuatoriana atraviesa por escenarios críticos,
debido a la baja producción de café que se registra en el país, la disminución del
rendimiento de los cafetos y la reducción de superficie productiva para este rubro.
Ante esta situación, se considera que la poca investigación existente sobre el café
ecuatoriano, impide el acertado planteamiento de proyectos estratégicos que
permitan mitigar este escenario.
Factores externos como la variabilidad en los precios de café en el mercado
internacional, representa otra problemática para el sector cafetero. Según cifras
oficiales de la Asociación Nacional de Exportadores de Café (ANECAFE), a
octubre del 2019 las exportaciones de café reportaron cifras significativamente
bajas en comparación con años anteriores. Desde el año 2012 en adelante, se
ha registrado una disminución de un 78%, en las exportaciones de café y sus
derivados, lo que en la actualidad representa una pérdida de aproximadamente
USD 214 millones, en generación de divisas para el país.
Por lo que se considera, que basar la mayor parte de la economía proveniente
de un recurso natural como el café, únicamente en las exportaciones no es del
todo acertado, debido a la enorme susceptibilidad de este sector frente a factores
externos; siendo necesario diversificar los usos o aplicaciones de la especie en
función de las propiedades y calidad del fruto.
El café es una especie vegetal, que puede ser aprovechada como producto al
granel, como materia prima para elaboración de derivados, y como producto
natural para el aprovechamiento del contenido de compuestos químicos que
posterior a procesos industriales pueden ser exportados como materia prima,
entre otros. Esto, siempre y cuando exista el levantamiento de información que
permita ampliar la oferta en cuanto al aprovechamiento de la producción agrícola.
3
Al respecto, en el país, centros especializados de investigación realizan
esfuerzos científicos para el mejoramiento biológico de la especie Coffea, pero
desde el espacio de las ciencias químicas es necesario conocer los potenciales
de la especie en función de su composición química.
4
I.2 Formulación del problema
De acuerdo con los antecedentes del planteamiento del problema, es
necesario establecer como interrogante para este estudio: ¿Cuáles son los
niveles de concentración de los isómeros de ácidos clorogénicos presentes en
el café de acuerdo a la especie y grado de maduración de las especies de Coffea
cultivadas en Ecuador?
5
I.3 Justificación
Los ácidos clorogénicos comprenden un grupo de ácidos resultantes de la
unión entre ácidos transcinámicos y el ácido quínico. Estos compuestos fenólicos
son reconocidos por la diversa actividad biológica que presentan, según lo
reportado por numerosos estudios. En comparación con otras especies, el café
presenta un mayor contenido de ácidos clorogénicos, los cuales en su mayoría
se encuentran como mono y di-ésteres, y forman más de 40 compuestos.
Actualmente el sector cafetalero del país enfrenta problemas en toda su
cadena productiva, razón por la cual se requiere del compromiso de todos
quienes son parte de la cadena agroindustrial del café, así como de las
instituciones de educación superior que promueven la investigación y el
desarrollo del sector cafetalero como una contribución efectiva al impulso de la
transformación de la matriz productiva del país.
La información que se pueda obtener, sobre la composición química, y de
compuestos bioactivos en el café, permitiría a los actores del sector tener un
mayor conocimiento sobre este recurso agrícola, y encauzaría un mejor
aprovechamiento del grano de café ecuatoriano.
El presente trabajo evalúa el contenido de ácidos clorogénicos, 3-
cafeoilquínico, 5-cafeoilquínico, 4-cafeoilquínico, acido 3,4-dicafeolquínico, acido
3,5-dicafeolquínico, acido 4,5-dicafeolquínico en granos de café ecuatoriano
seleccionados de acuerdo a especies, variedades y grado de maduración,
consideradas variables para este estudio.
Para el alcance de las metas planteadas, se hace necesaria la aplicación de
técnicas cromatográficas que permiten no solo identificar, sino confirmar y
cuantificar el contenido de ácidos clorogénicos; para posteriormente poder
establecer comparaciones entre las variables antes mencionadas.
Para ello, en la presente investigación se ha llevado a cabo la optimización de
las condiciones analíticas para la determinación satisfactoria y rápida de ácidos
clorogénicos. Cabe destacar, que la metodología desarrollada en este trabajo
constituye una base para posteriores determinaciones de estos compuestos en
especies similares, mediante la aplicación de un sistema de Cromatografía
Liquida de Ultra Rendimiento acoplado a un detector de espectrometría de
6
masas (UPLC – MS), de tal manera que en comparación con otras metodologías
se puedan obtener resultados de identificación y cuantificación, con mayor
precisión y en un menor tiempo de análisis.
I.4 Hipótesis
El café ecuatoriano presenta diferencias en su contenido de ácidos
clorogénicos de acuerdo a su especie y estado de maduración.
7
I.5 Objetivos
I.5.1 Objetivo General
Determinar el contenido de isómeros de ácidos clorogénicos en especies
seleccionadas del género Coffea cultivado en Ecuador.
I.5.2 Objetivos específicos
• Optimizar condiciones analíticas para la identificación y cuantificación
cromatográfica de los isómeros de ácidos clorogénicos presentes en el café
cultivado en el Ecuador.
• Evaluar el contenido de ácidos clorogénicos en las especies
seleccionadas de café ecuatoriano de acuerdo al grado de maduración de la
especie.
• Establecer un estudio comparativo entre los niveles de ácidos
clorogénicos del café cultivado en Ecuador, de acuerdo a su especie y grado de
maduración.
8
I.6 Operacionalización de las variables
VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADORES
DEPENDIENTES
Identificación de ácidos
clorogénicos
Detección de los
compuestos
Tiempo de retención y espectro MS
Contenido de ácidos
clorogénicos
Cantidad de metabolitos
contenidos en una matriz
mg/Kg
INDEPENDIENTES
Especie
Identificación botánica de la especie
Características
Grado de maduración
Establecido mediante escala colorimétrica
CIE
Elaborado por: Autores, (2020).
9
CAPÍTULO II
MARCO TEORICO
II.1 Café
El café es uno de los productos más consumidos a nivel mundial. Según el
Servicio Ecuatoriano de Normalización (INEN), se puede definir al café como el
producto comestible de las especies cultivadas del genero Coffea, en las cuales
frutos y granos son utilizados como alimentos. Taxonómicamente la planta de
café corresponde a la división Magnoliophyta, como se observa en la Tabla I.
Tabla I. Taxonomía del café.
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
REINO Vegetal
DIVISION Magnoliophyta
CLASE Dicotyledoneae
SUBCLASE Asteridae
ORDEN Rubiales
FAMILIA Rubiaceae
GENERO Coffea
Fuente: Bold et al., 1980.
II.1.1 Producción de café en Ecuador
El café para Ecuador es uno de los principales productos de exportación, lo
que lo convierte en una de las especies de mayor relevancia para el país. En
materia económica el café ecuatoriano en el 2019 genero $55.785.542 en
divisas, según datos de la Asociación Nacional de Exportadores de Café
(ANECAFE). En el ámbito social, el sector cafetalero es generador de empleo
para las familias que basan sus recursos en la agricultura, incluso, en la región
amazónica la producción de café permite que las distintas etnias como los
Kichwas, Shuaras, Tsáchilas se beneficien mediante el comercio de este
producto (PROECUADOR, 2013).
10
Según datos de ANECAFE, Ecuador presenta una producción mixta, es decir,
que cultiva las especies arábica (Coffea arábica) y robusta (Coffea canephora),
razón por la cual, es uno de los 14 países entre cerca de 70 que exporta ambas
especies.
En Ecuador, la siembra de café se da en sus cuatro regiones naturales: la
región costa siembra 112.000 hectáreas, la región andina 62.000 hectáreas, la
región amazónica 55.000 hectáreas y la región Insular 1000 hectáreas de
cafetales.
En la Figura 1, se destacan las principales zonas del Ecuador donde existe
mayor producción cafetalera, de acuerdo con registros del año 2017 reportados
por el INEN.
Figura 1.Zonas productoras de café en Ecuador
Fuente: INEN-ESPAC 2017
11
Las principales zonas de cultivo de café se dividen en:
• Zona oriental: Comprenden a las provincias de Napo, Sucumbíos y
Francisco de Orellana. Productoras de café robusta.
• Zona centro oeste: la provincia de Manabí. Productora de café arábico
• Zona central: provincias de Pichincha, Esmeraldas, Bolívar, Cotopaxi y
Los Ríos. Productoras de café arábico y robusta
• Zona sur: provincias de Loja, Zamora Chinchipe y El Oro. Productoras de
café arábico
II.2 Especies de café cultivadas en Ecuador.
II.2.1 Café robusta
La especie Coffea canephora conocida como café robusta, es un arbusto
multicaule el cual puede alcanzar de hasta 12 metros de altura. Las
inflorescencias son axilares, formadas por uno o tres verticilos, constituido cada
uno por 15 a 30 flores blancas, cuya corola posee de 5 a 7 pétalos. Sus ramas
son largas de 20 a 35 cm de largo y 8 a 15 cm de ancho, oblongas acuminadas
y con relieve abarquillado. (Játiva Reyes, M., y Tinoco J., L. 1994).
II.2.2 Variedades
Congolensis
La variedad congolensis posee varias características útiles, como una gran
tolerancia a la enfermedad de la Roya (Hemileia vastratix), al barrenillo blanco
del tallo y a la invasión de nematodos. Es originaria del Congo y tiene el potencial
de dar rendimientos constantes (Duicela, et al 2006).
Timor
La variedad Timor resulta del cruce natural entre Coffea canephora y Coffea
arábica. Las plantas de esta variedad, presentan variabilidad en sus
características morfológicas y productivas. Los rangos de adaptación son
limitados y presentan resistencia a la Roya del cafeto y también resistencia a la
12
enfermedad de los frutos causados por el hongo Colletotrichum coffeanum (CBD)
(INIAP, 1993).
Conilon
La variedad Conilon se origina en Gabón (África) y posteriormente introducida
en el sureste de Brasil. Presenta gran diferencia genética en productividad,
tamaño, maduración y además alta tolerancia a plagas y enfermedades. Posee
hojas pequeñas con bordes ondulados y presenta una fecundación cruzada,
ocasionada principalmente por la auto-incompatibilidad (INCAPER, 2007).
II.3 Café arábica
La especia arábica es originaria de las montañas sur occidentales de Etiopía,
en el altiplano del Sudán y el Norte de Kenia, en el África nororiental, el mismo
que está ubicado entre 1.300 a 2.000 metros de altitud.
Se encuentra en estado silvestre y alcanza entre 9 y 12 metros de altura, con
hojas opuestas y simples con color verde oscuro, borde ondulado, base obtusa
y ápice acuminado. Produce una drupa carnosa y ovoide de color rojo la cual
contiene dos semillas (Amores et al., 2004).
II.3.1 Variedades
Sarchimor
Proviene de un cruce entre dos variedades: Villa Sarchi (de la familia de café
bourbon), y Timor. Se combinaron los nombres de Villa Sarchí e Híbrido de Timor
para llamarle finalmente Sarchimor. Esta es una variedad que se ha utilizado
para mejorar la resistencia a la Roya.
Esta variedad se ha vuelto popular en muchas fincas del continente americano
debido a su excelente taza de productividad y su tolerancia a diferentes plagas
(INIAP, 1993).
Caturra rojo
La variedad Caturra rojo proviene de una mutación del Borbón, en el estado
Minas Gerais en Brasil. Es una planta de tronco grueso, porte bajo, y poco
ramificado. Posee entrenudos cortos en sus ramas y en el tallo, lo que lo hace
13
un alto productor. Posee hojas grandes, redondeadas, gruesas, de borde
ondulado, y de color verde oscuro. Es un arbusto de un aspecto compacto y de
mucho vigor. Las ramas laterales forman un ángulo cerrado con el tronco (INIAP,
1993).
Catuaí rojo
Es una variedad originaria de Brasil, resultado del cruzamiento de Caturra y
Mundo Novo. Es de porte pequeño e internudos cortos. Presenta gran
uniformidad genética y tiene la propiedad de producir mucho, y debido al
crecimiento secundario en las bandolas (palmilla), desde pequeño posee un
potencial de muy alta producción.
El Catuaì rojo es la variedad de más amplia distribución en Ecuador, así como
el Catuaì amarillo; ambos mantienen características y cualidades similares pero
el Catuaì rojo es de preferencia por parte de los productores (INIAP, 1993).
Pacas
Es un híbrido que se formó de forma natural de la variedad Bourbón, debe su
nombre al apellido de la familia en cuya propiedad se identificó la variedad.
El arbusto de Pacas es de porte bajo, sus ramas laterales forman un ángulo
de 45 grados. Posee follaje abundante, con hojas de color verde oscuro, así
como entrenudos cortos que le dan un aspecto compacto. El fruto de Pacas es
de color rojo y tamaño es mediano. Esta variedad desarrolla una gran tolerancia
a los problemas de sequía, viento y sol y se adapta mejor a altitudes de 500 a
1000 msnm (INIAP, 1993).
Acawa
La variedad Acawa, es originaria del cruce de Mundo Novo y Sarchimor, es
una semilla altamente productiva con muy buenas características organolépticas,
son resistentes a los periodos prolongados de sequía y a la enfermedad de la
Roya (INIAP, 1993).
Catucai
La variedad Catucai se originó a partir del cruce de Icatú y Catuaí en el Instituto
Brasileño del Café (IBC). Generalmente presenta resistencia moderada a la
Roya (Hemileia vastratix), es decir, ocurre poca caída de hojas y
14
consecuentemente menor daño en la planta (Ministerio de Agricultura y
Ganadería, 2014).
II.4 Composición química del café
El café contiene más de 2000 compuestos diferentes, como carbohidratos,
fibras, compuestos de nitrógeno, lípidos, minerales, ácidos y ésteres. Entre
estos, los ácidos clorogénicos (CQA) y la cafeína presentan importantes
beneficios para la salud.
La especie arábica posee características fenotípicas diferentes con respecto
a la especie robusta; estas características inciden en la diferencias o variaciones
en el contenido y/o proporción de los compuestos químicos de las especies,
como se detalla en la Tabla II. En donde se evidencia que en general presentan
un mismo orden de magnitudes, a excepción de ciertos compuestos tales como,
ácidos clorogénicos, sacarosa, cafeína y lípidos.
Tabla II. Composición química (Arábica y Robusta).
Componente químico Arábica (%) Robusta (%)
Polisacáridos 50,8 56,40
Sacarosa 8,00 4,00
Azucares reductores 0,10 0,40
Proteínas 9,80 9,50
Aminoácidos 0,50 0,80
Cafeína 1,20 2,20
Trigonelina 1,00 0,70
Lípidos 16,20 10,00
Ácidos alifáticos 1,10 1,20
Ácidos clorogénicos 6,90 10,40
Minerales 4,20 4,40
Compuestos
aromáticos
Trazas trazas
Fuente: Cenicafe.org
15
II.5 Ácidos clorogénicos
Los ácidos clorogénicos comprenden una de las familias más importantes de
compuestos polifenólicos presentes en especies vegetales. Son un complejo
grupo de moléculas que incluyen no solamente ésteres del ácido caféico, sino
también ésteres de otros cinamatos, así como los ácidos dicafeoilquinico y
cafeoilferuoilquínico.
II.5.1 Estructura
Los ácidos clorogénicos, deben su estructura a la esterificación entre varios
ácidos hidroxicinámicos con el ácido quínico. Debido a las diferentes posiciones,
variedades y posibilidades de condensación entre estos, el término ácidos
clorogénicos abarca un extenso grupo de ácidos denominados acorde a su
estructura, tal como son los ácidos cafeoilquínicos, ácidos dicafeoilquínicos y
ácidos ferúlicos.
Los ácidos clorogénicos pueden encontrarse principalmente como mono y di-
ésteres, estructuras conjugadas por la esterificación en las posiciones 1-, 3-, 4-,
5-del ácido quínico. Así tenemos, los ácidos cafeoilquínicos (CQA), ácidos
dicafeoilquínicos (diCQA), los ácidos feruloilquínicos (FQA) y los ácidos p-
coumaroilquínicos (p-CoQA) (Marin, G. 2008). En la Tabla III, se detalla la
clasificación de los principales ácidos clorogénicos y sus isómeros.
Tabla III. Isómeros de ácidos clorogénicos.
CLASIFICACIÓN ACORDE A LOS ISÓMEROS DE LOS ÁCIDOS
CLOROGÉNICOS
Ácidos
cafeoilquínicos (CQA)
Ácidos
dicafeoilquínicos (DiCQA)
Ácidos
feruloilquínicos (FQA)
ácido 3-cafeoilquínico
(3-CQA)
acido 4-cafeoilquínico
(4-CQA)
ácido 5-cafeoilquínico
(5-CQA)
ácido 3,4-dicafeoilquínico
(3,4-DiCQA)
ácido 3,5-dicafeoilquínico
(3,5-DiCQA)
ácido 4,5-dicafeoilquínico
(4,5-DiCQA)
ácido 3-feruloilquinico
(3-FQA)
ácido 4-feruloilquinico
(4-FQA)
ácido 5-feruloilquinico
(5-FQA)
Elaborado por: Autores, (2020).
16
Los principales ácidos clorogénicos presentes en el café son, ácido 3-
caffeoilquínico (3-CQA), ácido 4-cafeoilquínico (4-CQA), ácido 5-cafeoilquínico
(5-CQA), ácido 3,4dicaffeoilquínico (3,4-diCQA), ácido 3,5-dicaffeoylquinic (3,5-
diCQA) y ácido 4,5dicaffeoylquinic (4,5-diCQA). También se pueden encontrar,
trazas de ácido 3-feruloilquínico (3-FQA), ácido 4-feruloilquínico (4-FQA), Ácido
5-feruloilquínico (5-FQA), ácido 3-p-cumaroilquínico (3-p-CoQA), ácido 4-p-
cumaroilquínico (4-p-CoQA) y el ácido 5-p-coumaroylquinic (5-p-CoQA) (Liang,
N., & Kitts, D. 2015).
El ácido clorogénico más abundante en el café, es el ácido 5-cafeoilquínico
(5-CQA), el cual se encuentra en mayor concentración en granos de café verde.
Este compuesto ha sido objeto de múltiples estudios, los cuales le atribuyen
distintas propiedades farmacológicas.
A continuación, se muestran las estructuras de los diferentes isómeros de
ácidos clorogénicos, específicamente los ácidos cafeoilquínicos,
dicafeoilquínicos y feruoilquínicos.
ácido 3-cafeoilquínico.
17
ácido 4-cafeoilquínico.
ácido 5-cafeoilquínico.
Figura 2. Estructura química de los ácidos cafeoilquínicos 3-CQA, 4-CQA y 5-CQA.
Elaborado por: Autores, (2020).
Ácido 3,5-dicafeoilquínico.
18
Ácido 3,4-dicafeoilquínico.
Ácido 4,5-dicafeoilquínico.
Figura 3.Estructura química de los ácidos dicafeoilquinícos 3,4-diCQA, 3,5-
diCQA y 4,5-diCQA.
Elaborado por: Autores, (2020).
19
Ácido 3-feruoilquínico. Ácido 4-feruoilquínico.
Ácido 5-feruoilquínico.
Figura 4. Estructura química de los ácidos feruoilquínico 3-FQA, 4-FQA y 5- FQA.
Elaborado por: Autores, (2020).
II.5.2 Propiedades
En las especies vegetales, los ácidos clorogénicos generalmente se localizan
en las paredes celulares unidos a polisacáridos mediante esterificación (Aerts &
Baumann, 1994). Estos compuestos son biosintetizados a partir de la
fenilalanina, y tienen una marcada influencia en la plasticidad y textura de las
plantas, además de cumplir funciones de protección contra daños por herbívoros,
plagas, luz UV y daños físicos (Marin, G. 2008).
Por otra parte, debido a las múltiples propiedades farmacológicas que se les
adjudican a los ácidos clorogénicos y sus isómeros, múltiples investigaciones
describen a éstos ácidos como compuestos bioactivos que poseen propiedades
antimicrobianas, antiinflamatorias, entre otras (Dillenburg et al., 2017).
Estudios in vitro e in vivo relacionan los ácidos clorogénicos con la prevención
de enfermedades cardiovasculares (W. Jiang, Wei, & He, 2015), y de
enfermedades catalogadas como crónicas tales como diabetes (Bagdas et al.,
2015) y obesidad (Gugliucci and Bastos, 2009).
20
En la actualidad, son muchas las propiedades terapéuticas que se le atribuyen
a estos compuestos, entre las que destacan principalmente aquellas que
involucran efectos antioxidantes, captación de radicales libres, inhibición
tumoral, efectos hiperglucémicos, antihipertensivos, así como de protección y
tratamiento de patologías cardiovasculares. Algunos autores (Mu et al., 2017;
Jiang et al., 2000) indican que estos compuestos tienen un gran potencial para
ser utilizados en la investigación y desarrollo de fármacos antitumorales, debido
a que son considerados prooxidantes, es decir tienen un papel importante en la
inhibición del crecimiento de células tumorales.
Se ha reportado, que en los granos de café existen importantes cantidades de
compuestos fenólicos, y se considera que estos compuestos además de los
mencionados beneficios para la salud, también inciden directamente en la
calidad del café, debido a que juegan un papel importante en el sabor y aroma
del mismo (Brigitta et al., 2016).
Diversas investigaciones acerca de ácidos clorogénicos, se han enfocado,
sobre todo, en determinar la biodisponibilidad de estos compuestos, la forma de
absorción y el metabolismo de los mismos en los humanos, así como sus
potenciales efectos en la salud.
La composición química de los granos de café, presenta variaciones en
relación con factores tales como la especie, la madurez, tostación del grano la
fermentación, entre otros; por ejemplo en el caso del tostado del café, los ácidos
clorogénicos cambian su composición debido a que son inestables
térmicamente; debido a las altas temperaturas, parte de estos compuestos son
isomerizados, otros son transformados en quinolactonas, y una última parte son
degradados a compuestos de bajo peso molecular (Clifford, 2000).
Con respecto al estado de maduración del fruto de café, se ha reportado que
existen diferentes tendencias en el contenido de CQA según el grado de
maduración de los granos de café, se sugiere además un mayor contenido de
mono-CQA en granos verdes, así como un contenido de los di-CQA superior en
granos en estado maduro (Anthony et al., 1993; Clifford, M. 1985; Guyot et al;
1988). Estudios sugieren que, en el fruto del café, las transformaciones de estos
compuestos transcinánimos, puede deberse en parte a una hidrólisis producida
21
por la oxidación que sufren los alimentos, a medida que aumenta su madurez
(Clifford, 2000).
II.6 Análisis cromatográfico
II.6.1 Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación física en la cual, los
componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases de diferente
naturaleza como consecuencia de la variación que se establece al ser
arrastrados por una fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una fase
estacionaria, sólida o líquida. La adecuada elección de estas fases permite que
tales diferencias se traduzcan en una separación efectiva de los solutos.
La cromatografía se puede clasificar en dos métodos, la Cromatografía de
Gases (GC) y la Cromatografía de Líquidos (LC). La cromatografía de gases es
una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. Esta se lleva a cabo
siempre en columna, por lo tanto, esta técnica es utilizada comúnmente para la
separación de compuestos orgánicos e inorgánicos que sean térmicamente
estables y volátiles. Por otra parte, la cromatografía de líquidos es un método de
separación, que se da gracias a la afinidad del compuesto por una fase móvil o
por una fase estacionaria. A diferencia con la cromatografía de gases, la
cromatografía líquida no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica
de la muestra (Sgariglia, M et al., 2010).
La cromatografía líquida comprende hoy en día, dos importantes sistemas
HPLC Y UPLC. Las siglas HPLC obedecen a la abreviación en inglés de
Cromatografía de Líquidos de Alto Rendimiento. Considerando que es una
técnica que sirve para separar diferentes constituyentes de una mezcla, es la
técnica más utilizada para identificar, cuantificar y separar compuestos de una
muestra. En tanto, UPLC corresponde a Cromografía Liquida de Ultra
Rendimiento por sus siglas en inglés, esta es una variación del HPLC, pero el
fundamento cromatográfico es el mismo. La diferencia entre el HPLC y el UPLC,
es la separación más rápida del compuesto con una buena eficiencia y
resolución, debido al mejoramiento en la tecnología de columnas de menor
diámetro y partículas de fase estacionaria de menor tamaño que responden a
ultra presiones.
22
Es importante destacar que los sistemas de UPLC tienden a ampliar su
utilización cada vez más, ya que mediante ella se aprovechan al máximo los
principios cromatográficos, usando columnas cortas con un tamaño de partícula
de 2 μm, esto conlleva tiempos de análisis mucho más rápidos. Cabe mencionar,
que existen diversas diferencias entre las técnicas HPLC y UPLC como se detalla
en la Tabla IV.
En vista de las ventajas que presenta el sistema UPLC en comparación con
el HPLC, para el presente trabajo se optó por utilizar la cromatografía líquida de
ultra rendimiento (UPLC), tal y como se detalla en el capítulo de metodología.
Tabla IV. Diferencias entre HPLC y UPLC.
Cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC)
Cromatografía líquida de ultra
rendimiento (UPLC)
Presión inferior a 400 bar Presión hasta 1000 bar
Largos tiempos de análisis Cortos tiempos de análisis
Menos contrapresión, más vida de la
columna.
Más contrapresión disminuye la vida
de las columnas. Aumentar la
temperatura de la columna reduce el
problema de contrapresión en UPLC.
Diámetro interno 3 a 10 μm. Diámetro interno de 0,75 a 1,8 μm.
Detectores utilizan grandes caudales
y celdas de detección más grandes.
Detectores que usan caudales
pequeños y límites de detección
bajos.
Más consumo de solvente, menos
rendimiento de muestra.
Disminuye el consumo de solvente y
aumenta el rendimiento de la muestra.
Elaborado por: (Ahmadeen, 2012).
23
II.6.2 Detectores de Cromatografía Líquida
El detector es un componente principal en el cromatógrafo; existen varios tipos
de detectores que se utilizan dependiendo de la química del compuesto,
permitiendo ubicar en tiempo y espacio cada componente de la muestra
analizada. Los detectores en cromatografía de líquidos se dividen en 2 grupos.
Los detectores basados en una propiedad de la disolución que responden a una
característica de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante
dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por
otra parte, los detectores que se basan en algunas de las propiedades del soluto,
como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son
propias de la fase móvil (Álvarez, 2019).
Los tipos de detectores más empleados en la cromatografía liquida son:
• Detector UV
• Detector Índice de Refracción
• Detector de Fluorescencia
• Detectores electroquímicos
• Espectrómetro de masa
Espectrometría de masas
Es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que han sido
convertidas en iones, por lo tanto, no puede medir la masa molecular
directamente, pero mide la relación masa/carga de los iones formados de las
moléculas. Los espectrómetros de masas como se observa en la Figura 5
contienen siete partes. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el
tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades
del sistema (Mendieta, C et al., 2017).
La determinación de masas, se realiza mediante:
• Generación de moléculas (fragmentos de átomos) en fase gaseosa.
• Ionización de los mismos.
• Separación en función de su relación m/z.
• Detección de los iones.
24
Fuentes de iones
gaseosos
Analizador de masas
Transductor de iones
10-5 a 10-8 Torr Bomba de vacío
Introducción de muestra
Procesador de la señal
Ionización Selección de iones Detección de iones
Elaborado por: Autores, 2020.
Figura 5. Componentes del espectrómetro de masas
Como parte de la optimización de condiciones cromatográficas para la
determinación de ácidos clorogénicos, y en vista de las ventajas que ofrecen
ciertos detectores sobre otros, en el presente estudio se empleó un
espectrómetro de masas por su capacidad de analizar y proporcionar la identidad
molecular de un amplio rango de componentes, separándolos por su función
masa/carga, detectando su presencia y/o cuantificando su concentración, y
reduciendo el riesgo de coeluciones o interferencias de componentes
inesperados.
En el transcurso de los últimos años, para la determinación de ácidos
clorogénicos en especies vegetales, se han descrito nuevas metodologías que
procuran una óptima identificación y cuantificación de los ácidos clorogénicos,
por ello se han empleado diferentes sistemas cromatográficos, entre los que
destacan el sistema HPLC y el sistema UPLC, debido a la polaridad de los
compuestos a analizar; este último sistema representa una opción o un escenario
mejorado debido a las ventajas que ofrece en comparación con el HPLC, tal
como se ha descrito en la Tabla IV.
25
Las metodologías analizadas en la Tabla V, sugieren que para la extracción
de los ácidos clorogénicos y en base a la polaridad de los analitos de interés, se
utiliza una mezcla de solventes polares (agua, etanol, metanol, entre otros.) en
diferentes proporciones, permitiendo una extracción satisfactoria de los CQA.
26
II.7 Análisis de metodologías utilizadas en la determinación de ácidos clorogénicos en café, derivados y otras especies
vegetales.
Tabla V. Comparación de la metodología utilizada en diferentes estudios para la determinación de ácidos clorogénicos.
TEMAS ESPECIE COMPUESTO PREPARACION DE MUESTRA
ANALISIS INSTRUMENTAL
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Desarrollo de un método de análisis para la cuantificación de ácidos clorogénicos en café.
Café arábica 5-CQA Pesar 1 g de café tostado y molido en un balón aforado de 100 ml y agregar 50 ml de agua caliente. Colocar el balón en un baño maría (90-95 °C) por 60 min. Enfriar a temperatura ambiente y aforar con agua destilada. Filtrar y diluir el filtrado 10 veces.
Técnica de espectroscopía UV (longitud de onda 200- 400 nm)
Solis L, Herrera C., 2005.
27
Contenido de ácidos clorogénicos en granos de Coffea arabica y C. canephora, según el desarrollo del fruto.
Café arábica 3- CQA 4- CQA 5- CQA; 3,4-diCQA 3,5-diCQA 4,5-diCQA 4- FQA 5- FQA Ácido cafeico Ácidos orto y para cumáricos
Las muestras se trataron con nitrógeno líquido, se molieron y se tamizaron. Se tomó un gramo de café almendra molido en un matraz, se le adicionó una solución de 100 ml de metanol acuoso 70 % v/v y 0,5 % de sulfato de sodio. Se sometió a 125 rpm y maceración. El extracto obtenido se filtró.
Se usó un equipo HPLC, en fase reversa con la precolumna y la columna Symmetry C18. Se utilizaron dos solventes para la fase móvil, solvente A: 100 ml de agua y 1 ml
de H3PO4 (85 % alta pureza), y solvente B: acetonitrilo grado HPLC, eluídas en modo gradiente A/B. la detección se efectuó a 324 nm UV
Marín G., & Puerta Q., 2008.
Cuantificación de cafeína, trigonelina y ácido clorogénico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Café arábica 5-CQA Las muestras fueron molidas, se tomó un 1 g de cada muestra para ser extraído en un matraz de 250 ml conteniendo 100 ml de mezcla metanol-agua (70/30) y 0.5 % de Na2SO4. El matraz fue agitado durante 10 horas a una temperatura de 4 °C en oscuridad El extracto orgánico fue filtrado
para eliminar el polvo.
Se utilizó un equipo HPLC. Se utilizaron dos solventes para la fase móvil. El solvente A fue agua con 2 mM de ácido fosfórico, pH 2.7; el solvente B fue metanol al 5 % de 2 mM de ácido fosfórico, pH 3.9. Se utilizó el siguiente gradiente: mezcla A-B (75/25) La detección se hizo a una longitud de onda de 325 nm.
López Bóbeda, J. R. 2008.
28
Determinación de ácidos clorogénico y cafeico, cafeína, polifenoles totales y actividad antioxidante de tres variedades de café (Coffea arabice L.).
Café arabica 5-CQA Se pesó 1 g de muestra molida y se añadió 20 ml de agua a 100 °C, se llevó a baño maría (90- 95 °C) por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, luego se pasaron a unos microtubos y se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos a una temperatura de 4 °C.
Se realizó por HPLC. La fase móvil fluyó en un sistema de gradiente binario preparado con metanol (solvente A) y solución buffer (solvente B). La detección se realizó a una longitud de onda de 330 nm, usando un detector UV - VIS.
Félix Zamora, M. D. R. 2009.
29
Comparative profiles of Achyrocline alata (Kunth) DC. and A. satureioides (Lam.) DC., Asteraceae, applying HPLC-DAD- MS.
Achyrocline alata (Kunth) A. satureioides (Lam.) DC., Asteraceae,
5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA 4,5-diCQA
Se pesaron 100 mg de muestra, se extrajeron con 3 ml de MeOH: H2O (7:3) y 3 ml de cloruro de metileno con el objetivo de eliminar compuestos apolares. Luego, esta mezcla se sometió a ultrasonidos durante 20 minutos seguidos.
.
Se utilizó un equipo HPLC con un detector de matriz de diodos acoplado a un espectrómetro de masas. Para el HPLC una columna monolítica (Onyx ™ 150 x 4,6mm - C-18 - Phenomenex) y una pre-columna del mismo. La fase móvil consistió en una elución de gradiente lineal a un caudal de 3 ml / min con las siguientes mezclas: agua: ácido acético 1 % (v/v) (faseA) y acetonitrilo: ácido acético al 1% (fase B) como eluyentes. Los primeros 8 minutos se eluyeron con fase B con gradiente 5-12 %, siguiente 13-22 % (8- 25 min), 22-35 % (25- 29 min), 35 % (29-30 min), 35-100% (30-34 min).
Zampieron et al., 2009.
30
Comparison of nine common coffee extraction methods: instrumental and sensory analysis.
Café 3- CQA 4- CQA 5- CQA
Se pesó 2 g de café extracto, 500 µl Carrez I (solución acuosa de ZnSO₄ al 30 %),500 µl Carrez II (15 % de hexaciano de potasio acuoso) y 500 ml de metanol se diluyeron con agua destilada hasta 25 ml y filtrada con papel de filtro y un filtro de jeringa (0.45 µm)
Se utilizó un equipo HPLC equipado con una columna Agilent Eclipse Plus C18 y un diodo detector de matriz. La fase móvil A era agua (que contenía 0,1 % de ácido fórmico) y la fase móvil B fue acetonitrilo (0.1 % de ácido fórmico). El modo degradado es 1 min con 5 % de fase móvil B, luego 10 min con 25 % de B y finalmente 50 % de B por 20 min. El caudal fue 0,35 ml / min. El detector se ajustó a 325 nm para ácidos clorogénicos.
Gloess et al., 2013.
31
Identification and characterization of chlorogenic acids, chlorogenic acid glycosides and flavonoids from Lonicera henryi L. (Caprifoliaceae) leaves by LC–MS.
Hojas verdes de L. henryi
3-CQA 5-CQA 3,4-diCQA 3,5-diCQA
Se extrajeron hojas verdes frescas (5 g) con metanol acuoso, homogeneizado con una licuadora por 30 min y se filtró. Los solventes se eliminaron por evaporación al vacío y se reconstituyeron las muestras en metanol y fueron filtrados a través de un filtro de membrana para utilizarse directamente LC – MS.
Se utilizó un equipo HPLC, la separación se logró en una columna que contiene C18 amida 5 µm, con un diámetro interno de 5 mm 3 mm El solvente A: agua / ácido fórmico (1000: 0,05 v / v) y el disolvente B: Metanol. Los disolventes se administraron a un caudal total de 500 µl / min. El gradiente perfil fue de 10 % B a 70 % B linealmente en 70 minutos seguido por 10 min isocrático y un retorno al 10% de B a los 90 min. Se usó un detector DAD con una celda de flujo de tubo de luz (registrando a254,28 y 320 nm y escaneo de 200 a 600 nm).
Jaiswal, R, Müller, A, Karar, M, & Kuhnert. 2014.
32
Assessment of protected designation of origin for Colombian coffees based on HRMS- based metabolomics.
Café arábica 3- CQA 4- CQA 5- CQA
Las muestras pasaron a través de líquido nitrógeno y triturado en un molino ultra centrífugo a 14.000 RPM. Se extrajeron 3 g de muestra con 10 ml. de acetonitrilo / agua / ácido fórmico (80:20), (v / v), sonicar 15 min y centrifugado a 6000 RPM durante 10 min. El sobrenadante, se diluyeron 2 ml del sobrenadante con 6 ml de agua Mili-Q y la solución se usó para el análisis de cromatografía líquida de fase inversa (RP)
Se instaló un sistema UPLC (interconectado a una masa híbrida de alta resolución cuadrupolo- ToF, Espectrómetro (HRMS) utilizando un Interfaz Z-spray-ESI que funciona tanto en ionización positiva como negativa. Un concentrador MiVac Duo, se empleó para llevar muestras de extractos a sequedad al vacío.
Hoyos. D et al., 2017.
33
Chlorogenic acid isomer contents in 100 plants comercialized in Brazil.
Las plantas se compraron en seco.
4- CQA 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA
Se realizó pesando 40 g de muestra de cada proveedor, que luego fue homogeneizado y triturado en un molino de martillos con un tamiz de malla. Para extraer los ácidos clorogénicos, se pesaron 0,5 g de la muestra triturada y se añadieron 15 ml de solución de extracción (74 % de agua: 26 % de etanol), se calentó en un baño de agua a 60 °C bajo agitación a 240 rpm durante 22 minutos. Luego se midió el volumen a 100 ml, filtrado a través de una membrana PVDF.
Se utilizó un equipo UPLC, con un detector de matriz de diodos, una bomba ternaria y un horno de columna controlada a 30 ° C. Utilizamos una columna C18 con una longitud de 100 mm, un diámetro interno de 2,1 mm y un tamaño de partícula de 1,7 μm. La fase móvil fue agua acidificada con ácido fórmico (0.1%, pH 2.4) (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). La elución se realizó con un gradiente lineal. La velocidad de flujo fue de 0.3 ml/min, y el volumen de inyección fue de 10 μl.
Meinhart, A, 2017.
34
Analysis of chlorogenic acids isomers and caffeic acid in 89 herbal infusions (tea).
Se obtuvieron muestras de plantas de tres proveedores diferentes
4- CQA, 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA
La preparación de infusiones acuosas (té). Para este fin, 2 g de muestra se añadieron a 300 ml de agua hirviendo y se dejaron durante 16 minutos, la infusión se enfrió rápidamente a temperatura ambiente, se filtró a través de un tubo de 0,22 μm. filtro de membrana de PVDF y se inyecto al cromatógrafo.
El método de análisis se utilizó un equipo UPLC con detector de matriz de diodos, inyector automático, horno de columna a 30 ºC y una columna C18 de fase inversa de 100 mm de longitud, 2,1 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 1,7 μm. La fase móvil estaba compuesta de agua acidificada con ácido fórmico (0.1 %, pH 2.4; (eluyente A) y acetonitrilo (eluyente B) con un gradiente lineal. El caudal fue de 0,3 ml con un volumen de inyección de 10 μl.
Meinhart, A, 2018.
35
Componentes bioactivos de diferentes marcas de café comerciales de Panamá. Relación entre ácidos clorogénicos y cafeína.
Especie Coffea arábica; 8 son de variedad geisha, 1 variedad pacamara y 9 no se le identificó la variedad en los empaques comerciales
3-CQA 5-CQA
La muestra de café comercial (0,5 g si es café mezclado y 0,25 g si es café puro) fue mezclada con 25 ml de agua destilada y se colocó a calentar auna temperatura de 90 °C. Se dejó enfriar y luego se trasvasó la muestra a un tubo para centrífuga de 50 ml y se centrifugó por 15 minutos (10.000 rpm) decantó en un matraz volumétrico de 25 ml y se aforó con agua destilada.
Se utilizó un equipo HPLC, un detector de arreglo de diodos operando a 325 y 280 nm Con una columna ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical (4.6 x 150 mm, 5 µm). Las condiciones de separación establecidas fueron las siguientes: volumen de inyección de 20 µl, flujo de 0.4 ml/min. La fase móvil A (agua con 0.02 % ácido trifluoroacético), fase móvil B (metanol con 0.02 % de ácido trifluoroacético), temperatura de 25 °C y tiempo de corrida de 60 min
Vega, A., De León, J. A., Reyes, S. M., & Miranda, S. Y. 2018.
36
Contents of chlorogenic acids and caffeine in various coffee related products.
83 productos diferentes relacionados con el café
3- CQA 4- CQA 5- CQA, 3,4-diCQA 4,5-diCQA
Se midió por cada muestra 2.5 ml y se transfirió a tubo de centrífuga con 0,1 ml de cada una de las soluciones de Carrez I (10,6 g de trihidrato de ferrocianuro de potasio disuelto en 100 ml de agua destilada) y II (21,9 g de acetato de zinc dihidratado y 2 ml de ácido acético glacial diluido con agua destilada a 100 ml) fue añadido para aclarar la muestra. Se mezclaron con vórtice por 2 min. El volumen total se llevó a 50 ml mediante la adición de metanol al 10 %. La solución se centrifugó a 3500 rpm por 10 min. Se usó un filtro de jeringa de PTFE para filtrar el flotante.
Se realizó un equipo HPLC-DAD con un Accucore C18 (150 mm 4,6 mm, 2,6 um, Thermo Scientific, MA, EE. UU.). La fase móvil fue compuesta del eluyente A (tampón K2HPO4 20 mM que contiene fosfato al 0.1 % ácido) y eluyente B (acetonitrilo que contiene fosfato al 0.1 % ácido). El modo de gradiente se estableció inicialmente en una relación A / B de 97:3 de 0 a 5 min, luego el eluyente B a 75:25 de 25 a 35 min. La velocidad de flujo y el volumen de inyección fueron de 1 ml / min y 10 µl, respectivamente. Se utilizaron Longitudes de onda de 272 nm para el análisis de CGA.
Jong-Sup et al., 2019.
Elaborado por: Autores, (2020).
37
CAPÍTULO III: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
III.1 Tipo de investigación
El presente trabajo de investigación tiene como modalidad, la investigación
experimental, descriptiva y correlacional por cuanto está encaminado al estudio
de una (o más) variables, con el fin de describir el modo en que se produce un
acontecimiento particular.
III.2 Equipos, aparatos, materiales y reactivos
III.2.1 Reactivos
ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
• Acetonitrilo grado HPLC (MERCK)
• Ácido fórmico grado HPLC (MERCK)
• Agua destilada.
• Agua tipo 1
• Etanol grado absoluto
• Metanol grado HPLC (MERCK)
Estándares de ácidos clorogénicos*
• 3- CQA (Chem Impex).
• 4-CQA (Cayman Chemical)
• 5-CQA (Cayman Chemical)
• 3,4-diCQA (Cayman Chemical)
• 3,5-diCQA (Cayman Chemical)
• 4,5-diCQA (Carbo synth)
*Certificados con pureza ≥ 95%
III.2.2 Materiales
DETERMINACIÓN DE HUMEDAD ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
• Desecador
• Espátula
• Papel aluminio
• Pinzas metálicas
• Barras magnéticas
• Columna UPLC C18 (Waters) 2.1 x 100mm Acquity
• Filtros específicos 0.45 µm
• Jeringas
• Matraces aforados (10 ml)
• Matraces erlenmeyer (50 ml)
• Papel filtro
• Pipetas automáticas (1-100 ul)
• Viales de alta recuperación 1ml
38
III.2.3 Equipos y Aparatos
EQUIPOS APARATOS
• Balanza analítica (OHAUS)
• Cromatógrafo UPLC Waters con
Detector de masas (QDa) ACQUITY
• Agitar magnético (CORNING)
• Horno de secado (BIOBASE)
III.3 Muestras
Las muestras de café arábica y robusta fueron recolectadas en el Instituto
Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), Estación Experimental
Tropical Pichilingue, en el cantón Quevedo, provincia de Los Ríos. En esta
estación experimental el cultivo de café se realiza en parcelas, diferenciadas
entre sí de acuerdo a especies clasificadas.
La estación experimental maneja al menos 20 variedades de café, de las
cuales 7 variedades fueron tomadas como objeto de estudio y seleccionadas de
acuerdo a criterios de mayor comercialización y/o mayor producción del grano
de café. En la Tabla VI, se presenta la identificación mediante códigos, asignada
por el INIAP para las variedades recolectadas de acuerdo a cada especie.
Tabla VII. Identificación de especies, variedades y código de muestras que fueron objeto de estudio.
ESPECIE VARIEDAD ECOTIPO
Arábica Catuaì Rojo T16
Arábica Sarchimor T15
Arábica Pacas T17
Arábica Caturra Rojo T18
Arábica Acawa T5
Arábica Catucai T1
ESPECIE VARIEDAD ECOTIPO
Robusta Congolensis T18
Robusta Congolensis T3
Robusta Congolensis T4
Robusta Congolensis T5
Elaborado por: Autores, (2020).
39
III.4 Diseño experimental
En la Figura 6, se describe la metodología que se aplicó en el trabajo de
investigación realizado.
1. Recolección de muestras.
2. Determinación de humedad.
Separación por especie y
grado de maduración (verde,
pintón y maduro).
3. Preparación de soluciones
stock de cada estándar.
Estándar 3-CQA; 4-CQA; 5-
CQA; 3,4-diCQA; 3,5-diCQA y
4,5-diCQA con una
4. Preparación de curva de
calibración.
5. Selección de condiciones
cromatográficas.
concentración de 100 ppm.
Preparación de soluciones de
trabajo (mix) de estándares
en un rango de concentración
0,25-10,00 ppm.
6. Método de extracción de
ácidos clorogénicos en base a
Avalos & Mera (2018).
7. Preparación de muestras de análisis.
8. Análisis de datos.
Extracción hidroalcohólica por
maceración a partir de
muestra fresca.
Determinar mediante
UPLC/MS.
Figura 6. Flujograma de la metodología aplicada
Elaborado por: Autores, (2020).
9. Reporte de resultados.
40
III.4.1 Selección de muestras
Para la separación y caracterización de las muestras de café de las especies
arábica y robusta, se tomaron en cuenta los parámetros de forma, color y grado
de maduración; para estos dos últimos parámetros se tomó como referencia la
escala detallada en la Figura 7, en la cual se observa el estado de maduración
por color y sus días después de la antesis (DDA). Para este trabajo se
seleccionaron 3 estados de maduración: verde aproximadamente 182 DDA,
pintón aproximadamente 217 DDA y maduro aproximadamente 231 DDA.
Figura 7.Caracterización de los estados de maduración del café
Fuente: Carvajal, Aristizábal, Oliveros & Mejía, 2011.
41
En la Figura 8, se observa a modo de ejemplo, la aplicación de los criterios
para la selección de las muestras.
Cabe mencionar que los mismos parámetros fueron aplicados a todas las
muestras que fueron objeto de estudio.
Coffea arábica
Coffea canephora
Figura 8. Muestras seleccionadas de acuerdo al grado de maduración
Elaborado por: Autores, (2020).
42
III.4.2 Determinación de Humedad
Método gravimétrico
En cajas de aluminio se pesaron aproximadamente 1 g de cada una de las
muestras, estas fueron secadas en un horno a 105°C durante 3 horas. Cumplido
el tiempo, las muestras fueron sacadas y colocadas en un desecador para
enfriarlas a temperatura ambiente, y posteriormente ser pesadas. Después se
llevaron a calentar 1 hora adicional y fueron pesadas nuevamente. Este método
se repitió hasta tener un peso constante en las muestras. Los valores obtenidos
se evaluaron mediante la siguiente ecuación:
Dónde:
𝑯𝒈 =
𝑴𝟐 − 𝑴𝟏
𝑴𝟐 − 𝑴
𝑿𝟏𝟎𝟎
Hg: Perdida en peso por desecación (%)
M2: masa del envase con la muestra de ensayos (g)
M1: masa del envase con la muestra de ensayo desecado (g)
M: masa del envase vacía (g)
III.4.3 Análisis cromatográfico de los ácidos clorogénicos
Para el desarrollo del análisis cromatográfico se tomó como base las
condiciones analíticas planteadas por Avalos&Mera, (2018) en su trabajo de
investigación. Las condiciones instrumentales fueron optimizadas para la
detección de los compuestos objetos de estudio mediante espectrómetro de
masas.
Fundamento del método de maceración hidroalcohólica
Se realizó la extracción de ácidos clorogénicos mediante una maceración
hidroalcohólica, la cual se fundamenta en la capacidad del solvente de retener
los metabolitos, de manera que se obtenga un extracto líquido (con los principios
activos disueltos) y el material vegetal sobrante.
43
III.4.3.1 Preparación de soluciones stocks (3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-
diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA)
Se prepararon soluciones stock, con estándares certificados de ácidos
clorogénicos, 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA.
• Para las soluciones stock de 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA se pesaron 10 mg de
cada estándar. Luego, cada uno fue traspasado a un matraz de 100 ml, para
dilución y enrace con acetonitrilo:metanol (ACN:MetOH). Para cada dilución se
obtuvo una concentración de 100 ppm.
• Para las soluciones stock de 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA se
pesaron 5 mg de cada estándar. Luego, cada uno fue traspasado a un matraz
de 50 ml, para dilución y enrace con ACN:MetOH. Para cada dilución se obtuvo
una concentración de 100 ppm.
III.4.3.2 Preparación de la curva de calibración
De las soluciones stocks que se encuentran en una concentración de 100
ppm, se realizó un mix de todas, y se llevó a una concentración de 10 ppm, a
partir de esta solución se prepararon diferentes diluciones para obtener los
puntos para la curva de calibración de los ácidos clorogénicos (0,25; 1,00; 2,50;
5,00 y 10,00 ppm). En Tabla VII, se observan las distintas soluciones de trabajo
y las alícuotas que se tomaron para ser llevadas a enrace en un matraz
volumétrico de 10 ml.
Tabla VIII. Volúmenes de trabajo de la curva de calibración.
Concentración (ppm) Volumen (ml)
0,25 0,25
1,00 1,00
2,50 2,50
5,00 5,00
10,00 10,00
Elaborado por: Autores, (2020)
44
III.4.3.3 Condiciones cromatográficas
Se emplearon condiciones cromatográficas en las cuales se aplicó un sistema
cromatográfico de fase reversa, con una columna C18 de 2.1 mm de diámetro
interno y 100 mm de longitud, con un tamaño de partículas de 1.7 µm (marca
waters). En la fase móvil se utilizó agua con ácido fórmico al 0.1 % (Fase A) y
acetonitrilo grado HPLC (fase B). La elución se realizó en modo gradiente, como
se observa en la Tabla VIII, con un flujo de 0.350 ml/min. La detección se realizó
con un detector de espectrometría de masas con un cono de voltaje entre 5 a 35
voltios y un escáner de masas que va de 100 a 600 m/z. El volumen de inyección
de la muestra fue de 2 μl y la temperatura del horno de la columna fue de 25°C.
Tabla VIII. Elución en modo gradientes de las fases A y B.
Tiempo (min)
Fase A Fase B
0,00 90 10
2,27 85 15
2,49 75 25
5,67 75 25
5,89 90 10
9,00 90 10
Elaborado por: Autores, (2020).
III.4.3.4 Método de extracción del ácido clorogénico
Para la extracción del ácido clorogénico se trituraron y pesaron 2,5 g. de
granos de café, los cuales fueron llevado a un matraz de 50 ml, para su posterior
enrace con una solución hidroalcohólica etanol: agua (2:1). Se procedió a una
maceración de 6 horas mediante agitación magnética. Posteriormente, se filtró
(papel filtro) el extracto de los granos de café obtenido de la maceración. Este
método está basado en el procedimiento desarrollado por (Ávalos & Mera, 2018).
45
III.4.3.5 Preparación de muestras para el análisis cromatográfico
Por cada extracto de muestra se tomó una alícuota de 100 µl y fue llevada a
un vial de alta recuperación y se añadió 900 µl de metanol grado HPLC para
obtener una dilución 1:10 y posteriormente llevada al cromatógrafo para su
cuantificación.
46
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
IV.1 Determinación del porcentaje de humedad
Respecto a los ensayos realizados para la determinación de humedad en
granos de café, en la Tabla IX se presentan los valores obtenidos para todas las
muestras analizadas de acuerdo a la especie.
Tabla IX. Porcentaje de humedad de acuerdo a las especies de café.
Promedio Promedio DS
Promedio CV
Coffea arábica (%)
65,68 2,42 3,70%
Promedio
Coffea canephora (%)
Promedio DS
Promedio CV
65,94 2,73 4,18%
Elaborado por: Autores, (2020).
Los valores promedios de humedad obtenidos para el presente trabajo fueron
de 65,88 % y 65,94 % en granos de Coffea arábica y Coffea canephora
respectivamente. Estos resultados se asemejan a los obtenidos en el estudio
desarrollado por Ávalos y Mera, (2018) en el que se reporta una humedad de
67,20 % para granos de café frescos.
IV.2 Optimización de condiciones cromatográficas
En el presente trabajo se realizaron ensayos cromatográficos mediante un
sistema UPLC con un detector de espectrometría de masas, inyectando un mix
de solución de estándares de ácidos clorogénicos (3-CQA, 5-CQA, 4-CQA, 3,4-
diCQA, 3,5-diCQA y 4,5-diCQA). Cabe mencionar que las condiciones
cromatográficas, así como la preparación de las muestras, han sido optimizadas
a partir del estudio realizado por (Ávalos & Mera, 2018). En comparación con
dicha metodología, los ensayos de la presente investigación fueron realizados
con un volumen de inyección de 2 μl. Se empleó una columna C18 de 2.1 mm
de diámetro interno y 100 mm de longitud, con un tamaño de partículas de 1.7
μm (marca waters).
47
En la fase móvil se utilizó agua con ácido fórmico al 0.1% (Fase A) y
acetonitrilo grado HPLC (fase B); lo que permitió la acidificación de la fase móvil,
y a la vez favoreció la ionización de los compuestos. La elución se realizó en
modo gradiente entre las fases A/B como se detalla en la Tabla VIII. Con un flujo
de 0.350 ml/min, la temperatura del horno de columna fue de 25°C. Se tomó
como muestra la extracción hidroalcohólica realizada a partir de los solventes
etanol:agua (2:1).
En la Figura 9, se puede apreciar el orden de elución de los distintos isómeros
de ácidos clorogénicos, a partir de 6 estándares certificados (3-CQA, 5-CQA, 4-
CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA Y 4,5-diCQA), demostrando así que el orden de
elución obtenido es similar a los resultados reportados por Ávalos & Mera,
(2018).
Figura 9. Cromatograma obtenido mediante UPLC-MS de un mix de estándares a una concentración de 1 ppm.
Elaborado por: Autores, (2020).
48
En cuanto a la Figura 9, en la Tabla X se presentan los tiempos de retención
de los 6 isómeros de ácidos clorogénicos que se detectaron mediante el sistema
UPLC-MS, el cual por ser un equipo que posee características de mayor
rendimiento y mejor resolución, permitió la elución de los compuestos en un
menor tiempo.
Tabla X. Tiempo de retención de los isómeros de ácidos clorogénicos.
Compuestos Peso molecular
(g/mol)
Tiempo de retención (min)
3-CQA 354.31 1,488
5-CQA 354.31 2,240
4-CQA 354.31 2,477
3,4-diCQA 516.45 4,560
3,5-diCQA 516.45 4,692
4,5-diCQA 516.45 4,912
Elaborado por: Autores, (2020).
En el trabajo realizado se empleó un espectrómetro de masas con analizador
de triple cuadrupolo, debido a su alta sensibilidad y el uso de masas específicas
para la identificación de compuestos. Se utilizó un rango de masas entre 100 a
600 m/z con el propósito de abarcar el peso molecular de todos los compuestos,
y por ende de sus iones específicos (M++1) obtenidos por ionización electrospray
en modo positivo; este rango de masas (m/z) fue también propuesto por Cifford,
et al. (2005), quien menciona que los mono-CQA responden a una masa de 353
m/z y los di-CQA a una masa de 515 m/z.
IV.3 Curva de calibración
La elaboración de la curva de calibración (Tabla XI y Tabla XIII) con las
soluciones estándares de diferentes concentraciones permitió la cuantificación
de la concentración de los isómeros presentes en las muestras en base a la
ecuación de la recta. La curva demostró el comportamiento lineal de los
compuestos como se observa en la Tabla XII y Tabla XIV.
49
Figura 10. Curva de calibración de los estándares Mono-CQA.
Elaborado por: Autores, (2020).
Tabla XI. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y
áreas obtenidas de los compuestos MonoCQA.
Concentración (ppm)
Área
3-CQA
Área
5-CQA
Área
4-CQA
0,25 23743,41 13024,75 13708,30
1,00 133430,91 50592,18 77032,75
2,50 336619,42 262140,04 351507,99
5,00 647405,03 498605,37 580924,26
10,00 1229223,16 952630,02 1113613,09
Tabla XII. Linealidad de la curva de calibración de los MonoCQA.
Compuesto Ecuación de la recta R
3-CQA y = 1,24e+005 x + 1,32e+004 0,998226
5-CQA y = 9,86e+004 x – 7,57e+003 0,995538
4-CQA y = 1,14e+005 x + 2,00e+003 0,995195
mg
/Kg
50
Figura 11. Curva de calibración de los estándares di-CQA.
Elaborado por: Autores, (2020).
Tabla XIII. Niveles de concentración utilizados para la curva de calibración y
áreas obtenidas de los compuestos diCQA.
Concentración (ppm)
Área
3,4-diCQA
Área
3,5-diCQA
Área
4,5-diCQA
0,25 25607,09 11502,73 37641,59
1,00 134118,93 64857,91 177009,08
2,50 371624,09 192717,41 475100,38
5,00 808158,55 427668,40 993553,49
10,00 1736754,31 898414,03 1909573,99
Tabla XIV. Linealidad de la curva de calibración
Compuesto Ecuación de la recta
de los diCQA.
R
3,4-diCQA Y = 1,79e+005 X – 5,01e+004 0,998975
3,5-diCQA Y = 9,29e+004 X – 2,62e+004 0,999451
4,5-diCQA Y = 1,89e+005 X + 2,15e+003 0,998386
mg
/Kg
51
IV.4 Análisis del contenido de ácidos clorogénicos
En el presente estudio, se evaluó el contenido de ácidos clorogénicos en base
a la detección mediante UPLC-MS, de los mono-isómeros 3-CQA, 4-CQA, 5-
CQA y, los di-isómeros 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, en granos de café de
distintas variedades pertenecientes a las especies Coffea arábica y Coffea
canephora cultivadas en Ecuador, cada una en diferentes etapas de maduración.
De acuerdo con los análisis cromatográficos realizados en las distintas
muestras, en la Figura 12 se reportan a manera de gráfico los resultados
obtenidos, a partir de los cuales, en términos generales se puede constatar
importantes diferencias del contenido de ácidos clorogénicos entre la especie
arábica y robusta, además de variaciones en la concentración de estos
compuestos según el estado de maduración de las muestras analizadas.
Información bibliográfica consultada, señala que estudios realizados en
muestras de café de diferentes orígenes refieren un similar comportamiento de
aumento o disminución del contenido de estos compuestos fenólicos con
respecto al grado de maduración. En el caso de trabajos realizados con granos
de café arábica de Asia y Europa, se reporta un mayor contenido de mono-CQA
en el estado maduro, en comparación con el grano verde; mientras que en café
de Sudamérica, el grano de robusta presenta mayor contenido de CQA en estado
verde (Marín et al, 2008; Clifford et al, 1987; Ohiokpehai et al, 1982).
Si bien la mayoría de variedades analizadas presentan un comportamiento
semejante al reportado por la bibliografía, en algunas de ellas se puede constatar
que el contenido de CQA en sus diferentes estados de maduración difiere a lo
señalado por la literatura, razón por la cual se procede a realizar el análisis de
resultados, destacando algunos de los comportamientos más relevantes
reportados para este estudio. Para lo cual, en la Tabla XV se detallan los rangos
de concentraciones obtenidos para cada isómero de ácido clorogénico.
52
0,000
1000,000
2000,000
3000,000
4000,000
5000,000
6000,000
7000,000
8000,000
9000,000
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
3-C
QA
5-C
QA
4-C
QA
3,4
-diC
QA
3,5
-diC
QA
4,5
-diC
QA
T16 CatuaiRojo Arábica
T15 SarchimorArábica
T17 PacasArábica
T18 CaturraRojo Arábica
T5 AcawaArábica
T1 CatucaiArábica
T18Congolensis
Robusta
T3 CongolensisRobusta
T4 CongolensisRobusta
T5 CongolensisRobusta
Figura 12. Contenido de mono-CQA y di-CQA en especies de café cultivadas en Ecuador.
mg/K
g
53
Tabla XV. Rango de valores de concentración para cada isómero de ácido
clorogénico.
Especie arábica Especie robusta
Rango de concentración en mg/Kg
Rango de concentración en mg/Kg
Compuestos Verde Pintón Maduro Verde Pintón Maduro
3-CQA 11-91 53-421 48-164 43-191 56-263 73-456
5-CQA 197-1477 506-2919 565-1579 1489-7699 1452-5078 1165-4974
4-CQA 66-382 111-864 179-418 240 414 245-957
3,4-diCQA 90-133 99-195 109-164 137-359 187-314 172-359
3,5-diCQA 113-228 138-271 129-232 471-829 228-543 175-408
4,5-diCQA 22-63 43-123 59-160 89-246 109-230 130-301
Elaborado por: Autores, 2020.
IV.4.1 Análisis del contenido de Mono-isómeros de ácidos clorogénicos
en Coffea arábica y Coffea canephora.
De acuerdo con los análisis realizados, se confirmó la presencia de los
isómeros 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA en todas las variedades de café que fueron
objeto de estudio. Se describe en primer lugar el comportamiento y las
concentraciones registradas para 5-CQA, el cual es según numerosos estudios
el ácido clorogénico que presenta mayor concentración en comparación con
otros mono-isómeros y di-isómeros de ácidos clorogénicos en granos de café
arábica y robusta (Gonzales et al, 2018; Gotelan et al, 2007; Ramírez, 1988).
En variedades de la especie Coffea arábica, los valores obtenidos para la
concentración de 5-CQA, independientemente del estado de maduración, se
mantuvieron dentro de un rango de 350 - 1580 mg/Kg (Tabla XV), como se
muestra en la Figura 13, a excepción de la variedad Catuaí Rojo, que en estado
pintón presentó un incremento en la concentración de hasta 2918 mg/Kg.
Es importante resaltar, que para la variedad Catuaí Rojo, de la especie Coffea
arábica, se reporta un aumento en la concentración de todos los isómeros de
CQA, cuando esta se encuentra en estado pintón, tal como se observa en la
Figura 12. Cabe destacar, que para la especie arábica, estudios como el
realizado por Maldonado, C. (2017), señalan a esta variedad como una de las
54
que mejores características sensoriales presenta; esto puede tener relación con
la concentración elevada de CQA que contienen los granos cuando se
encuentran en estado pintón y maduro, ya que como mencionan Tfouni et al,
(2013) y Brigitta et al, (2016), estos compuestos fenólicos tienen una marcada
influencia en el aroma y la calidad sensorial del café.
Figura 13.Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie Coffea arábica.
Fuente: Autores, (2020).
Los resultados muestran la tendencia de mayor concentración en los granos
maduros de la especie Coffea arábica; lo cual guarda correspondencia con lo
referido por Marín, et al. (2003), cuando menciona que la acidez titulable de los
granos de Coffea arábica, es mayor cuando estos se encuentran en estado
maduro.
Por otra parte, en la Figura 14, se observa que para la especie Coffea
canephora el valor más alto registrado de 5-CQA fue 7690 mg/Kg, el cual se
encontró en granos verdes del ecotipo T5. Es necesario señalar, que esta
concentración es la máxima alcanzada por los isómeros de ácidos clorogénicos
en todas las variedades analizadas, incluyendo a las de la especie arábica. En
el caso de Coffea robusta, el 5-CQA constituye el compuesto clorogénico de
mayor concentración, tal como lo reportan la mayoría de autores.
5-CQA C. ARÁBICA
9000
8000
7000 VERDE
6000 PINTÓN
5000 MADURO
4000
3000
2000
1000
0
T16 Ecotipos T5 T1
mg/
Kg
55
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
T3 T5
mg/
Kg
5-CQA C. ROBUSTA
Figura 14. Contenido de ácido 5-cafeoilquínico, en especie
Coffea canephora
Fuentes: Autores, (2020).
Si bien múltiples investigaciones refieren que en el café robusta el mayor
contenido de 5-CQA se encuentra en los granos verdes (Somporn et al, 2011;
Marin et al, 2003; Naveed et al, 2018), en la Figura 14 se evidencia que el ecotipo
T3 de robusta presenta un ligero incremento en el grano en estado maduro,
presumiblemente debido a que este ecotipo de congolensis constituye un clon
biológicamente mejorado.
Cabe destacar además, que los isómeros 3-CQA y 4-CQA se encuentran
considerablemente en menor concentración; y entre ellos, el ácido 4-
cafeoilquínico es mayor en ambas especies registrándose un rango de
concentración de 240 - 957 mg/Kg (Tabla XV), principalmente en los granos en
estado pintón y maduro. Sin embargo, es de señalar que en ciertas variedades
la concentración mínima de 4-CQA no fue detectable, lo que puede deberse en
parte, a que los valores mínimos hayan estado por debajo de los límites de
detección planteados para este estudio. Por su parte, el mayor contenido del
ácido 3-CQA se encontró generalmente en los granos en estado maduro, con
valores inferiores a 456 mg/Kg en las variedades que fueron objeto de análisis.
56
Al respecto, Craig et al (2016), señala una mayor concentración del 4-CQA
en especies de café arábica, en comparación con el contenido de 3-CQA, lo cual
es similar a lo evidenciado en el presente estudio.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se considera que el análisis del
contenido de ácidos clorogénicos en diferentes especies de café de acuerdo con
su grado de maduración resulta de gran utilidad, al permitir determinar los
estadios óptimos del grano en los cuales puede existir un mejor aprovechamiento
de los CQA.
IV.4.2 Análisis del contenido de Di-isómeros de ácidos clorogénicos en
Coffea arábica y Coffea canephora.
Además de los mono-isómeros, se detectó la presencia de di-isómeros de
ácidos clorogénicos 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA en todas las muestras de
café seleccionadas. Estos compuestos presentaron variaciones en su contenido
de acuerdo al grado de maduración de las especies que fueron analizadas.
En la Figura 12, se puede observar que existe una notable diferencia en
cuanto al contenido de mono-isómeros y di-isómeros en muestras de café.
Para Coffea arábica, en todas sus variedades, los valores obtenidos de los
tres di-isómeros en los tres estados de maduración se mantuvieron en los rangos
de 22 -271mg/Kg (Tabla XV). Tal como señala Moon, et al. (2006), este valor
puede ser considerado bajo, si es comparado con los valores obtenidos para los
mono-CQA. La tendencia descrita en el apartado previo para la variedad Catuaí
Rojo también se presentó para este caso, ya que esta reportó los valores de
concentración más altos para el ácido 3,5-dicafeoilquínico y ácido 3,4-
dicafeoilquínico en el grano en estado pintón.
Los datos obtenidos sugieren que el 4,5-dicafeoilquínico fue el di-isómero con
menor concentración en las muestras estudiadas con una concentración inferior
a 160 mg/Kg.
La concentración de di-isómeros de ácidos clorogénicos en la especie Coffea
canephora demostró un comportamiento similar en cuanto al contenido de estos
ácidos, para los ecotipos analizados el rango de concentración se mantuvo entre
175 – 829 mg/Kg. El ácido 3,5-dicafeoilquínico fue el di-isómero en mayor
concentración, y su valor máximo fue reportado en el ecotipo T5 en granos verde.
57
A)
B)
Estudios como el realizado por Balyaya & Clifford, (1995), reconocen al 3,5-
diCQA como el isómero di-CQA de mayor concentración tanto en granos de
arábica como de robusta; sin embargo, otros autores como Farah et al, (2005);
Ky et al, (1997) mencionan al 4,5-diCQA como el más abundante de los di-
isómeros en muestras de café arábica y robusta.
En este caso, es de señalar que si bien el contenido de 3,5-diCQA fue mayor
en todas las muestras analizadas, entre especies, la concentración superior se
reporta en Coffea canephora. Estos resultados se asemejan a los obtenidos por
Marín, et al. (2008), en que se determina una mayor concentración de di-
isomeros para la variedad de café robusta.
A manera de ejemplo, en la Figura 15 y Figura 16 se presentan los
cromatogramas obtenidos a partir de la inyección de muestras de granos de café
robusta y arábica, en estado pintón.
Figura 15. Cromatograma de la muestra de café robusta: A) Elución de los monoCQA; B) Elución de los diCQA
58
B)
Figura 16. Cromatograma de la muestra de café arábica: A) Elución de los monoCQA; B) Elución de los diCQA
A)
59
CONCLUSIONES
De acuerdo al estudio realizado, y tal como se recoge en esta memoria, se
logró optimizar las condiciones analíticas para la identificación y cuantificación
cromatográfica de los isómeros de ácido clorogénico. Esta optimización permitió
el desarrollo del método mediante un sistema UPLC acoplada a un detector de
espectrometría de masas, consiguiendo la separación y elución de los
compuestos en un menor tiempo de análisis.
Se confirmó la presencia de isómeros de ácidos clorogénicos, en todas las
variedades de café, de las especies que fueron objeto de estudio; existiendo
diferencias en el contenido de los mono-isómeros y di-isómeros clorogénicos
entre la especie Coffea arábica y Coffea canephora. De las dos especies que
fueron analizadas, los granos de café robusta fueron los que presentaron una
mayor concentración de ácidos clorogénicos.
Los isómeros de ácidos clorogénicos presentan variaciones en su
concentración, de acuerdo al grado de maduración del grano de café. Así, las
variedades de café arábica estudiadas, presentaron la concentración máxima de
clorogénicos en estado pintón y maduro, mientras que las muestras de café
robusta, presentaron una mayor concentración de CQA en el grano verde.
60
RECOMENDACIONES
Se recomienda el desarrollo de estudios que permitan el levantamiento de
información acerca de los factores biológicos que pueden incidir en la variabilidad
del contenido de los isómeros de ácidos clorogénicos.
Así también se considera importante dar continuidad al estudio químico de las
especies de Coffea para la identificación de marcadores que caractericen el
origen de las especies, con la finalidad de poder conocer cómo afectan las
condiciones ambientales (temperatura, humedad, tipo de suelo) al contenido del
recurso vegetal, no solo por la concentración de estos compuestos fenólicos.
61
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66
GLOSARIO
Antesis: Es el periodo de florescencia o floración de las plantas con flores.
Bandolas: son ramas secundarias
Ecotipo: Es una misma especie que en ambientes diferentes tienen una
expresión fenotípica distinta por la interacción de los genes con el medio
ambiente.
Especie: En taxonomía, se denomina especie (del latín species) a la unidad
básica de clasificación biológica.
Internudos: Porción del tallo localizada entre dos nudos contiguos.
Isómeros: Son moléculas que tienen la misma fórmula molecular pero diferente
estructura.
Multicaule: Se aplica a la planta que tiene muchos tallos que nacen juntos.
Variedad: En botánica es una población con caracteres que la hacen reconocible
a pesar de que hibrida libremente con otras poblaciones de la misma especie.
67
ANEXOS.
Anexos A. Muestreo en junio de 2019. Estación Experimental
Tropical Pichilingue, en el cantón Quevedo, provincia de Los Ríos.
68
Anexos B. Muestras seleccionadas de Coffea arábica.
Coffea arábica
69
Anexos C. Muestras seleccionadas de Coffea canephora.
Coffea canephora
70
Anexos D. Resultados obtenidos en la determinación de humedad.
Muestra
Promedio
DS
CV (%)
T16V 62.32 1.32 2.11
T16P 65.76 1.13 1.72
T16M 65.75 2.14 3.26
T15V 63.90 2.69 4.21
T15P 68.29 1.34 1.96
T15M 66.92 2.47 3.69
T17V 64.56 6.17 9.56
T17P 66.80 3.04 4.55
T17M 63.56 2.27 3.57
T18V 63.05 0.37 0.58
T18P 64.10 0.64 0.99
T18M 65.78 3.31 5.03
T5V 69.22 0.69 0.99
T5P 65.95 2.30 3.48
T5M 67.54 0.62 0.92
T1V 64.68 6.46 9.99
T1P 68.07 1.02 1.50
T1M 66.02 5.55 8.41
RT18V 66.61 3.72 5.58
RT18P 64.21 4.41 6.86
RT18M 66.91 0.30 0.44
RT3V 64.76 5.43 8.39
RT3P 67.77 2.62 3.87
RT3M 64.54 4.30 6.66
RT4V 65.66 2.14 3.25
RT4P 66.27 1.92 2.90
RT4M 67.29 2.60 3.87
RT5V 68.81 0.73 1.06
RT5P 63.17 3.72 5.89
RT5M 65.33 0.93 1.42
71
Anexos E. Maceración hidroalcohólica de las muestras.
Anexos F. Extractos hidroalcohólicos en viales.
Anexos G. Cromatógrafo UPLC Waters (modelo ACQUITY) con detector de espectrometría de masas (QDa).