UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC)
Desbloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas resistentes a
los agentes inductores
Memoria presentada por María José Fernández de Nestosa para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas por la
Universidad Complutense de MadridMadrid, Septiembre de 2007
La presente tesis doctoral titulada “Desbloqueo de la diferenciación
en células eritroleucémicas resistentes a los agentes inductores”, ha sido
realizada por la licenciada María José Fernández de Nestosa, bajo la
dirección de la Dra. Dora B. Krimer Smunis, en el Departamento de Biología
Celular y del Desarrollo del Centro de Investigaciones Biológicas (C.I.B.) del
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C.).
Lic. María José Fernández de Nestosapara optar al título de Doctor
VºBº del Director de Tesis VºBº del Tutor de Tesis
Dra. Dora B. Krimer Smunis Dr. Álvaro Martínez del Pozo
Septiembre de 2007
A mi madre,
que le da el toque irreponsable a mi vida
Nothing shocks me.
I´m a scientist.
Harrison Ford (1942 - ), como Indiana Jones
Agradecimientos:
En primer lugar quiero agradecer a la Dra. Débora Krimer la oportunidad que
me ha brindado de realizar la tesis doctoral en su laboratorio. Especialmente quisiera
agradecerle la dedicación y el tiempo que me ha ofrecido a lo largo de estos años.
También quiero agradecer a los Doctores Pablo Hernández y Bernardo Schvartzman
por sus consejos y su interés por mi trabajo de tesis.
En segundo lugar quiero expresar mi más profunda gratitud a Marisa y a Pili
por todo lo que me han enseñado tanto dentro como fuera del laboratorio. Gracias por
los consejos y por darme ánimos en los momentos más difíciles.
Ahora llegó el momento de agradecer a todos los que han pasado por el laboratorio
a lo largo de estos siete años, gracias por todo lo que me han enseñado y porque han
hecho que me sienta como en casa, nunca necesité ni tan siquiera pedir ayuda porque
siempre estuvieron ahí para darme una mano. Sin ustedes jamás habría llegado hasta
aquí y dudo mucho que en la vida vuelva a encontrar gente tan especial. Nunca
voy a olvidar los momentos que pasamos juntos. Alberto, mi compañero de escritorio,
gracias por enseñarme lo que es la eficiencia en el laboratorio. Ali-Oli, aparte de ser
la madre de Inés, sos la madre de casi todos los que pasamos por el U3B. Gracias a
vos estoy en Madrid, empezaste a enseñarme en Paraguay y no te quedó otra que
continuar aquí, gracias por la paciencia y por seguir “aguantándome” fuera del labo.
Leti’O, mi amiga del alma, sé que estás ahí cuando más te necesito y lo más lindo es
que siempre vas a estar ahí, me siento tan a gusto contigo que hasta JC me empieza a
parecer un tipo agradable. Raúl, siempre dispuesto a ayudar y dar consejos, gracias
por tenerme tanta paciencia. Ana, gracias por introducirme al “mundo de las células
MEL”, admiro tu fuerza de voluntad y tu valentía. No quiero olvidarme de Agur, mi
compañera de traversuras y risas en el labo. Leo y Marta, para mí, mis dos hermanas
españolas, gracias por ser tan generosas conmigo, por el aguante y por estar siempre
pendientes de mí (no sé si merezco unas hernamas tan buenas). Lolailo, me caíste bien
desde el principio y no me equivoqué, gracias por tus consejos y tus ánimos, por ser
tan espontánea y por hacerme reír hasta en los momentos más difíciles. Eva, gracias
por ser tan dulce y por preocuparte siempre por mí. María, víctima de mi afán de
ocupación territorial, es un placer saber que te tengo ahí detrás, no sé cómo hacés pero
estás siempre animada y dispuesta a ayudar al que necesita, vas a llegar muy lejos
(siempre y cuando no te coma la boa). Y por último, y no por ello la menos importante,
Zaira, fuiste todo un descubrimiento, trajiste aires nuevos al laboratorio, sos una
especie de angel de la guarda, te quiero llevar conmigo a mi siguiente laboratorio.
Después de tantos años y tantas cosas compartidas también tengo que agradecer
a las familias de mis compañeros de laboratorio, especialmente a Ana María, por
todos sus cuidados y por el cariño que siempre ha brindado, y a Chuca, por sus consejos
y su “comida de madre”.
También quiero a agradecer muy especialmente a “los Patricios”. Carlos,
Donna y Yoli, ustedes son para mí parte de mi grupo de trabajo. Me han ayudado en
incontables ocasiones, sus consejos y su ayuda han sido decisivos para el desarrollo de
esta tesis.
No quisiera olvidarme de gente del CIB que ha contribuido directa o
indirectamente a esta tesis: Javi, Fran, Patricia, María Paz, “las Vidalitas”, Gaizka y
Gisella. Gracias por animarme y por darle una chsipa de alegría a mis días.
En estos años de trabajo he encontrado muchos amigos incondicionales que
han estado conmigo en los buenos y en los malos momentos: Nicolás, Sofía, Lourdes,
Guillermo, Sonia, Loles y Mike.
Por último, ellos, lo más lindo que tengo en la vida, mi familia. Mamá, sólo vos
y yo sabemos cuán increíble es que yo esté hoy acá, me enseñaste todo lo que no se
aprende en los libros ni en la escuela, contigo aprendí a tomarme muy pocas cosas en
serio, gracias por tu sabiduría de vida y porque sin vos hace mucho que me habría
ahogado en una vaso de agua. Papá, a lo mejor sea como dice Rodrigo que contigo
aprendimos lo que no hay que hacer en la vida, sos la persona más inteligente que
conozco y me enseñaste que me puedo caer y volver a levantar todas las veces que haga
falta. Carmen Cancio, la que nos va enterrar a todos, vos sí que no te hacés problema
por nada, sabés disfrutar de la vida como nadie, sos mi ídola. Herminia de Brix, un
ejemplo de entrega a los demás, lástima que hoy no puedas estar acá. Tío Luis, gracias
por darme ánimos y apoyarme en los primeros pasos de mi carrera y, por cierto,
gracias también por traerme al mundo. Mis tías (o mis otras mamás): Carmiña, Mecha
y Marica, ustedes me enseñaron el valor de una familia. Mis hermanos: Rodrigo,
Paloma y Waldo, gracias por haberme aguantado tanto, estoy orgullosa de tener unos
hermanos como ustedes. A mis primas, muy especialmente a Andrea, Belén y Ana,
gracias por hacerme sentir que siempre las tengo muy cerca. Podría continuar más
porque tengo la suerte de tener una familia enorme y muy unida, sólo quiero decir
gracias a todos.
Abreviaturas
Abreviaturas
5-Aza-2-dC 5-Aza-2’-deoxicitidinaBFU-E Unidades Formadoras de brotes eritroidesBSA Albúmina de suero bovinoB+ Benzidina positivoCBP CREB-Binding ProteincDNA DNA complementarioCFU-E Unidades formadoras de colonias eritroidescpm Cuentas por minutoC-terminal Carboxi-terminaldCTP Trifosfato de desoxicitosinaDEPC DietilpirocarbonatoDMEM Medio Eagle modificado por DulbecoDMSO DimetilsulfóxidoEDTA Ácido etilendiamino tetra-acéticoEPO EritropoyetinaEPO-R Receptor de eritropoyetinaF-MCF Friend Mink Cell Focus-formingF-MuLV Friend Murine Leukemia VirusGFP Green Fluorescent ProteinHDAC Deacetilasa de histonasHMBA N,N’-Hexametilen-bis-acetamidaKb KilobasesKDa KilodaltonMCF Mink Cell Focus-forming virusMEL Murine erythroleukemiaMEL-R Murine erythroleukemia resistenteN-terminal Amino-terminalPAGE Electroforesis en geles de poliacrilamidapb Pares de basesPBS Tampón fosfato alcalinoPCR Reacción en cadena de la polimerasaPVDF Polivinilideno difluoradorpm Revoluciones por minutoRT-PCR Retrotranscripción acoplada a PCRSDS Dodecil sulfato sódicoSFFV Spleen Focus Forming VirusSfpi-1 SFFV proviral integration site-1STAT Signal Transducers and Activators of TranscriptionSTK Stem-cell kinase receptorTBE Tris-Borato-EDTATBST Tampón tris salino Tween-20TPA 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato (PMA)
Índice
ÍNDICE
Abreviaturas
1.INTRODUCCIÓN
1.1. Hematopoyesis 21.2. Eritropoyesis 31.3. Las células MEL como modelo de diferenciación in vitro 4
1.3.1. Establecimiento de las células MEL 41.3.2. El complejo Friend 41.3.3. Etapas de la diferenciación inducida de las células MEL 8
1.4. Inducción de la diferenciación: respuesta al HMBA 101.5. Desbloqueo de la diferenciación de células MEL: cambios a nivel molecular 11
1.5.1. Parada de la proliferación celular 11 1.5.2. La red Myc-Max-Mad y la regulación de la proliferación y la diferenciación celular 13 1.5.2.1. La Familia Myc 13 1.5.2.2. La Familia Mad 15 1.5.3. Regulación transcripcional de la eritropoyesis 16
1.5.4. GATA-1, un gen maestro? 18 1.6. PU.1 y el bloqueo de la diferenciación eritroide 20 1.7. Fli-1 y el bloqueo de la diferenciación eritroide 24 1.8. Lecciones del SFFV y del modelo in vitro de células MEL 26
2.OBJETIVOS 29
Índice
3.MATERIALESYMÉTODOS
3.1. Cultivos celulares 313.1.1. Líneas celulares 313.1.2. Transfectantes derivados de MEL-R 313.1.3. Condiciones de cultivo 323.1.4. Ensayos de diferenciación 32 3.1.4.1. Tratamiento con HMBA 32 3.1.4.2. Tratamiento con otros agentes inductores de la diferenciación eritroide 33 3.1.4.3. Tratamiento con TPA 33 3.1.4.4. Tratamiento con 5-Aza-2-dC 33 3.1.4.5. Tratamiento con TSA 343.1.5. Ensayo de benzidina 343.1.6. Tinción con azul de toluidina y May Grünwald-Giemsa 343.1.7. Tratamiento con Fibronectina 353.1.8. Cinética de crecimiento y viabilidad celular 353.1.9. Distribución en las distintas fases del ciclo celular.Determinación del tamaño celular 36
3.2. Transfecciones con vectores de expresión 363.2.1. Construcción de plásmidos 363.2.2. Transfecciones estables con cationes lipídicos 383.2.3. Selección de transfectantes 38
3.3. Preparación y análisis de DNA 393.3.1. Extracción y purificación de DNA plasmídico 393.3.2. Extracción y purificación de DNA genómico 39
3.3.3. Transferencia, marcaje e hibridación del DNA separado en geles de agarosa (Southern) 40 3.3.3.1. Transferencia a soportes sólidos 40 3.3.3.2. Marcaje radiactivo de sondas 40 3.3.3.3. Hibridación de DNA 40 3.3.4. Secuenciación de DNA 413.4. Preparación y análisis de RNA 41
3.4.1. Extracción y purificación de RNA 413.4.2. Transferencia, marcaje e hibridación de RNA separado engeles de agarosa (Northern) 41
Índice
3.4.2.1. Electroforesis y transferencia a soportes sólidos 413.4.2.2. Hibridación de RNA 42
3.5. RT-PCR 423.6. Preparación y análisis de proteínas 44
3.6.1.Purificación de proteínas 44 3.6.1.1. Obtención de extractos proteicos totales 44 3.6.1.2. Obtención de extractos proteicos nucleares 44
3.6.2. Separación electrofóretica de proteínas e inmunodetección(Western) 45
3.6.3. Coinmunoprecipitación de proteínas endógenas 45 3.6.4. Inmunomarcaje 46
4.RESULTADOS
4.1. Caracterización de líneas celulares eritroleucémicas resistentesa la acción de agentes inductores de la diferenciación 49
4.1.1. Establecimiento de líneas celulares eritroleucémicas resistentes (MEL-R) a agentes inductores de la diferenciación 494.1.2. Expresión de marcadores de la diferenciación eritropoyética 544.1.3. Viabilidad celular, cinética de crecimiento y distribución de las distintas fases del ciclo celular de cultivos MEL-R 554.1.4. Incremento del tamaño celular: Es c-myc el responsable? 584.1.5. Potencial de MEL-R para la diferenciación hacia el linajemegacariocítico 614.1.6. Expresión de genes involucrados en la transición proliferacióndiferenciación 63
4.2. Causas de la inactivación de PU.1 en MEL-R 664.2.1. Expresión de la glicoproteína gp55 del SFFV en MEL-R 66
4.2.2. Análisis de la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 68 4.2.3. Cambios epigenéticos en el locus Sfpi-1/PU.1 69 4.2.4. Es PU.1 necesario para una respuesta al HMBA? 71 4.2.5. La inactivación de PU.1 en MEL-R no influye en la actividad de STAT1 73
4.3. Desbloqueo de la diferenciación hacia el linaje eritroide 74
Índice
4.3.1. Efecto de la expresión ectópica de Mad1 sobre la diferenciación de células MEL-R 75 4.3.2. Efecto de la inhibición de c-Myc sobre la diferenciación de células MEL-R 78 4.3.3. Diferenciación espontánea en respuesta a la sobreexpresión de GATA-1 80 4.4. Fli-1, antagonista de GATA-1 en ausencia de PU.1 83 4.4.1. Análisis de la expresión de genes que codifican para proteínas que regulan la actividad de GATA-1 84 4.4.2. PU.1, Fli-1 y el bloqueo de la actividad de GATA-1 86
5.DISCUSIÓN
5.1. Desbloqueo de la diferenciación de células eritroleucémicas 895.2. MEL-R y la resistencia al HMBA 905.3. Es PU.1 indispensable para el bloqueo de la diferenciación delas células Friend? 945.4. La inhibición de la proliferación celular y la reactivación de larespuesta al HMBA 975.5. GATA-1 y el desbloqueo de la diferenciación de las célulasMEL-R 995.6. Antagonismo entre GATA-1 y PU.1 1005.7. Causas del bloqueo de la actividad de GATA-1 en las células MEL-R 101
6.CONCLUSIONES 107
7.BIBLIOGRAFÍA 109
8.ANEXO 123
1. INTRODUCCIÓN
Introducción
�
Los procesos de proliferación, diferenciación y muerte celular se
encuentran altamente coordinados en las células de los diferentes tejidos
que componen un organismo vivo. En las células tumorales se produce un
desequilibrio entre estos procesos dando como resultado una proliferación
celular descontrolada, un bloqueo de la diferenciación y una pérdida de
regulación de la muerte celular. Tradicionalmente, la investigación en el
área del cáncer se ha centrado en la identificación y caracterización de
genes involucrados en la regulación de la proliferación y la muerte celular.
Sin embargo, sabemos poco acerca de los mecanismos implicados en el
bloqueo de la diferenciación celular (Tenen, 2003). En la mayoría de los
casos, el grado de diferenciación es inversamente proporcional al potencial
proliferativo de las células, existiendo siempre un acoplamiento severo
entre proliferación y diferenciación. Se ha demostrado, por otra parte, que
la pérdida del potencial de diferenciación no es irreversible y, de hecho,
se conocen agentes químicos capaces de inducir la diferenciación de
células tumorales transformadas. A lo largo de los años, se han establecido
diversas líneas celulares leucémicas capaces de reiniciar el programa de
diferenciación, que han facilitado el estudio del mecanismo de acción de
algunos agentes inductores de la diferenciación celular y, a su vez, han
permitido desarrollar nuevos tratamientos para el cáncer basados en lo
que se ha denominado terapiasdediferenciación.
Uno de los objetivos del laboratorio donde se ha desarrollado la
presente tesis es la identificación y caracterización de factores involucrados
en el desbloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas. Como
principal modelo de estudio se util izan líneas celulares eritroleucémicas, en
este caso células MEL (Murine Erythroleukemia cell l ine), que constituyen
uno de los sistemas mejor caracterizados de reprogramación de células
tumorales hacia una diferenciación y división celular terminal (Marks y
col., 1978). Partiendo del sistema de diferenciación in vitro de las células
MEL en el presente trabajo se describe el establecimiento y análisis de
líneas resistentes a la acción de agentes inductores de la diferenciación
celular con el fin de identificar factores involucrados en el bloqueo de la
diferenciación de las líneas tumorales.
Introducción
�
1.1.Hematopoyesis
La hematopoyesis es un proceso altamente controlado que da lugar a
la formación de las células necesarias para el funcionamiento del sistema
inmune, el transporte de oxígeno y la hemostasis. Todas las células del
sistema hematopoyético se originan a partir de un progenitor pluripotente
común, las células madres hematopoyéticas (HSCs) (Morrison y col.,
1995). Las HSCs tienen la doble capacidad de autorenovarse y diferenciarse
para dar lugar a los diferentes linajes del sistema hematopoyético. esto
tiene lugar a través de una división celular asimétrica, donde a partir de una
HSC se produce una célula madre y una célula progenitora multipotente
que está determinada a diferenciarse para producir los distintos tipos
celulares del sistema hematopoyético (Knoblich, 2001). Las HSCs pueden
dar lugar a un progenitor l infoide (CLP) o a un progenitor mieloide (CMP).
Los CLPs dan lugar a los linfocitos -B y -T, mientras que los CMPs están
determinados a diferenciarse para dar lugar a un progenitor común
para granulocitos y macrófagos (GMP) o un progenitor común para los
linajes megacariocítico y eritroide (MEP). Cuando han completado la
maduración, las células diferenciadas abandonan la médula ósea y migran
al torrente sanguíneo y a los distintos tejidos para ejecutar su función. Se
ha estimado que se producen aproximadamente 3 billones de células al día
para mantener la homeostasis del sistema hematopoyético. Este proceso
está regulado por una combinación de factores extrínsecos e intrínsecos.
Entre los factores externos se encuentran las citoquinas y las hormonas así
como las interacciones con las células del estroma y la matriz extracelular
(Ogawa, 1993). Entre los factores internos se encuentran los factores de
transcripción que activan o inhiben la expresión de genes involucrados en
el programa de diferenciación. La alta tasa de productividad junto con el
estricto control de los diferentes procesos de maduración hacen que este
sistema sea vulnerable a los cambios que afectan el delicado balance entre
proliferación, diferenciación y muerte celular. En las leucemias se produce
un bloqueo de la producción de células diferenciadas que provoca una
acumulación anormal de células indiferenciadas a expensas de células
maduras y funcionales.
Introducción
�
1.2.Eritropoyesis
La eritropoyesis es el proceso de formación de los eritrocitos que tanto
en humanos como en ratones ocurre en la médula ósea del esternón, de los
huesos largos y de las costil las. El eritrocito maduro deriva de un progenitor
multipotencial que, mediante procesos no bien conocidos, se diferencia
en células formadoras de colonias eritroides, las BFU-E (formadoras de
colonias eritroides grandes y abundantes) y las CFU-E (formadoras de
colonias pequeñas y escasas) y seguidamente a proeritroblastos, las
primeras células de la serie roja identificables morfológicamente. Los
proeritroblastos maduran a normoblastos basófilos y luego a normoblastos
policromáticos en los que se inicia la síntesis de hemoglobina. Al final
del proceso, los normoblastos policromáticos maduran a normoblastos
ortocromáticos que al perder el núcleo evolucionan a reticulocitos.
Finalmente, los reticulocitos desarrollan en 2-4 días los eritrocitos maduros
que permanecen en la sangre durante 120 días. Los diferentes estadios
morfológicos de la diferenciación eritroide se representan en la Figura
1. La principal citoquina implicada en la mitogénesis, diferenciación y
superviviencia de la células eritroides es la eritropoyetina(Epo), la cual
se sintetiza en el riñón en respuesta a la demanda de oxígeno y la cantidad
de eritrocitos en sangre. La diferenciación mediada por la Epo depende
de la expresión del receptor de eritropoyetina (Epo-R), que comienza
en el estadio más temprano, el BFU-E, aunque el receptor es necesario
recién a partir del estadio de CFU-E.
Figura1.Estadiosdeladiferenciacióneritropoyética.Representación de los diferentes estadios morfológicos de la eritropoyesis. Se muestran fotos de células teñidas con May Grünwald-Giemsa que corresponden a cada estadio.
Proeritroblasto Normoblastobasofílico
Normoblastopolicromatofílico
Normoblastoortocromatofílico
Reticulocito Eritrocito
Introducción
�
1.3. Las células MEL como modelo de diferenciación in vitro
1.3.1.EstablecimientodelascélulasMEL
En el año 1966, Charlotte Friend y colaboradores establecieron
cultivos celulares derivados de tumores subcutáneos del bazo de
ratones infectados con un complejo vírico denominado complejo Friend
(Friend y col., 1966). Cuando se cultivaron las células MEL en un medio
semisólido se observaron eritroblastos en diferenciación, lo que sugería
la potencialidad inherente de las células MEL hacia la diferenciación
ertitroblástica. Posteriormente, estos datos fueron confirmados por varios
laboratorios (Marks y col., 1978; Singer y col., 1974). En el año 1971,
intentando transfectar células MEL, Friend observó que el DMSO era
capaz de inducir la reactivación del programa de diferenciación eritroide
(Friend y col., 1971). Este hallazgo fue crucial y supuso el reconocimiento
del sistema de diferenciación in vitro de las células MEL, conocidas
también como célulasFriend en honor a su descubridora, como modelo
de estudio de la diferenciación. A partir de ese momento un gran número
de compuestos polares han sido util izados para inducir la diferenciación de
las células MEL, entre los que destacan el HMBA y el DMSO. Algunos de
estos agentes como el ácido retinoico, el HMBA y los ácidos hidroxámicos
han sido util izados en pacientes que padecían determinados tipos de
leucemias (Leszczyniecka y col., 2001; Marks, 2007).
1.3.2.ElcomplejoFriend
El complejo Friend está formado por el SFFV (Spleen Focus
Forming Virus), un virus deficiente en replicación, responsable de la
transformación de los progenitores eritroides (Wolff y Ruscetti, 1985) y por
el F-MuLV (Friend Murine Leukemia Virus), que contiene los componentes
necesarios para la replicación del SFFV (Spiro y col., 1988). Existen
dos variantes del SFFV, el SFFV-P y el SFFV-A, que causan policitemia
y anemia, respectivamente (Mirand y col., 1968; Sassa y col., 1968;
Steinheider y col., 1979). A diferencia de otros retrovirus oncogénicos,
Introducción
�
el SFFV no expresa una forma mutante y constitutivamente activa de un
gen del huésped. En su lugar, codifica para una glicoproteína, la gp55,
que es capaz de unirse al receptor de eritropoyetina (Epo-R) y activarlo
de manera constitutiva (Figura 2). La gp55, codificada por el gen env,
es una glicoproteína quimérica con una región N-terminal homóloga a la
glicoproteína codificada por el gen env del MCF (Mink Cell Focus-Forming
Virus) y una región C-terminal que deriva de la glicoproteína gp70 del F-
MuLV (Lee y col., 2003). La dimerización del receptordeeritropoyetina(Epo-R) debido a la interacción con un homodímero de la gp55 produce
una activación de las mismas rutas de señalización activadas por Epo,
incluyendo la vías Jak2-Stat, Ras/Raf-1/MAPK y PI3K (Muszynski y col.,
1998; Nishigaki y col., 2000; Ohashi y col., 1995). Sin embargo, a diferencia
de la respuesta a Epo, la infección con el SFFV provoca una activación
constitutiva de estas vías de señalización.
Epo
Epo-R
gp55
Epo-R
a bEritroblasto normal Eritroblasto infectado conel complejo Friend
Membranaplasmática
Figura2.Activacióndel receptordeeritropoyetina (Epo-R)mediadapor lagp55.a) Activación del receptor de eritropoyetina (Epo-R) mediada por Epo en proeritroblastos normales. b) Activación constitutiva del receptor de eritropoyetina (Epo-R) por la glicoproteína gp55 del SFFV en proeritroblastos infectados con el complejo Friend.
El proceso de transformación de los progenitores eritroides infectados
con el complejoFriend puede dividirse en dos fases que se resumen en
el esquema de la Figura 3 (Ben-David y Bernstein, 1991). La etapa inicial,
conocida como fase pre-leucémica, se produce en las primeras horas
después de la infección y se caracteriza por la activación constitutiva del
Introducción
�
receptordeeritropoyetina(Epo-R) debido a la unión de la glicoproteína
gp55 del SFFV (Figura 2) (Ben-David y col., 1990; D’Andrea, 1992). Se
ha demostrado que la gp55 necesita interaccionar además con una forma
truncada del receptor STK (stem-cell kinase receptor) conocida como sf-STK (Zhang y col., 2006). Como consecuencia de la activación del receptor
de eritropoyetina (Epo-R) y de sf-STK se produce una expansión policlonal
de progenitores eritroides, principalmente de los compartimentos BFU-E y
CFU-E, lo que resulta en una esplenomegalia e hiperplasia masiva (Liao y
Axelrad, 1975; Peschle y col., 1980).
Friend Complex(SFFV + F-MuLV)
Charlotte Friend
FasePreleucémica
-proliferación policlonal de progenitores eritroides-hiperplasia masiva, esplenomegalia-proceso rápido (horas) en gran # de células-activación constitutiva del EpoR
Infección Eritroblastos
FaseLeucémica
-expansión clonal de células malignas (bazo, MO, hígado)-proceso lento (semanas), evento raro-capacidad de renovación ilimitada (inmortalización)-ausencia de respuesta a Epo-PU.1 y/o Fli-1 ; p53
Integración Locus PU.1
Figura 3. Transformación de progenitores eritroides infectados con el complejo Friend.Representación esquemática de las fases de la eritroleucemia inducida por el SFFV en ratones infectados con el complejo Friend formado por el Spleen Focus Forming Virus (SFFV) y el Friend Murine Leukemia Virus (F-MuLV).
Introducción
�
La segunda etapa, conocida como fase leucémica, es un proceso
lento, ocurre al cabo de 6-12 semanas después de la infección y se
caracteriza por la aparición de algunos clones de células malignas
que, a diferencia de los progenitores de la primera fase, han perdido la
capacidad de diferenciarse en respuesta a Epo (Tambourin y col., 1979).
Se ha demostrado que en el 95% de las eritroleucemias inducidas por el
complejo vírico Friend el SFFV se integra en el locus del gen Sfpi-1/PU.1
(SFFV Proviral Integration site-1/ Purine Rich) que codifica para la proteína
PU.1, un factor de transcripción específico del sistema hematopoyético
perteneciente a la familia Ets. El provirus se integra generalmente en
dirección contraria a la orientación transcripcional del gen, dentro de una
región de alrededor de 3 kb que se localiza a 10 kb corriente arriba del
primer exón del gen (Figura 4), y provoca la activación constitutiva del gen
Sfpi-1/PU.1 a través del LTR del SFFV (Moreau-Gachelin, 1994; Moreau-
Gachelin y col., 1990; Moreau-Gachelin y col., 1988; Paul y col., 1989).
SFFV-P
PU.1
1 2 3 4 5
Locus Sfpi-1
LTR LTR
gp55
Figura4.IntegracióndelSFFVenellocusSfpi-1delosprogenitoreseritroidesinfectadosconelcomplejoFriend. Esquema del locus Sfpi-1 donde se indican las probables zonas de integración del SFFV (flechas rojas), los exones que codifican para la proteína PU.1 (1-5, segmentos en verde) y la orientación transcripcional del SFFV y el gen Sfpi-1/PU.1 (flechas en morado). Se muestra la estructura del provirus indicando la glicoproteína gp55 codificada por el gen env y los LTRs (Long Terminal Repeat).
En la mayoría de los clones leucémicos se produce además una
inactivación de p53, ya sea debido a un silenciamiento del gen que codifica
para el supresor tumoral o a la expresión de una proteína mutada (Mowat y
col., 1985; Munroe y col., 1990). Las líneas celulares eritroleucémicas
presentan características propias del estadio de proeritoblasto y pueden
proliferar indefinidamente in vitro. Sin embargo, bajo la acción de agentes
Introducción
�
inductores de la diferenciación, las células MEL son capaces de diferenciarse
hasta un estadio equivalente al de normoblasto ortocromatofíl ico en
ausencia de Epo (Harrison, 1976; Housman y col., 1980; Marks y Rifkind,
1978; Rifkind, 1986; Tsiftsoglou y Robinson, 1985).
Se ha sugerido en diversas ocasiones que la activación de PU.1,
provocada por la integración del SFFV, es responsable del bloqueo de
la diferenciación de las células de la eritroleucemia murina (Rekhtman y
col., 1999; Zhang y col., 2000). Esta hipótesis se ha visto reforzada
al comprobar que la sobreexpresión de PU.1 induce eritroleucemia en
ratones transgénicos (Barnache y col., 1998). El análisis de los ratones
util izados en ese estudio reveló que PU.1 está directamente implicado en
el bloqueo de la diferenciación de los proeritroblastos. Todos estos datos
sugieren que PU.1 se comporta como un oncogen cuando se expresa en
progenitores eritroides.
La infección sólo con el F-MuLV, el retrovirus que complementa al
SFFV en el complejo Friend, también es capaz de inducir una eritroleucemia
caracterizada por anemia y esplenomegalia, aunque en estos casos la
infección sólo es efectiva en ratones recién nacidos (Silver y Kozak, 1986).
La transformación de ratones adultos requiere un tratamiento previo con
fenil-hidrazina (PHZ) para estimular la producción de progenitores eritroides
(Lee y col., 2003). A diferencia de la transformación inducida por el SFFV,
la eritroleucemia inducida por el F-MuLV no presenta una fase policlonal
pre-leucémica debido a que el F-MuLV carece de la glicoproteína gp55. Sí
en cambio en el 75% de los casos se produce una activación constitutiva
de otro miembro de la familia Ets, Fli-1 (Friend Leukemia Insertion site-
1), como consecuencia de la integración del F-MuLV en el locus del gen
fl i-1 (Ben-David y col., 1990).
1.3.3.EtapasdeladiferenciacióninducidadelascélulasMEL
Cuando se trata un cultivo de células MEL con un agente inductor
se producen una serie de cambios complejos que conducen a las células
de manera irreversible a la diferenciación hacia el l inaje eritroide (Figura
5). Inicialmente, las células tratadas con HMBA atraviesan un período
de latencia (12-24 horas) denominado pre-determinación, caracterizado
Introducción
�
por una represión general de la expresión génica en donde, eliminando
el agente inductor, las células vuelven al estado inicial. A partir de ese
momento, comienza la etapa de determinación en donde la células
adquieren la capacidad irreversible de cesar la división celular y expresar
las características del estado diferenciado, aún en ausencia del agente
inductor. A partir de las 72 horas de tratamiento se observa un porcentaje
importante de células que expresan marcadores eritropoyéticos y a las 96
horas más del 90% de las células están ya diferenciadas (Marks y Rifkind,
1978; Reuben y col., 1976; Vanegas y col., 2003).
Horas en HMBA
12-24 24-48 >72
Pre-determinaciónMEL Determinación Diferenciación
Figura 5. Representación esquemática del programa de diferenciación de las células MELinducido por el HMBA. Cuando las células MEL son tratadas con el agente inductor (HMBA) se produce la reactivación del programa de diferenciación eritroide. Durante las primeras 12-24 horas de tratamiento, las células se encuentran en una etapa reversible denominada pre-determinación. A las 24 horas de tratamiento, las células entran en el período de determinación, iniciándose la expresión de las características del estadio diferenciado. Finalmente a las 72 horas con HMBA, la mayoría de las células expresan marcadores propios del linaje eritroide, como las α y β globinas y se observan cambios morfológicos similares a los propios de eritrocitos adultos.
La inducción de la diferenciación de las células MEL va acompañada
de numerosos cambios que también son característicos de la diferenciación
de células eritroides en su entorno natural. Entre ellos se destacan
la inducción de la expresión de marcadores eritroides como las α y β
globinas, los grupos heme, la anhidrina carbónica, los receptores de la
espectrina y de la transferina, entre otros. Se producen también cambios
morfológicos característicos de la diferenciación eritroide: la relación de
volumen entre citoplasma y núcleo decrece, la cromatina se condensa y el
tamaño celular disminuye. Aunque en condiciones normales de cultivo las
células no llegan a perder el núcleo, se ha demostrado que en presencia
de fibronectina las células pueden eliminar el núcleo alcanzando la etapa
de reticulocitos (Patel y Lodish, 1987). La diferenciación culmina con el
Introducción
�0
cese de la división celular y la pérdida de la tumorigenicidad (Tsiftsoglou y
col., 2003a; Tsiftsoglou y col., 2003b; Volloch y Housman, 1982).
1.4.Induccióndeladiferenciación:respuestaalHMBA
Aunque han transcurrido casi cuarenta años desde el descubrimiento
del sistema de diferenciación inducida de las células Friend, se desconoce
aún el mecanismo util izado por los distintos agentes inductores para
reactivar el programa de diferenciación. Una de las hipótesis más
aceptadas es que los inductores activan diversas rutas de señalización
de forma similar a como ocurre en la eritropoyesis. Se sabe que en la
hematopoyesis normal los distintos factores de crecimiento interactúan
con los receptores de membranas de las células precursoras activando
rutas de señalización que provocan una activación/represión selectiva de
genes que controlan a su vez los procesos de proliferación, diferenciación
y apoptosis celular (Nicola, 1989).
La diferenciación de las células MEL en respuesta al tratamiento
con HMBA se desarrolla en varias fases. En etapas tempranas, previas
a la determinación celular, el inductor provoca una serie de cambios
metabólicos entre los que se incluyen una alteración en la permeabilidad
de la membrana plasmática debida a cambios en el flujo de Ca2+, Na+ y K+
(Bridges y col., 1981; Mager y Bernstein, 1978), un aumento transitorio
en la concentración celular de AMP cíclico, una rápida translocación de
PKC σ y ε del citosol a la membrana y la aparición de una forma de
PKC independiente de los niveles de Ca2+ y fosfolípidos (Gazitt y col.,
1978; Marks y col., 1996). Dado que no se han indentificado receptores
celulares para el HMBA u otros compuestos polares, se ha postulado que
los cambios en el potencial de la membrana plasmática serían la vía para
activar directa o indirectamente una o más rutas de señalización (Marks y
col., 1994).
Dentro de las vías de señalización específicas se ha observado que el
HMBA, al igual que Epo, activa la fosforilación de JAK2 y STAT5 en células
Friend. La activación de la fosforilación se inicia a partir de las 12 horas
de tratamiento con el inductor, alcanzando un pico a las 24 horas, que se
Introducción
��
mantiene hasta las 96 horas. De manera consistente, se comprobó que la
estimulación con HMBA resulta en un incremento de la unión de STAT5 al
DNA (Rane y Reddy, 2002). Otros agentes inductores de la diferenciación,
como el DMSO y el butirato de sodio, también activan la ruta JAK2/STAT5.
Se ha demostrado que la sobreexpresión de un dominante negativo de
STAT5 en la línea celular T3CI-2, transformada con el complejo Friend,
inhibe la capacidad del HMBA para inducir diferenciación (Yamashita y
col., 1998). Este dato podría estar en conjunción con un trabajo reciente
de Nishigaki y colaboradores en donde se demuestra que el bloqueo de
otro miembro de la familia STAT, STAT1, juega un papel clave en el proceso
de transformación de las células MEL (Nishigaki y col., 2006).
Finalmente, las vías de señalización activadas por el HMBA se
transmiten al núcleo donde se traducen en cambios selectivos de la
expresión génica. Existen evidencias de que otros eventos mediados
por el inductor, como las roturas de simple cadena o los cambios en la
configuración de la estructura de la cromatina, también podrían estar
involucrados en la inducción de la diferenciación de las células MEL
(Fibach y col., 1977; Friend y col., 1966; Friend y col., 1971).
1.5.DesbloqueodeladiferenciaciónencélulasMEL:cambiosanivelmolecular
1.5.1.Paradadelaproliferacióncelular
Durante el desarrollo normal de las células hematopoyéticas existe
una correlación inversa entre la proliferación y la diferenciación celular. El
hecho de que en la mayoría de los células tumorales se observe una pérdida
de los controles de la proliferación junto con la aparición de características
propias de células inmaduras refuerza la existencia de una relación inversa
entre ambos procesos. Después del tratamiento con un agente inductor de
la diferenciación como el HMBA, las células MEL se dividen un máximo de
4-5 veces más, dejan de proliferar y se acumulan en la fase G1/G0 del ciclo
celular (Rifkind y col., 1996). Aparentemente, el inicio de la diferenciación
se produce en la interfase G1/S del ciclo celular (Friedman y Schildkraut,
Introducción
��
1977; Geller y col., 1978). Estudios previos han puesto de manifiesto
que la diferenciación de las células MEL va acompañada de cambios
específicos en la expresión de factores relacionados con la regulación
de la proliferación celular. Entre los reguladores positivos de la división
celular, cuyos niveles de expresión descienden en respuesta a los agentes
inductores, se encuentran los protoncogenes c-myc, c-myb y c-jun y las
ciclinas dependientes de quinasas (cdks), específicamente cdk6 y cdk4
(Dmitrovsky y col., 1986; Lachman y Skoultchi, 1984; Matushansky y
col., 2000; Smith y Prochownik, 1992). Paralelamente, se produce una
activación de la expresión de genes que codifican para inhibidores del
ciclo celular como p21CIP1/WAF1, p27 KIP y mad1 (Hsieh y col., 2000; Larsson y
col., 1994).
Un hecho mayormente aceptado es que el cese de la división celular y
la activación de marcadores específicos del estadio diferenciado constituyen
dos eventos independientes (Tsiftsoglou y col., 2003a). Sin embargo, en
ocasiones se ha puesto de manifiesto la existencia de reguladores duales
capaces de controlar tanto la proliferación como la diferenciación celular
(Zhu y Skoultchi, 2001). En este sentido, Rylski y colaboradores demostraron
que el factor de transcripción GATA-1 es capaz de inhibir la proliferación
celular reprimiendo directamente la expresión de c-myc (Rylski y col., 2003).
Esto no impide que lleve a cabo su tradicional función como activador de
la expresión de genes marcadores de estadios diferenciados. Asimismo,
se ha comprobado que algunos factores involucrados en la regulación del
ciclo celular como p21CIP1/WAF1, p27KIP y Mad1 son capaces de inducir un
desbloqueo de la diferenciación celular (Cultraro y col., 1997a; Ohnuma y
col., 1999). Matushansky y colaboradores demostraron que la expresión de
Cdk6, cuyos niveles disminuyen rápidamente en respuesta a los agentes
inductores de la diferenciación, es capaz de inhibir la diferenciación de
células eritroleucémicas (Matushansky y col., 2003). Todos estos resultados
apoyan la teoría sobre la existencia de una coordinación exquisita entre
proliferación y diferenciación celular.
Introducción
��
1.5.2.La redMyc-Max-Mady la regulaciónde laproliferaciónyladiferenciacióncelular
1.5.2.1.LaFamiliaMyc
Las proteínas de la familia Myc, en particular c-, N- y L-Myc, están
involucradas en proliferación, crecimento celular, apoptosis e inhibición
de la diferenciación celular. Estas oncoproteínas están activadas directa o
indirectamente en más del 70% de los tumores humanos y su sobreexpresión
provoca la desregulación de la proliferación celular (Grandori y col.,
2000; Nilsson y Cleveland, 2003). En condiciones fisiológicas normales
la expresión de c-myc es necesaria y suficiente para la entrada en la
fase S del ciclo celular (Evan y Littlewood, 1993; Hanson y col., 1994).
Experimentos en una línea celular de fibroblastos heterocigota para el
protoncogen demostraron que la reducción en los niveles de c-Myc resulta
en un retraso de la transición entre las fases G0 y S del ciclo celular.
Este retraso estaría relacionado principalmente con la reducción en los
niveles de ciclina E (Evan y Littlewood, 1993; Hanson y col., 1994). Por el
contrario, la inhibición de c-myc induce la salida del ciclo celular y acelera
la diferenciación de células MEL tratadas con DMSO (Prochownik y col.,
1988).
c-Myc, así como el resto de los miembros de la familia, pertenecen
al grupo de factores de transcripción que contienen un dominio bHLHZip
(basic/helix-loop-helix/leucine zipper) (Figura 6). El dominio característico
bHLHZip se localiza en el extremo C-terminal y consta de una región básica
de unión a DNA y una región HLHZip que regula la interacción proteína-
proteína. En el extremo N-terminal se encuentra el dominio transactivador
(TAD) con dos regiones altamente conservadas, la caja Myc 1 (MB1) y
la caja Myc 2 (MB2), importantes en la regulación de la estabilidad de c-
Myc. La proteína contiene además una señal de localización nuclear (NLS)
y un dominio central acídico que contiene varios sitios de fosforilación
que podrían ser importantes para la función de c-Myc. En condiciones
normales, la vida media de la proteína es muy corta, ya que es rápidamente
ubiquitinizada y degradada por la maquinaria del proteasoma. En las
células tumorales, sin embargo, el mecanismo de control que regula la
Introducción
��
expresión de c-Myc se ha perdido, lo que resulta en niveles anormalmente
altos de la proteína (Alitalo y col., 1987; Henriksson y Luscher, 1996).
En ese sentido, se ha observado una alta frecuencia de mutaciones
puntuales en la secuencia codificante de c-myc en linfomas de Burkitt,
l infomas asociados a la infección con HIV y en cierto tipo de leucemias
linfoblásticas agudas (Marcu y col., 1992). Estas mutaciones se localizan
principalmente en el dominio de transactivación dentro o cerca de la cajaMyc1(MB1), siendo el residuo treonina 58 el más frecuentemente mutado
(Hoang y col., 1995). Como resultado se produce una inhibición de la
fosforilación de la treonina 58, involucrada en la degradación de c-Myc,
dando lugar a una estabilización anormal de la proteína (Bahram y col.,
2000).
Figura6.DominiosestructuralesdelosmiembrosdelasfamiliasMyc,Mad,Max,MntyMga.Esquema representativo de las estructuras de los factores bHLHZip de la red Myc-Max-Mad. a) Los miembros de la familia Myc (c-Myc, N-Myc y L-Myc). MB1 (Myc Box 1) y MB2 (Myc Box 2) son dominios altamente conservados, presentes en todos los miembros de la familia, indispensables para las funciones activadoras y/o represoras de la transcripción. TAD, dominio transactivador de c-Myc. b) Las isoformas de Max. Max puede formar homodímeros o heterodímeros con todos los miembros de la red a través del dominio bHLHZip, la región básica (b) confiere especificidad de unión a la secuencia CACGTG. c) Los miembros de la familia Mad. SID, dominio tipo alfa hélice N-terminal que les permite interaccionar con los co-represores transcripcionales Sin3a y Sin3b. NLS, señal de localización nuclear.
Para poder actuar, ya sea como activador o represor transcripcional,
c-Myc requiere la formación de un heterodímero con la proteína Max, a
través de sus respectivos dominios bHLHZip (Blackwood y Eisenman,
1991; Blackwood y col., 1992). El complejo Myc:Max se une a las cajas E
a
b
MB1 TAD MB2 NLS b HLHZipc-Myc
1 439
MB1 MB2 b HLHZipN-Myc
1 462
MB1 MB2 b HLHZipL-Myc
1 364
MaxL MaxSNLSb HLHZip
1601
NLSb HLHZip
1511
NLSSID b HLHZipMad1 Mxi1
1 220
Mad3 Mad4SID b HLHZip
1 206
SID b HLHZip
1 209SID b HLHZip
1 220
c
Introducción
��
(CACGTG o CATGTG), elementos reguladores presentes en los promotores
de muchos genes, y activa la transcripción de los genes diana de c-Myc
para estimular la proliferación, la transformación o la apoptosis celular. La
actividad transactivadora de c-Myc depende además del reclutamiento de
proteínas capaces de modificar la estructura de la cromatina como SWI/
SNF y la acetiltransferasa de histonas TRAPP/hGCN5 (Figura 7) (Dugan y
col., 2002; McMahon y col., 1998; Park y col., 2001; Park y col., 2002).
c-Myc
GCN5
TRRAP
Max
CACGTG
HDAC-1,-2
MaxMad1
Ski/SnoSin3A/B
N-COR
CACGTG
Figura7.RegulacióntranscripcionalatravésdelaredMyc-Max-Mad.Los complejos Myc:Max se unen a los elementos CACGTG (también CACATG) y activan la transcripción de sus genes diana. La capacidad de Myc para activar la transcripción depende de la asociación con su co-activador TRAPP el cual, a su vez, recluta a la acetiltransferasa de histonas GCN5. Por el contrario, los complejos Mad:Max se unen a los mismos sitios reprimiendo la expresión de los genes diana. Esta actividad represora de la transcripción está mediada por los co-represores Sin3a y Sin3b, N-CoR y Ski y las desacetilasas de histonas 1 y 2 (HDAC-1,-2).
1.5.2.2.LafamiliaMad
La proteína Max es capaz de formar homodímeros y heterodímeros
con otros factores de transcripción que contienen el dominio bHLHZip
(Figura 6). Entre estos factores se encuentran, además de c-Myc, los
miembros de la familia Mad (Mad1, Mxi, Mad3 y Mad4) y las proteínas Mnt
(Rox) y Mga. Se ha demostrado que estas 6 proteínas funcionan como
antagonistas de Myc, capaces de competir con c-Myc por la dimerización
con Max para luego unirse a las cajas E y reprimir la expresión de los
genes diana de c-Myc (revisado en (Baudino y Cleveland, 2001)). De
entre estos antagonistas de c-Myc, sólo Mad1 y Mad4 son característicos
de estadios diferenciados (Queva y col., 1998). Las familias Mad,MaxyMyc constituyen, por lo tanto, una red compleja que regula la transición
proliferación/no proliferación o proliferación/diferenciación (Figura 7).
Introducción
��
Debido a que Max se expresa de manera constitutiva, son los niveles
de Myc y Mad los que determinan que se produzca una activación o una
inhibición de la proliferación celular, respectivamente. Se ha demostrado
que el represor transcripcional Mad1 es capaz de antagonizar la capacidad
de c-Myc para inducir proliferación y apoptosis (Gehring y col., 2000). La
represión transcripcional mediada por Mad1 se produce a través de un
complejo que incluye los co-represores N-Co-R y Sin3a/Sin3b, las HDACs
1 y 2 y las proteínas Ski y Sno (Figura 7) (Baudino y Cleveland, 2001).
Estudios previos de Cultraro y colaboradores demostraron que la expresión
ectópica de Mad1 es capaz de inducir un desbloqueo de la diferenciación
de células MEL (Cultraro y col., 1997a).
1.5.3.Regulacióntranscripcionaldelaeritropoyesis
Los factores de transcripción específicos del sistema hematopoyético
juegan un papel clave en la diferenciación de los precursores celulares
hacia los distintos linajes (revisado en (Cantor y Orkin, 2001; Cantor y
Orkin, 2002; Shivdasani y Orkin, 1996)). El hecho de que muchos de estos
factores se vean implicados en translocaciones cromosómicas o inserciones
virales que pueden ser causa de distintos tipos de leucemias en humanos
y ratones resalta la importancia de estos reguladores en la diferenciación
hematopoyética. Tal es el caso de las proteínas de fusión AML1/ETO y PML/
RARα que se producen como resultado de translocasiones cromosómicas
en un 25% de los casos de leucemia aguda mieloide (AML) y en un 95%
de los casos de leucemia aguda promielocítica (APL), respectivamente.
En el caso de inserciones virales en ratones, los casos mejor estudiados
son PU.1 y Fli-1, dos factores de transcripción de la familia Ets que
se activan como consecuencia de la integración del SFFV y el F-MuLV,
respectivamente.
Durante la última década los esfuerzos por comprender las bases
moleculares de la diferenciación eritropoyética llevaron a la identificación
de varios factores de transcripción linaje-específicos que incluyen a GATA-1, SCL/TAL-1, EKLF, LMO2/RBTN2, p45 NF-E2, entre otros (revisado en
(Cantor y Orkin, 2002; Perry y Soreq, 2002)). El factor de transcripciónGATA-1 es un mediador central de la diferenciacióneritroide que regula,
Introducción
��
además de su propia transcripción, la expresión de las globinas, las enzimas
involucradas en la síntesis de los grupos heme (ALAS-S, ALA-D, PBG-
D), el inhibidor de apoptosis Bcl-XL, GATA-2, NF-E2 y algunos factores
involucrados en proliferación celular, como c-Myc, c-Myb y Cdk6 (Ferreira y
col., 2005). Los experimentos realizados con células madres demostraron
que aquéllas que no expresan GATA-1 son capaces de diferenciarse y dar
lugar a los diferentes tejidos de ratón a excepción de los eritrocitos (Pevny y
col., 1991). Un análisis más detallado util izando ratones quiméricos reveló
que los precursores eritroides que carecen de GATA-1 son incapaces
de diferenciarse más allá del estadio de proeritroblasto (Pevny y col.,
1995). Estos resultados corroboran que GATA-1 es indispensable para la
diferenciación de los progenitores eritroides.
La proteína GATA-1 se une a la secuencia (T/A)GATA(A/G) presente
en la mayoría de los promotores y potenciadores de genes relacionados
con el estadio eritropoyético y megacariocítico diferenciado (Orkin, 1992;
Weiss y Orkin, 1995). GATA-1 contiene dos dominios “dedos de zinc”
localizados en los extremos N- y C- terminal. Ambos son necesarios para
la unión al DNA y para la interacción con otras proteínas como FOG-1,
LMO2, EKLF, CBP y PU.1 (Figura 8) (Ferreira y col., 2005).
FOG-1
COOHNH2
CBP/p300EKLFSP-1Fli-1
PU.1
Figura8.Interaccionesproteína-proteínadeGATA-1.Representación esquemática de la proteína GATA-1. Los sitios de unión de las proteínas que interaccionan con GATA-1 están indicados mediante barras negras horizontales. Los segmentos negros representan los dos dominios “dedos de zinc”.
Se conoce además que la acetiltransferasa CBP (CREB-Binding
Protein) acetila a GATA-1 en dos motivos ricos en lisinas altamente
conservados, y que se localizan cerca de los dominios “dedo de zinc“
(Boyes y col., 1998; Hung y col., 1999). Se ha comprobado que la
acetilación de GATA-1 resulta en un incremento en la eficiencia de unión
Introducción
��
a DNA (Boyes y col., 1998). La mutación de estos sitios o el bloqueo de
la acetilación, como ocurre con la proteína de fusión AML1/ETO, inhiben
la capacidad de GATA-1 para inducir la diferenciación de progenitores
eritroides, lo cual demuestra que la acetilación de GATA-1 juega un papel
clave en la regulación de su función transactivadora (Boyes y col., 1998;
Choi y col., 2006). Se ha comprobado que la sobreexpresión de GATA-1
induce la diferenciación espontánea de las células MEL y que la acetilación
de GATA-1, a través de CBP, juega un papel fundamental en este proceso
(Choe y col., 2003; Hong y col., 2002).
1.5.4.GATA-1,ungenmaestro?
A finales de los años 80 el grupo de Harold Weintraub, del Fred
Hutchinson Cancer Research Center (USA), aisló e identificó Myo-D
como un gen regulador de la diferenciación del músculo esquelético. Más
allá de regular la activación de genes del l inaje muscular, el grupo de
Weintraub demostró que Myo-D era capaz de convertir en mioblastos a
células de diferentes orígenes como fibroblastos, condriocitos, neuronas
y otras (Weintraub y col., 1991). Esto originó la idea de la existencia de
“genes maestros” de los distintos linajes celulares, capaces de orquestar
el programa de diferenciación. La hipótesis de la existencia de un “gen
maestro” que regula la determinación hacia un linaje específico no ha
encontrado una correspondencia plena en el l inaje eritroide. Uno de
los factores que se asemeja a Myo-D en su modo de acción es GATA-1, capaz de activar genes marcadores de eritropoyesis y provocar la
determinación hacia el l inaje eritroide. Sin embargo, GATA-1 también se
expresa en células pertenecientes a otros linajes, como por ejemplo en
células de Sertoli, megacariocitos y eosinófilos, y juega un papel crítico
en la diferenciación de los dos últimos (Ito y col., 1993; Martin y col.,
1990; Romeo y col., 1990; Vyas y col., 1999; Yomogida y col., 1994; Yu y
col., 2002; Zon y col., 1993). Por último, su capacidad para disparar la
determinación en otros sistemas es reducida (Layon y col., 2007). Todos
estos datos hacen dudar de la capacidad de GATA-1 para actuar como
“gen maestro” del l inaje eritroide. Actualmente, se reconoce que la
eritropoyesis es un proceso altamente complejo regulado, más que por
Introducción
��
un único “gen maestro”, por una combinación de factores de transcripción
que forman complejos multiproteicos cuya composición varía a lo largo
de la diferenciación (Perry y Soreq, 2002). En esta complicada red de
interacciones la activación directa de factores específicos se completa con
efectos inhibidores de factores característicos de programas alternativos
(i.e. interacción GATA-1/PU.1), distintas combinaciones de un número
variable de factores (i.e. GATA-1/FOG, GATA-1/Gfi-1B, etc), la variabilidad
cuantitativa de los distintos factores, etc (Rodriguez y col., 2005; Starck y
col., 2003; Stopka y col., 2005).
En los últimos años se ha añadido un nivel de complicación
adicional condicionado por la acumulación de datos relativos a la
estructura de la cromatina. Los cambios epigenéticos juegan un papel
clave en el silenciamiento y la activación de genes específicos durante
la diferenciación celular. Estudios previos han puesto de manifiesto
la implicación de los cambios en la metilación del DNA en el proceso
de transformación oncogénica (Jones y Laird, 1999). La metilación del
DNA de supresores tumorales es un mecanismo frecuente de represión
transcripcional en procesos oncogénicos (Baylin y col., 2000; Bird y Wolffe,
1999; Jones y Laird, 1999). Tal es el caso de la proteína de fusión PML/
RARα que bloquea la diferenciación mieloide mediante el reclutamiento
de complejos represores que contienen DNA metiltransferasas y HDACs
que inhiben la transcripción de genes diana del ácido retinoico (Di Croce y
col., 2002). El tratamiento con drogas antitumorales resulta, en muchos
casos, en una demetilacióndelDNA con la consecuente reactivación de
la expresión génica y la reversión del fenotipo transformado (Di Croce y
col., 2002). Asimismo, el uso de inhibidores de las DNA metiltransferasas
y las HDACs provoca una aceleración de la reactivación del programa de
diferenciación. En este sentido, se ha demostrado que el tratamiento con
5-aza-2’-deoxicitidina(5-Aza-2’-dC) potencia la diferenciación de células
mieloides leucémicas inducida por el ácido retinoico y los análogos de
la vitamina D3, incluso en el caso de células que no responden a estos
inductores (Lotem y Sachs, 2002).
Introducción
�0
1.6.PU.1yelbloqueodeladiferenciacióneritroide
PU.1 es un miembro de la familiaEts de factores de transcripción,
que se caracteriza por el alto grado de homología de todos los miembros
en el dominio de unión a DNA, localizado generalmente en el extremo C-
terminal (Figura 9). Este dominio, conocido como dominioEts, reconoce
una secuencia consenso rica en purinas, GGA(A/T), con secuencias
adyacentes que dan la especificidad a cada miembro. Dos componentes de
la familia, PU.1 y Fli-1, inicialmente identificados como transactivadores,
están involucrados en hematopoyesis.
El gen Sfpi-1/PU.1 que codifica para el factor de transcripción PU.1
fue inicialmente identificado como el gen diana del SFFV, causante de la
Dominio Ets
Ets IDIDAD HLHETS (Ets-1, Ets-2)
Ets ADAD HLHFli-1 (Erg,FEV)
EtsADPU.1 (SPI, Spi-1, Spi-B, etc)
EtsHLHGAPBß binding
ELG (GABPα)
Ets IDIDADPEA3 (ER71, ER81, ERM, etc)
EtsADELF (Elf-1, Elf-2, ESX/ESE-1, etc)
Ets ID IDAD (RD)SRF binding
TCF (Elk-1, Sap-1, Net, Netb)
ERF (PE1/METS, PE2/ERF) Ets RD
HLH RDmSin3A N-CoR binding
TEL (TEL/ETV6, TEL2) Ets
Figura9.EstructuradelosmiembrosdelafamiliadeproteínasEts.Dominio ets de unión a DNA (Ets); región hélice-loop-hélice (HLH), dominio activador (AD), dominio auto-inhibidor (ID) y dominio represor (RD).
Introducción
��
transformación de precursores eritroides (Moreau-Gachelin y col., 1988).
Experimentos posteriores demostraron que la infección de cultivos de
médula ósea de ratón con un retrovirus que expresa PU.1 provoca un
bloqueo de la diferenciación eritroide (Schuetze y col., 1993). Asimismo,
la sobreexpresión de PU.1 induce eritroleucemia en ratones transgénicos,
confirmando que PU.1 es un regulador negativo de la eritropoyesis
(Barnache y col., 1998). Sin embargo, PU.1 es un factor indispensable
para la diferenciación granulocítica y monocítica del sistema mieloide,
así como para la diferenciación de los linfocitos B (Figura 10) (Kastner y
Chan, 2007). Esto coloca a PU.1 como un factor que actúa positivamente
en el caso del sistema mieloide o linfoide, pero que se comporta como un
oncogen cuando se activa en el sistema eritroide.
HSCs
PU.1
PU.1
PU.1
CLPs
CMPs
MEPs
GMPs
Pro-T Pre-T
Pro-B Pre-B
Linfocito T
Linfocito B
Monocito
Granulocito
Eritrocito
Megacariocito
Figura10.PapeldePU.1en la regulaciónde ladiferenciaciónhematopoyética.Las células madres hematopoyéticas (HSCs) dan lugar a dos tipos de progenitores. Los progenitores linfoides (CLPs) se diferencian para producir linfocitos T y B, mientras que los progenitores mieloides (CMPs) dan lugar a progenitores comunes para granulocitos y eosinófilos (GMPs) y progenitores comunes para megacariocitos y eritrocitos (MEPs). La activación de PU.1 es esencial para la transición de HSC a CLP y la diferenciación de los GMPs hacia monocitos. Por el contrario, la inactivación de PU.1 es esencial para la transición de CMPs a MEPs.
Introducción
��
Se ha sugerido que el mecanismo principal mediante el cual PU.1
inhibe la eritropoyesis se basa en su capacidad para antagonizar con
GATA-1 (Figura 11) (Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). Existen
evidencias que indican que ambos factores de transcripción interaccionan
a través de sus respectivos dominios de unión a DNA (Liew y col., 2006;
Zhang y col., 1999).
Figura11.AntagonismoGATA-1/PU.1duranteladiferenciaciónhematopoyética.Ambas proteínas inhiben sus respectivas funciones mediante mecanismos distintos. GATA-1 inhibe la función de PU.1 bloqueando la interacción con su co-factor c-Jun mientras que PU.1 se une a GATA-1 y recluta un complejo represor que inhibe la transcripción de sus genes diana. Ambos factores de transcripción autorregulan su expresión (líneas punteadas). Según este modelo, GATA-1 y PU.1 inhiben la capacidad del otro para activar la transcripción del receptor del factor activador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF-R) y del receptor de eritropoyetina (EPO-R), respectivamente, inhibiendo la diferenciación hacia los linajes mieloide y eritroide.
GATA-1 inhibe a PU.1 bloqueando la interacción con su cofactor
c-Jun en mieloblastos (Zhang y col., 1999) mientras que PU.1 se une y
bloquea a GATA-1 en células eritroides (Rekhtman y col., 2003; Rekhtman
y col., 1999). El grupo de Skoultchi, del Albert Einstein College of Medicine
(USA), demostró en células MEL que PU.1 se une a GATA-1 cuando este
último está unido al promotor de sus genes diana. En el mismo trabajo se
sugiere que PU.1, en cooperación con la proteína del retinoblastoma (Rb),
c-JUN
Célula Madre
GATA
Precursormieloide
Precursoreritroide
GM-CSF-RExpresión del
EPO-RExpresión del
PU.1
Señalactivadora
Introducción
��
recluta un complejo represor que incluye a la HP1α y a la metiltransferasa
de histonas Suv39h, provocando el silenciamiento de la cromatina (Figura
12) (Stopka y col., 2005).
gata
Rb Suv39HHP1a
H3K9Me H3 (H3.3)K9Ac
gata
GATA-1
CBP
GATA-1
PU.1a b
Represión de la expresión de las dianas de GATA-1
Activación de la expresión de las dianas de GATA-1
Figura12.ModelodelaregulacióndeactividadtranscripcionaldeGATA-1mediadaporPU.1encélulasMEL.Se muestran las proteínas y las modificaciones de las histonas presentes cerca de los sitios de unión de GATA-1 a la cromatina cuando los niveles de PU.1 son lo suficientemente altos para reprimir la expresión de los genes diana de GATA-1 (a) y cuando los niveles de PU.1 se reducen produciéndose una reactivación de la expresión de los mismos (b). Se indica la unión de la proteína del retinoblastoma (Rb), la HP1a unida a H3K9Me (flecha con dos puntas) y la Suv39H y la CBP que causan metilación y acetilación (flechas), respectivamente.
Nishigaki y colaboradores han sugerido un mecanismo diferente para
explicar el bloqueo de la diferenciación de las células eritroleucémicas
mediado por PU.1 (Nishigaki y col., 2006). Esta teoría no excluye sin
embargo, la derivada del clásico antagonismo GATA-1/PU.1. Este
mecanismo estaría relacionado con la regulación de las proteínas STAT1/3
(Signal Transducers and Activators of Transcription 1/3), cuya
activación está bloqueada en células MEL. En condiciones normales, la
asociación de Epo a su receptor resulta en la fosforilación de las proteínas
STAT1/3 que luego de dimerizar se translocan al núcleo y se unen al DNA
de sus genes diana (Figura 13) (Ohashi y col., 1995; Penta y Sawyer,
1995). Esta fosforilación está bloqueada en las células eritroleucémicas
debido la sobreexpresión de la fosfatasa Shp-1 que a su vez está inducida
por PU.1. En la presente tesis se analiza la activación de la fosforilación
de STAT1 en una línea eritroleucémica derivada de MEL-DS19 en donde
el gen Sfpi-1/PU.1 está silenciado (MEL-R).
Introducción
��
Epo
JAK2
P
P
P
P
P
PSTAT
DímeroSTAT
Núcleo
Citoplasma
Activación de la expresión de las dianas de STAT
Epo-R
Figura13.ActivacióndelasproteínasSTATmediadaporlaactivacióndelreceptordeeritropoyetina(Epo-R).La activación del receptor de eritropoyetina (Epo-R) debido a la unión de Epo resulta en la fosforilación de las proteínas STAT a través de JAK2. Las proteínas STAT fosforiladas forman dímeros que se translocan al núcleo para activar la expresión de sus genes diana.
1.7.Fli-1yelbloqueodeladiferenciacióneritroide
Fli-1 (Friend leukemia insertion site-1) es otro miembro de la familiaEts que fue identificado por el grupo de Ben-David como el sitio de
integración preferido del F-MuLV en precursores eritroides (Ben-David y
col., 1991). Al igual que PU.1, Fli-1 posee una zona altamente conservada
de unión a DNA responsable de la asociación a una secuencia consenso
rica en purinas, GGA(A/T), de una gran variedad de regiones reguladoras
de la transcripción, virales y celulares (Figura 9) (Macleod y col., 1992;
May y col., 1993).
Introducción
��
Cuando el F-MuLV actúa en solitario, sin formar parte del complejo
Friend, es capaz de producir eritroleucemias sólo en líneas susceptibles
de ratones recién nacidos (Ben-David y Bernstein, 1991). Como ya se
mencionó previamente (Sección 1.3.2.), las eritroleucemias inducidas por
el F-MuLV no exhiben una fase pre-leucémica típica, caracterizada por la
expansión de eritroblastos. La primera alteración genética que se detecta
en células infectadas por el F-MuLV es la integración del provirus en el
locus del gen Fli-1, evento que ocurre en el 75% de los casos y que afecta
a la autoregeneración de las células progenitoras (Ben-David y col., 1990;
Howard y col., 1993). La inmortalización de las células requiere además
la pérdida de p53 y la activación de Bcl-2, procesos que le confieren
una ventaja selectiva de crecimiento (Howard y col., 1996; Howard y col.,
2001; Pereira y col., 1999; Tamir y col., 1999).
La activación de Fli-1 a causa de la integración de un provirus se
ha descrito además en leucemias distintas del tipo B o distintas del tipo
T inducidas por el Cas-Br-E y en leucemias granulocíticas inducidas por
el Gaffy MuLV (Bergeron y col., 1991; Denicourt y col., 1999). Fli-1 se
activa también en células del sarcoma de Ewing como resultado de una
translocación cromosómica. Esto da lugar a la formación de una proteína
quimérica en donde se fusionan el dominio de unión a DNA de Fli-1 con una
proteína de unión a RNA (EWS) del cromosoma 22 de humanos (Delattre y
col., 1992). En conjunto, todos estos datos que describen la expresión
aberrante del gen, en el tiempo o en la forma, sugieren que Fli-1 posee un
gran potencial oncogénico.
El modo de acción de Fli-1 recuerda sin duda al de PU.1. Actúa
como un regulador positivo y necesario durante el desarrollo de un linaje
celular determinado, en este caso el megacariocítico, pero tiene actividadoncogénica en precursores eritroides. En este trabajo, se analiza
el potencial de Fli-1 para bloquear el proceso de diferenciación como
alternativa del ausente PU.1 en líneas eritroleucémicas resistentes a los
agentes inductores de la diferenciación (MEL-R).
Introducción
��
1.8. Lecciones del SFFV y del modelo in vitro de célulasMEL
Desde que Charlotte Friend describió la inducción de eritroleucemias
en ratones infectados con el complejoFriend (Friend, 1957), el retrovirus
y la enfermedad que lleva su nombre se han convertido en una herramienta
valiosa para el estudio de la eritropoyesis. Varios aspectos del proceso
tales como la vía de señalización de Epo, el mecanismo de desarrollo de
las leucemias y la patogénesis retroviral han sido objeto de análisis en las
células Friend (Ney y D'Andrea, 2000).
La policitemia inducida por el SFFV en ratones presenta una gran
similitud con la enfermedad policitemiavera de humanos. Esta enfermedad
de origen clonal, que afecta a precursores hematopoyéticos, origina una
sobreproducción de células sanguíneas, especialmente glóbulos rojos
(Golde y col., 1981). Al igual que ocurre durante la fase pre-leucémica de
ratones infectados con el SFFV, en los pacientes con policitemiavera se
produce un incremento en la formación de BFU-Es y CFU-Es en ausencia
de Epo (Casadevall y col., 1982). Se ha sugerido que los progenitores
eritroides de los pacientes podrían expresar una proteína análoga
a la gp55 del virus que es capaz de interaccionar con el receptor de
eritrpoyetina (Epo-R) y activarlo de manera constitutiva (Ruscetti, 1995).
Alternativamente, estos pacientes podrían presentar mutaciones en el gen
que codifica para el receptor de eritropoyetina (Epo-R) que resulten en
una activación aberrante del receptor (Ruscetti, 1995). En la medida que
avancemos en el conocimiento del mecanismo de activación del receptor
por el SFFV, podremos empezar a diseñar terapias para contrarrestar
está activación que, a su vez, podrían aplicarse en el tratamiento de
pacientes con policitemiavera u otras enfermedades asociadas con una
desregulación de la eritropoyesis.
El estudio de las células Friend ha sido útil además para identificar
genes que están involucrados en la susceptibil idad de los ratones a la
transformación con el complejo vírico (Axelrad, 1969). Dentro de este
grupo se ha identificado el locus Fv2 (Friend virus susceptibil ity 2) donde
se encuentra el gen que codifica para una forma truncada del receptor con
actividad tirosina quinasa STK (sf-STK) que carece del dominio extracelular
Introducción
��
pero conserva los dominios transmembrana y quinasa (Persons y col.,
1999). Se ha demostrado que los ratones que no expresan sf-STK son
resistentes a la infección con el complejo Friend. Esta resistencia no se
debe a una interferencia con la entrada del retrovirus o a alteraciones en su
ciclo vital sino a la influencia de sf-STK en la determinación de la capacidad
de la gp55 para inducir la proliferación de los eritroblastos infectados con
el SFFV (Lilly, 1970). De manera consistente con estos resultados, se ha
propuesto que el gen Fv2 podría estar involucrado en la regulación del ciclo
celular de las BFU-Es (Suzuki y Axelrad, 1980). Debido a que las BFU-Es
son las dianas principales de la infección retroviral, el efecto de Fv2 sobre
la proliferación explicaría la importancia de sf-STK para el desarrollo de la
eritroleucemia mediada por el SFFV. En un modelo inicial se planteó que la
gp55 mediaría una interacción funcional entre el receptor de eritropoyetina
(Epo-R) y sf-STK. Sin embargo, Zhang y colaboradores demostraron que
la glicoproteína gp55 del SFFV-P interacciona de forma independiente con
sf-STK y el receptor de eritropoyetina (Epo-R) para inducir eritroblastosis
y policitemia, respectivamente (Zhang y col., 2006). La identificación de
sf-STK permite ampliar el conocimiento de los mecanismos de resistencia
al cáncer en ratones y, por extrapolación, en humanos.
Por otra parte, el modelo de la eritroleucemia murina constituye
también un sistema ampliamente util izado en la investigación del mecanismo
de acción de los distintos agentes inductores de la diferenciacióncelular. Desde el hallazgo del DMSO como un agente inductor de la
diferenciación de las células MEL (1971), se han desarrollado una gran
variedad de compuestos químicos capaces de reactivar la diferenciación e
inhibir la tumorigenicidad de células leucémicas. Entre estos compuestos
se encuentra el HMBA que ha servido de punto de partida para el desarrollo
de compuestos polares de segunda generación que son hasta 2000 veces
más activos, entre los que destacan el EMBA (dietil-bis-[pentametileno-
N,N-dimetilcarboxamida]malonato) y los ácidos hidroxámicos como el SAHA
(suberoylanilida ácido hidroxámico) y el CBHA (ácido m-carboxicinámico
bis-hridroxiamida) (Marks y Breslow, 2007). Uno de estos compuestos, el
SAHA, actúa como un inhibidor de las HDACs que activa la acetilación
de histonas, factores de transcripción y proteínas involucradas en la
regulación de la proliferación, la migración y la muerte celular. En ensayos
Introducción
��
clínicos, el SAHA ha mostrado una potente actividad anticancerígena, tanto
en tumores sólidos como hematológicos a dosis que son bien toleradas
por los pacientes (Marks, 2007; Marks y Breslow, 2007). En conjunto,
estos datos confirman la validez de las células de la eritroleucemia murina
como modelo para el estudio del mecanismodeacciónde losagentesantitumorales y el desarrollo de nuevas terapias anticancerígenos.
2. OBJETIVOS
Objetivos
��
Uno de los objetivos del laboratorio en donde se ha llevado a cabo
la presente tesis doctoral es avanzar en el conocimiento de cómo la
transformación oncogénica perturba el equilibrio proliferación-diferenciación
y cómo estas perturbaciones pueden ser revertidas, restableciendo de ese
modo los controles normales. Como modelo de trabajo se utilizan células
eritroleucémicas que, aunque inmortalizadas por la integración de un
complejo vírico, son capaces de reiniciar el programa de diferenciación.
En el presente trabajo se describe el establecimiento y análisis de líneas
resistentes a la acción de agentes inductores de la diferenciación celular con
el fin de identificar factores involucrados en el bloqueo de la diferenciación
de las líneas tumorales. Los objetivos concretos de este trabajo fueron:
- Establecer y caracterizar líneas eritroleucémicas resistentes a la acción
de los agentes inductores de la diferenciación celular, en este caso el
HMBA.
- Analizar el papel del factor de transcripción PU.1 en el desbloqueo de
la diferenciación en respuesta a los agentes inductores.
- Investigar la potencialidad de las líneas resistentes para reiniciar el
programa de diferenciación hacia el linaje eritroide. Determinar el efecto de
la inhibición de la proliferación celular o de la sobreexpresión de reguladores
del linaje eritroide sobre el desbloqueo de la diferenciación de las líneas
resistentes.
- Analizar las posibles causas de la inhibición de la actividad del gen
regulador GATA-1 en las líneas resistentes.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
��
3.1.Cultivoscelulares
3.1.1.Líneascelulares
MELDS-19. (Murine erythroleukemia cell line). Línea celular cedida por el
laboratorio del Dr. Arthur I. Skoultchi del Albert Einstein College of Medicine
(USA). Deriva de una de las líneas originales establecidas por Charlotte
Friend a partir de tumores subcutáneos de ratones infectados con el complejo
vírico Friend (Friend y col., 1966; Marks y Rifkind, 1978) formado por el
SFFV (Spleen Focus Forming Virus) y el MuLV (Murine Leukemia Virus).
CB7.Línea celular establecida en el laboratorio del Dr. Yaacov Ben-David del
Department of Medical Biophysics, University of Toronto (Canadá). Derivada
de colonias aisladas de bazo de ratones BABL/c infectados al nacer con el
MuLV (Shibuya y Mak, 1983).
DP18.Línea celular establecida en el laboratorio del Dr. Yaacov Ben-David
del Department of Medical Biophysics, University of Toronto (Canadá).
Derivada de células de bazo de ratones DBA/2 infectados con el SFFV (Ben
David y col., 1988).
MEL-R. Línea celular derivada de MEL DS-19 establecida durante el
transcurso de esta tesis. Las MEL-R se seleccionaron mediante pases
sucesivos en presencia de N,N´-Hexamethylene-bis-acetamide (HMBA)
(Sigma) 5 mM durante 6-8 semanas (ver resultados apartado 4.1.1.).
293T. Línea celular originada a partir de células epiteliales de riñón de
embrión humano transformadas con el DNA del adenovirus tipo 5 que llevan
integrada una copia de la región temprana del genoma de SV40 (ATCC:
CRL-11268).
3.1.2.TransfectantesestablesderivadosdeMEL-R
MEL-RpMTHbetaglobin.neo.Transfectante estable derivado de MEL-R que
contiene integrado el vector de expresión pMTHbetaglobin.neo que confiere
resistencia a neomicina y es inducible por ZnCl2.
MEL-RpMTH.neo.GFP-Mad.Transfectante estable derivado de MEL-R que
contiene integrado el vector de expresión pMTH.neo-GFP-Mad.
MEL-R pSUPER.retro.neo+GFP. Transfectante estable derivado de MEL-
Materiales y Métodos
��
R que contiene integrado el vector de expresión pSUPER.retro.neo+GFP
(OligoEngine).
MEL-RpSUPER.neo+GFP.Myc.Transfectante estable derivado del MEL-R
que contiene integrado el vector de expresión pSUPER.neo+GFP-Myc.
MEL-RpEBBpuro.ERTransfectante estable derivado de MEL-R que contiene
integrado el vector de expresión pEBBpuro.ER.
MEL-RpEBBpuro.GATA-ERTransfectante estable derivado de MEL-R que
contiene integrado el vector de expresión pEBBpuro.GATA-ER.
MEL-R pEBBpuro.PU.1-ER Transfectante estable derivado de MEL-R que
contiene integrado el vector de expresión pEBBpuro.PU.1-ER.
3.1.3.Condicionesdecultivo
Las líneas celulares MEL DS-19, MEL-R y 293T, así que como las líneas
transfectantes derivadas de MEL-R, se mantuvieron en medio de cultivo básico
Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM) (Life Technologies, Inc.). Las líneas
celulares CB7 y DP18 se mantuvieron en medio Mínimo Esencial alfa (alpha-
MEM) (Life Technologies, Inc.). Los medios de cultivo se complementaron
con penicilina a una concentración de 100 U/ml (Life Technologies, Inc.),
estreptomicina a una concentración de 100 µgr/ml (Life Technologies,
Inc.) y suero fetal bovino (GIBCO, Euroclone y PAA laboratories GMBH),
previamente inactivado a 55ºC, a una concentración final del 10% (v/v). Los
medios de los transfectantes se complementaron con 5 µgr/ml de puromicina
(Sigma) o con 600 µgr/ml de geneticina (G418) (Calbiochem). El cultivo de
las células MEL-R se llevó a cabo en presencia de HMBA 5 mM. Las células
se incubaron a 37ºC, en atmósfera húmeda, en presencia de CO2 al 5%.
3.1.4.Ensayosdediferenciación
3.1.4.1.TratamientoconHMBALas células MEL son líneas celulares inmortalizadas capaces de reiniciar el
programa de diferenciación bajo la acción de un agente inductor. A lo largo de
este trabajo se utilizó como agente inductor el HMBA, disuelto en agua estéril
a una concentración final de 5 mM (Reuben y col., 1976). El tratamiento con
HMBA se llevó a cabo en cultivos celulares en crecimiento exponencial a
Materiales y Métodos
��
una concentración de 2-3x105 células/ml, recogiéndose muestras a distintos
tiempos. La incubación se realizó bajo las mismas condiciones descritas
para el mantenimiento de los cultivos celulares.
3.1.4.2.TratamientoconotrosagentesinductoresdeladiferenciacióneritroideEl dimetil sulfóxido (DMSO), el butirato de sodio y la hemina son agentes
inductores de la diferenciación de células eritroleucémicas (Friend y col.,
1971; Malinin y Ebert, 1980; Rutherford y col., 1979). El tratamiento con
DMSO al 1%, hemina 50 µM o butirato de sodio 0,5 mM se llevó a cabo en se llevó a cabo en
cultivos celulares en crecimiento exponencial a una concentración de 2-
3x105 células/ml, recogiéndose muestras a distintos tiempos. La incubación
se realizó bajo las mismas condiciones descritas para el mantenimiento de
los cultivos celulares.
3.1.4.3.TratamientoconTPAEl tratamiento con 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) para inducir
la diferenciación hacia el linaje megacariocítico se llevó a cabo en células
MEL y MEL-R en crecimiento exponencial (2-3x105 células/ml). Los cultivos
se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.) suplementado
con suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina a las concentraciones
descritas en el apartado 3.1.3., en presencia de distintas dosis de TPA (1 y
10 nM). Se recogieron muestras a distintos tiempos y se analizó el efecto
sobre la ploidía celular. Se determinó la expresión del marcador alfa-2b-
beta-3 -integrina (αIIbβ3), específico de megacariocitos, mediante citometría
de flujo.
3.1.4.4.Tratamientocon5-Aza-dCLa 5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-dC) es un inhibidor de las metiltransferasas
que provoca la demetilación del DNA y, por lo tanto, un desbloqueo de la
expresión génica. Se analizó el efecto de distintas concentraciones de 5-
Aza-2-dC (0,2; 0,4; 0,8 y 10 µM) sobre la viabilidad celular en células MEL-
R y se determinó el efecto de la dosis óptima (0,4 µM) sobre el desbloqueo
de la diferenciación. El tratamiento con 5-Aza-2-dC se llevó a cabo en
células MEL-R en crecimiento exponencial (2-3x105 células/ml) cultivadas
Materiales y Métodos
��
en presencia o ausencia de HMBA 5mM, recogiéndose muestras a distintos
tiempos. La incubación se realizó bajo las mismas condiciones descritas
para el mantenimiento de los cultivos celulares. La expresión de PU.1 se
analizó mediante RT-PCR semicuantitativa.
3.1.4.5.TratamientoconTSALa Tricostatina A (TSA) es un inhibidor de las deacetilasas de histonas (HDAC)
capaz de provocar un desbloqueo de la expresión génica. Los cultivos de
células MEL y MEL-R se mantuvieron en presencia de TSA (50 nM) durante
5 días. Se recogieron muestras a distintos tiempos y se analizó la expresión
de PU.1 mediante RT-PCR.
3.1.5.Ensayodebenzidina
Las células diferenciadas se detectaron mediante el ensayo de benzidina
(Gusella y col., 1976; Marks y Rifkind, 1978). La benzidina reacciona con
los grupos heme de la hemoglobina produciendo una coloración azul en las
células diferenciadas. Se mezclaron volúmenes iguales de una suspensión
celular y de una solución 77,7 mM de dihidrocloruro de benzidina (Sigma)
conteniendo 0,3% de peróxido de hidrógeno (Merck). Se incubó durante 10
minutos a temperatura ambiente y se realizó un contaje celular distinguiendo
las células teñidas (diferenciadas) de las no teñidas (no diferenciadas). Para
realizar preparaciones citológicas permanentes se recogieron 1x106 células
a distintos tiempos de tratamiento con HMBA, se lavaron con PBS 1X y se
trataron con benzidina. Las células se centrifugaron 3 minutos a 700 rpm
sobre un portaobjetos utilizando una citocentrífuga (Cytospin 3 SHANDON).
Se agregó una gota del medio de montaje EUKITT (O. Kindler GmbH 86), se
colocó un cubreobjetos y se dejó secar a temperatura ambiente.
3.1.6.TinciónconazuldetoluidinayMayGrünwald-Giemsa
Se recogieron 1x106 células, se lavó el pellet con PBS 1X y se centrifugó
3 minutos a 700 rpm utilizando una citocentrífuga (Cytospin 3 SHANDON).
Las preparaciones se incubaron 10-20 minutos con azul de toluidina (Sigma)
disuelto en agua destilada a una concentración final de 1mg/ml, se lavó
Materiales y Métodos
��
durante un minuto con agua destilada y se secó al aire. Para la tinción May
Grünwald-Giemsa, se incubó durante 5 minutos con May Grünwald (Sigma)
y se lavó en tampón fosfato (20-70 mmol/l), pH 7.2, durante un minuto. A
continuación se incubó durante 15-20 minutos con Giemsa (Sigma) disuelto
1:20 en agua desionizada, se lavó con agua desionizada y se secó al aire.
Las preparaciones se montaron utilizando el medio de montaje EUKITT (O.
Kindler GmbH 86).
3.1.7.TratamientoconFibronectina
La membrana plasmática de las células MEL contiene una proteína de 140
KDa que se une de manera específica a fibronectina (Fn) (Patel y Lodish,
1986). Estudios previos han demostrado que las células MEL son capaces de
diferenciarse a reticulocitos cuando se mantienen adheridas a una matriz de
fibronectina (Patel y Lodish, 1987). El tratamiento con fibronectina (Roche),
diluida en PBS 1X a una concentración final de 50 µg/ml, se llevó a cabo en
células MEL y MEL-R en crecimiento exponencial. Los cultivos se mantuvieron
durante 6 días en presencia de HMBA (5mM) en placas de petri pre-tratadas
durante 1-2 horas a 15- 25ºC con 1-2 ml de fibronectina. Se recogieron
muestras cada 24 horas. Se realizaron preparaciones citológicas.
3.1.8.Cinéticadecrecimientoyviabilidadcelular
La cinética de crecimiento se realizó contabilizando las células con ayuda
de una cámara de Neubauer bajo una lupa MZ6 (Leica) a intervalos de 24hr
durante al menos 3 días. La viabilidad celular se determinó mediante el
método de exclusión del colorante azul de tripano. Se mezclaron volúmenes
iguales de una suspensión celular y de azul de tripano (Sigma) al 0,5%
disuelto en PBS 1X y se cuantificó el número de células no teñidas (vivas)
y teñidas de azul (muertas). En ambos casos se realizaron contajes de al
menos 3 muestras de cultivos independientes.
Materiales y Métodos
��
3.1.9. Distribución en las distintas fases del ciclo celular.Determinacióndeltamañocelular
La distribución de las células a lo largo del ciclo celular se determinó en
función del contenido de DNA mediante la incorporación de ioduro de
propidio (IP) (Crismann, 1973). Se centrifugaron 3-5x105 células durante 5
minutos a 1000 rpm, se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en una
solución que contenía PBS 1X, NP-40 al 0,05%, 60 µgr/ml de RNAsa A y 25
µgr/ml de PI. Las muestras se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente
y se analizaron en un citómetro de flujo EPICS-XL Coulter que opera a 200
mW, usando una longitud de onda de 488 nm emitida por un láser de argón
con un pico de emisión de 590 nm. La determinación del tamaño celular se
llevó a cabo a partir del 3x105 células. Se centrifugó a 1000 rpm 5 minutos,
se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en 300 µl de PBS 1X. Las
muestras se analizaron midiendo la dispersión frontal (forward scattering,
FS) en el citómetro de flujo.
3.2.Transfeccionesconvectoresdeexpresión
3.2.1.Construccióndeplásmidos
pSTBlue-1.Mad. Derivado de pSTBlue-1 AccepTor Vector (Novagen). Se
clonó la secuencia codificante de Mad-1, obtenida mediante PCR usando
como molde cDNA de MEL y como cebadores los oligonucleótidos Mad fw y
Mad rv, en el vector pSTBlue-1 AccepTor Vector.
pEGFP-C1.Mad. Derivado de pEGFP-C1 (Clontech). Se subclonó la secuencia
codificante de Mad-1 obtenida a partir vector pSTBlue-1.Mad digerido con
BamHI y SalI en el vector pEGFP-C1 digerido con las mismas enzimas.
pSTBlue-1.GFP-Mad. Derivado de pSTBlue-1 (Novagen). Se clonó la
secuencia codificante de la proteína de fusión GFP-Mad, obtenida mediante
PCR usando como molde el vector pEGFP-C1.Mad y como cebadores
los oligonuclétidos GFP fw y pEGFPC1 rv, en plásmido pSTBlue-1
AccepTorVector.
pMTH.neo.GFP-Mad. Derivado de pMTHbetaglobin.neo. La secuencia
codificante de la proteína GFP-Mad obtenida a partir del vector pSTBlue-
Materiales y Métodos
��
1.GFP-Mad digerido con BamHI se insertó en el vector pMTHbetaglobin.neo
digerido con la misma enzima.
pSUPER.retro.neo+GFP.Myc. Derivado del pSUPER.retro.neo+GFP
(OligoEngine). Se clonó un fragmento de 64 pb con extremos BamHI y BglII
que contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 987-1005 del
exón II del mRNA de c-myc murino en el vector pSUPER.retro.neo+GFP
(Figura 14). La secuencia diana para inhibir la expresión de c-myc fue: 5’-
GAACATCATCATCCAGGAC-’3.
Figura 14. Esquema del siRNA-Myc. El vector pSUPER.GFP-Neo.myc-i se construyó clonando un fragmento de 64 pb con extremos BamHI y BglII que contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 987-1005 del exón II del mRNA de c-myc murino en el vector pSUPER.retro.neo+GFP. La secuencia diana para inhibir la expresión de c-myc fue 5’-GAACATCATCATCCAGGAC-’3.
AA5’ 3’GAACATCATCATCCAGGAC
Secuencia diana (c-myc exón 2)
5’-GATCCCGAACATCATCATCCAGGACttcaagagaGTCCTGGATGATGATGTTCTTTTTGGAAA-3’
5’-GGGCTTGTAGTAGTAGGTCCTGtctcttgaaCAGGACCTACTACTACAAGAAAAACCTTTTCGA-3’
Oligos
Ligación
LoopSense Antisense Term. PolII
BglII
BamHI
5’-GAACAUCAUCAUCCAGGACu u c
aa
a g a gGAACAUCAUCAUCCAGGACUU3’-
pSUPER.retro.neo+GFP.Myc
myc-i
H1 Promoter
PGK
Neo-GFP
Materiales y Métodos
��
pEBBpuro.GATA-ER.Derivado de pEBBpuro. Construido en el laboratorio
del Dr. Arthur I. Skoultchi. Contiene la secuencia codificante de GATA-1
fusionada al dominio de unión a estrógeno del receptor de estrógeno humano.
Se contruyó clonando un fragmento BamHI-NotI que contenía la secuencia
codificante de la proteína de fusion GATA-ER en el vector pEBBpuro digerido
con las mismas enzimas (Choe y col., 2003).
pEBBpuro.PU.1-ER.Derivado de pEBBpuro-ER. Se amplificó la secuencia
codificante de PU.1 mediante PCR utilizando como molde cDNA de células
MEL y como cebadores los oligonucleótidos PU.1-ER fw y PU.1-ER rv.
El producto de RT-PCR, que contenía dianas de restricción para BamHI,
fue digerido e insertado en el vector pEBBpuro.ER digerido con la misma
enzima.
3.2.2.Transfeccionesestablesconcationeslipídicos
Se utilizaron 3-5 µgr de DNA plasmídico resuspendido en 0,15 ml de medio
DMEM sin suero (solución A). Se mezclaron 50 µl de lipofectina (Life
Technologies, Inc.) con 0,1 ml de medio DMEM sin suero (solución B) y se
incubó 30-45 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló la solución A con
la solución B y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se
añadió la mezcla (A+B) a 5x106 células MEL-R resuspendidas en 0,7 ml de
medio DMEM sin suero y se incubó durante 6 horas a 37ºC en un incubador
de CO2. El aislamiento de clones se llevó a cabo mediante selección de
clones GFP-positivos utilizando un separador de células modelo FACS
Vantage (Becton-Dickinson) o realizando diluciones en serie para distribuir
las células uniformemente en placas de 96 pocillos a una concentración de
1x103 células por pocillo.
3.2.3.Seleccióndetransfectantes
Las líneas transfectadas con pEBBpuro se seleccionaron en 5 µgr/ml de
puromicina cambiándose el medio cada 3 días. Aquellas transfectadas con
pMTHbetaglobin.neo y pSUPER.retro.neo+gfp se seleccionaron en 600 µgr/
ml de G418. Los clones recombinantes se transfirieron a frascos de cultivo
para su amplificación. El análisis de la diferenciación celular se llevó a cabo
Materiales y Métodos
��
en presencia de 5 mM de HMBA. En el caso de los transfectantes estables
derivados de MEL-R que contienen vectores inducibles los cultivos se
mantuvieron además en presencia o ausencia de 100 µM de ZnCl2 (pMTH.
neo.GFP-Mad) o 1x10-7 M de β-estradiol (pEBBpuro.GATA-ER y pEBBpuro.
PU.1-ER).
3.3.PreparaciónyanálisisdeDNA
3.3.1.ExtracciónypurificacióndeDNAplasmídico
Se transformaron bacterias de Escherichia coli de la cepa DH5αF´ con los
plásmidos correspondientes según el protocolo de Hanahan (Hanahan,
1986). Se amplificaron los cultivos en medio selectivo y se aisló DNA
plasmídico utilizando el sistema de extracción High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche).
3.3.2.ExtracciónypurificacióndeDNAgenómico
Se centrifugaron 1x107 células, se lavó el pellet con PBS 1X, se resuspendió
en 3 ml del buffer de lisis (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM a pH 8.0, EDTA
25 mM a pH 8.0, SDS al 0,5% y Proteinasa K 0,1 mg/ml) y se incubó en
un horno a 55ºC durante 16 horas. Se añadieron 200 U de RNAsa A y se
incubó 20 minutos a 37ºC. Después de centrifugar a 14000 rpm durante 5
minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares y añadir
2 ml de TEN (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 150 mM), la muestra
se desproteinizó con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) (PCIA).
Finalmente, el DNA se precipitó con 2,5 volúmenes de etanol al 100% frío.
Se centrifugó a 9000 rpm durante 30 minutos a 4ºC, se lavó con etanol al
70% y se resuspendió en 200 µl de H2O destilada.
Materiales y Métodos
�0
3.3.3. Transferencia, marcaje e hibridación del DNA separado engelesdeagarosa(Southern)
3.3.3.1.TransferenciaasoportessólidosUna vez realizada la electroforesis en geles de agarosa al 0,7%, los geles
se trataron con ácido clorhídrico 0,25 M durante 15 minutos y se lavaron con
agua destilada. El DNA se transfirió por capilaridad en condiciones alcalinas
a membranas de nylon (Zeta Probe, Bio-Rad).
3.3.3.2.MarcajeradiactivodesondasLas diferentes sondas empleadas en esta tesis fueron marcadas con 40 µCi
del precursor radiactivo {α-32P} dCTP, mediante la técnica del random priming
extension utilizando el sistema Ready-to-go de Amersham-Pharmacia. Las
sondas marcadas se purificaron en columnas Sephadex-50 de la misma casa
comercial. Los plásmidos empleados en este trabajo con los correspondientes
fragmentos utilizados como sondas son los siguientes:
- fragmento EcoRI-XhoI de 600 pb del cDNA de la β-globina murina,
contenido en el plásmido pSK+ (Allen y col., 1987).
- plásmido pSTBlue-1.PU.1, conteniendo la secuencia codificante de
PU.1 murino.
- fragmento PstI de 700 pb del cDNA de c-myc murino, contenido en el
plásmido pMC-myc54 (Lachman y Skoultchi, 1984).
- fragmento PstI de 800 pb (sonda A) correspondiente a las posiciones
-12353 a -13124 del locus PU.1 murino, contenido en el plásmido
C45a6b (Moreau-Gachelin y col., 1988).
3.3.3.3.HibridacióndeDNALa solución empleada para hibridar DNA consistió en SSPE 2X (NacCl 360
mM, Na2HPO4×7H2O 20 mM y EDTA 2 mM a pH 8.0), leche descremada al
0,5%, sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1% y 0,5 mg/ml de DNA de esperma
de salmón sonicado y desnaturalizado. En todos los casos se realizó una
prehibridación de 3-4 horas a 65ºC en la misma solución. A continuación
se añadió la sonda marcada y desnaturalizada (1x106 cpm/ml) y se incubó
a 65 ºC durante 16 h.Finalizado el tiempo de hibridación las membranas se
lavaron sucesivamente con SSC 2X/SDS 0,1%; SSC 0,5X/SDS 0,1%; SSC
Materiales y Métodos
��
0,1X/ SDS 0,1%, este último precalentado a 65ºC, durante 15 minutos en
cada caso. Para las autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix
RP2.
3.3.4.SecuenciacióndeDNA
Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en el Servicio de
Secuenciación Automática del CIB (CSIC), empleando un secuenciador
automático ABI Prism 3700 DNA Analyser de Applied Biosystems.
3.4.PreparaciónyanálisisdeRNA
3.4.1.ExtracciónypurificacióndeRNA
El aislamiento y purificación de RNA total de cultivos celulares se llevó a cabo
utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies). Se centrifugaron
5-10x106 células, se lavó el pellet con PBS 1X y se resuspendió en 1 ml de
Trizol. El homogeneizado se incubó 5 minutos a temperatura ambiente, se
añadieron 200 µl de cloroformo, se agitó con vórtex y se incubó 2-3 minutos
a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12300 rpm durante
15 minutos a 4ºC y se recuperó la fase acuosa. El RNA se precipitó con 500 µl
de isopropanol, se lavó con etanol al 75% y se resuspendió en agua tratada
con DEPC. Finalmente, se realizó una valoración espectrofotométrica de la
concentración y pureza del RNA.
3.4.2. Transferencia, marcaje e hibridación del RNA separado engelesdeagarosa(Northern)
3.4.2.1.ElectroforesisytransferenciaasoportessólidosSe disolvieron alícuotas de 20 µg de RNA total en una solución desnaturalizante
(formamida 50%, formaldehído 6%, ácido bórico 0,5 M, borato de sodio 50
mM, sulfato de sodio 100 mM, EDTA 10 mM, glicerol 50% y púrpura de
bromocresol 0,74%). Se calentó la muestra durante 5 minutos a 65ºC y
se fraccionó en geles de agarosa al 1,2% con bromuro de etidio 0,5 µg/
ml y formaldehído 3% en tampón borato (ácido bórico 0,5 M, borato de
Materiales y Métodos
��
sodio 50 mM, sulfato de sodio 100 mM y EDTA 10 mM). Se transfirió por
capilaridad a membranas de nylon (Zeta Probe, Bio-Rad) en SSC 10X y se
fijó el RNA exponiendo la membrana a 1200 µJ en un UV StratalinkerTM 1800
de Cultek.
3.4.2.2.HibridacióndeRNAEl marcaje de las sondas se describe en el apartado 3.3.3.2. Se prehibridó
1-2 horas en una solución que contenía Na2HPO4 0,3 M, NaH2PO4 0,2M,
SDS 7%, EDTA 1mM a pH 8.0 y BSA 1%. A continuación se añadió la sonda
marcada y desnaturalizada (2-10x 106 cpm/ml) y se incubó durante 16 h a
65ºC.
Finalizado el tiempo de hibridación se lavaron las membranas dos veces
en una solución de SSC2X/SDS 0,1% a temperatura ambiente y una vez en
una solución de SDS 0,1X/SDS 0,1% a 50ºC durante 5 minutos. Para las
autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix RP2.
3.5.RT-PCR
Se sintetizó cDNA a partir de RNA total de células MEL y MEL-R utilizando
oligo dT15 2,5 µM, dNTPs 0,5 mM, SUPERase IN 1 U/µl (AMBION) y 200 U de
transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (USB). Las
condiciones utilizadas en la reacción enzimática fueron: 10 minutos a 25ºC,
45 minutos a 42ºC y 15 minutos a 99ºC. La amplificación del cDNA por PCR
se llevó a cabo utilizando cebadores a una concentración de 0,5 µM, MgCl2
2mM, dNTPs 0,2 µM y de 2-5 U de las DNA polimerasas recombinantes
Recombitaq (LINUS) y Expand High Fidelity PCR System (Roche). Todos los
oligonucleótidos empleados en esta tesis fueron suministrados por Roche
Molecular Biochemicals (Tablas I y II).
Materiales y Métodos
��
TablaI.Oligonucleótidos empleados en el desarrollo de la tesis.Cebador Forward (fw) Reverse (rv)
Myb 5’-GATGATGGGCGCCCCACTCAA-3’ 5’-CTCACATGACCAGAGTTCGAG-3’
Myc 5’-ACGACGATGCCCCTCAAC-3’ 5’-GTTTATGCACCAGAGTTTCG-3’
Mad-1 5’-GAAGATCTGCAGGATGGCGACAGCCG-3’ 5’-GAAGATCTGAGGTGGAGAGGACTCTC-‘3
GFP 5’-GAACCGTCAGATCCGCTAG-3’ 5’-CAACAGCCACAACGTCTATA-3’
pEGFPC1 5’-GAGAAGCGCGATCACATGGT-3’ 5’-GGTATGGCTGATTATGATCAG-3’
p27 5’-GAGGAGGAAGATGTCAAACGT-3’ 5’-CACCGGA GCTGTTTACGTCT-3’
GATA-1 5’-CCCCAGTGTTCCCATGGATTTTCCTG-3’ 5’-AAGGTCAAGGCTATTCTGTGTACCT-3’
GATA-2 5’-CACCACCCGATACCCACCTAT-3’ 5’-CCATGGCAGTCACCATGCT-3’
FOG-1 5’-CCAGAGAAGATGTGAGCCCA-3’ 5’-GTTTCTCTTCCGTCGCCGAG-3’
Gfi-1b 5’-CTGCTGTAATTCCTGTGGCA-3’ 5’-TGAAGGCTTTGCCACACATC-3’
EKLF 5’-TAGCCTCATAGCCCATGAGGCAGAAGA-3’ 5’-CATCCCCAGTCCTTGTGCAGGATCAC-3’
Fli-1 5’-GAACTCTGGCCTCAACAAAAG-3’ 5’-TGTCTCTGTTGGATGTGGCTG-3’
PU.1 5’-GGATCTGACCAACCTGGAGC-3’ 5’-GCTCAGGAGCCTGGCGGTCTCT-3’
PU.1-ER 5’-GGGGCACCTGGTCCTGAG-3’ 5’-CGCGGATCCGAGTGGGGCGGGAGGCG-3’
GAPDH 5’-ACAACAGTCCATGCCATCAC-3’ 5’-TCCACCACCCTGTTGTA-3’
Shp1 5’-CAGGATGGTGAGGTGGTTT-3’ 5’- CTCAAACTCCTCCCAGAAG-3’
TablaII.Descripción de las condiciones de las reacciones de PCR
Producto Cebadores Desnaturalización Anillamiento Elongación Nºdeciclos
c-myb Myb fw; Myb rv 95ºC 30’ 63ºC 1’ 72ºC 1’ 30
c-myc Myc fw; Myc rv 94ºC 1’ 64ºC 1’ 72ºC 1’ 30
mad-1 Mad-1 fw; Mad-1 rv 94ºC 1’ 65ºC 1’ 72ºC 1’ 30
GFP-Mad pEGFPC1 fw; Mad-rv 94ºC 1’ 65ºC 1’ 72ºC 1’ 30
p27 p27 fw; p27 rv 94ºC 1’ 55ºC 1’ 72ºC 1’ 25
GATA-1 GATA-1 fw; GATA-1 rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 25
GATA-2 GATA-2 fw; GATA-2 rv 94ºC 30’’ 62ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30
FOG-1 FOG-1 fw; FOG-1 rv 94ºC 30’’ 65ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30
Gfi-1b Gfi-1b fw; Gfi-1b rv 94ºC 30’’ 65ºC 30’’ 72ºC 30’’ 30
EKLF EKLF fw; EKLF rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 25
Fli-1 Fli-1 fw; Fli-1 rv 94ºC 1’ 60ºC 1’ 72ºC 1’ 30
PU.1 PU.1 fw; PU.1 rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 30
PU.1.ER PU.1-ER fw; PU.1-ER rv 94ºC 1’ 66ºC 1’ 72ºC 1’ 30
GAPDH GAPDH fw; GAPDH rv 94ºC 10’’ 65ºC 30’’ 72ºC 2,5’ 20
Shp1 Shp1 fw; Shp1 rv 94ºC 1’ 55ºC 1’ 72ºC 1’ 30
Materiales y Métodos
��
3.6.Preparaciónyanálisisdeproteínas
3.6.1.Purificacióndeproteínas
3.6.1.1.ObtencióndeextractosproteicostotalesLa extracción de proteínas totales de MEL, MEL-R, CB-7, DP18 y 293-T se
llevó a cabo a partir de 5-10x106 células. Se centrifugó a 1000 rpm durante 5
minutos a 4ºC, se lavó el pellet dos veces con PBS 1X frío y se resuspendió
en el tampón de lisis de Laemmli (Tris-HCl 65mM a pH 6.8, glicerol 10%, 2-
-mercaptoetanol 5% y SDS 1%) suplementado con 1% (v/v) de un cóctel de
inhibidores de proteasas (Sigma). A continuación se desnaturalizó a 95ºC
durante 10 minutos y se sonicó en frío. Para separar las proteínas de los
restos celulares se centrifugó a 14500 rpm durante 10 minutos a 4ºC. La
concentración de las diferentes muestras se valoró utilizando el reactivo
Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad).
3.6.1.2.ObtencióndeextractosproteicosnuclearesLa extracción de proteínas nucleares para inmunoprecipitación (IP) de MEL
y MEL-R se llevó a cabó a partir 2-4x107 células. Se centrifugó a 3000
rpm durante 15 minutos a 4ºC, se lavó el pellet dos veces con PBS 1X, se
resuspendió en 1 ml del tampón A (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9, MgCl2 1,5
mM y KCl 10 mM) suplementado con inhibidores de proteasas (Complete
Mini EDTA-free, Roche) y se incubó en hielo durante 10 min. A continuación
se agitó mediante vórtex durante 10 segundos y se centrifugó a 14000 rpm
durante 15 segundos para eliminar la fracción citoplasmática. Los núcleos
se resuspendieron en 300-500 µl del tampón C (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9,
MgCl2 1,5 mM, NaCl 0,42 M y glicerol 25%) suplementado con inhibidores de
proteasas. Se incubó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 14000 rpm
durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante constituyó el extracto nuclear.
La concentración de las diferentes muestras se valoró utilizando el reactivo
Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad).
Materiales y Métodos
��
3.6.2.Separaciónelectroforéticadeproteínaseinmunodetección(Western)
La separación de proteínas se realizó en geles de SDS-poliacrilamida del
10-15% según el método Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando el sistema
de separación electroforética Mini-Protean (Bio-Rad). La transferencia a
membranas de PVDF (InmobilonTM-P, Millipore) se llevó a cabo mediante
electrotransferencia húmeda (Mini-Protean, Bio-Rad) durante 2 horas a 100
V. Las membranas se bloquearon con agente bloqueante de membranas
(Amersham) o albúmina de suero bovino al 5% en TBST (Tris-HCl 20mM,
NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,1%) durante 2 horas a temperatura ambiente.
La incubación con el anticuerpo primario se realizó en la solución de bloqueo
durante 16 horas a 4ºC. Se lavó tres veces durante 10 minutos en TBST y
se incubó con el anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa, diluido
en la solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras otra
serie de lavados con TBST se realizó la detección empleando el sistema
SuperSignal®West Pico Chemoluminiscent Substrate (Pierce). Para las
autoradiografías se emplearon películas AGFA Curix RP2.
3.6.3.Coinmunoprecipitacióndeproteínasendógenas
La interacciones in vivo PU.1-GATA-1 y Fli-1-GATA-1 se analizaron mediante
la coinmunoprecipitación de proteínas endógenas presentes en extractos
nucleares de MEL y MEL-R. El extracto nuclear (1-2 mg) se incubó con
2,5 µg de un anticuerpo monoclonal de rata anti-GATA-1 (N6, Santacruz
Biotechnology) durante 2-3 horas a 4ºC o con 6 µg de un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-Fli-1 durante 16 horas a 4ºC. Como control se utilizó
un anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón (Santacruz Biotechnology) o un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-rata (SIGMA). Se añadieron 50 µl de
proteína G-sefarosa al 50% y se incubó en una noria durante 1 hora a 4ºC.
Se centrifugó a 13000 rpm durante 1 minuto y se lavó el precipitado varias
veces con el tampón de lavado (Hepes-KOH 10 mM a pH 7.9, NaCl 150 mM
y NP-40 0,1%). Las proteínas inmunoprecipitadas se resuspendieron en 50
µl de tampón de carga 2X (SDS 4%, glicerol 20%, Tris-HCl 100 mM a pH 7,5,
DTT 200 mM y azul de bromofenol), se calentó durante 5 minutos a 95ºC y
Materiales y Métodos
��
se separó en geles de SDS-poliacrilamida. La inmunodetección se llevó a
cabo según las condiciones descritas en el apartado anterior.
*Cedido por el laboratorio de la Dra. Ruscetti, Laboratory of Cancer Prevention, National
Cancer Institute-Frederick, Frederick, Maryland (USA).
3.6.4.Inmunomarcaje
La inmunodetección de la subunidad alfa-2b (αIIb/CD41/gpIIb) de la integrina
alfa-2b-beta-3 (αIIbβ3) se llevó a cabo mediante citometría de flujo utilizando
un anticuerpo anti-CD41 acoplado a isotiocianato de fluoresceína (CD41-
FITC). Se centrifugaron 3-5x105 células durante 5 minutos a 1000 rpm, se
lavó el pellet con PBS 1X frío, se resuspendió en una solución de PBS 1X
que contenía el anticuerpo a una concentración final de 0,2 µg/µl y se incubó
30 minutos a 4ºC. A continuación se lavó con PBS 1X frío y se resuspendió el
pellet en 300 µl de PBS 1X frío. Las muestras se analizaron en un citómetro
de flujo EPICS-XL Coulter usando una longitud de onda de 488 nm, emitida
por un láser de argón, con un pico de emisión de 525 nm. Se utilizó como
control un anticuerpo secundario acoplado a FITC.
TablaIII.Anticuerpos empleados en el desarrollo de esta tesis.
Anticuerpo CasaComercial Referencia Dilución
Fli-1 (C-19)
PU.1 (Spi-1) (T-21)
GATA-1 (N6)
α-Tubulina
c-myc (Clone 67P05)
Mad (C-19)
gp-70
Stat1
pStat1
Santa Cruz Biotech.
Santa Cruz Biotech.
Santa Cruz Biotech.
Sigma
NeoMarkers
Santa Cruz Biotech.
*No comercial
Cell Signaling
Cell Signaling
Sc-356
Sc-352
Sc-265
T 9026
MS-1054-P0
Sc:222
-
9172
9171
1:1000
1:1000
1:500
1:10000
1:300
1: 1000
1:10000
1:1000
1:1000
Materiales y Métodos
��
Nota: Se agradece especialmente a las siguientes personas por la cesión de
material biológico utilizado en la presente tesis doctoral:
Dr. Arthur I. Skoultchi, Albert Einstein College of Medicine (USA): plásmido
pEBBpuro.GATA-ER.
Dr. Yaacov Ben-David, Department of Medical Biophysics, University of
Toronto (Canadá): líneas celulares CB7 y DP18.
Dra. Sandra Ruscetti, Laboratory of Cancer Prevention, National Cancer
Institute-Frederick (USA): anticuerpo anti-gp70.
Dr. Timothy Bender, University of Virginia School of Medicine (USA): plásmido
pMTHbetaglobin.neo.
Dra. Françoise Moreau-Gachelin, Institut Curie (Francia): plásmido
C45a6b.
Dr. Olivier Delattre, Institut Curie (Francia): anticuerpo anti-Fli-1.
4. RESULTADOS
Resultados
��
4.1. Caracterización de líneas celulares eritroleucémicasresistentes a la acción de agentes inductores de ladiferenciación
La línea celular eritroleucémica MEL-DS19 deriva de progenitores
eritroides cuya diferenciación ha sido interrumpida o bloqueada por la
integración del complejo vírico Friend (Friend y col., 1966; Marks y Rifkind,
1978). Algunos compuestos químicos como el HMBA actúan de un modo aún
desconocido provocando el reinicio del programa de diferenciación (Marks
y col., 1978). Estas características han convertido a las células MEL en un
sistema idóneo para el estudio de las bases moleculares de la diferenciación
celular así como del mecanismo de acción de algunos agentes inductores
del proceso, como el HMBA, que podrían eventualmente utilizarse como
agentes terapéuticos en procesos tumorales.
En el presente trabajo se han establecido líneas celulares derivadas
de MEL-DS19 con el objeto de estudiar el mecanismo de acción del HMBA
sobre el bloqueo de la diferenciación eritroide. Estas líneas son capaces
de crecer de manera indefinida en presencia de HMBA aunque mantienen
características eritroleucémicas similares a las de la línea progenitora.
En este apartado se describe el establecimiento de estas líneas celulares
resistentes y se comparan algunos parámetros del crecimiento en cultivo
con los de las líneas parentales incluyendo la cinética de crecimiento, el
porcentaje de superviviencia, la distribución de las fases del ciclo celular, el
tamaño celular, la capacidad de diferenciación y la expresión de marcadores
de diferenciación y proliferación celular.
4.1.1. Establecimiento de líneas celulares eritroleucémicasresistentes(MEL-R)alosagentesinductoresdeladiferenciación
El porcentaje de diferenciación espontánea de un cultivo de células
MEL-DS19 creciendo exponencialmente es menor al 1%. Cuando se
exponen estos cultivos a tratamientos con inductores de la diferenciación,
tales como el HMBA, se desencadenan una serie de procesos que conducen
de manera irreversible a la diferenciación hacia el linaje eritroide. Según
resultados previos de nuestro y otros laboratorios, a partir de las 48 horas de
Resultados
�0
tratamiento con 5 mM HMBA el porcentaje de células diferenciadas aumenta
gradualmente hasta alcanzar alrededor del 90% a las 120 horas. En todos
los casos, un porcentaje reducido de células, que con HMBA ronda el 10%,
no responde al agente inductor y permanece en el estadio de proeritroblasto.
Con el fin de establecer cultivos estables a partir de células resistentes se
expusieron cultivos de células MEL-DS19 en presencia continua de HMBA.
La diferenciación inducida por el HMBA, al igual que ocurre durante la
eritropoyesis normal, va acompañada de una inhibición de la división celular.
Por lo tanto, en estas condiciones, sólo podían proliferar aquellas células
que mostraban una resistencia frente al inductor. La resistencia adquirida
se determinó cuantificando el porcentaje de células diferenciadas a distintos
tiempos mediante el ensayo de benzidina que pone de manifiesto las células
hemoglobinizadas (células B+) y, por lo tanto, diferenciadas (Figura 15a).
Después de 45 a 75 días de tratamiento se aisló una población de células
capaces de crecer en presencia de HMBA con un porcentaje de células
B+ inferior al 1%. Este proceso de selección se repitió tres veces bajo las
mismas condiciones y en todos los casos se obtuvo una población de células
con un porcentaje de células diferenciadas similar al de un cultivo de células
MEL indiferenciadas (Figura 15b).
Tal como se comentó en la introducción, además del HMBA existen
otros agentes químicos capaces de inducir la diferenciación de células
eritroleucémicas. Con el objeto de comprobar si la resistencia de las células
MEL-R es una respuesta específica al HMBA o, si por el contrario, es una
propiedad intrínseca de las células resistentes que inhibe el desbloqueo del
programa de diferenciación celular se analizó la respuesta de cultivos MEL-R
frente a tratamientos con otros agentes inductores de la diferenciación tales
como el DMSO, la hemina y el butirato de sodio. En el caso del tratamiento
con DMSO al 1% se partió de 3 cultivos independientes de MEL-DS19 y MEL-
R creciendo en fase exponencial. Para testar la capacidad de diferenciación
de la hemina y el butirato de sodio, además de los cultivos mencionados, se
utilizó la línea celular CB7, derivada de progenitores eritroides infectados
sólo con el F-MuLV, que es resistente al HMBA pero sensible al tratamiento
con hemina y butirato de sodio. Utilizando como en el caso anterior 3 cultivos
independientes, se expuso cada uno de ellos a hemina 50 µM o butirato de
sodio 0,5 mM a lo largo de 5 días de tratamiento. En todos los casos, al final
Resultados
��
a
MEL MEL-R0
20
40
60
80
100
No diferenciadas (B-)Diferenciadas (B+)
5 30 45 69 Días en HMBA
20
40
60
80
% C
élul
as B
+
MEL-RMEL-R2MEL-R3
MEL Líneas resistentes0 5 30 45 69 Días en HMBA
b
% C
élul
as
Figura15.Establecimientode líneaseritroleucémicasresistentesalHMBA.a) Se expusieron células MEL-DS19 (MEL) en presencia continua de HMBA 5mM. Se determinó el porcentaje de células diferenciadas a distintos tiempos mediante el ensayo de benzidina contabilizando el número de células coloreadas (que reaccionan con grupos heme de la hemoglobina) (B+) con respecto al número de células no coloreadas (B-). Se consideró resistentes a aquellas células que no se diferenciaban después de cinco días de tratamiento con HMBA. b) El proceso de selección se repitió 3 veces partiendo de distintos cultivos de células MEL-DS19.
del tratamiento, se contabilizó el porcentaje de células hemoglobinizadas.
De manera similar a lo observado con HMBA, el porcentaje de células
diferenciadas en presencia de DMSO se mantuvo por debajo del 3% en MEL-
R mientras que en las células MEL-DS19 alcanzó valores superiores al 90%
(Figura 16a). Los tratamientos con hemina y butirato de sodio resultaron en
un incremento del porcentaje de células diferenciadas en CB7 alcanzando
valores por encima del 10 y el 30%, respectivamente. La respuesta a estos
inductores de MEL-DS19 y MEL-R fue escasa, observándose sólo un aumento
significativo, mayor del 15%, en el caso de MEL-DS19 frente a butirato de
sodio (Figura 16b).
a
MEL MEL-R0
20
40
60
80
100
No diferenciadas (B-)Diferenciadas (B+)
5 30 45 69 Días en HMBA
20
40
60
80
% C
élul
as B
+
MEL-RMEL-R2MEL-R3
MEL Líneas resistentes0 5 30 45 69 Días en HMBA
b
% C
élul
as
Resultados
��
Con el propósito de comprobar la homogeneidad de los cultivos
resistentes en relación al bloqueo de la diferenciación se aislaron clones a
partir de un cultivo MEL-R utilizando un separador de células. Se analizó a
continuación la respuesta de cada uno de los clones a los agentes inductores
de la diferenciación. De 62 clones aislados se seleccionaron 8 en los cuales
se contabilizó el número de células diferenciadas en presencia de HMBA y
DMSO. Como se muestra en la Figura 17, en todos los clones el porcentaje
de células hemoglobinizadas fue inferior al 1%.
Hemina Butiratode sodio
10
20
30
% C
élul
as B
+
MEL
CB7MEL-R
b
2 5 10
20
40
60
80
Días en DMSO
% C
élul
as B
+MELMEL-R
a
Figura16.Resistenciaaotrosagentesinductoresdeladiferenciacióncelular.a) Los cultivos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R se trataron con DMSO al 1% y se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+) a distintos tiempos. b) Las células MEL-DS19, MEL-R y CB7 se mantuvieron en presencia de butirato de sodio 0,5 mM y hemina 50 µM. Al cabo de cinco días de tratamiento se contabilizó el número de células hemoglobinizadas (B+).
% C
élul
as B
+
HMBADMSO
MEL 7A 7H 8A 8E 10A 10C 11E11A
30
60
90
Clones MEL-R
Figura 17. Aislamiento de clonesresistentes.Se aislaron clones a partir de un cultivo de MEL-R utilizando un separador de células. De 62 clones aislados se seleccionaron 8 (7A, 7H, 8A, 8H, 8E, 10A, 10C, 11A y 11E) en los cuales se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+) en presencia de HMBA 5mM y DMSO al 1%.
Resultados
��
Por otra parte, se comprobó si la resistencia a reiniciar el proceso de
diferenciación dependía de la presencia continua del agente inductor o si, por
el contrario, las células adquirían características intrínsecas que les permitían
permanecer indefinidamente en el estadio de proeritroblasto. Las células
MEL-R se cultivaron en ausencia de HMBA durante distintos períodos de
tiempo (10, 20 y 30 días) y a continuación se expusieron nuevamente, durante
5 días, al agente inductor. El efecto sobre el desbloqueo de la diferenciación
se analizó contabilizando el número de células hemoglobinizadas (Figura
18). En todos los casos, el porcentaje de células B+ fue inferior al 1% lo cual
indicaba que las células mantenían la resistencia al HMBA aún después de
permanecer durante períodos prolongados en ausencia del agente inductor.
En conjunto, los resultados obtenidos demostraron que las células MEL-
R han adquirido (o perdido) características que inhiben la reactivación del
programa de diferenciación celular en respuesta a los agentes inductores.
5
15
% C
élul
as B
+
5
15
25Día
s si
n H
MB
A
HMBA+ HMBA-
0d 10d 20d 30d 5d
- HMBA + HMBA
MEL-R
Figura18. Irreversibilidadde la resistenciaalHMBA.El esquema representa el diseño del experimento que consta de una fase variable (10, 20 ó 30 días) sin HMBA y una fase constante (5 días) en presencia de HMBA. Al final de esta segunda fase se contabilizaron las células B+. Se cultivaron células MEL-R en ausencia de HMBA durante 10, 20 ó 30 días. A continuación, se agregó HMBA al medio de cultivo y al cabo de 5 días se determinó el porcentaje de células diferenciadas (B+).
Resultados
��
4.1.2. Expresión de marcadores de la diferenciacióneritropoyética
Una de las características de la diferenciación de células
eritroleucémicas, así como de otros linajes celulares, son los cambios en la
expresión génica que ocurren a lo largo del proceso. Así, se ha observado en
las primeras fases una inhibición de la expresión de genes relacionados con
estados proliferativos y al final del proceso un incremento en la expresión
de genes específicos del linaje eritroide (Figura 19) (Ramsay y col., 1986).
Con el objeto de comprobar si las células MEL-R presentaban un patrón de
expresión similar al de las células parentales se llevaron a cabo Northern
blots utilizando sondas correspondientes al oncogen c-myc, marcador de
estados proliferativos, y al gen de la β-globina, característico del fenotipo
diferenciado. Los resultados del patrón de expresión de ambos genes se
presentan en la Figura 19. Tanto en las células MEL-DS19 no tratadas con
HMBA como en las MEL-R se detectó una señal intensa correspondiente al
transcrito de 2,3 kb de c-myc. Como era de esperar, en células MEL-DS19
tratadas con HMBA durante 72 horas, cuando alrededor del 80% de las
MEL
HMBA+-
PU.1c-mycc-myb
GATA-1β-globinamad1
a0 72 RMEL
c-myc
β-globina
18S
b
Figura19.Expresióndemarcadoresdeestadiosproliferativosydiferenciados.a) Cambios de expresión génica que se producen en las células MEL-DS19 (MEL) en respuesta al tratamiento con HMBA. Se muestran dos tubos que contienen el pellet de células MEL-DS19 creciendo en fase exponencial (izquierda) o después del tratamiento con HMBA (derecha). El estadio proliferativo (pellet blanco) se caracteriza por la expresión de protoncogenes como c-myc, c-myb y PU.1. En el estadio diferenciado (pellet rojo) se produce una inactivación de los genes característicos del estadio inmaduro junto con una activación de genes relacionados con la salida del ciclo celular, como mad1, y la adquisición del fenotipo maduro, como GATA-1 y β-globina. b) Northern blots de células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y tratadas con HMBA durante 72 horas (72) y células MEL-R (R). La hibridación se llevó a cabo con sondas radiactivas específicas para c-myc y β-globina. La tinción con bromuro de etidio se utilizó para verificar integridad del RNA y la carga equitativa en cada muestra.
Resultados
��
células están diferenciadas, se observó una reducción significativa de la
expresión del protoncogen. Lo contrario se observó en el caso del transcrito
de 0,6 kb correspondiente al mRNA de β-globina. Tanto en MEL-R como
en células MEL-DS19 indiferenciadas se observó una señal débil que se
corresponde con una expresión basal del gen. En células MEL-DS19 tratadas
con HMBA, sin embargo, se visualizó una banda conspicua, producto de la
transcripción intensa del gen de la β-globina, dato que corrobora resultados
previos (Vanegas y col., 2003). Estos experimentos demostraron que las
células MEL-R, aún en presencia de HMBA, permanecen en un estado
proliferativo indiferenciado, similar al de las células parentales no tratadas
con el inductor.
4.1.3.Viabilidadcelular,cinéticadecrecimientoydistribucióndelasdistintasfasesdelciclocelulardecultivosMEL-R
Con el objeto de determinar si el tratamiento continuo con HMBA
afectaba a la viabilidad celular se calculó el porcentaje de células viables
utilizando el método de exclusión de azul de tripano. Se partió de 3
cultivos independientes de MEL y MEL-R creciendo en fase exponencial y
se contabilizó el número de células teñidas (muertas) frente al número de
células no teñidas (vivas). Tal y como se representa en la Figura 20a, durante
los primeros 3 días de cultivo el número de células viables en ambos casos
fue mayor al 95%. Estos resultados indicaron que la presencia continua del
HMBA no afecta significativamente a la viabilidad de las células MEL-R.
Para comparar la cinética de crecimiento de las células MEL-DS19 y
MEL-R se utilizaron en cada caso 3 cultivos independientes creciendo en
fase exponencial y se recogieron alícuotas a intervalos de 24 horas (Figura
20b). El tiempo de duplicación de MEL alcanzó valores de entre 10-12 horas,
coincidiendo con resultados previos de nuestro y otros laboratorios (Marks y
Rifkind, 1978; Vanegas y col., 2003). El tiempo de duplicación de MEL-R, sin
embargo, difiere considerablemente del de las líneas parentales alcanzando
valores de entre 16-18 horas. Entre las 72 y las 96 horas los valores se
estabilizan en ambos casos debido probablemente a la saturación de los
cultivos.
Resultados
��
Se ha comprobado que a lo largo del tratamiento con HMBA y a
medida que las MEL-DS19 se diferencian se produce una inhibición de la
proliferación celular debido a una acumulación gradual de las células en la
fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993; Rifkind y col., 1996). Con
el fin de comparar la distribución de las distintas fases del ciclo celular
de cultivos MEL-R con respecto a las células parentales a lo largo de la
diferenciación se analizaron muestras de cada población mediante citometría
de flujo. Previamente, se determinó el porcentaje de células diferenciadas
mediante el ensayo de benzidina. Como se muestra en la Figura 21a, se
observó que la distribución entre las fases G1, S y G2+M de las células
0
5
10
15
0 24 48 72 96
15
10
5
24h0h 48h 72h 96h
Nº c
élul
as x
105
MELMEL-R
b
80
90
100
24h0h 48h 72h 96h
% C
élul
as v
iabl
esMELMEL-R
a
Figura 20. Viabilidad y cinética de crecimiento de células MEL-R. a) Curva de viabilidad de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R. Se partió de cultivos creciendo en fase exponencial y se contabilizó el porcentaje de células viables cada 24 horas durante 5 días consecutivos. b) Curva de crecimiento de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R. Se analizaron en cada caso 3 cultivos independientes creciendo en fase exponencial a una concentración de 1x105 células/ml y se determinó el número de células/ml cada 24 horas durante 5 días.
Resultados
��
MEL varía según el tiempo de exposición al HMBA. Tal y como se describió
previamente en cultivos asincrónicos de células MEL (Kiyokawa y col.,
1993; Vanegas y col., 2003), se observó una acumulación gradual de las
células en G1 que comienza a las 48 horas y se prolonga hasta el final del
tratamiento (96 horas) coincidiendo con un incremento en el porcentaje de
células hemoglobinizadas (Figura 21b). El perfil que presentaron las células
MEL-R coincide con el de las células MEL indiferenciadas (0hr), mostrando
una distribución característica de estados proliferativos.
a b
Contenido de DNA
0hr
48hr
MEL-R
2C 4C
96hrNúm
ero
de c
élul
as
Figura21.DistribucióndelasfasesdelciclocelularencélulasMEL-R.a) Las distintas muestras se trataron con ioduro de propidio (IP) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se examinó la distribución a lo largo del ciclo celular de células MEL-DS19 indiferenciadas (0hr) y diferenciadas con HMBA durante 48 y 96 horas y células MEL-R. b) En paralelo, se procesó una alícuota de cada muestra según el test de benzidina.
Resultados
��
4.1.4. Incremento del tamaño celular de MEL-R. Es c-myc elresponsable?
El fenotipo del proeritroblasto transformado con el complejo vírico Friend
que da lugar a las células MEL-DS19 difiere significativamente del producto
diferenciado después de una inducción con HMBA. Las consecuencias más
llamativas radican en una disminución sustancial del tamaño celular, una
condensación de la cromatina y, en circunstancias especiales, la exclusión
nuclear en la fase diferenciada (Figura 22).
Figura 22. Diferenciación de células MEL-DS19 adheridas a una matriz de fibronectina. Los cultivos de MEL-DS19 (MEL) se mantuvieron en presencia de HMBA 5mM en placas de petri pre-tratadas con fibronectina. Preparaciones citológicas de cultivos no tratados y tratados con HMBA durante 4, 5 ó 6 días. Se observan proeritroblastos, normoblastos policromáticos y ortocromáticos y reticulocitos que han perdido el núcleo. Aumento: 600X.
El fenotipo de las MEL-R es similar al que presentan las parentales
MEL-DS19 a excepción del tamaño celular, significativamente mayor
comparado con el de las células parentales indiferenciadas. En la Figura
23a se muestra un estudio comparativo de los tamaños relativos de MEL-R
y MEL-DS19 realizado mediante la determinación de la dispersión frontal
(forward scattering, FS) en un citómetro de flujo, datos que corroboran las
observaciones realizadas al microscopio óptico (Figura 23b). Se estimó que
el tamaño de las MEL-R es aproximadamente un 25% mayor que el de las
MEL DS-19 indiferenciadas que, a su vez, son un 25% más grandes que las
MEL DS-19 diferenciadas. Este resultado llevó a especular con una posible
relación entre el incremento del tamaño celular y la expresión aberrante de
c-myc en MEL-R. La regulación del crecimiento celular está generalmente
acoplada a la proliferación celular aunque, en células tumorales, este
MEL
Días en HMBA
3 - 4 5 >6
Proeritroblasto N. policromático N. ortocromático Reticulocito
Resultados
��
acoplamiento puede estar alterado. Se ha demostrado que la oncoproteína c-
Myc juega un papel esencial en este proceso. La inactivación de c-myc retarda
el crecimiento y reduce el tamaño celular mientras que la sobreexpresión
del oncogen incrementa estos valores (Johnston y col., 1999; Piedra y col.,
2002).
Tamaño celular
120hr
0hr
MEL-R
a b
Figura 23. Comparación del tamaño celular de células MEL-DS19 y MEL-R. a) Se determinó el tamaño celular relativo de células MEL-DS19 indiferenciadas (0hr) y diferenciadas con HMBA (120hr) y células MEL-R mediante la medición de la dispersión frontal (forward scattering) en un citómetro de flujo. b) Alícuotas de las muestras utilizadas en a) teñidas con May Grünwald-Giemsa. Aumento: 400X.
Los niveles de expresión de c-myc en las células MEL-R son similares
a los detectados en las líneas parentales (Figura 19b) lo cual descarta la
sobreexpresión del oncogen como posible causa del aumento del tamaño
celular de MEL-R. Sin embargo, c-Myc podría ser el responsable de este
aumento a través de una mayor estabilidad de la oncoproteína. En tumores
primarios y ciertos tipos de linfomas se ha observado con frecuencia la
presencia de mutaciones puntuales en el dominio de transactivación, más
específicamente en la región conocida como caja Myc 1 (MB1) involucrada
en la degradación de c-Myc (véase esquema en Figura 24) (Albert y col.,
1994; Axelson y col., 1995; Bhatia y col., 1993; Clark y col., 1994; Murphy y
col., 1986; Rabbitts y col., 1983; Showe y col., 1985).
Resultados
�0
Con el fin de localizar posibles mutaciones que pudieran alterar
la estabilidad de la oncoproteína en MEL-R se comparó la secuencia de
aminoácidos de c-Myc de células MEL-DS19 y MEL-R con la del genoma
de ratones BALB/c (Figura 25). El grado de similitud fue del 100% en los
3 casos, lo cual descarta la hipótesis de la existencia de mutaciones en la
secuencia codificante de c-myc como posible causa de una estabilización de
la proteína e, indirectamente, del incremento del tamaño celular.
Figura24.Representaciónesquemáticadelaestructuradelaproteínac-Myc. Se indican las regiones conservadas. MB1, caja Myc 1; MB2, caja Myc 2; TAD, dominio de transactivación; NLS, señal de localización nuclear; b, región básica; bHLHZip, motivo tipo”helix-loop-helix” y motivo tipo “cremallera de leucina”. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la MB1, incluyendo los sitios de fosforilación Treonina (T) 58 y Serina (S) 62. Se indican con un asterisco (*) los sitios más frecuentemente mutados.
Figura25.Alineamientode lasecuenciadeaminoácidosde laproteínac-Myc.Comparación de las secuencia de aminoácidos de la proteína c-Myc de MEL-DS19 y MEL-R con la del genoma de ratones BALB/c utilizando el programa Clustal del EMBL-EBI. En el recuadro superior se indican los aminoácidos de la caja Myc 1 (MB1). Los aminoácidos representados en rojo corresponden a los sitios de fosforilación Treonina (T) 58 y Serina (S) 62.
MB1 TAD MB2 NLS b HLHZipc-Myc
APSEDIWKKFELLPTPPLSPSR***** ***58 62
P P
MPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATSMPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATSMPLNVNFTNRNYDLDYDSVQPYFICDEEENFYHQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVATS********************************************************************************
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AYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGAAYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGAAYILSIQADEHKLTSEKDLLRKRREQLKHKLEQLRNSGA***************************************
10 20 30 40 50 58 62 70 80
90 100 110 120 130 140 150 160
170 180 190 200 210 220 230 240
250 260 270 280 290 300 310 320
330 340 350 360 370 380 390 400
410 420 430
MELMEL-RRatón
MELMEL-RRatón
MELMEL-RRatón
MELMEL-RRatón
MELMEL-RRatón
MELMEL-RRatón
MB1
Resultados
��
4.1.5. Potencial de MEL-R para la diferenciación hacia el linajemegacariocítico Algunos investigadores han sugerido que las líneas eritroleucémicas
de ratón, al igual que ocurre con las humanas K562 y HEL, podrían derivar
hacia distintos linajes hematopoyéticos (revisado en (Tsiftsoglou y col.,
2003b)). Los linajes eritroide y megacariocítico provienen de un progenitor
bipotencial común y existen evidencias que indican que eritroblastos y
megacarioblastos expresan marcadores específicos comunes a ambos
linajes celulares (Paoletti y col., 1995). El fenotipo de las células MEL-R, en
especial el tamaño celular, podría ser indicativo de que se ha seleccionado
una población que ha perdido la capacidad de diferenciación eritroide en
favor de una diferenciación megacariocítica. Con el fin de investigar esta
posibilidad se trataron los cultivos MEL-R con el éster de forbol TPA, un
agente inductor de la diferenciación megacariocítica. En el análisis del
contenido de DNA y la distribución de las células en G1, S y G2+M después
del tratamiento con distintas dosis de TPA no se observaron indicios de
poliploidización, característica esencial de megacariocitos, ni cambios en la
distribución de las fases del ciclo celular (Figura 26).
Figura26.DistribucióndelciclocelularencélulasMEL-DS19yMEL-Rtratadasconunagenteinductordeladiferenciaciónmegacariocítica.Se expusieron cultivos de células MEL-DS19 y MEL-R a dosis de 1 y 10 nM de TPA durante 96 horas. El contenido de DNA se analizó mediante tinción con ioduro de propidio (IP) y citometría de flujo.
MEL-DS19
Control
TPA 1 nM
MEL-R
Núm
ero
de c
élul
as
TPA 10 nM
2C 4C 8C 8C2C 4C
Resultados
��
Se analizó además la expresión de la integrina alfa-2b-beta-3 (integrina alfa-2b-beta-3 (αIIbβ3),
un marcador de membrana específico de megacariocitos (Figura 27). Tanto
en MEL-R como en MEL-DS19, no se detectó un incremento en el porcentaje
de células CD41+ en respuesta al inductor.
Aún cuando los tratamientos con TPA no provocaron la poliploidización
de los cultivos MEL-R, se observó en ocasiones que algunos clones sufrían
procesos de tetraploidización (Figura 28). Este fenómeno ocurría en general
después de largos períodos de cultivo, tras repetidos ciclos de división celular.
No obstante, las células permanecían siempre en un estado tetraploide y no
prosperaban hacia una ploidía más compleja.
En conjunto estos resultados descartan que las líneas resistentes
respondan a estímulos dirigidos a una diferenciación megacariocítica. Esto
hace suponer que las MEL-R no corresponden a precursores que se han
desviado del linaje eritroide, a favor del megacariocítico, sino que al igual
que las MEL-DS19 están bloqueadas en su capacidad de diferenciación. En
el caso de las MEL-R, sin embargo, han perdido la capacidad de respuesta
a los inductores clásicos de diferenciación eritroide.
0,5%1,2%
1,5%1,0%
TPA 10 nM
TPA 1 nM
0,7%0,7%
MEL-DS19 MEL-R
CD41
Control
Nº d
e cé
lula
s
Figura27.Expresióndelaalfa-2b-beta3-integrina(αIIbβ3)encélulasMEL-DS19yMEL-RtratadasconTPA.Se cultivaron células MEL-DS19 y MEL-R en presencia de TPA 1 y 10 nM durante 96 horas y se analizó la expresión la subunidad αIIb (CD41/gpIIb) mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD41. Las barras rojas y los números indican el porcentaje de células CD41 positivo.
Resultados
��
4.1.6. Expresión de genes involucrados en la transiciónproliferación-diferenciación
A lo largo del proceso de diferenciación de las células MEL hacia el
linaje eritroide se producen cambios en la expresión de genes relacionados
con la inhibición de la proliferación celular y la adquisición del fenotipo
diferenciado (Garcia-Sacristan y col., 2005; Kirsch y col., 1986; Lachman y
Skoultchi, 1984; Rao y col., 1997; Stopka y col., 2005; Vanegas y col.,
2003). Con el fin de comparar el patrón de expresión de genes cuyos niveles
cambian durante el proceso de diferenciación eritroide se realizaron RT-
PCRs semicuantitativas en células MEL-R y en células MEL tratadas y no
tratadas con HMBA (Figura 29). Como control se amplificó un fragmento
de 451 pb correspondiente al mRNA de GAPDH. Se seleccionaron genes
pertenecientes a dos grupos esenciales para la diferenciación eritroide,
Tiempo (meses)
MEL-R3
MEL-DS19
Clon 7H
2C 4C 8C 2C 4C 8C 2C 4C 8C
1 2 4
Figura28.Tetraploidizaciónespontáneadelíneasresistentes.Se analizó el contenido de DNA mediante incorporación de ioduro de propidio (IP) de cultivos de células MEL-DS19, del clon resistente 7H y de células resistentes MEL-R3. Las muestras se tomaron a distintos tiempos a lo largo de 4 meses consecutivos.
Resultados
��
un grupo relacionado con la regulación de la proliferación celular y otro
relacionado con el estado diferenciado. Dentro del primer grupo se analizó
la expresión de c-myc y c-myb, dos reguladores positivos de la proliferación
celular cuyos niveles disminuyen en la primeras 48 horas de tratamiento,
coincidiendo con la determinación irreversible de la células hacia el linaje
eritroide (Dmitrovsky y col., 1986; Lachman y Skoultchi, 1984; Smith y
Prochownik, 1992). Por otro lado, se determinó la expresión de inhibidores
de la proliferación celular, como mad1, p27 y p21, cuyos niveles en los
primeros dos casos aumentan significativamente en las células inducidas
coincidiendo con la salida del ciclo celular (Hsieh y col., 2000; Larsson y
col., 1994). En cuanto al segundo grupo, se analizó la expresión de factores
de transcripción que regulan la activación de genes específicos del linaje
eritroide. Se estudió en este caso el patrón de expresión de GATA-1 y EKLF,
cuyos niveles aumentan en las etapas finales de la diferenciación. Por otra
parte, se analizó la expresión de PU.1 que actúa como antagonista de GATA-
1, cuyos niveles disminuyen en las primeras horas de tratamiento con el
inductor. En todos los casos, a excepción de PU.1, el patrón de expresión de
MEL-R fue similar al de las células parentales no tratadas con HMBA.
c-myc
c-myb
mad1p27
p21
GAPDH
48 960 RMEL
GATA-1
EKLF
PU.1GAPDH
48 960 RMEL
Figura29.InactivacióndePU.1encélulasMEL-R.Se sintetizó cDNA de cadena sencilla a partir de RNA de células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R). La expresión de genes relacionados con la regulación de la diferenciación eritroide se analizó mediante RT-PCR-semicuantitativa utilizando cebadores específicos (ver Materiales y Métodos). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Como control de carga se amplificó un fragmento de 451 pb correspondiente al cDNA de GAPDH.
Resultados
��
El patrón de expresión observado para PU.1 en MEL-DS19, al igual
que el de c-myc y c-myb, coincide con el comportamiento bimodal descrito
anteriormente y, como ya se sugirió entonces, es la consecuencia de una
inhibición general de la expresión génica durante el período de determinación
(Vanegas y col., 2003). De esta forma, se comienza con niveles de expresión
muy altos que disminuyen drásticamente entre las 12 y las 48 horas de
tratamiento con HMBA para luego recuperarse parcialmente a las 96 horas.
Sin duda, el resultado más sorprendente fue la falta de expresión
de PU.1 en las células MEL-R. Este resultado fue confirmado mediante
Northern blot (Figura 30a) y Western blot incluyendo clones derivados de
MEL-R (R7A y R11A), una segunda población de células resistentes (MEL-
R2) y células resistentes mantenidas en ausencia de HMBA (R-H) (Figura
30b). Paralelamente, se analizó la expresión de la proteína GATA-1, la
principal diana a través de la cual PU.1 inhibe la diferenciación eritroide. La
utilización de un anticuerpo anti-GATA-1 permitió detectar una banda de 49
KDa cuya intensidad fue similar en las líneas resistentes y en las MEL-DS19
parentales (Figura 30c).
PU.1
18S
0 R72a MEL
7A 11A
MEL-R2
R-H
PU.1
MEL-R
α-Tubulina
b
cGATA-1
7A 11A
MEL-R2
R-HMEL-R
α-Tubulina
96 0MEL
MEL
Figura30.AnálisisdelaexpresióndePU.1yGATA-1enlíneasresistentes.a) Northern blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA durante 72 horas (72) y células MEL-R (R) hibridado con el cDNA de PU.1 marcado radiactivamente. El gel teñido con bromuro de etidio se utilizó para verificar la integridad del RNA y la carga equitativa en cada muestra. b) Western blot de células MEL-DS19 (MEL), células MEL-R, clones resistentes (7A y 11A), células MEL-R2 y células MEL-R cultivadas en ausencia de HMBA durante 7 días (R-H). La membrana se incubó con un anticuerpo anti-PU.1. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina. c) Western blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (96), células MEL-R, clones resistentes (7A y 11A), células MEL-R2 y células MEL-R cultivadas en ausencia de HMBA durante 7 días (R-H). La membrana se incubó con un anticuerpo anti-GATA-1. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina.
Resultados
��
Estos resultados demostraron que el silenciamiento de PU.1 en
líneas eritroleucémicas no es suficiente para desbloquear la diferenciación
eritropoyética. Por otra parte, sugieren que la actividad de GATA-1, presente
en las MEL-R, tiene que estar impedida por un factor distinto a PU.1.
4.2.CausasdelainactivacióndePU.1enMEL-R
El proceso de transformación de la células MEL, tal como se describe
en la introducción de la presente tesis, se lleva a cabo en dos fases bien
definidas. Durante la primera fase se produce una activación constitutiva del
receptor de eritropoyetina (EpoR) dando lugar a una proliferación policlonal
de progenitores eritroides (Li y col., 1990). La segunda fase se manifiesta
como una expansión clonal de células malignas en las que se ha producido
la integración del SFFV en una zona cercana al promotor del gen Sfpi/PU.1
induciendo la activación constitutiva de PU.1 (Moreau-Gachelin y col., 1988;
Paul y col., 1989; Paul y col., 1991).
Se ha constatado y descrito en el apartado 4.1.6. que, contrariamente
a lo esperado, la expresión de PU.1 está inhibida en las líneas resistentes.
En este apartado se analizan las posibles causas de la inactivación de PU.1
en MEL-R, tales como los cambios en la expresión de la glicoproteína gp55
del SFFV, la pérdida de la integración del SFFV en el locus Sfpi y los posibles
cambios epigenéticos en el gen que codifica para PU.1.
4.2.1.Expresióndelaglicoproteínagp55delSFFVenMEL-R
Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de PU.1
depende de la activación constitutiva del EpoR mediada por la glicoproteína
gp55 del SFFV (Afrikanova y col., 2002; Quang y col., 1997). Con el objeto de
comprobar si la inactivación de PU.1 en cultivos MEL-R se debía a cambios
en la expresión de la gp55 se efectuó un análisis comparativo de la expresión
de la glicoproteína en las células MEL-R y las líneas parentales MEL-DS19
indiferenciadas y diferenciadas. Ante la falta de un anticuerpo específico
para la gp55 el análisis se llevó a cabo mediante Western blot utilizando un
anticuerpo policlonal anti-gp70, cedido por el laboratorio de la Dra. Sandra
Resultados
��
Ruscetti, que reconoce tanto la gp70 del MuLV así como la gp55 del SFFV
(véase esquema en la Figura 31). Como control se utilizaron extractos totales
de la línea celular DP18, cedida por el laboratorio del Dr. Yacoov Ben-David,
derivada de ratones infectados sólo con el SFFV. Como se muestra en la
Figura 31, se observó un alto nivel de expresión de la proteína gp55 tanto
en células MEL-DS19 indiferenciadas como en las MEL-R. En las células
MEL-DS19 tratadas con HMBA durante 96 horas, cuando más del 90% de las
células están diferenciadas, se observó una disminución en la expresión de
la glicoproteína. Este descenso es debido a una disminución generalizada
de la expresión durante la diferenciación que ocurre también en el caso de
la gp70 y que se ha descrito en otras ocasiones (Vanegas y col., 2003).
En resumen, estos resultados indicaron que la glicoproteína gp55 del
SFFV permanece activa en las células MEL-R, al igual que en las células
progenitoras.
MuLV gp70
ExtracelularMembranaIntracelular
MCF gp70
MuLV gp15Único
Rico enProlinas
Rico enProlinas
Deleciónen SFFV
CCCCCC
C
C
CCCCCC
C
C
CC
CC
CCC
CC
C
CCC
C
C
Friend MCFMuLV
SFFV
a
0 96 RMEL
gp70
gp55
α-Tubulina
DP18b
Figura31.Análisisdelaexpresióndelaglicoproteínagp55encélulasMEL-R.a) Comparación del producto codificado por el gen env del Friend mink cell focus-forming (F-MCF) MuLV (80 kDa) y el SFFV (55 KDa) donde se representa, entre otras cosas, la región derivada de la glicoproteína gp70 del MuLV. C= residuos de cisteína b) Western blot de células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (96), células MEL-R (R) y células DP18 utilizando un anticuerpo policlonal anti-gp70 que reconoce tanto la gp70 del MuLV como la gp55 del SFFV. La membrana se incubó además con un anticuerpo anti-α-Tubulina como control de carga.
Resultados
��
4.2.2.AnálisisdelaintegracióndelSFFVenellocusSfpi/PU.1
Una segunda causa probable de la inactivación de PU.1 en MEL-R
sería la pérdida de la integración del SFFV en el locus Sfpi/PU.1. Con el
propósito de comprobar este supuesto se procedió a analizar la localización
del provirus en las líneas resistentes. El DNA genómico aislado a partir de
células MEL-DS19 y MEL-R y de tejidos de ratones BALB/c se digirió con
las enzimas de restricción BamHI y EcoRV y se analizó mediante Southern
blot (Figura 32). Se utilizó como sonda el plásmido C45a6b que contiene un
fragmento PstI- PstI de 800 pb correspondiente a las posiciones -12353 a
-13124 del locus PU.1 murino y se localiza cerca del extremo 5’ del LTR del
SFFV (Probe A en (Moreau-Gachelin y col., 1988)) (véase esquema de la
Figura 32). Los resultados obtenidos con ambas enzimas evidenciaron una
banda común a las tres muestras correspondiente al alelo normal de Sfpi/
PU.1, de aproximadamente 10,6 kb en el caso de BamHI y 23,4 kb en el de
EcoRV (Figura 32b).
b
a
SFFV-P1 2 3 4 5
B BRV RVC45a6b
Ratón
MELMEL-
R
9.4
6.5
Ratón
MELMEL-
R
BamHI EcoRV
23
9.4
Figura32.AnálisisporSouthern blotdelaintegracióndelSFFVenellocusSfpi-1encélulasMEL-R.a) Esquema del locus Sfpi-1/PU.1 donde se indica la zona de integración del SFFV-P, los exones que codifican para la proteína PU.1 (1-5, segmentos en verde), la sonda utilizada para analizar la integración del virus (C45a6b) y los sitios de corte de las enzimas de restricción BamHI (B) y EcoRV (RV). b) Se digirió DNA genómico de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R y de tejidos de ratones BALB/c con las enzimas de restricción BamHI o EcoRV y se analizó mediante Southern blot utilizando la sonda C45a6b que contiene un fragmento PstI de 800 pb (sonda A) correspondiente al locus PU.1 murino. Los círculos rojos indican la banda correspondiente al alelo en el cual está integrado el provirus.
Resultados
��
Tanto en MEL-DS19 como en MEL-R se detectó además una banda
adicional de menor tamaño, correspondiente al alelo en el cual se ha integrado
el virus (Figura 32b). El tamaño de la banda es similar en ambas muestras,
aproximadamente 6 kb en el caso de BamHI y 9 kb en el de EcoRV, lo cual
demuestra que la integración del SFFV ocurre en el contexto del locus Sfpi/
PU.1 y en la misma localización tanto en MEL-DS19 como en MEL-R.
4.2.3.CambiosepigenéticosenellocusSfpi-1/PU.1
Los resultados obtenidos en los dos apartados anteriores permitieron
corroborar que el gen env del SFFV que codifica para la gp55 estaba activo
en MEL-DS19 y MEL-R y que el sitio de inserción del SFFV en el locus Sfpi/
PU.1 era similar en ambas líneas celulares. Por lo tanto, se descartó que
estos dos eventos fueran las causas directas del silenciamiento de PU.1
en MEL-R. Se planteó entonces la posibilidad de que hubiera diferencias a
nivel epigenético. Para testar esta hipótesis se llevaron a cabo experimentos
utilizando dos agentes ampliamente empleados en diversos sistemas para
estudiar modificaciones epigenéticas: la 5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-
dC), un análogo de la citosina capaz de inhibir la metilación del DNA y la
Tricostatina A (TSA) un inhibidor de las deacetilasas de histonas (Issa y
Byrd, 2005; Yoshida y col., 1990). Previamente, se efectuaron ensayos para
determinar la dosis óptima de 5-Aza-2-dC que no comprometiera la viabilidad
celular (Figura 33).
% C
élul
as v
iabl
es
20
40
60
80
100
0h 24h 48h 96h 120h72h
0,8 µM
0,2 µM
1 µM5 µM10 µMControl
0,4 µM
Figura 33. Determinación delasdosisóptimade5-Aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-2-dC). Se trataron cultivos de células MEL-R en crecimiento exponencial con distintas concentraciones de 5-Aza-2-dC (0,2; 0,4; 0,8, 5 y 10 µM) y se determinó el porcentaje de células viables cada 24 horas durante 5 días consecutivos.
Resultados
�0
Se seleccionaron dosis de entre 0,4 y 0,8 µM en donde se observó que
el porcentaje de células viables alcanzaba valores superiores al 50%
después de 96 horas de tratamiento. La expresión de PU.1 en MEL y MEL-
R se determinó mediante RT-PCR semicuantitativa. Después de 24 horas
de tratamiento con 0,4 µM de 5-Aza-2-dC se observó en todos los casos
una banda de 0,8 kb correspondiente al producto de amplificación de PU.1
(Figura 34a). Por el contrario, después de un tratamiento con TSA durante
5 ó 24 horas se observó un producto amplificado sólo en MEL-DS19 (Figura
34b). De estos resultados se deduce que el tratamiento con 5-Aza-2-dC, a
diferencia del TSA, provoca la activación de PU.1 en las MEL-R. Esto induce
a pensar que al menos parte del locus Sfpi/PU.1 estaría metilado en las
células MEL-R, siendo ésta una de las causas de la inactivación de PU.1 en
las líneas resistentes.
a MEL MEL-RAza+ + -PU.1
GAPDH
b
PU.1
GAPDH
5 h 24 h CRT-
TSAM MMR RR
Figura34.ReactivacióndePU.1encélulasMEL-Rtratadascon5-Aza-2-dC.a)Los cultivos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R se trataron con 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 µM durante 24 horas y se analizó la expresión de PU.1 mediante RT-PCR semicuantitativa. b) Las células MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) se cultivaron en presencia de Tricostatina A (TSA) 50 nM durante 5 y 24h. A continuación se analizó la expresión de PU.1 mediante RT-PCR semicuantitativa.
Debido a que el tratamiento con 0,4 µM de 5-Aza-2-dC inducía la
expresión de PU.1 se analizó el efecto que esta inducción podría ejercer
sobre la diferenciación de MEL-R, en ausencia o presencia de HMBA.
Los resultados obtenidos, representados en la Figura 35, demostraron
que el tratamiento con 5-Aza-2-dC no es suficiente para provocar la
diferenciación de los cultivos y los porcentajes de células B+ obtenidos son,
consecuentemente, insignificantes. Sin embargo, en presencia de HMBA se
observó un incremento importante en el porcentaje de células diferenciadas
que alcanzó valores superiores al 25%.
Resultados
��
72 hr 96 hr 120 hr 144 hr
30
20
25
15
10
5
% C
élu
las
B+ Aza 0,8 µM
Control
Aza 0,4 µM/HMBAAza 0,8 µM/HMBA
Aza 0,4 µM
Figura 35. El tratamientocon 5-Aza-2-dC induce ladiferenciación de MEL-Ren presencia de HMBA.Los cultivos de células MEL-R se mantuvieron en medio conteniendo 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 ó 0,8 µM en presencia o ausencia de HMBA 5 mM durante 5 días y se determinó el porcentaje de células hemoglobinizadas (B+).
De estos resultados se deduce que la metilación del DNA estaría
implicada en la resistencia de las células MEL-R a reiniciar el programa de
diferenciación. La demetilación del DNA sería insuficiente para desbloquear
la diferenciación aunque haría a las células receptivas a la acción de un
agente inductor como el HMBA. Esto no aclara, sin embargo, qué gen o
genes son los “protagonistas” de esta respuesta.
4.2.4.EsPU.1necesarioparaunarespuestaalHMBA?
Los resultados del apartado anterior demostraron que el tratamiento de
las células MEL-R con 5-Aza-2-dC resulta en una reactivación de la expresión
de PU.1. Paralelamente, se ha constatado que este tratamiento induce un
desbloqueo de la diferenciación en presencia de HMBA. A la vista de estos
hechos, se especuló con la idea de que la inactivación de PU.1 podría ser
la causa del bloqueo de la respuesta de las células MEL-R al HMBA, en
cuyo caso la sobreexpresión de PU.1 sería capaz de revertir el proceso.
Para investigar esta posibilidad se establecieron líneas resistentes estables
capaces de sobreexpresar PU.1. Se clonó el fragmento correspondiente a la
zona codificante de PU.1 en el vector inducible pEBBpuro.ER, de forma que
se obtuvo una forma condicional de PU.1 fusionada al dominio de unión a
estrógeno del receptor de estrógeno humano (ER) que se induce en presencia
de β-estradiol (Figura 36a). Previo a las transfecciones, se comprobó la
Resultados
��
fidelidad de la secuencia así como la correcta localización del marco de
lectura con respecto al epítopo ER. La funcionalidad de la proteína de fusión
PU.1-ER en los transfectantes se analizó mediante Western blot (Figura
36b). El efecto de la expresión ectópica de PU.1 sobre un posible desbloqueo
de la diferenciación en respuesta al HMBA se determinó contabilizando el
número de células hemoglobinizadas en cultivos tratados con β-estradiol.
Como se muestra en la Figura 36c, al cabo de 5 días de tratamiento con el
agente inductor, no se observó un incremento en el porcentaje de células
diferenciadas en los transfectantes que expresaban PU.1 exógeno. Por
otra parte, se comprobó que la inducción de la proteína de fusión PU.1-ER
provocaba un retraso en la cinética de crecimiento de los transfectantes
(Figura 36d). Esto último coincide con estudios previos en donde se demuestra
que la sobreexpresión de PU.1 en células eritroleucémicas induce una
inhibición de la proliferación celular (Yamada y col., 1997). Estos resultados
sugieren que la activación de PU.1 no es suficiente para desbloquear el
proceso de diferenciación en respuesta al HMBA.
Figura 36. La expresión ectópica de PU.1 es insuficiente para desbloquear la diferenciación en respuestaalHMBAencélulasMEL-R.a) Esquema del vector pEBBpuro.PU.1-ER donde se representa el gen que codifica para la resistencia a puromicina (PuroR), cuya expresión está regulada a través del promotor PGK, y el fragmento que codifica para la proteína de fusión PU.1-ER, clonado corriente abajo del promotor EF1α. b) La eficiencia de la construcción se analizó mediante Western blot de extractos proteicos totales de los transfectantes PU.1-ER 3 (P-ER 3), PU.1-ER 7 (P-ER 7) y PU.1-ER 8 (P-ER 8). Como control negativo se utilizó un cultivo transfectado con el pEBBpuro.ER (Control). c) Se determinó el efecto de la expresión ectópica de PU.1 sobre el desbloqueo de la diferenciación en respuesta al HMBA en cultivos tratados con β-estradiol 0,1 µM durante 24 ó 120 horas. Como control positivo se muestra un cultivo de células MEL-R tratado con 5-Aza-2-dC (Aza) 0,4 µM en presencia o ausencia de HMBA. d) Curva de crecimiento de los transfectantes no tratados (3, 7 y 8) y tratados con β-estradiol (3, 7 y 8 + Est). Los números 3, 7 y 8 corresponden a los transfectantes PU.1-ER 3, PU.1-ER 7 y PU.1-ER 8, respectivamente.
c
PuroR PU.1 ERPGK EF1α
P-ER 7P-ER 3 P-ER 8 Aza
10
20
30 0h24h120h
% C
élul
as B
+
HMBA+ + + + + + + + - ++
a
P-ER3
P-ER7
P-ER8
Contro
l
PU.1-ERα-Tubulina
b
90
100 3
3+Est
78
7+Est8+Est
60
30
24h0h 48h 72h
Nº d
e cé
lula
s x
104
dβ-estradiol
Resultados
��
4.2.5.LainactivacióndePU.1enMEL-RnoinfluyeenlaactividaddeSTAT1
En un estudio reciente, el grupo de la Dra. Ruscetti del National
Cancer Institute (USA) sugirió que la inmortalización de los progenitores
eritroides infectados con el SFFV estaba provocada, entre otras cosas, por
un bloqueo de las señales de diferenciación activadas por la proteína STAT1.
Este bloqueo, se especulaba, se debía a unos altos niveles de la fosfatasa
Shp-1 inducidos a su vez por la expresión inoportuna de PU.1 (Nishigaki y
col., 2006). De hecho, se demuestra en el mismo trabajo que la estimulación
con Epo resulta en una activación de la vía de señalización de STAT1 en
líneas eritroleucémicas que no expresan PU.1. Los resultados descritos
en esta tesis demuestran que las células MEL-R sufren un bloqueo de la
diferenciación que es independiente de la actividad de PU.1. Es improbable,
por lo tanto, que este bloqueo esté relacionado con una inactivación de la vía
de señalización de STAT1 a través de PU.1. En este apartado se describen
los resultados de experimentos llevados a cabo para esclarecer esta
contradicción. Se determinó el grado de fosforilación de STAT1 en cultivos
de células MEL-DS19 y MEL-R en respuesta a Epo e interferón-α (INF-α), un
activador constitutivo de la fosforilación de las proteínas STAT. En la Figura
37a se muestra un Western blot en donde se utilizó un anticuerpo anti-
STAT1 que detecta las isoformas α y β de STAT1 fosforiladas en el residuo
tirosina 701. Se observan dos bandas de 84 y 91 KDa correspondientes a
STAT1 α y β, respectivamente, lo cual demuestra que ambas isoformas están
fuertemente fosforiladas en respuesta a la estimulación con INF-α, tanto en
MEL-DS19 como en MEL-R. Por el contrario, no se detectaron indicios de
fosforilación en ninguno de los cultivos, antes o después del tratamiento
con Epo. En paralelo, se testaron los niveles de expresión de la fosfatasa
Shp-1 mediante RT-PCR semicuantitativa. Se observó que Shp-1 presenta
unos niveles altos de expresión en células MEL-DS19 indiferenciadas y que
estos niveles disminuyen cuando las células se diferencian (Figura 37b). La
expresión de Shp-1 en MEL-R es similar a la de las células MEL-DS19 no
inducidas.
Resultados
��
ba48 960 R
MEL
Shp-1
GAPDH
C E IC E IMEL MEL-R
pSTAT1α
STAT1pSTAT1ß
Figura37.BloqueodelafosforilacióndeSTAT1encélulasMEL-R.a) Western blots de extractos proteicos de células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R tratadas con INF-α 500 U/ml o Epo murina 100 U/ml. La membrana se incubó sucesivamente con un anticuerpo anti-pstat1 que reconoce las isoformas STAT1 α y STATβ fosforiladas en el residuo tirosina 701 y un anticuerpo anti-stat1 que reconoce tanto las isoformas fosforiladas como las no fosforiladas. C= Control, E= Epo y I= INF-α. b) Análisis mediante RT-PCR semicuantitativa de la expresión de Shp-1 en células MEL-DS19 (MEL) no tratadas (0) y tratadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R).
En conjunto, estos resultados sugieren que la fosfatasa Shp-1 podría
estar involucrada en el bloqueo de la diferenciación de las líneas resistentes,
aunque su actividad no vendría regulada por PU.1. Los resultados no
resuelven, sin embargo, la implicación de las STAT1 en este proceso.
4.3.Desbloqueodeladiferenciaciónhaciaellinajeeritroide
Las líneas eritroleucémicas resistentes al HMBA establecidas en
la presente tesis doctoral comparten muchas de las características de la
línea progenitora MEL-DS19, tal como se ha demostrado en los apartados
anteriores. La diferencia más significativa radica sin duda en el silenciamiento
de la expresión de PU.1. Se ha comprobado que este silenciamiento no es si
acaso el único responsable de la incapacidad de las líneas resistentes para
desbloquear la diferenciación en respuesta a diferentes inductores. En ese
caso, la expresión ectópica de PU.1 sería capaz de revertir el fenotipo de las
MEL-R induciendo la respuesta al HMBA. Se ha demostrado en un apartado
anterior que la expresión ectópica de PU.1 sólo produce un retardo en el
crecimiento celular pero en ningún caso el desbloqueo de la diferenciación
(apartado 4.2.4., Figura 36c). Quedaba pendiente por establecer si las MEL-
R son susceptibles de retomar el programa de diferenciación, incluso en
ausencia de PU.1, y, en ese caso, si el resultado sería la diferenciación
hacia el linaje eritroide. Algunos resultados previos obtenidos en células
MEL-DS19 han permitido establecer que el desbloqueo de la diferenciación
exige que concurran dos procesos: la inhibición de la proliferación celular
Resultados
��
y la activación de factores de transcripción específicos (Choe y col., 2003;
Matushansky y col., 2000; Matushansky y col., 2003).
En este bloque de resultados se analizan los efectos que produce
la interferencia en la expresión de factores que regulan el ciclo celular en
relación con el desbloqueo de la diferenciación en MEL-R. Asimismo, se
investigan las consecuencias de una sobreexpresión de GATA-1, uno de
las factores de transcripción imprescindibles para el desarrollo del linaje
eritroide.
4.3.1.EfectodelaexpresiónectópicadeMad1sobreladiferenciacióndecélulasMEL-R
Tal como se describió en la introducción (apartado 1.5.2.2.) Mad1 es
capaz de formar heterodímeros con Max y ejercer una función antagonista
de c-Myc (Cultraro y col., 1997a). La expresión de Mad1 es característica
de estadios diferenciados (Cultraro y col., 1997b). En el Western blot de
la Figura 38a se observa una intensa señal debido a la alta expresión
de Mad1 en células MEL-DS19 diferenciadas así como la prácticamente
ausencia de proteína en MEL-DS19 indiferenciadas y MEL-R. Con el objeto
de comprobar si la expresión de Mad1, que teóricamente debería provocar
una parada del ciclo celular, induce un desbloqueo de la diferenciación en
MEL-R se establecieron transfectantes estables capaces de expresar de
manera ectópica la proteína Mad1. Para ello, se clonó un fragmento capaz
de codificar para la proteína de fusión GFP-Mad en el vector de expresión
pMTHbetaglobin.neo que transcribe bajo la regulación del promotor de
la metalotionina y, por lo tanto, es inducible por ZnCl2 (Figura 38b). Se
transfectaron células MEL-R con dicho vector y se seleccionaron en grupos,
en presencia de G418. Una segunda selección se llevó a cabo utilizando
un separador de células para aislar aquellos clones que expresaran altos
niveles de GFP. Del total de 56 clones obtenidos se seleccionaron 6 en los
cuales se confirmó, mediante Western blot, una alta expresión de la proteína
de fusión GFP-Mad (Figura 38c).
Resultados
��
1 2 5 8 19 22CGFP-Mad
α-Tubulina
c
bGFP Mad
PGK MTH
ZnCl2
NeoR
a
α-Tubulina
Mad10 96 RMEL
Figura38.Establecimientode transfectantesestablesqueexpresan laproteínade fusiónGFP-Mad. a) Análisis por Western blot de los niveles de Mad1 en células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (96) y células MEL-R (R). b) Esquema del vector pMTH.neo.GFP-Mad donde se representa el promotor PGK, el gen que codifica para la resistencia a neomicina (NeoR) y el fragmento que contiene la secuencia codificante de la proteína GFP-Mad, cuya expresión está regulada por el promotor de metalotionina (MTH) inducible por ZnCl2. c) Se transfectaron células MEL-R con la construcción pMTH.neo.GFP-Mad y se aislaron clones que expresaban altos niveles de GFP utilizando un separador de células. La expresión de la proteína de fusión GFP-Mad se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-Mad1. Los números representan transfectantes individuales, C= control y corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío.
Se analizó a continuación el potencial de cada uno de estos clones para
reiniciar la diferenciación contabilizando el número de células diferenciadas
según el ensayo de benzidina. En la Tabla I y la Figura 39a se muestran los
porcentajes de células diferenciadas después de 4 días de crecer los cultivos
en presencia o ausencia de ZnCl2 y/o HMBA. El porcentaje de diferenciación
espontánea en todos los casos es relativamente bajo, llegando a un máximo
del 25,9% en el clon 19. Los porcentajes de diferenciación se incrementan
en todos los casos en presencia de HMBA superando el 80% de células
diferenciadas en los clones que expresan GFP-Mad más eficientemente
(clones 8, 19 y 22). Por otra parte, la reacción positiva de las células al
ensayo de benzidina, tal y como se deduce de la coloración azul de los
núcleos (Figura 39b), se origina a causa de la interacción de los grupos
heme de la hemoglobina con la benzidina y, por lo tanto, es una indicación
del linaje eritroide. No se observaron diferencias en el porcentaje de células
B+ en presencia o ausencia de ZnCl2 debido, probablemente, al escape del
promotor de la metalotionina, hecho que ocurre con frecuencia en este tipo
de vectores.
Resultados
��
TablaI.DiferenciacióndelostransfectantesGFP-Mad%CélulasBenzidinaPositivo
-HMBA +HMBA
ZnCl2 - + - -
Control 1,7 0,8 0,8 1,3
Clon 1 5,3 5,3 28,2 36,5
Clon 2 0,7 0,7 28,4 37,1
Clon 5 5,4 5,4 19,0 19,4
Clon 8 2,4 8,8 88,9 90,8
Clon 19 9,4 25,9 98,0 97,6
Clon 22 6,6 12,3 87,8 90,6
Los clones MEL-R pMTH.neo.GFP.Mad se cultivaron en medio DMEM completo con G418 en presencia o ausencia de 100 µM ZnCl2 y/o 5 mM HMBA durante 4 días. El porcentaje de células B+ se estimó mediante el ensayo de benzidina. Se utilizó como control un clon MEL-R pMTHbetaglobin.neo.
Figura39.LaexpresiónectópicadeMad1provocaundesbloqueodeladiferenciacióndecélulasMEL-RenpresenciadeHMBA.a) Porcentaje de células diferenciadas (B+) en transfectantes cultivados en presencia o ausencia de ZnCl2 100 µM y/o HMBA 5mM. Cada barra corresponde a la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. Los números representan clones individuales, C= control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío. b) Tinción con benzidina de los transfectantes tratados y no tratados con HMBA. Se muestran campos representativos de los experimentos descritos en a).
HMBA
Control
Clon 1
Clon 2
Clon 5
- +
Clon 8
Clon 19
Clon 22
HMBA- +b
a
C 1 2 5 8 19 22
20
40
60
80
100
% C
élul
as B
+
Zn/HMBA-/-+/--/++/+
Resultados
��
Cuando se analizó mediante citometría de flujo el contenido de DNA
de los clones 8, 19 y 22 tratados con ZnCl2 y HMBA se observó que los
perfiles coincidían con el de un cultivo diferenciado de células MEL-DS19
observándose un pico de acumulación en la fase G1 del ciclo celular (Figura
40). De estos resultados se deduce que la expresión ectópica de Mad1, aún
sin actuar directamente sobre el desbloqueo de la diferenciación, predispone
a las células MEL-R hacia un estado que les permite responder al HMBA.
Se demostró que las MEL-R mantienen aún la capacidad de diferenciarse y,
al menos cuando se utiliza HMBA como agente inductor, llevan a cabo una
diferenciación hacia el linaje eritroide.
Contenido de DNA
Nº d
e cé
lula
s
2C 4C
Control
2C 4C
Clon 19
2C 4C
Clon 8
2C 4C
Clon 22
Figura40.Acumulaciónen la faseG1delciclocelularen los transfectantesMEL-RpMTH.neo.GFP-Mad.Los clones 8, 19 y 22 se trataron con ZnCl2 100 µM y HMBA 5mM durante 96 horas y se analizó el contenido de DNA mediante citometría de flujo. Control= células transfectadas con el vector pMTHbetaglobin.neo.
4.3.2. Efecto de la inhibición de la expresión de c-Myc sobre ladiferenciacióndecélulasMEL-R
Los resultados obtenidos, descritos en el apartado anterior, permitieron
demostrar que la sobreexpresión de Mad1 influye en el desbloqueo de
la diferenciación de las células MEL-R. Es de suponer que el efecto de
Mad1 sobre el proceso radica en su capacidad para antagonizar con c-Myc
interfiriendo de esta forma con la proliferación celular. Si esta hipótesis es
correcta la inhibición de c-Myc debería producir un efecto similar. Con el
objeto de comprobar si esto es así, se establecieron transfectantes estables
que expresaban un RNA interferente de c-Myc. El RNA interferente se diseñó
utilizando como molde una zona específica del exón 2 de c-myc, tal y como se
describe en Materiales y Métodos (apartado 3.2.1.), y se incorporó al vector
Resultados
��
de expresión pSUPER.retro.neo+GFP (Figura 41a). Una vez seleccionados
los transfectantes, primero en grupos resistentes a G418 y luego en clones
que expresaban altos niveles de GFP, se confirmó mediante Western blot la
capacidad del vector para silenciar la expresión de c-Myc (Figura 41b).
aNeoRGFPsiRNA-Myc
H1 PGK
siRNA-Myc- + - +c-Myc
α-Tubulina
MEL MEL-Rb
Figura41. Inhibiciónde laexpresióndec-MycmediantesiRNA.a)Esquema del vector pSUPER.retro.neo+GFP.Myc donde se indica el fragmento que codifica para el siRNA anti-Myc (siRNA-Myc), clonado corriente abajo del promotor H1, y el fragmento que codifica para la proteína quimérica GFP-NeoR, cuya expresión está regulada por el promotor PGK. b) La funcionalidad de la construcción se analizó por Western blot en células MEL-DS19 (MEL) y MEL-R transfectadas con pSUPER.retro.neo+GFP (-) o pSUPER.retro.neo+GFP.Myc (+). Las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc. Como control de carga se utilizó un anticuerpo anti-α-Tubulina.
Como era de esperar, aquellos clones más eficientes en su capacidad
de expresar el RNA interferente eran también los más deficientes en cuanto
a crecimiento y viabilidad celular. De un total de 22 clones se seleccionaron
8 cuya curva de crecimiento se representa en la Figura 42. La capacidad de
proliferación de la mayoría de los clones seleccionados fue prácticamente
nula (clones 6, 7, 10, 13 y 14) o al menos muy reducida (clones 2, 4 y 9) en
comparación con el control.
0h 24h 48h 72h
Nº d
e cé
lula
s x
104
20
40
60
80
Control24679101314
Figura42.Inhibicióndelaproliferacióncelular en los transfectantes MEL-RpSUPER.retro.neo+GFP.Myc. Se realizó una curva de crecimiento partiendo de cultivos en crecimiento exponencial (1x105 células/ml). Se contabilizó el número de células/ml cada 24 horas durante 4 días consecutivos. Los números corresponden a clones individuales. Cada curva representa la media de tres experimentos independientes.
Resultados
�0
Cuando se analizó el porcentaje de células hemoglobinizadas en
cultivos no tratados y tratados con HMBA durante 96 horas se observó un
incremento en el porcentaje de células diferenciadas sólo en el caso de
aquéllos que habían crecido en presencia del inductor (Figura 43a y b). Esto
se observa más claramente para los clones 2 y 4, que son asimismo dos de
los que presentaron un mayor crecimiento con respecto al control.
b
% C
élul
as B
+
C 2 4 6 9 13
10
20
30 - HMBA+ HMBA
a - +
Control
Clon 4
Clon 2
HMBA
Figura 43. La inhibición específica de c-Myc provoca un desbloqueo de la respuesta de la células MEL-RalHMBA.a) Se analizó el efecto de la inactivación de c-Myc sobre la diferenciación celular contabilizando el porcentaje de células hemoglobinizadas (B+)en presencia o ausencia de HMBA 5mM. Los números corresponden a clones individuales. C= transfectante control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector vacío. b) Tinción con benzidina del control y los clones pSUPER.retro.neo+GFP.Myc tratados y no tratados con HMBA.
Estos resultados son consistentes con la noción de que el silenciamiento
de c-myc induce un bloqueo de la proliferación celular y confirman que la
inhibición de la proliferación es un requisito indispensable para que se
produzca la diferenciación celular. Tal y como ocurría con la sobreexpresión
de Mad1, el silenciamiento de c-myc no provoca directamente un desbloqueo
de la diferenciación, sino que predispone a las células MEL-R para responder
a inductores del proceso, en este caso el HMBA.
4.3.3.DiferenciaciónespontáneaenrespuestaalasobreexpresióndeGATA-1
El factor de transcripción GATA-1 es un regulador clave de la
eritropoyesis que coordina la inhibición de la proliferación con la maduración
celular actuando tanto como activador o represor de genes involucrados
Resultados
��
en ambos procesos (Rodriguez y col., 2005; Rylski y col., 2003). Estudios
previos en MEL-DS19 han demostrado que la sobreexpresión de GATA-1
induce un desbloqueo espontáneo de la diferenciación (Choe y col., 2003).
GATA-1 está activo en las líneas MEL-R así como en las progenitoras MEL-
DS19 y su nivel de expresión es alto incluso en células indiferenciadas. No
obstante, los niveles del factor de transcripción se incrementan discretamente
en células diferenciadas (Figuras 29 y 30c). Con el objeto de investigar si
la sobreexpresión de GATA-1 producía algún efecto sobre la diferenciación
de las líneas resistentes se transfectaron células MEL-DS19 y MEL-R con el
vector inducible, pEBBpuro.GATA-ER, que expresa una forma condicional de
GATA-1 fusionada al dominio de unión a estrógeno del receptor de estrógeno
humano (ER) (Figura 44a). Previamente, se analizó la eficiencia del vector
mediante transfecciones transitorias en células 293T, que no expresan GATA-
1, y se comprobó la funcionalidad de la proteína quimérica en respuesta a β-
estradiol (Figura 44b). De los transfectantes originados a partir de MEL DS-
19 y MEL-R se aislaron clones resistentes a puromicina mediante diluciones
en serie y se analizó el nivel de expresión de la proteína de fusión GATA-ER
mediante Western blot (Figura 44c).
ERPuroR GATA-1PGK EF1a
a 293T
pEBBpuro.G-ER
MEL
GATA-ER
GATA-1
β-estradiol--
- --
+++
b
cC 4 10 C 9 5 1
MEL MEL-R
GATA-ER
GATA-1
Figura44.ObtencióndetransfectantesestablesquesobreexpresanlaproteínadefusiónGATA-ER.a) Esquema del vector pEBBpuro.GATA-ER donde se representan el gen que codifica para la resistencia a puromicina, clonado corriente arriba del promotor PGK, y el fragmento que codifica para la proteína de fusión GATA-ER, cuya expresión está regulada por el promotor EF1α. b) La funcionalidad de la construcción se analizó mediante Western blot en células 293T transfectadas con pEBBpuro.GATA-ER tratadas y no tratadas con β-estradiol 0,1 µM. La membrana se incubó con un anticuerpo anti-GATA-1 que reconoce tanto la proteína endógena como la quimérica. Como control positivo se incluyeron células MEL-DS19 (MEL). c) Se transfectaron células MEL-DS19 y MEL-R con la construcción pEBBpuro.GATA-ER y se aislaron clones mediante diluciones en serie. La expresión de GATA-ER en presencia de β-estradiol 0,1 µM se analizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-GATA-1. Los números representan transfectantes individuales; C= transfectante control, corresponde a células MEL-R transfectadas con el vector pEBBpuro.ER.
Resultados
��
En todos los casos, a excepción de los controles, se observaron dos
bandas de 75 KDa y 49 KDa correspondientes a la proteína de fusión GATA-
ER y a la proteína endógena, respectivamente. El efecto de la sobreexpresión
de GATA-1 sobre un posible desbloqueo de la diferenciación en presencia o
ausencia de HMBA y/o β-estradiol se determinó contabilizando el porcentaje
de células B+ (Tabla II y Figura 45a y b).
TablaI.DiferenciacióndelostransfectantesGATA-ER%CélulasBenzidinaPositivo
-HMBA +HMBA
β-estradiol - + - -
MEL 4 0,1 93,6 94,1 93,5
MEL 10 0,1 5,3 94,4 94,7
MEL-R 9 3,6 49,3 15,8 44,5
MEL-R 5 0,4 29,0 6,6 30,4
MEL-R 1 0,5 3,9 3,9 19,6
Los transfectantes MEL y MEL-R pEBBpuro.GATA.ER se cultivaron en medio DMEM completo con puromicina en presencia o ausencia de 0,1 µM β-estradiol y/o 5 mM HMBA durante 4 días. El porcentaje de células B+ se estimó mediante el ensayo de benzidina.
Clon 9Control Clon 5 Clon 1β-estradiolHMBA
- + - +- - + +
- + - +- - + +
- + - +- - + +
- + - +- - + +
15
30
45
% C
élul
as B
+
β-estradiol
Control
Clon 5
Clon 9
- +a b
Figura45.LasobreexpresióndeGATA-1induceladiferenciaciónespontáneadelascélulasMEL-R.a) El efecto de la sobreexpresión de GATA-1 sobre el desbloqueo de la diferenciación de MEL-R se analizó contabilizando el número de células hemoglobinizadas (B+) en presencia o ausencia de β-estradiol 0,1 µM y/o HMBA 5 mM. Cada barra corresponde a la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. b) Preparaciones citológicas teñidas con benzidina de los clones MEL-R pEBBpuro.GATA-ER tratados o no tratados con β-estradiol. Se muestran campos representativos de los experimentos descritos en a).
Resultados
��
Se comprobó que la sobreexpresión de GATA-1 induce un incremento
significativo del porcentaje de células hemoglobinizadas. En los clones que
expresaban niveles más altos de la proteína de fusión, como era el caso
del clon 9, el porcentaje de células B+ alcanzó valores superiores al 50%
y, como era de esperar, se observó que la expresión de β-globina era más
pronunciada (Figura 46). El porcentaje de células diferenciadas no sufrió
grandes variaciones cuando se añadió HMBA al medio de cultivo, a diferencia
de lo que ocurría en el caso de las transfecciones con Mad-1 y c-Myc. Estos
resultados demostraron que la sobreexpresión de GATA-1 es suficiente
para inducir un desbloqueo de la diferenciación en las células resistentes,
diferenciación que ocurre invariablemente hacia el linaje eritroide.
18S
C C4 5 910
β-globina
β-estradiol- + - + - + - + - + - +
MEL MEL-R
Figura 46. Análisis mediante Northern blot de la expresión de β-globina enlostransfectantesGATA-ER.Se aisló RNA total de los transfectantes MEL-DS19 (MEL) y MEL-R pEBBpuro.GATA-ER tratados o no tratados con β-estradiol 0,1 µM, se fraccionaron alícuotas de 10 µg en un gel desnaturalizante y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. El filtro se hibridó con el vector pSK(+)β-globina, linearizado con EcoRI, marcado radiactivamente. La tinción con bromuro de etidio se utilizó para verificar la integridad del RNA y la carga equitativa de la muestras.
4.4.Fli-1,antagonistadeGATA-1enausenciadePU.1
GATA-1 es uno de los factores de transcripción fundamentales del
sistema eritropoyético. Aún cuando se expresa constitutivamente en MEL-
DS19 y en MEL-R (Figura 30c) de forma similar a como ocurre en todos los
precursores eritropoyéticos, la actividad de GATA-1 está bloqueada en las
células eritroleucémicas (Rekhtman y col., 2003; Stopka y col., 2005; Zhang
y col., 2000). En el presente trabajo se ha demostrado que la sobreexpresión
de GATA-1 provoca la diferenciación espontánea de las células MEL-R
(apartado 4.3.3., Tabla II y Figura 45). Existen evidencias que sugieren
que PU.1 inhibe la diferenciación de MEL-DS19 uniéndose y reprimiendo a
Resultados
��
GATA-1 (Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). En MEL-R, donde la
actividad de PU.1 está silenciada, se deduce que debería existir otro factor
(o factores) con la capacidad de bloquear la función de GATA-1.
En este apartado se investiga el papel del factor de transcripción Fli-
1 como un posible antagonista alternativo de GATA-1 capaz de bloquear
la respuesta a los agentes inductores de la diferenciación en ausencia de
PU.1.
4.4.1. Análisis de la expresión de genes que codifican paraproteínasqueregulanlaactividaddeGATA-1
De los resultados obtenidos en apartados anteriores se deduce que la
inactivación de PU.1 es insuficiente para inducir el desbloqueo de GATA-1.
En un intento de comprobar si existe otro factor alternativo a PU.1 en MEL-
R se analizó mediante RT-PCR semicuantitativa la expresión de genes que
codifican para proteínas capaces de regular la actividad de GATA-1 durante
la diferenciación eritroide (Figura 47).
b48 960 R
MEL
GATA-2
GAPDH
Fli-1
48 960 RMEL
FOG-1
Gfi-1b
GAPDH
a
Figura 47. Análisis de la expresión de genes que codifican para proteínas capaces de modificar laactividaddeGATA-1.Análisis por RT-PCR semicuantitativa del nivel de expresión de genes que codifican para reguladores positivos a) o negativos b) de la actividad de GATA-1 y la eritropoyesis en células MEL-DS19 (MEL) indiferenciadas (0) y diferenciadas con HMBA (48 y 96) y células MEL-R (R).
Se investigaron inicialmente dos reguladores positivos de la actividad
de GATA-1, FOG-1 y Gfi-1b (Figura 47a). En el caso de FOG-1 se observó
un producto de amplificación cuya intensidad era similar en MEL-R y MEL
DS-19 indiferenciadas. En las células MEL-DS19 tratadas con HMBA, se
observó un incremento en los niveles de FOG-1 que coincide en el tiempo
con una mayor expresión de GATA-1 y estaría en línea con estudios recientes
que indican que FOG-1 es activado de manera directa por GATA-1 (Welch y
Resultados
��
col., 2004). En el caso del factor de transcripción Gfi-1b se observaron
dos bandas correspondientes a transcritos alternativos que no mostraban
diferencias significativas a nivel de expresión entre las células MEL-R y
las progenitoras MEL-DS19. Estos resultados demuestran que los niveles
de FOG-1 y Gfi-1b son similares en MEL-DS19 y MEL-R y, por lo tanto, no
parece que exista una inactivación inapropiada en ningún caso. De forma
indirecta se deduce que ninguno de estos factores participa en el bloqueo
de la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes.
Se analizaron asimismo GATA-2 y Fli-1 como ejemplos de reguladores
negativos de GATA-1 e inhibidores de la diferenciación eritroide (Figura 47b).
La expresión de GATA-2 tanto en las células MEL-R como en las MEL-DS19
diferenciadas fue prácticamente indetectable. Por lo tanto GATA-2, al estar
inactivo en MEL-R, no podría ser el responsable del bloqueo de la actividad
de GATA-1. Los niveles de expresión de Fli-1, por el contrario, son altos
tanto en MEL-R como en MEL-DS19. En los cultivos de MEL-DS19 tratados
con HMBA se observa un descenso en los niveles de Fli-1 que coincide en el
tiempo con el inicio de la diferenciación. Para comprobar si la expresión de
Fli-1 a nivel de proteína reproducía los resultados anteriores se analizaron
mediante Western blot extractos proteicos de MEL-DS19, MEL-R y dos
clones derivados de MEL-R, 7A y 11A. Se utilizó un anticuerpo anti-Fli-1 que
reconoce dos isoformas que se originan a partir de codones de iniciación
alternativos (ver esquema de la Figura 48a) (Sarrazin y col., 2000). En todos
los casos se detectaron dos bandas, de 48 y 51 KDa, correspondientes a las
dos isoformas mencionadas anteriormente. La intensidad relativa de ambas
isoformas difería en las líneas resistentes y las parentales.
Figura48.Regulacióndiferencialdelaexpresióndelasisoformasde48y51KDadeFli-1enMEL-DS19yMEL-R.a) Representación esquemática de los dos mRNAs que codifican para las isoformas de Fli-1. Ambos comparten el mismo marco de lectura, pero se originan en el AUG+1 y el AUG+100 dando lugar a las isoformas de 48 y 51 KDa, respectivamente. b) Análisis por Western blot de la expresión de las isoformas de Fli-1 en extractos proteicos totales de MEL-DS19 (MEL), MEL-R y los clones resistentes 7A y 11A.
AUG AUG UAG51 kDa48 kDa
+1 +100 +1356a b MEL
MEL
-R
7A 11A48 kDa51 kDa
Resultados
��
a IPGATA-1
M MR R
Input 1%
PU.1
GATA-1**
M R M RM R
Input3%
IPFli-1
IPControl
GATA-1
b
Figura 49. Interacción entre Fli-1 y GATA-1 en células MEL-R. a) Se inmunoprecipitaron extractos nucleares de MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) con un anticuerpo monoclonal anti-GATA-1. Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-PU.1 y anti-GATA-1. La tercera y la cuarta línea corresponden al 1% de los extractos totales utilizados en la inmunoprecipitación. b) Los extractos nucleares de MEL-DS19 (M) y MEL-R (R) se inmunoprecipitaron con un anticuerpo monoclonal anti-Fli-1 o un anticuerpo irrelevante (control). Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-GATA-1. La primera y la segunda línea corresponden al 3% de los extractos totales utilizados en la inmunoprecipitación.
En MEL-DS19 la banda correspondiente a la isoforma de 48 KDa es
más intensa que la de 51 KDa. Lo contrario se observa en MEL-R y en los
clones 7A y 11A (Figura 48b). Es posible que el cambio en la relación entre
ambas isoformas esté relacionado con el bloqueo de la respuesta a los
inductores en las líneas resistentes. Por otro lado, la presencia activa de Fli-
1 en las líneas resistentes induce a pensar en este factor de transcripción
como un posible candidato alternativo a PU.1 capaz de interaccionar con
GATA-1 y bloquear la diferenciación de MEL-R.
4.4.2.PU.1,Fli-1yelbloqueodelaactividaddeGATA-1enMEL-R
PU.1 interacciona físicamente con GATA-1 cuando este último
está unido al DNA de sus genes diana. Se especula que esto permite el
reclutamiento de un complejo represor que provoca el silenciamiento de la
cromatina creando así un entorno estructural inactivo (Stopka y col., 2005).
Con el propósito de corroborar que PU.1 se une a GATA-1 en las líneas
parentales se analizó la interacción PU.1/GATA-1 mediante experimentos
de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas utilizando un anticuerpo
monoclonal anti-GATA-1 para inmunoprecipitar y anticuerpos anti-PU.1
y anti-GATA-1 para la detección. Se comprobó que GATA-1, presente en
extractos nucleares de MEL-DS19 y MEL-R, coinmunoprecipitaba con PU.1
en MEL-DS19. Como era de esperar, no se observó ninguna interacción en
las células MEL-R (Figura 49a).
Resultados
��
En el apartado anterior se demostró que Fli-1, un factor de transcripción
que comparte características estructurales y funcionales con PU.1, está
activo en MEL-R. Con el objeto de comprobar si Fli-1 interactuaba con
GATA-1, supliendo probablemente la función de PU.1, se llevaron a cabo
experimentos de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas de células
MEL-R y MEL-DS19 utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fli-1.
Tal y como se observa en la Figura 49b, se comprobó que Fli-1, presente
en ambos extractos nucleares, interacciona con GATA-1 tanto en las células
MEL-R como en las MEL-DS19 parentales.
De estos experimentos se deduce que Fli-1 podría estar implicado en
el bloqueo de GATA-1 en las líneas resistentes. No se descarta que Fli-1
incluso coopere con PU.1 para bloquear a GATA-1 en las células progenitoras
MEL-DS19.
5. DISCUSIÓN
Discusión
��
5.1.Desbloqueodeladiferenciacióndecélulaseritroleucémicas
La caracterización de genes involucrados en el desbloqueo de la
diferenciación de las células eritroleucémicas ha sido objeto de numerosos
estudios. La hipótesis de la existencia de un “gen maestro” que activa la
determinación hacia un linaje específico, como se propuso para Myo-D en
el linaje muscular, no ha encontrado una correspondencia plena en el linaje
eritroide. Los resultados obtenidos demuestran que la determinación celular
hacia el linaje eritroide es un proceso complejo cuya regulación implica
mucho más que un único gen regulador (Cantor y Orkin, 2002; Iwasaki y
Akashi, 2007; Tenen, 2003). Actualmente, se cree que la activación de la
diferenciación hacia un linaje específico del sistema hematopoyético depende
de la acción combinada de factores de transcripción específicos así como de
éstos y varios factores constitutivos que, en un fino equilibrio cuantitativo,
dan lugar a uno u otro linaje celular (Perry y Soreq, 2002). Un ejemplo en
este sentido lo constituye la exquisita proporción que debe existir entre los
factores de transcripción hematopoyéticos GATA-1 y PU.1 para determinar
la diferenciación eritroide o mieloide (Rekhtman y col., 2003; Rekhtman y
col., 1999; Tenen, 2003; Zhang y col., 2000).
Se ha demostrado que el tratamiento de las células eritroleucémicas con
agentes inductores de diferenciación celular resulta en cambios selectivos
de la expresión génica que conducen a las células de forma irreversible a la
diferenciación eritroide. En los primeros estadios se produce una inhibición
de la expresión de genes relacionados con un fenotipo inmaduro, como
GATA-2, c-myb y c-myc, junto con una acumulación de las células en la
fase G1 del ciclo celular (Lachman y Skoultchi, 1984; Matushansky y col.,
2000; Rifkind y col., 1996). De manera coordinada con el cese de la división
celular, la activación de factores de transcripción específicos y los cambios
en la conformación de la cromatina inducen la reactivación del programa
de diferenciación. El proceso culmina con la síntesis de hemoglobina y
otros marcadores específicos del linaje eritroide y la reversión del fenotipo
transformado.
En la presente tesis doctoral se han abordado algunos aspectos
relacionados con el desbloqueo de la diferenciación de las células
eritroleucémicas utilizando como modelo las células Friend. En un intento
Discusión
�0
por identificar y caracterizar factores involucrados en la respuesta al HMBA
se establecieron líneas eritroleucémicas derivadas de MEL-DS19 que son
resistentes a la acción del inductor (MEL-R). Se demostró que las células
resistentes son capaces de reiniciar el programa de diferenciación hacia el
linaje eritroide cuando se induce una parada de la proliferación celular o
se sobreexpresa el regulador transcripcional GATA-1. Contrariamente a lo
esperado, se constató que la expresión de PU.1 está inhibida en las líneas
resistentes, aún cuando la integración del SFFV ocurre en el mismo sitio
que en las células progenitoras. El tratamiento de las células MEL-R con 5-
Aza-2-dC provocó una reactivación de la expresión de PU.1, lo cual sugiere
que el gen Sfpi-1/PU.1 está metilado en MEL-R y que ésta podría ser la
principal causa de la inactivación de PU.1 en las líneas resistentes. Por
último, los resultados obtenidos sugieren que el factor de transcripción Fli-1
podría actuar como un inhibidor de GATA-1, alternativo a PU.1, en células
eritroleucémicas.
5.2.MEL-RylaresistenciaalHMBA
Cuando se exponen cultivos de células MEL-DS19 a tratamientos con
inductores de la diferenciación tales como el HMBA se desencadena una serie
de procesos que conducen a la reactivación del programa de diferenciación
eritroide. En el presente trabajo se aisló una población de células que, a
diferencia de las MEL-DS19 parentales, son capaces de proliferar en presencia
de HMBA y presentan un porcentaje de células diferenciadas similar al de
un cultivo de células MEL-DS19 indiferenciadas (Figura 15). Experimentos
posteriores revelaron que la resistencia observada no es específica para el
HMBA, ya que las células MEL-R son también resistentes a otros agentes
inductores de la diferenciación celular, como el DMSO, el butirato de sodio
y la hemina. Las dianas moleculares del HMBA, así como del resto de los
agentes mencionados, no han sido aún identificadas. En ocasiones se ha
sugerido que el modo de acción del HMBA y el DMSO estaría asociado a
cambios en la actividad PKC (Protein Kinase C), activación de tirosinas
fosfatasas, variaciones en la concentración de calcio en las células, etc
(revisado en (Tsiftsoglou y col., 2003a)). Por otra parte, el modo de acción
Discusión
��
del butirato de sodio, un inhibidor de las HDACs, podría estar relacionado con
la inhibición de ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinases) y la activación
de “vías transduccionales de p38” (p38 signal transduction pathways) (Witt y
col., 2000). Sea cual fuere el mecanismo de acción de los distintos agentes
inductores ninguno es capaz de desbloquear la diferenciación de las
células resistentes, lo que induce a pensar que el modo de acción de estos
inductores converge en una vía común. Paralelamente, se comprobó que la
resistencia al HMBA no depende de la presencia continua del inductor ya
que las células MEL-R conservan la resistencia aún después de permanecer
largos períodos en ausencia de HMBA. Se desconoce, sin embargo, si los
factores que confieren esta resistencia son inherentes a las MEL-R o si, por
el contrario, se manifiestan sólo después del tratamiento con HMBA.
El análisis de la distribución de las distintas fases del ciclo celular
en células MEL-R tratadas con HMBA confirmó que las células resistentes
presentan una distribución característica de estados proliferativos, a
diferencia de las MEL-DS19 inducidas con HMBA en donde se produce una
acumulación gradual en la fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993;
Vanegas y col., 2003). Junto con el patrón de expresión de marcadores
de proliferación y diferenciación celular, c-myc y β-globina, nuestros
experimentos confirmaron que las líneas resistentes se mantienen en un
estado indiferenciado. No obstante, se observaron algunas diferencias
fenotípicas entre las células MEL-DS19 indiferenciadas y las MEL-R. La
comparación de la cinética de crecimiento de ambas poblaciones puso
de manifiesto la existencia de un alargamiento considerable del tiempo
de duplicación de las células MEL-R con respecto al de la línea parental.
Asimismo, se comprobó que el tamaño de las células resistentes es un 25%
mayor que el de las células MEL-DS19 indiferenciadas, que a su vez son
un 25% más grandes que las MEL-DS19 diferenciadas. Este incremento
podría tener relación con la inhibición de la salida del ciclo celular en las
líneas resistentes. Se ha sugerido que la oncoproteína c-Myc juega un papel
esencial en el acoplamiento entre proliferación y crecimiento celular. c-Myc
activa la expresión de genes relacionados con la biogénesis ribosómica,
el metabolismo de los nucleótidos y la regulación de la traducción, lo cual
trae acoplado un incremento del tamaño celular (revisado en (Dang, 1999;
Oskarsson y Trumpp, 2005)). Johnston y colaboradores demostraron que
Discusión
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dmyc, el ortólogo de c-myc en Drosophila, regula el tamaño celular durante
el desarrollo. La pérdida de dmyc en las células del ala de Drosophila retarda
el crecimiento celular y como consecuencia se reduce el tamaño del ala,
mientras que la sobreexpresión de dmyc incrementa la tasa de crecimiento
y el tamaño celular (Johnston y col., 1999). Asimismo, se ha constatado
que la sobreexpresión de c-Myc induce un incremento significativo del
tamaño celular en células B y en fibroblastos (Beier y col., 2000; Iritani y
Eisenman, 1999; Schuhmacher y col., 1999). En base a estos datos se ha
sugerido que el potencial de c-Myc para estimular la progresión del ciclo
celular se debe, en parte, a su capacidad para activar el crecimiento celular
(Eisenman, 2001). En el caso de MEL-R, se pensó en un principio que el
aumento del tamaño podría estar relacionado con una sobreexpresión de c-
myc. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el nivel de
expresión de las células MEL-DS19 parentales indiferenciadas y las MEL-
R. Aún es posible, no obstante, que el incremento del tamaño celular esté
relacionado con una estabilización anormal de la proteína que podría tener
su origen en mutaciones específicas. En un trabajo reciente, Buschbeck y
colaboradores confirmaron que la desestabilización de c-Myc, a través de
PML4 (Promyelocitic leucemia gene isoform 4), potencia la diferenciación
granulocítica en células U937 tratadas con vitamina D (Buschbeck y col.,
2007).
En linfomas de Burkitt, así como en linfomas asociados a la infección
con HIV y en cierto tipo de leucemias linfoblásticas agudas se ha observado
una alta frecuencia de mutaciones puntuales en la zona codificante de c-myc
(Marcu y col., 1992). Estas mutaciones se localizan principalmente en el
dominio de transactivación dentro o cerca de la caja Myc 1 (MB1) y resultan
en una inhibición de la fosforilación de los residuos treonina 58 y/o serina 62,
involucrados en la degradación de c-Myc. El residuo treonina 58 fosforilado
por GSK3 es reconocido por la proteína FBW7, que regula la ubiquitinización
de c-Myc para su posterior degradación a través de la vía del proteasoma.
Las mutaciones puntuales que afectan al residuo treonina 58, o a residuos
que forman parten de la vía de señalización que regula la fosforilación del
residuo treonina 58, inhiben la degradación de c-Myc y resultan en una
estabilización anormal de la proteína (Bahram y col., 2000; Hoang y col.,
1995) . Los resultados de la secuenciación de c-myc en las células MEL-R
Discusión
��
desecharon la hipótesis de la presencia de mutaciones específicas como
causa de una posible estabilización anormal de la oncoproteína. No se
descarta, sin embargo, la existencia de otras modificaciones que pudieran
resultar en una mayor estabilidad de c-Myc en las líneas resistentes.
Estudios recientes han puesto de manifiesto que la estabilización de c-Myc
podría estar relacionada con alteraciones en la ruta de degradación GSK3
– FBW7. En células de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL)
que carecen de mutaciones en la secuencia codificante la estabilización
de c-Myc está relacionada con una menor afinidad por la GSK3β (Glycogen
Synthase Kinase3β), la quinasa que fosforila a c-Myc en el residuo treonina
58. (Malempati y col., 2006). Por otra parte, en células de osteosarcoma
(U2OS) se ha descrito una proteasa, USP28, que antagoniza la función de
FBW7α aumentando la estabilidad de c-Myc en el núcleo (Popov y col.,
2007). Los mismos autores demostraron que USP28 es necesaria para la
estabilización de c-Myc en células tumorales humanas y que la inhibición de
USP28 tiene el mismo efecto sobre proliferación y diferenciación celular que
la pérdida de c-Myc.
El incremento del tamaño celular de las MEL-R, unido al hecho de que
las células fueran incapaces de reiniciar el programa de diferenciación hacia
el linaje eritroide, llevó a suponer que las mismas podrían haber perdido
la capacidad de diferenciación eritroide en favor de una diferenciación
megacariocítica. Se ha sugerido que las células MEL podrían, al igual que ocurre
con las líneas humanas K562 o HEL, derivar hacia el linaje megacariocítico
(Tsiftsoglou, 2003a). De hecho en algún caso se observó que la inducción de
células MEL con HMBA en presencia de cantidades limitantes de suero podía
activar el programa de diferenciación megacariocítico a expensas del eritroide
(Paoletti y col., 1995). Los resultados de los experimentos llevados a cabo
con el éster de forbol TPA, un inductor de la diferenciación megacariocítica,
han permitido comprobar que las células MEL-R no responden al TPA y por
lo tanto no se diferencian hacia el linaje megacariocítico. Esta hipótesis
está reforzada además por la falta de expresión de marcadores del linaje
megacariocítico.
Por otra parte, se verificó que después de largos períodos en cultivo
las células resistentes tienden a duplicar su contenido de DNA en ausencia
de una división celular posterior para dar lugar a tetraploides estables. La
Discusión
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duplicación del juego de cromosomas para producir células tetraploides es
un paso intermedio para el posterior desarrollo de aneuploidías en células
tumorales (Margolis, 2005; Margolis y col., 2003; Storchova y Pellman,
2004). Esta inestabilidad genómica podría explicar la adquisición de
características especiales de las células tumorales tales como la capacidad
de hacer metástasis y desarrollar resistencia a los agentes anticancerígenos
(Beckman y Loeb, 2005; Prochownik, 2005; Storchova y Pellman, 2004). De
hecho, los genes implicados en el checkpoint encargado de eliminar células
tetraploides, como p53 y Rb, están inactivos en la mayoría de los tumores
(Margolis y col., 2003). Se ha observado que la inactivación de p53 junto
con una desregulación de la expresión de c-myc acelera el desarrollo de
tetraploidías o pseudotetraplodías en fibroblastos y células mieloides de
orígen murino (Li y Dang, 1999; Yin y col., 1999). La tetrapliodización de las
MEL-R sería por lo tanto la consecuencia de un aumento de la inestabilidad
genómica. Es posible que las células resistentes a los agentes inductores de
la diferenciación posean una grado de tumorigenicidad más elevado y por lo
tanto tiendan a tetraploidizar más fácilmente. La causa de este aumento (+
myc? - PU.1?) está aún por resolver.
5.3.EsPU.1indispensableparaelbloqueodeladiferenciacióndelascélulasFriend?
El resultado más sorprendente obtenido a lo largo del desarrollo
del presente trabajo fue la inactivación de PU.1 observada en las líneas
resistentes (Figuras 29 y 30a y b). La activación de la expresión de PU.1 debido
a la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 es un evento considerado
esencial para la transformación de los progenitores eritroides infectados
con el complejo Friend (Li y col., 1990). Se ha sugerido, y es ampliamente
aceptado, que la activación constitutiva de PU.1 es la principal causa del
bloqueo de la diferenciación de las células MEL (Moreau-Gachelin, 1994;
Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 2000). Asimismo, se ha constatado
que la sobreexpresión de PU.1 en células MEL impide el desbloqueo de
la diferenciación en respuesta al tratamiento con HMBA (Rao y col., 1997;
Yamada y col., 1997), mientras que el silenciamiento de PU.1, mediante la
Discusión
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utilización de siRNA, induce un desbloqueo parcial de la diferenciación de
células eritroleucémicas (Atar y Levi, 2005). La concurrencia simultánea de
la inactivación de PU.1 y el bloqueo de la diferenciación que se aprecia en
las líneas resistentes representan por lo tanto un desafío al posible papel
que se le atribuye a PU.1.
Con el fin de determinar las posibles causas del silenciamiento de
PU.1 en las líneas resistentes se consideraron distintas hipótesis. Por un
lado, la inactivación de PU.1 podría estar relacionada con la inhibición de
la expresión de la glicoproteína gp55 del SFFV. Quang y colaboradores
demostraron que la expresión de gp55 es necesaria tanto para el inicio
como para el mantenimiento de la transformación mediada por el SFFV
(Quang y col., 1997). De acuerdo con esto último, se ha postulado que la
actividad transcripcional del promotor de PU.1 depende de la activación del
receptor de eritropoyetina (Epo-R) a través de la gp55 (Afrikanova y col.,
2002; Quang y col., 1997). El análisis de la expresión de la gp55 confirmó
que la glicoproteína del SFFV permanece activa en las células MEL-R, al
igual que ocurre en las células parentales y que, por lo tanto, no puede ser
la causa del silenciamiento del gen Sfpi-1/PU.1. Como alternativa a esta
hipótesis se pensó que la inactivación de PU.1 podría deberse a la pérdida
de la integración del SFFV en el locus Sfpi-1/PU.1 de las células MEL-R. En
varias líneas celulares infectadas con el SFFV el lugar de integración del
provirus ocurre en el 95% de los casos en la zona promotora del gen Sfpi-1/
PU.1 (Moreau-Gachelin, 1994). El análisis mediante Southern blot demostró
que la integración del SFFV ocurre en la misma zona , dentro del locus Sfpi-
1/PU.1, tanto en MEL-DS19 como en MEL-R. Por lo tanto, se descarta la
pérdida de la integración del provirus como posible causa del silenciamiento
de PU.1.
Por último, otra hipótesis plausible intenta relacionar la inactivación
de PU.1 con cambios epigenéticos. Los resultados obtenidos señalan que el
gen Sfpi-1/PU.1 está metilado en las líneas resistentes. El tratamiento con 5-
Aza-2-dC, un inhibidor de la metilación del DNA, induce el desbloqueo de la
respuesta al HMBA. De este resultado se deduce que la metilación del DNA
podría estar involucrada en la resistencia de las células MEL-R a reiniciar el
programa de diferenciación en respuesta al HMBA. De manera consistente
con esta hipótesis, existen evidencias que confirman que el tratamiento
Discusión
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con drogas antitumorales resulta, en muchos casos, en una demetilación
del DNA con la consecuente reactivación de la expresión génica y la
reversión del fenotipo transformado (Di Croce y col., 2002). Por otra parte,
el tratamiento con inhibidores de las DNA metiltransferasas o las HDACs
provoca, en muchos casos, una reactivación del programa de diferenciación
y la consecuente pérdida de la tumorigenicidad (Lotem y Sachs, 2006).
Debido a que el tratamiento con 5-Aza-2-dC provoca tanto la reactivación
de PU.1 como el desbloqueo de la diferenciación en presencia de HMBA
se especuló con la posibilidad de que la inactivación de PU.1 podría ser la
causa de la resistencia de MEL-R al agente inductor. Sin embargo, tal como
se deduce de los transfectantes de PU.1 (apartado 4.2.4.), la expresión
ectópica de PU.1 es insuficiente para inducir el desbloqueo de la respuesta
al HMBA. Es posible que se trate de una respuesta compleja mediada por
varios rutas simultáneas en donde PU.1 sea sólo uno más de los factores
necesarios para dicha respuesta.
Por otra parte, en un intento por dilucidar el papel de PU.1 en células
eritroleucémicas se analizó la activación de las proteínas STAT. Un estudio
reciente del laboratorio de Sandra Ruscetti del National Cancer Institute
(USA) sugiere que uno de los mecanismos a través de los cuales PU.1
inhibe la diferenciación de las células MEL podría estar relacionado con la
inactivación de las proteínas STAT1/3 (Nishigaki y col., 2006). Según Nishigaki
y colaboradores el bloqueo de la fosforilación de STAT1 en las células MEL
se debe a una activación aberrante de la fosfatasa hematopoyética Shp-1,
inducida a su vez por una expresión inapropiada de PU.1. De esta manera, la
inhibición de la actividad de las proteínas STAT1/3 en las células MEL estaría
directamente relacionada con la activación constitutiva de PU.1 (Nishigaki
y col., 2006). De manera contraria a lo esperado, nuestros experimentos
confirman que la fosforilación de STAT1 está bloqueada en MEL-R, a pesar
del silenciamiento del gen Sfpi-1/PU.1. Por otra parte, se observó que el nivel
de expresión de Shp-1 en MEL-R es similar al de MEL-DS19. Por lo tanto,
si bien la fosfatasa Shp-1 podría ser la principal responsable del bloqueo de
STAT1, su activación no dependería de PU.1. Nuestros resultados no aclaran,
sin embargo, la implicación de STAT1 en el bloqueo de la diferenciación en
respuesta al HMBA.
Discusión
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5.4.LainhibicióndelaproliferacióncelularylareactivacióndelarespuestaalHMBA
El cese de la división celular es un requisito indispensable, aunque
no suficiente, para la diferenciación eritropoyética. A lo largo del proceso
de diferenciación de las células MEL hacia el linaje eritroide se produce
una inactivación de genes relacionados con estadios proliferativos, como
c-myc y c-myb, junto con una activación de reguladores negativos de la
proliferación celular, como p21, p27 y mad1 (Dmitrovsky y col., 1986; Hsieh
y col., 2000; Lachman y Skoultchi, 1984; Larsson y col., 1994; Matushansky
y col., 2000; Smith y Prochownik, 1992). Nuestros resultados demuestran
que el patrón de expresión de estos genes en las líneas resistentes es
similar al observado en un cultivo no inducido de células MEL-DS19. Existen
evidencias que indican que la activación inoportuna de factores implicados
en la progresión del ciclo celular, como c-Myb, c-Myc o Cdk6, bloquea la
diferenciación de las células MEL en respuesta a los agentes inductores
(Chen y col., 2002; Dmitrovsky y col., 1986; Matushansky y col., 2003). Por
el contrario, la sobreexpresión de inhibidores de la proliferación celular como
Mad1, antagonista de c-Myc, es capaz de revertir el bloqueo y reactivar el
programa de diferenciación (Cultraro y col., 1997a; McArthur y col., 2002).
Cultraro y colaboradores comprobaron que la sobreexpresión de Mad1 en
un transfectante estable de células MEL que contiene integradas 36 copias
del gen c-myc humano resulta en una reactivación de la diferenciación en
respuesta al HMBA (Cultraro y col., 1997a). Éstos, y otros autores, postulan
que el desbloqueo de la diferenciación mediada por Mad1 estaría relacionado
con la formación de heterodímeros Mad1:Max a expensas del complejo Myc:
Max. En el mismo trabajo se comprobó que los mutantes de Mad1 que no
interaccionan con Max y mSin3 son incapaces de inducir el desbloqueo de
la diferenciación. Estos resultados confirman la importancia del complejo
represor Max-Mad1-mSin3 en la transición proliferación-diferenciación.
Los resultados obtenidos en los apartados 4.3.1. y 4.3.2. ponen
de manifiesto que tanto la inhibición de la expresión de c-Myc como la
expresión ectópica de Mad1 provocan un incremento en el porcentaje de
células diferenciadas en MEL-R, en presencia de HMBA. En el caso de los
transfectantes de Mad1 que expresan altos niveles de la proteína de fusión
Discusión
��
GFP-Mad (clones 8, 19 y 22) el porcentaje de células hemoglobinizadas es
superior al 80%. El análisis de la distribución de las fases del ciclo celular
confirmó que el desbloqueo de la diferenciación, tal como ocurre en las
células MEL-DS19 tratadas con HMBA, va acompañado de una acumulación
de las células en la fase G1 del ciclo celular (Kiyokawa y col., 1993; Vanegas
y col., 2003). En los transfectanes estables de c-Myc, el incremento, aunque
significativo, del porcentaje de células hemoglobinizadas es inferior al
observado en los transfectantes de Mad1. El silenciamiento parcial de c-myc
mediado por el RNA interferente podría ser la causa de la diferencia en el
porcentaje de células diferenciadas entre los transfectantes de c-Myc y los
de Mad1. Una inhibición más eficiente de c-myc compromete la viabilidad
celular, tal como se observó en el caso de algunos clones (clones 6, 7, 10,
13 y 14). En conjunto, nuestros resultados demuestran que, tal como se
representa en el esquema de la Figura 50a, la inhibición de la proliferación
celular, a través de modificaciones en la expresión de los componentes de la
red Myc-Max-Mad, induce el desbloqueo de la diferenciación de las células
MEL-R en respuesta al HMBA. Se podría deducir entonces que la resistencia
de MEL-R a los inductores de la diferenciación podría estar causada, en
parte, por un fallo en la parada de la proliferación celular.
Figura50.DesbloqueodeladiferenciacióneritroideencélulasMEL-R. La inhibición de la proliferación celular, ya sea mediante la expression ectópica de Mad1 o la inhibición de la expresion de c-Myc, provoca un desbloqueo de la diferenciación de MEL-R en respuesta al HMBA (a), mientras que la activación de GATA-1, un factor de transcripción indispensable para la diferenciación eritroide, es suficiente para inducir el desbloqueo espontáneo de la diferenciación de las células MEL-R (b).
Inhibición de la proliferación celular
Activación de genes específicos del linaje eritroide
c-MycMad1
HMBA
GATA-1
a
b
Discusión
��
5.5. GATA-1 y el desbloqueo de la diferenciación de las célulasMEL-R
La diferenciación de las células MEL requiere, además de la salida
del ciclo celular, de reguladores transcripcionales específicos que activen la
expresión de marcadores del linaje eritroide. La sobreexpresión del factor de
transcripción GATA-1 en células MEL induce el desbloqueo espontáneo de la
diferenciación eritroide (Choe y col., 2003). De manera consistente con estos
resultados, en la presente tesis doctoral se comprobó que la sobreexpresión
de GATA-1 provoca el desbloqueo de la diferenciación también en las
células MEL-R. Sin embargo, a diferencia de los observado en el caso de la
diferenciación inducida por la expresión ectópica de Mad1 o la interferencia
de Myc, que dependen de la presencia de HMBA, la sobreexpresión de
GATA-1 por sí sola es suficiente para inducir la diferenciación de las células
MEL-R (ver esquema de la Figura 50b).
La capacidad de GATA-1 para provocar la diferenciación espontánea
de las células MEL-R podría estar relacionada con dos requisitos
indispensables para la diferenciación: la parada de la proliferación celular
y la adquisición de características específicas del linaje eritroide. GATA-1
lleva a cabo una doble función: actúa como un inhibidor de la proliferación
celular reprimiendo la expresión de c-myc (Rylski y col., 2003) y al mismo
tiempo activa la expresión de genes específicos del linaje eritroide, como
las globinas o las enzimas involucradas en la síntesis de los grupos heme
(ALAS-S, ALA-D, PBG-D). Rodríguez y colaboradores, utilizando un sistema
de marcaje con biotina seguido de una purificación con streptavidina,
demostraron in vivo en células eritroides que GATA-1 interacciona con
factores de transcripción hematopoyéticos y proteínas remodeladoras de
la estructura de la cromatina. Estos complejos están relacionados con la
represión de genes característicos de estadios inmaduros (GATA-1/FOG-
1-MeCP1), la parada de la proliferación (GATA-1/Gfi-1B) y la activación de
genes específicos del linaje eritroide (GATA-1/FOG-1, GATA-1/Lbd1, GATA-
1/TAL-1) (Rodriguez y col., 2005). Por lo tanto, GATA-1, a través de sus
diferentes interacciones, actúa simultáneamente deteniendo proliferación y
activando diferenciación eritroide, lo cual explica que su sola sobreexpresión
provoque la diferenciación de células MEL-DS19 y MEL-R.
Discusión
�00
5.6.AntagonismoentreGATA-1yPU.1
GATA-1 y PU.1 son factores de transcripción específicos que regulan
la diferenciación hacia los linajes eritroide y mieloide, respectivamente.
La diferenciación hacia un linaje u otro depende del balance entre ambas
proteínas (ver esquema Figura 8). El antagonismo entre GATA-1 y PU.1
reside en la interacción física del dominio de “dedos de zinc” del extremo C-
terminal de GATA-1 y el dominio “ets” de PU.1 (Figura 8) (Liew y col., 2006;
Rekhtman y col., 1999; Zhang y col., 1999). En el linaje mieloide, GATA-
1 inhibe la función de PU.1 bloqueando la interacción con c-Jun (Figura
11). En el caso del linaje eritroide, se han postulado dos mecanismos que
podrían ser complementarios. El grupo del Skoultchi, del Albert Einstein
College of Medicine (USA), sostiene que la inhibición de GATA-1 mediada
por PU.1 depende del reclutamiento de la proteína del retinoblastoma (Rb)
que, junto con otras proteínas represoras como HP1α y Suv39H, provoca
un silenciamiento de los genes diana de GATA-1 (ver esquema Figura 12)
(Rekhtman y col., 2003; Stopka y col., 2005). Como alternativa, los trabajos
del grupo de Blobel, del Children’s Hospital of Philadelphia (USA), señalan
que PU.1 se une a GATA-1 e inhibe la acetilación, mediada por CBP (Creb-
Binding Protein), de dos motivos ricos en lisinas altamente conservados que
se localizan cerca de los dominios de “dedo de zinc” de los extremos N y
C-terminal de la proteína (Hong y col., 2002). Existen suficientes evidencias
tanto in vitro como in vivo que corroboran que la acetilación de GATA-1
incrementa la actividad transactivadora y está relacionada con su habilidad
para inducir la diferenciación eritroide (Boyes y col., 1998; Choi y col.,
2006; Hung y col., 1999). Se ha descrito que la mutación de cualquiera de
estos motivos de acetilación inhibe parcialmente la capacidad de GATA-
1 para inducir diferenciación de precursores eritroides mientras que la
eliminación simultánea de ambos la anula totalmente (Hung y col., 1999).
Independientemente del modelo planteado, en ambos casos se acuerda que
PU.1 actúa como un inhibidor de la actividad de GATA-1 en el linaje eritroide
(Rekhtman y col., 2003; Rekhtman y col., 1999; Stopka y col., 2005; Zhang
y col., 1999; Zhang y col., 2000).
Discusión
�0�
Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran que GATA-1 se
expresa constitutivamente en MEL-DS19 y demuestran que lo mismo ocurre
en las líneas resistentes. La sobreexpresión de GATA-1, de forma similar
a lo observado en MEL-DS19 (Choe y col., 2003), induce la diferenciación
espontánea de la células MEL-R. En MEL-R, sin embargo, a diferencia de
lo que ocurre en las células progenitoras MEL-DS19, el gen que codifica
para PU.1 está silenciado. Los experimentos de coinmunoprecipitación
de proteínas endógenas confirmaron que PU.1 interacciona con GATA-1
en MEL-DS19 mientras que, como era de esperar, no se observó ninguna
interacción en las células MEL-R. Si, como se postula, la activación de PU.1
es la principal causa del bloqueo de la actividad de GATA-1 en MEL-DS19,
y MEL-R carece de PU.1, debería existir otro factor (o factores) responsable
de la inhibición de GATA-1. En este sentido, un estudio reciente a nivel
molecular dejó en evidencia que la interacción entre PU.1 y GATA-1 es muy
débil (Liew y col., 2006). En base a esos resultados los autores proponen
un posible mecanismo que permitiría cambios rápidos en la regulación de la
composición de los complejos de GATA-1 con otras proteínas.
5.7.CausasdelbloqueodelaactividaddeGATA-1enlascélulasMEL-R
Tal como se discute en el apartado anterior los resultados del trabajo
sugieren que en las líneas resistentes otro factor, distinto de PU.1, es el
responsable del bloqueo de la actividad de GATA-1. Entre las proteínas que
se unen a GATA-1, y son esenciales para su actividad activadora o represora
de la transcripción, destacan Gfi-1b y FOG-1. El factor de transcripción Gfi-
1b se une a GATA-1 para suprimir la expresión de genes involucrados en
proliferación celular, tales como c-myb y c-myc, en estadios tempranos de
la diferenciación (Rodriguez y col., 2005). Por otra parte, los mutantes de
GATA-1 que no pueden interactuar con FOG-1 son incapaces de inducir la
diferenciación de progenitores eritroides que no expresan GATA-1 (Crispino y
col., 1999). Sin emabrago, la posibilidad de que FOG-1 y/o Gfi-1b fueran
responsables del bloqueo de la actividad de GATA-1 quedó descartada en base
a los análisis de expresión mediante RT-PCR semicuantitativa. En ninguno
Discusión
�0�
de los casos se observaron cambios significativos entre MEL-DS19 y MEL-R.
Paralelamente, se analizó la expresión de GATA-2, un importante regulador
de la hematopoyesis cuya inactivación es crucial para la diferenciación
eritropoyética. GATA-2 es capaz de unirse a las dianas de GATA-1 y reprimir
su expresión, inhibiendo de esta manera la diferenciación eritroide (Grass y
col., 2003). Los resultados revelaron que el gen que codifica para GATA-2
está inactivo en MEL-R. Por lo tanto, GATA-2 no podría estar involucrado en
el bloqueo de la actividad de GATA-1.
Fli-1 es otro de los factores de transcripción del linaje hematopoyético
que posee el potencial de inhibir la diferenciación eritroide. Starck y
colaboradores demostraron que Fli-1 interacciona con GATA-1 en células
MEL indiferenciadas (Starck y col., 2003). A diferencia de lo que ocurre en
las células MEL-DS19 tratadas con HMBA, los niveles del mRNA de Fli-1 se
mantienen altos en las células MEL-R. La presencia activa de Fli-1 en MEL-R
induce a pensar en una alternativa a PU.1 capaz de interaccionar con GATA-1
y bloquear la diferenciación de MEL-R. El análisis a nivel de proteínas reveló
la existencia de una relación inversa en la expresión de las dos isoformas de
Fli-1 en MEL-DS19 y MEL-R. Estas isoformas se originan mediante el uso
de codones de iniciación de la traducción alternativos, el AUG+1 da lugar
a la isoforma de 51 KDa mientras que el AUG+100, que se encuentra en el
mismo marco de lectura que el primero, da lugar a la isoforma de 48 KDa
(Sarrazin y col., 2000). No se descarta la posibilidad de que este cambio en
la expresión relativa de ambas isoformas esté relacionado con el bloqueo
de la respuesta a los inductores en las líneas resistentes. Experimentos de
sobreexpresión en células MEL revelaron que tanto la isoforma de 48 KDa
como la de 51 KDa inhiben la diferenciación en respuesta al HMBA (Sarrazin
y col., 2000). Se ha especulado con la posibilidad de que ambas isoformas
estén involucradas en la regulación de la expresión de Fli-1 a nivel post-
transcripcional o traduccional (Sarrazin y col., 2000).
Los experimentos de coinmunoprecipitación de proteínas endógenas
demostraron que Fli-1 interacciona con GATA-1 tanto en las células MEL-R
como en las MEL-DS19. Fli-1, por lo tanto, es un candidato potencial para
sustituir a PU.1 y bloquear la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes.
No se descarta incluso la posibilidad de que Fli-1 coopere con PU.1 para
reprimir a GATA-1 en MEL-DS19. De manera consistente con esta hipótesis,
Discusión
�0�
Starck y colaboradores demostraron que Fli-1 es una diana transcripcional de
PU.1 (Starck y col., 1999). Los autores del trabajo sugieren que la capacidad
de PU.1 para inhibir la diferenciación eritroide podría depender, al menos en
parte, de la activación de Fli-1.
Tanto Fli-1 como PU.1 han sido identificados como oncogenes cuya
activación provoca la transformación de progenitores eritroides (Athanasiou y
col., 2000; Ben-David y col., 1991; Moreau-Gachelin y col., 1996; Pereira
y col., 1999; Tamir y col., 1999). Por otro lado, se ha demostrado que la
sobreexpresión de Fli-1, al igual que la de PU.1, inhibe la diferenciación de
las células MEL en respuesta a los agentes inductores (Rao y col., 1997;
Starck y col., 1999; Yamada y col., 1997). En ambos casos la interacción con
el dominio de unión a DNA de GATA-1 se produce a través de este dominio
(Eisbacher y col., 2003; Rekhtman y col., 1999; Starck y col., 2003; Zhang
y col., 1999) (Figura 8). Tanto en el caso de PU.1 como en el de Fli-1, la
interacción con GATA-1 no resulta en una inhibición de la unión GATA-1-
DNA (Eisbacher y col., 2003; Rekhtman y col., 1999). Hong y colaboradores
observaron que PU.1 inhibe la acetilación de GATA-1 en células MEL (Hong
y col., 2002). En un estudio posterior, Liew y colaboradores aportaron una
explicación a nivel molecular y propusieron que el dominio ets de PU.1
bloquea el acceso de CBP a los sitios de acetilación de GATA-1 (Liew y
col., 2006). Esto mismo podría ocurrir en el caso del dominio ets de Fli-1,
lo cual resultaría en un bloqueo de la capacidad de GATA-1 para activar la
diferenciación eritroide (Figura 51).
Figura51.InhibicióndelaactividadtranscripcionaldeGATA-1mediadaporFli-1encélulasMEL-R.Modelo para explicar la inhibición de la actividad de GATA-1 en las líneas resistentes. a) En células MEL tratadas con HMBA la interacción CBP/GATA-1, a través de los dominios de “dedo de zinc”, provoca la acetilación de GATA-1 estimulando se actividad transcripcional. b) En células MEL-R la interacción Fli-1/GATA-1, a través de los dominios de “dedo de zinc”, podría, entre otras cosas, inhibir la union de CBP bloqueando la reactivación de los genes diana de GATA-1.
a b
GATA-1
CBP
GATA-1
Fli-1
MEL + HMBA MEL-R + HMBA(T/A)GATA(A/G) (T/A)GATA(A/G)
Discusión
�0�
Estudios preliminares en células eritroleucémicas han puesto de
manifiesto que, además de PU.1, otros miembros de la familiaEts podrían
inhibir el proceso de diferenciación interfiriendo con la acetilación de factores
nucleares involucrados en la regulación del balance entre proliferación
celular y maduración (Hong y col., 2002).
La interacción entre Fli-1 y GATA-1 no siempre tiene un efecto
antagónico. Se ha constatado que en el linaje megacariocítico Fli-1 unido
a GATA-1 activa la expresión de genes linaje-específicos (Eisbacher y col.,
2003). Esto no elimina, sin embargo, la posibilidad de que en un contexto
distinto, en este caso en el linaje eritroide, Fli-1 actúe como un inhibidor de
GATA-1. Se podría pensar en la posibilidad, dada la cercanía entre ambos
linajes, de que Fli-1 actúe como un regulador de la actividad de GATA-1
inhibiendo su capacidad para activar el programa de diferenciación eritroide
en favor de la activación de programa megacariocítico.
En conjunto, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral
apoyan la hipótesis de que la activación de la diferenciación eritropoyética
depende de una compleja red de factores, entre los que se encuentran
factores de transcripción específicos y factores constitutivos, que funcionan
en un delicado equilibrio para activar o reprimir el programa de diferenciación
eritroide (Figura 52). El papel determinante de PU.1 como principal ejecutor
del bloqueo de la diferenciación en células eritroleucémicas queda en parte
cuestionado. Se añade, sin embargo, un nuevo elemento a la compleja red
de factores que regulan la eritropoyesis, Fli-1, cuya habilidad para inhibir la
diferenciación eritroide podría deberse, entre otras cosas, a su capacidad
para unirse y reprimir a GATA-1.
Para confirmar la hipótesis de Fli-1 como posible antagonista de
GATA-1 en células eritroleucémicas se debería analizar su capacidad para
inhibir la inducción de la diferenciación de MEL-R mediada por GATA-1.
En el caso de que Fli-1 sea capaz de inhibir la actividad de GATA-1, sería
interesante estudiar el mecanismo mediante el cual se produce el bloqueo.
En ese sentido, tal como se ha sugerido, se podría analizar el efecto de Fli-1
sobre la acetilación de GATA-1 a través de la acetiltransferasa CBP (Creb-
Binding Protein).
Discusión
�0�
PU.1
Fli-1Rb
Shp-1
STAT1
JAK2
EPO-R
EKLFCBP
Bcl-X
GATA-2
Gfi-1BFOG
ß-globina
c-Mycgp55
Bcl-2
GATA-1
Mad1
Figura52.Reddefactoresimplicadosenladiferenciacióndecélulaseritroleucémicas. En verde se indican los factores de transcripción GATA-1 y PU.1, en azul las proteínas que constituyen diana directas o que interaccionan directamente con ambos reguladores transcripcionales. En rojo se representan las proteínas que interaccionan con GATA-1 y PU.1 de manera indirecta y que están involucradas en el bloqueo/desbloqueo de la diferenciación eritroide. Las flechas en curva representan una autoregulación transcripcional, las flechas con sentido único indican una activación transcripcional, las líneas terminadas en una barra indican una represión transcripcional, las flechas de dos sentidos indican una interacción proteína-proteína, las líneas dobles indican un antagonismo y las líneas dobles discontinuas en color rojo representan un probable antagonismo.
6. CONCLUSIONES
Conclusiones
�0�
1- Se han establecido líneas celulares eritroleucémicas derivadas
de MEL-DS19 resistentes a la acción de los agentes inductores de
la diferenciación celular. A diferencia de la línea parental, las células
resistentes son capaces de proliferar indefinidamente y permanecer en
un estadio indiferenciado en presencia de los agentes inductores de la
diferenciación.
2- Se ha comprobado que la resistencia al HMBA no depende de la
presencia continua del inductor sino de factores intrínsecos de las células
resistentes que inhiben la reactivación del programa de diferenciación
celular.
3- Se ha demostrado que, a diferencia de lo que ocurre en la línea
progenitora, el gen que codifica para el factor de transcripción PU.1
está silenciado en las líneas resistentes. La inactivación de PU.1 es,
sin embargo, insuficiente para inducir el desbloqueo de la diferenciación
celular.
4- Se ha comprobado que el tratamiento con agentes demetilantes
del DNA induce la reactivación de PU.1. Este resultado sugiere que la
inhibición de la expresión de PU.1 en las líneas resistentes podría estar
relacionada con cambios en la estructura de la cromatina.
5- Se ha constatado que la activación de la fosfatasa hematopoiética
Shp-1, involucrada en la inhibición de la fosforilación de STAT1, es
independiente de PU.1.
6- Se ha demostrado que las líneas resistentes son capaces de reiniciar
el programa de diferenciación en respuesta al HMBA cuado se induce la
parada del ciclo celular. Tanto la inactivación de c-Myc como la expresión
ectópica de Mad1 provocan una inducción de la diferenciación hacia el
linaje eritroide en presencia del inductor.
Conclusiones
�0�
7- Se ha demostrado que la sobreexpresión de GATA-1 induce la
diferenciación de las líneas resistentes. A diferencia de lo observado con
c-Myc y Mad1, se ha comprobado que la sobreexpresión de GATA-1 es
suficiente para inducir el desbloqueo de la diferenciación hacia el linaje
eritroide de las líneas resistentes.
8- Se han encontrado evidencias que señalan al factor de transcripción
Fli-1 como un posible inhibidor, alternativo a PU.1, de la capacidad de
GATA-1 para inducir la diferenciación hacia el linaje eritroide.
7. BIBLIOGRAFÍA
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Zhang, P., Zhang, X., Iwama, A., Yu, C., Smith, K. A., Mueller, B. U., Narravula, S., Torbett, B. E., Orkin, S. H. y Tenen, D. G. (2000). PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding. Blood 96, 2641-2648.
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8. ANEXO
Anexo
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Publicacionesoriginalesderivadasdeestatesisdoctoral:
- García-Sacristán, A, Fernández-Nestosa,MJ, Hernández, P, Schvartzman,
JB y Krimer, DB (2005). Protein kinase clk/STY is differentially regulated
during erythroleukemia cell differentiation: a bias toward the skipped splice
variant characterizes postcommitment stages. Cell Research 15 (7): 495-
503.
- Fernández-Nestosa, MJ, Hernández, P, Schvartzman, JB y Krimer, DB
(2007). PU.1 is dispensable to block erytrhoid differentiation in Friend
erythroleukemia cells. Leukemia Res doi:10.1016/j.leukres (in press).
- Fernández-Nestosa, MJ, Hernández, P, Schvartzman, JB y Krimer, DB
(2007). Fli-1 interacts and represses GATA-1 to block MEL resistant cells
erythroid differentiation. Manuscrito.