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Transferencia de material genético II
Transferencia de material genético II
Restricción (Digestión)
Plásmido
Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.
Características
1. ORIGEN DE REPLICACIÓNCapaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero
2. MARCADORES DE SELECCIÓN
Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico
3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.
¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de
plásmidos?
¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa
Microscopia de polímero de agarosa
Uso de “colorantes”
1. BROMURO DE ETIDIO
2. SYBER SAFE
Tinción con Bromuro de Etidio
Tinción con Syber Safe
Sensibilidad del colorante SYBER-SAFE
50 25 12.5 6.25 3.125 50 25 12.5 6.25 3.125 ng
Gel de Agarosa al 1.5%
Teñido con Bromuro de Etidio
Gel de Agarosa al 1.5%
Teñido con SYBER-SAFE
Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos
DNA cromosomal
Plásmido abiertoPlásmido superenrrollado
1 Precipitación
con isopropanol
2 Cromatografía intercambio
aniónico
3 Filtración con membrana
de nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en la
membrana de nitrocelulosa
M 1
kb
- + - + BamHI- - + + NdeI
Inserto
Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE 2X
El plásmido obtenido se resuspendió en 20 L de H2O estéril. Posteriormente se tomaron 5 L para realizar la digestión correspondiente.
Restricción
Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.
Enzimas de restricción
· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)
Enzimas de restricciónNomenclatura Ejemplo Corresponde a:E Escherichia Género de la bacteriaco coli Especie de la bacteriaR RY13 Cepa de la bacteriaI La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima
Extremos romos
Extremos cohesivos
Plásmido
Usos de las enzimas de restricción
Identificación de muestra