Download - Tesis fernández briones
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Química Orgánica, Inorgánica y Bioquímica.
ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD METABÓLICA
DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO EN RATA
WISTAR. EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, LA
RESTRICCIÓN CALÓRICA Y EL TRATAMIENTO
ICV CON LEPTINA.
Alejandro Fernández Briones.
Junio, 2013
Tutores: Dr. Antonio Andrés Hueva.
Dra. Nilda Gallardo Alpizar.
AGRADECIMIENTOS.
Esta tesis va dedicada a todas aquellas personas que la han hecho posible, esta
es la única parte de la tesis donde me puedo tomar la licencia de no ser políticamente
correcto, aunque intenteré serlo en la medida de lo posible.
En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Nilda
Gallardo y el Dr. Antonio Andrés, su empeño y esfuerzo en que este trabajo salga hacia
delante. Siempre los recordaré con cariño, por la confianza que ambos han depositado
en mi persona durante todo éste tiempo y por la cantidad de cosas que he aprendido
de ellos. No solo del trabajo, también de la vida.
Como no, a mis compañeros del laboratorio, a los cuales aprecio, y a los que
siempre recordaré con cariño.
A mis amigos, con los que he compartido tantas y tantas cosas que no podría
quedarme con ninguna en concreto. Sé que siempre estarán ahí para lo bueno y para
lo malo.
A mi familia, ya que durante el transcurso de estos años, han sucedido
demasiados acontecimientos negativos, como la perdida de varios familiares muy
cercanos a los que echo mucho de menos, un accidente de coche en el que casi pierdo
la vida, además de un sinfín de adversidades que no habría podido superar de no
haber tenido el apoyo incondicional por parte de mi familia en especial de mi padre
por ser capaz de templarme los nervios en los momentos difíciles, y de mi madre que
contra todo pronóstico consiguió hacer de mi un hombre de provecho.
Quiero hacer una mención especial a mi hermano, la persona con la que más
tiempo he pasado en mi vida, con el que siempre discuto hasta el punto de mandarnos
a la mierda casi a diario, pero al que siempre echo en falta cuando necesito
desahogarme, y sé que siempre estará ahí para lo que necesite.
Como no quiero extenderme mucho más, simplemente gracias a todos.
INDICE DE CONTENIDOS
1-INTRODUCCIÓN. ...................................................................................... 1
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2. ..................... 1
1.2- El tejido adiposo. ............................................................................. 3
1.2.1- El tejido adiposo blanco. ............................................................ 4
1.3- Fisiología del tejido adiposo. ............................................................ 5
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo. .................. 5
1.3.2- La Gota Lipídica. ......................................................................... 7
1.3.3- Lipólisis....................................................................................... 8
1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino. ..................................... 12
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα). ....................................... 14
1.4.2- IL-6. .......................................................................................... 15
1.4.3- PPARγ. ...................................................................................... 16
1.4.4- Resistina. .................................................................................. 17
1.4.5- Adiponectina. ........................................................................... 18
1.4.6- Leptina. .................................................................................... 19
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina. .......................................... 21
1.4.8- Secreción de leptina por el TAB. ............................................... 23
1.5- Insulina. .......................................................................................... 24
1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina. ..................................... 24
1.6- Interacción leptina-insulina. ........................................................... 25
1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la
sensibilidad a la insulina. .................................................................... 26
1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de
funcionalidad. .................................................................................... 27
1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta. .................... 29
1.10- Hipótesis y objetivos. ................................................................... 31
2- MATERIALES Y MÉTODOS. .................................................................... 33
2.1- Materiales. ..................................................................................... 33
2.2- Modelos de experimentación. ........................................................ 33
2.2.1- Modelo animal de envejecimiento. .......................................... 33
2.2.2- Modelo animal de restricción calórica. ..................................... 34
2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos. ...................................... 35
2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación. .......................................................... 35
2.5- Ensayo de Liposisis. ........................................................................ 36
2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS. .................... 36
2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular
(ICV) con Leptina. .................................................................................. 37
2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal. ........................ 40
2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina. .......................................... 40
2.6.3- Denervación del tejido adiposo. ............................................... 40
2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG). ......................... 41
2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero. ................... 42
2.8- Extracción de ARN. ......................................................................... 42
2.9- Transcripción inversa. .................................................................... 43
2.10- Real-time PCR. .............................................................................. 44
2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco.
Obtención de extracto total, membrana plasmática,
membrana interna, gota lipídica y citosol. ......................................... 45
2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares. ................................ 45
2.11.2- Gota lipídica. .......................................................................... 45
2.12- Determinación de la concentración de proteínas. ........................ 48
2.12.1- Mediante el método Bradford. ............................................... 48
2.12.2- Mediante el método Lowri. .................................................... 48
2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS),
e Inmuno detección de proteínas mediante Western Blot. ................ 48
2.14- Caracterización de fracciones subcelulares. ................................. 49
2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico. ..................... 52
3- RESULTADOS. ....................................................................................... 53
3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas. ............................................. 54
3.2.- Ensayo ayuno-realimentación. ...................................................... 59
3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la
restricción calórica. ......................................................................... 60
3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral.
Efectos del isoproterenol y la insulina. ............................................ 67
3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL
en tejido adiposo. Efectos de isoproterenol y la insulina. ............... 70
3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los
niveles proteicos de ATGL, AQ7 y perilipina en los explantes
de tejido adiposo. ........................................................................... 71
3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK
en tejido adiposo. Efectos del envejecimiento y la restricción
nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina. .......................... 72
3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular
de proteínas durante la lipolisis. Efectos del envejecimiento y la
restricción calórica. ......................................................................... 75
3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de
novo de ácidos grasos y de captura de lípidos por el tejido
adiposo para la síntesis de TAG. ...................................................... 83
3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo
del tejido adiposo blanco en ratas de 3 meses de edad. Papel
del SNA en la transmisión de la señal de la leptina. ............................ 89
3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad
del TAB y la sensibilidad a la insulina. Resultados del test
de tolerancia a glucosa. ................................................................... 90
3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa
en respuesta a insulina por el TAB. ................................................. 91
3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA. ......... 93
3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido
adiposo blanco por la leptina a través del SNA. .............................. 94
3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad
lipolítica del tejido adiposo blanco por la leptina. ........................... 96
4- DISCUSIÓN ........................................................................................... 99
5- CONCLUSIONES. ................................................................................. 117
6- BIBLIOGRAFÏA. .................................................................................... 121
INDICE DE TABLAS.
Tablas de la Introducción.
Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB. ..... 13
Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con
funciones endocrinas / paracrinas / autocrinas . ................................... 14
Tablas de Materiales y Metodos.
Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio. .................. 45
Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio. .......................................... 51
Tablas de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Tabla 5. Características biológicas de los animales................................... 53
Tabla 6. Área bajo la curva. ...................................................................... 57
Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína
relacionada con el receptor de LDL (LPR-1) en tejido adiposo
de animales de 3, 8 y 24 meses de edad. .............................................. 58
Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero. .................................. 59
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Tabla 9. Niveles de leptina en suero tras el tratamiento icv con leptina. . 90
Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con
el tono simpático del tejido adiposo. .................................................... 94
Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la
síntesis de glicerol-3p y de TAG en el tejido adiposo. ............................ 94
INDICE DE FIGURAS.
Figuras de la introducción.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol. ..................................................... 10
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. ..................................... 11
Figura 3. Señalización de leptina. ............................................................. 22
Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal
de la insulina . ....................................................................................... 25
Figuras de materiales y métodos.
Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad
alimentadas ad libitum. ......................................................................... 34
Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo. ........................ 36
Figura 7. Esquema de la distribución de las muestras en la placa. ........... 37
Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las
minibombas osmóticas. ........................................................................ 39
Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico.
VL – ventrículo lateral. .......................................................................... 39
Figura 10. Imagen de la denervación quirúrgica. ...................................... 41
Figura 11. Representación esquemática del protocolo de
centrifugación diferencial utilizada para aislar las distintas
fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma
celular a partir del TAB. ......................................................................... 47
Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores
en fracciones subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. .......... 50
Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de
marcadores en fracciones subcelulares de cada condición
de tejido adiposo blanco epididimal. ..................................................... 50
Figuras de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 8 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 54
Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 24 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 55
Figura 16. Área bajo la curva .................................................................... 56
Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio
de incubación. ....................................................................................... 61
Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL
y ATGL y del transportador de glicerol AQ7 en condición basal. ........... 63
Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina
en extracto total de tejido adiposo visceral. .......................................... 65
Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas
de la enzima HSL en extracto total de tejido adiposo visceral. .............. 66
Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes
en estado basal. .................................................................................... 68
Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes
en estado basal. .................................................................................... 69
Figura 23. Representación de los cambios en la activación de
la enzima HSL . ...................................................................................... 70
Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total
de los explantes. ................................................................................... 72
Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies
fosforiladas y de la masa de AMPK. ....................................................... 73
Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la
enzima AMPK. ....................................................................................... 74
Figura 27A. Traslocación de la ATGL......................................................... 76
Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal. .. 76
Figura 28A. Traslocación de la HSL.. ......................................................... 77
Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal. ..... 78
Figura 29A. Traslocación de la P-565-HSL. ................................................ 79
Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada
inactiva de HSL en condición basal. ....................................................... 79
Figura 30A. Traslocación de la Perilipina. ................................................. 80
Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en
condición basal. .................................................................................... 81
Figura 31A. Traslocación de la Acuoporina 7. ........................................... 82
Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática
y membrana interna de AQ7 en condición basal. .................................. 82
Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ......................... 83
Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido
adiposo visceral. .................................................................................... 84
Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma
fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. ........................ 85
Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. ........... 86
Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal. ... 88
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot
representativo de STAT3. ...................................................................... 90
Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal..... 91
Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica
del tejido adiposo. ................................................................................. 92
Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de
norepinefrina con la denervación.......................................................... 93
Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras
el tratamiento ICV con leptina............................................................... 95
Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL
tras el tratamiento ICV con leptina. ....................................................... 96
Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido
adiposo tras el tratamiento ICV con leptina. ......................................... 97
Abreviaturas.
AC Adenilato ciclasa.
ACS Acil-CoA sintasa.
ACC Acetil-CoA carboxilasa.
ACTH Hormona corticotrófica.
AG Ácidos grasos.
AGL Ácidos grasos libres.
AGPR Proteína relacionada con agouti.
AKT RAC-beta serine/threonine-protein kinase.
AL Ad-libitum.
AMPc Adenosinmonofosfato cíclico.
AMPK Proteína quinasa activada por monofosfato de adenina.
Apo CII Apolipoproteína CII.
aP2 Proteína activadora 2.
AQ7 Acuoporina 7.
AR Receptor adrenérgico.
ARC Nucleo arcuato del hipotálamo.
ATGL Triglicérido lipasa.
AUC Área bajo la curva.
BSA Albumina de suero bobina.
CART Transcrito regulado por cocaína.
CD36 Proteína de diferenciación 36.
ChREBP Carbohydrate-reponse-element-binding.
CREB Factor de transcripción de la proteína de respuesta a AMPc .
CYT Citoplasma celular.
DNA Ácido desoxirribonucleico.
DNAc Ácido desoxirribonucleico complementario
DNL Lipogénesis de novo.
DTT Dithiothreitol.
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético.
EGTA Ácido etilenglicol (aminoetil éter) tetraacético.
FAS Sintetasa de ácidos grasos.
FIRKO Fat-specific insulin receptor knockout mice.
FR Restricción calórica.
GH Hormona de crecimiento.
Gi Proteína G inhibitoria.
GL Gota lipídica.
GLUT1 Transportador de glucosa 1.
GLUT4 Transportador de glucosa 4.
GPDH Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa.
Gs Proteína G estimulatoria.
G3P Glicerol 3 fosfato.
HDL Lipoproteínas de alta densidad.
HOMA Indicador de control de la homeostasis de la glucosa.
HSL Lipasa hormona sensible.
ICV Intra cerebro ventricular.
IGF-1 Factor de crecimiento de insulina-1.
IL-6 Interleuquiina 6.
INS Insulina.
IR Receptor de la insulina.
IRS Substrato del receptor de insulina.
ISO Isoproterenol.
JAK2 Tirosina-quinasas de la familia Janus.
KRH Krebs-Ringer-Hepes.
KRP Krebs-Ringer-fosfato.
LCR Líquido cefaloraquideo.
LDL Lipoproteínas de baja densidad.
LPL Lipasa lipoproteína.
LPR-1 LDL receptor protein related-1.
MAG Mono acil-gliceridos.
MGL Monoglicérido lipasa.
MI Membrana interna.
MP Membrana plasmática.
MSH Hormona melanocito estimulante.
mRNA Ácido ribonucléico mensajero.
mTOR Diana de rapamicina.
NA Noradrenalina.
NaN3 Azida sódica.
NE Norepinefrina.
NEFA Ácidos grasos libres.
NPY Neuropeptido Y.
NTC Membranas de nitrocelulosa.
P Perilipina.
PBS Buffer Fosfato Salino.
PCR Reacción en cadena de la polimerasa.
PDE Fosfodiesterasa.
PDHc Complejo de la piruvato deshidrogenasa.
PD3B Fosfodiesterasa 3B.
PEPCK Fosfoenol-piruvato-carboxi-quinasa.
PGC-1α Coactivador de la transcripción 1α.
PI3K Fosfoinositol-3- kinasa.
PKA Proteína quinasa A.
PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluoruro.
POMC Pro-opiomelacortina.
PPARγ Activador de la proliferación peroxisomal γ.
PTP1B Fosfotirosina fosfatasa 1B.
PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo.
QM Quilomicrones.
RNA Ácido ribonucléico.
rpm Revoluciones por minuto.
RT Transcriptara reversa.
SDS Dodecilsulfato sódico.
SEM Desviación estándar de la media.
Ser Serina.
SNA Sistema nervioso autónomo.
SNC Sistema nervioso central.
SNS Sistema nervioso simpatico.
SIRT1 Sirtuinas.
SOCS-3 Supresor de la señalización por citoquinas.
SOG Sobrecarga oral de grasas.
SREBP-1c Proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c.
STAT3 El transductor de señal y activador de la transcripción 3.
S6K Proteína ribosomal S6 quinasa.
TAB Tejido adiposo blanco.
TAE Tejido adiposo epididimal.
TAG Triacilgliceridos.
TAM Tejido adiposo marrón.
TAP Tejido adiposo perirrenal.
TG-LP Triglicéridos provenientes de los lípidos.
TG-QM Triglicéridos provenientes de los quilomicrones.
TAG-VLDL Triglicéridos provenientes de los lípidos de muy baja densidad.
Thr Treonina.
TNFα Factor de necrosis tumoral.
TSH Hormona estimulante de la tiroides.
Tyr Tirosina.
Tween 20 Monooleato de Polioxietileno Sorbitan.
TZDs Tiazolidinedionas.
T2DM Diabetes mellitus tipo 2.
UI Unidades internacionales.
VMH Región del hipotálamo ventromedial.
VL Ventrículo lateral.
VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad.
2DOG 3H-2-desoxiglucosa
.
INTRODUCCIÓN
Introducción
1
1-INTRODUCCIÓN.
Estado de la cuestión.
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2.
La masa del tejido adiposo está regulada por un equilibrio dinámico entre la
ingesta diaria y el gasto energético. La ruptura de este balance conlleva obesidad, una
enfermedad multifactorial que involucra un incremento en la masa del tejido adiposo.
Factores como la urbanización y la dieta desequilibrada, asociado con la
susceptibilidad genética han permitido que emerja el fenotipo obeso.
Además de los problemas físicos derivados del exceso de peso, la obesidad se
asocia con frecuencia a otras enfermedades crónicas y trastornos metabólicos como la
diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipemias, enfermedades cardiovasculares,
resistencia a insulina y otras alteraciones que contribuyen al desarrollo de la
morbilidad. La Organización Mundial de la Salud considera que la prevalencia del
sobrepeso y de la obesidad ha alcanzado en muchas regiones proporciones epidémicas
((Wild y col., 2004).
La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más común y es una de las
causas principales de mortalidad en las sociedades desarrolladas. Esta enfermedad
puede ser de 2 tipos, en función de su origen.
La diabetes tipo I representa menos del 10 % de los casos y, generalmente, se
diagnostíca en la infancia. Se caracteriza por elevados niveles de glucosa en sangre
debido a que el organismo no produce o produce poca insulina. En estos casos se
necesitan inyecciones diarias de insulina para sobrevivir.
La diabetes tipo II corresponde aproximadamente al 90% de todos los casos de
diabetes y, generalmente, se presenta en la edad adulta. Es una condición patológica
en la que existe resistencia a la acción de la insulina, con lo cual el metabolismo de
carbohidratos y lípidos no es regulado de manera adecuada por dicha hormona. Esta
patología se caracteriza por hiperglucemia, hiperlipidemia e hipoinsulinemia. En estas
condiciones, el organismo llega a necesitar del aporte de grandes cantidades de
insulina exógena (Saltiel AR, 2001).
Introducción
2
La diabetes tipo II es una enfermedad multifactorial con raíces poligénicas, así
como de naturaleza ambiental, ya que influye de forma importante, la dieta y una vida
sedentaria (Fujimoto WY, 2000). Sin embargo, desde hace décadas, existe un consenso
general en cuanto a la aparición de la Diabetes tipo II, la cual se debe al desarrollo
previo de resistencia a la insulina, que es un estado fisiológico en el que los tejidos
diana de esta hormona presentan una respuesta disminuida ante un estímulo
insulínico normal (Kahn CR, 1978).
Entre los mecanismos responsables de la resistencia a la insulina se han
descrito alteraciones de la expresión génica, de la distribución subcelular y del estado
de fosforilación de diferentes proteínas de la vía de transducción de señales de la
insulina, como por ejemplo: los sustratos del receptor de insulina, la PI3K (Saltiel AR,
2001), la AKT o el GLUT4 (Shepherd PR y col., 1999). Sin embargo, la obesidad es el
principal factor adquirido responsable de la disminución de la sensibilidad a la insulina
(Lewis G y col., 2002).
En este contexto, el tejido adiposo es reconocido actualmente como un tejido
clave en el desarrollo de la resistencia global a la insulina (Arner, 2003; Bays y col,
2008). Además de su función como depósito de energía y principal proveedor de
ácidos grasos para su utilización por otros tejidos, el tejido adiposo es un importante
órgano endocrino, liberando a la circulación péptidos semejantes a hormonas que
afectan al metabolismo sistémico y a la propia célula adiposa. Desde una perspectiva
“adipocéntrica” se postula que la expansión del tejido adiposo constituye un nexo
importante entre obesidad y resistencia a insulina (Virtue y Puig, 2010). En esta
dirección se ha propuesto que: un exceso del combustible energético almacenado que
sobrepasa la capacidad oxidativa/almacenamiento, sumado a la alteración de la
producción de citoquinas por los adipocitos y macrófagos residentes, más, el aumento
del estrés oxidativo y la inflamación crónica, entre otros, contribuiría a la
desregulación funcional del tejido adiposo (Medina-Gomez y col., 2007). En su
conjunto los aspectos mencionados convierten al tejido adiposo en un tejido clave en
el estudio de las bases moleculares de la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus
tipo II.
Introducción
3
Se estima que la prevalencia de la diabetes a nivel mundial será del 4.4% en el
año 2030, de modo que la epidemia de la diabetes continuará y para 2030 habrá en el
mundo 366 millones de diabéticos. Estas cifras continuarán incrementándose siempre
que se mantenga o incremente la prevalencia de obesidad (Wild y col, 2004).
1.2- El tejido adiposo.
Tradicionalmente, el tejido adiposo había sido considerado como un tejido
pasivo, destinado a ser exclusivamente un almacén energético. Sin embargo, en el año
1987 se identificó como uno de los principales tejidos implicados en el metabolismo de
hormonas esteroideas (Siiteri PK, 1987) y en la producción y secreción de adipsina, un
factor cuya expresión está marcadamente disminuida en situación de obesidad de
roedores (Flier JS y col, 1987).
Años más tarde, en 1994 la identificación y caracterización de la leptina, estableció al
tejido adiposo como un autentico órgano endocrino (Zhang Y y col., 1994). En los
últimos años, se ha confirmado que el tejido adiposo secreta numerosos péptidos
bioactivos y proteínas, llamadas colectivamente adipoquinas (Kershaw EE y col., 2004;
Guerre-Millo M.J, 2002), que pueden actuar tanto a nivel local (autocrino/paracrino) y
sistémico (endocrino) (Kershaw EE y col., 2004), como a nivel del sistema nervioso
central (Ahima RS y col., 2006). Estos factores desempeñan un papel muy importante
por su influencia sobre una amplia variedad de procesos fisiológicos, la mayoría de
ellos relacionados con la homeostasis de la glucosa y la regulación del balance
energético. Algunas adipoquinas como la leptina y la resistina, intervienen junto con la
insulina, en el control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad
a la insulina del organismo.
El preocupante aumento de la obesidad y las complicaciones derivadas de ésta,
como la diabetes mellitus y la enfermedad cardiovascular, ha incrementado
notablemente la necesidad de profundizar en el estudio del tejido adiposo, su
metabolismo y las consecuencias de la alteración de su actividad metabólica,
endocrina e inmunológica (Bays y col, 2008).
Introducción
4
En mamíferos, existen dos tipos de tejido adiposo: el tejido adiposo blanco
(TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM) (Cinti, 2001). Ambos tienen capacidad de
metabolizar y almacenar lípidos, pero presentan claras diferencias en cuanto a su
morfología, distribución, expresión génica, características del proteoma así como de su
función (Pulido y col, 2012). El tejido adiposo blanco es el órgano específico que
almacena la energía sobrante en forma de grasa; mientras que el tejido adiposo
marrón, tiene una función fisiológicamente opuesta: permite la disipación de energía
en forma de calor. Nuestra investigación se ha centrado en el estudio del TAB, por lo
tanto, dirigiremos nuestra atención hacia la descripción del mismo.
1.2.1- El tejido adiposo blanco.
En mamíferos, el TAB se encuentra extensamente distribuido en el organismo,
principalmente a escala dérmica, subcutánea, mediastínica, perigonadal, perirrenal, y
retroperitoneal (Cinti, 2001). Una vez que el tejido adiposo está completamente
formado, los adipocitos representan entre uno y dos tercios del mismo. El resto del
tejido adiposo está constituido por células sanguíneas, células endoteliales, pericitos, y
precursores de adipocitos con distintos grados de diferenciación, aunque también
pueden encontrarse preadipocitos (células intersticiales o vacías de lípidos) y células
mesenquimales, probablemente diferenciadas (las cuales poseen pequeñas gotas de
lípidos) (Hauner y col., 1989). Los adipocitos que son las células principales de este
tejido provienen de células mesenquimales indiferenciadas. En su origen presentan
pequeñas inclusiones lipídicas que al hacerse mayores y más numerosas, confluyen en
una única gota lipídica que ocupa casi todo el citoplasma.
Como se ha mencionado, el TAB es el mayor reservorio de energía, de
componentes de membrana y probablemente de moléculas señalizadoras de
naturaleza lipídica del organismo. Participa en el control de la homeostasis lipídica,
almacenando la energía sobrante en forma de triacilglicéridos y liberando ácidos
grasos libres y glicerol cuando el gasto energético excede la ingesta de energía. Todo
ello está regulado por los sistemas nervioso y endocrino.
Introducción
5
La liberación de ácidos grasos no esterificados a la circulación sanguínea en
momentos de demanda energética, continúa siendo la principal función del tejido
adiposo y la forma en que se regula la movilización de los lípidos almacenados en la
gota lipídica es un tema difícil de estudiar, que requiere de mucha investigación por la
estrecha relación que existe entre los niveles circulantes de ácidos grasos y la diabetes
tipo 2 (Birnbaum MJ, 2003).
1.3- Fisiología del tejido adiposo.
Cuando se incrementa la ingesta alimentaria y/o disminuye el gasto de energía,
el exceso de ésta se deposita de manera eficiente en el tejido adiposo en forma de
triglicéridos neutros. Sin embargo, cuando la alimentación es escasa y/o se
incrementan los requerimientos energéticos, las reservas de lípidos son liberadas para
proporcionar combustible energético en forma de ácidos grasos y de glicerol para la
síntesis de glucosa por otros tejidos.
Los triglicéridos provenientes de la dieta (exógenos) ingresan a la circulación
plasmática desde la linfa en la forma de quilomicrones. Por su parte, el hígado sintetiza
y secreta la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), la cual transporta los
triglicéridos endógenos sintetizados desde el hígado hasta los tejidos extrahepáticos.
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo.
La enzima lipoproteína lipasa (LPL) es una enzima multifuncional, que juega un
papel clave en la distribución de los ácidos grasos de los triglicéridos de las
lipoproteínas plasmáticas hacia los tejidos periféricos (Wang y col., 2009).
Presente en el endotelio capilar de los tejidos extrahepáticos, entre ellos el
tejido adiposo blanco, cataliza la hidrólisis de los triglicéridos de las lipoproteínas ricas
en triglicéridos (VLDL y quilomicrones). Estas lipoproteínas se unen a la enzima a través
de la apolipoproteína CII (Apo CII) y como resultado de la actividad de la LPL se libera
progresivamente ácidos grasos libres (AGL) y glicerol. Los AGL pueden difundir a través
Introducción
6
de la membrana plasmática o entrar a la célula adiposa a través de transportadores del
tipo CD36 y moverse al interior de la misma unidos a la proteína aP2. Luego, por acción
de la acetil-CoA sintasa son transformados en el acil derivado, acil-CoA. Los acil-CoA
son principalmente reesterificados con moléculas de glicerol-3P y almacenados
nuevamente como triglicéridos, mientras que el glicerol queda en la sangre y es
captado principalmente por las células hepáticas. En estas condiciones, los ácidos
grasos que no entran a los tejidos, se unen a la albúmina para su circulación por el
organismo.
Ahora bien, la captura de AGL, su activación y su esterificación al glicerol-3P
para formar TAG en el tejido adiposo, es un proceso que requiere en paralelo de la
captura de glucosa estimulada por la insulina y su transformación en glicerol-3P. En el
estado basal, cuando la glucemia es baja, la glucosa entra al adipocito a través del
transportador de membrana GLUT1, sin embargo, en situación de elevada glucemia y
en respuesta a la insulina, la glucosa es transportada preferentemente por el
transportador de membrana GLUT4. Una vez en el citoplasma, puede ser transformada
en dihidroxiacetona-P, la cual originará la molécula de glicerol-3P.
Una fracción de la glucosa capturada es metabolizada hasta piruvato. El
piruvato puede formar lactato en el citosol, o ingresar a la mitocondria y por
descarboxilación oxidativa irreversible (a través del complejo de la piruvato
deshidrogenasa – PDHc) se transforma en acetil-CoA. Los átomos de carbono del
acetil-CoA pueden sufrir una oxidación completa a CO2, con la consecuente liberación
de energía y formación de ATP.
En el tejido adiposo funcional, un exceso de glucosa estimula la síntesis de novo
de ácidos grasos, esto implica la salida de acetil-CoA de la mitocondria. La forma de
extraer acetato de la mitocondria es en forma de citrato, el producto de la
condensación de acetil-CoA y oxalacetato. En el citosol, el citrato es desdoblado a
oxalacetato y acetil-CoA. El acetil-CoA es transformado a malonil-CoA por carboxilación
irreversible catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Luego, el malonil-CoA sufre
un proceso de elongación catalizado por el complejo de la sintetasa de ácidos grasos
(FAS) para formar acil-CoA. A partir de este y de glicerol-3-P se sintetizan triglicéridos
que pasan a formar parte del reservorio de triglicéridos del tejido. En esta vía
Introducción
7
metabólica intervienen las enzimas glicerol-3-P aciltransferasa, ácido lisofosfatídico acil
transferasa y diacil-glicerol acil transferasa, esta última enzima es clave en el control de
este proceso (Proscura e Ignatieva, 2002).
La enzima LPL juega un papel fundamental en el almacenamiento de AG y de
colesterol en los adipocitos en forma de TAG y ésteres de colesterol que son lípidos
neutros. La esterificación dependerá del suministro de glicerol-3P generado a partir de
la glucolisis y de la captura de los AG. La entrada de AG al tejido adiposo depende del
gradiente de concentración. De modo que cuando aumenta la velocidad de
esterificación, aumenta la entrada de AG a la célula y la hidrólisis de los TG de las
lipoproteínas, catalizada por la LPL. Estos procesos están favorecidos en respuesta a la
insulina.
1.3.2- La Gota Lipídica.
La síntesis de la mayoría de los lípidos neutros como los TAG y los ésteres de
colesterol se realiza en el retículo endoplásmico y rápidamente estos lípidos se
depositan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica, presente en todas las
células (eucariotas) o en las partículas de lipoproteínas en células especializadas como
los hepatocitos y cardiomiocitos. Se piensa que la gota lipídica se forma a partir del
retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. Debido a la
dificultad que comporta el trabajo con lípidos, los estudios relacionados con los
mecanismos que modulan la actividad de la gota lipídica son escasos, sin embargo
tienen gran repercusión debido a su relación con la obesidad, la diabetes, el cáncer y la
neurodegeneración (Zechner y col, 2012).
Actualmente se acepta que la síntesis de lípidos neutros es suficiente para crear
una película que los cubre y concentra en una gota lipídica, a esta película se van
añadiendo fosfolípidos tomados a partir de la membrana del retículo endoplásmico
hasta formar una verdadera cubierta. También se propone la intervención necesaria de
las aciltransferasas en el proceso de formación, definición y orientación de la gota
lipídica en la membrana del retículo endoplásmico (Sturley y Hussain, 2012).
Introducción
8
1.3.3- Lipólisis.
En los mamíferos, la adaptación exitosa al estado de ayuno y de inanición
depende en gran medida de la movilización regulada de los ácidos grasos almacenados
en forma de triglicéridos en la gota lipídica del tejido adiposo blanco, proceso conocido
como lipólisis. Por lo tanto se define la lipolisis como la parte catabólica del ciclo de los
ácidos grasos. La regulación de la lipolisis es compleja y depende de las necesidades de
energía, de los niveles circulantes de hormonas, de la modificación covalente de las
enzimas lipolíticas y de la compartimentación subcelular de estas enzimas. Las
alteraciones de los mecanismos de regulación de la lipolisis tienen gran impacto en la
homeostasis de energía y la señalización celular (Birnbaum MJ, 2003; Zechner y col,
2012).
Los adipocitos contienen tres enzimas responsables de escindir los triglicéridos
en glicerol y ácidos grasos, la triglicérido lipasa (ATGL), la lipasa sensible a hormonas
(HSL) y la monoglicérido lipasa (MGL)). El primer paso en la degradación de los
triglicéridos está catalizado por la ATGL, que convierte los TAG en DAG. La HSL es
responsible de la hidrólisis de los DAG a MAG y la MGL de la hidrólisis de los MAG. En
el tejido adiposo la lipólisis se produce fundamentalmente por la acción de las enzimas
ATGL y HSL (Zechner y col, 2012).
Los ácidos grasos liberados pueden abandonar la célula y ser transportados por
la sangre unidos a la albúmina para ser utilizados por tejidos no adiposos (hígado,
músculo esquelético, cardiaco, etc) oxidándose o reesterificándose según las
condiciones nutricionales (Figura 1). Por otra parte, el glicerol generado tras la
degradación metabólica de los triglicéridos es transportado a través de la membrana
plasmática por medio, fundamentalmente, del canal de glicerol acuoporina 7 (AQP7).
(MacDougald y Burant, 2005).
La ATGL juega un papel fundamental en la regulación de la lipólisis basal. Se
conoce que tanto los agonistas de los receptores nucleares PPAR, el ayuno y los
glucocorticoides aumentan la expresión del gen de ATGL, mientras que la alimentación
Introducción
9
y la insulina la disminuyen. A diferencia de la HSL, los b-adrenérgicos regulan su
actividad de forma indirecta, a través del reclutamiento del coactivador CGI-58
(Zechner y col, 2012).
Sin embargo, la regulación de la actividad de la HSL depende fuertemente, de
los niveles intracelulares de cAMP y la actividad de la enzima PKA. En condiciones de
elevada demanda energética, la activación de los receptores β adrenérgicos en la
superficie de los adipocitos y de la proteína G estimulatoria (Gs) lleva a la generación
de AMPc, por activación de la enzima de membrana adenilil ciclasa. El AMPc activa la
proteína quinasa A (PKA), una serina-treonina quinasa que activa mediante
fosforilaciones de diferentes residuos de serina a la HSL. Al contrario, la estimulación
del receptor α2-adrenérgico promueve la inhibición de la adenilil ciclasa por medio de
la proteína G inhibitoria (Gi), reduciendo el contenido intracelular de AMPc e
inhibiendo la lipólisis (Lafontan y Berlan, 1995).
La HSL fosforilada y activa se mueve desde el citosol hacia la superficie de la
gota lipidica de la célula adiposa. La fosforilación de proteínas de la familia de las
perilipinas localizadas en la superficie de la gota lipidica, es también necesaria antes de
que la HSL pueda catalizar la hidrólisis de los triglicéridos. Las perilipinas no
fosforiladas crean una barrera entre la HSL y los lípidos, que evita la lipólisis, mientras
que la fosforilación de las perilipinas por la PKA permite a la HSL acceder a la superficie
de la gota lipidica. La acción de la HSL sobre los triglicéridos presenta especificidad por
los ésteres unidos en posición 1 y 3 del glicerol (Yeaman, 1990). En la regulación
postraduccional de la HSL intervienen también otras enzimas entre las que se
encuentra la AMPK (Zechner y col, 2012).
La hidrólisis de los monoglicéridos remanentes para dar glicerol y un ácido
graso, ocurre por la acción de la monoglicéridolipasa (MGL), que no se encuentra bajo
control hormonal y cuya abundancia en la célula es suficiente para evitar la
acumulación de productos intermediarios de la lipólisis (Horowitz, 2003).
Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante
del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c
inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la
degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos
dependientes de la insulina, la fosfoinositol
fosforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
vivo de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores
metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como
se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su
función metabólica modificando los niveles intracelular
PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol.
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una
disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expr
que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por
estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
Introducción
10
Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante
del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c
inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la
degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos
dependientes de la insulina, la fosfoinositol-3- kinasa (PI3-K), que activa por
osforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores adrenérgicos, por lo que a efectos
metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como
se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su
función metabólica modificando los niveles intracelulares de cAMP, la actividad de la
PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Estructura del Isoproterenol.
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una
disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expresión de HSL, por lo
que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por
estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón, hormona
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante
del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil ciclasa
inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la
degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos
K), que activa por
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios in vitro o ex
de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenérgicos, por lo que a efectos
metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como
se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su
es de cAMP, la actividad de la
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una
esión de HSL, por lo
que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por
estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
Introducción
11
basal (Langin y col, 2005; Jocken y col, 2007). Por otra parte, la lipolisis estimulada por
catecolaminas es superior en el tejido adiposo visceral en comparación con el tejido
adiposo subcutáneo, así como la liberación de ácidos grasos libres y de glicerol a la
sangre portal, de modo que la lipolisis mediada por catecolaminas afecta directamente
al contenido de glucosa y de grasa del hígado, promoviendo el desarrollo de
dislipemias, hiperglucemia y resistencia a la insulina (Bays y col, 2008).
Dadas sus funciones, no es de sorprender que el tejido adiposo esté
exquisitamente diseñado para responder a los cambios agudos de las señales
nutricionales. En realidad, a nivel molecular y bioquímico, los adipocitos están
equipados con la maquinaria necesaria para responder a la estimulación hormonal, por
ejemplo, el adipocito es sensible a la insulina, la cual estimula la captación de glucosa y
la lipogénesis e inhibe la lipólisis y además está sujeto a la regulación adrenérgica que
estimula la lipólisis (Sethi y Vidal-Puig, 2007).
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. En la figura se muestran las principales vías
metabólicas de los lípidos y de la glucosa en el tejido adiposo. Además se señalan algunas
enzimas, transportadores y receptores importantes de estas vías metabólicas. AC: adenilil
ciclasa, ACS: acil-CoA sintasa, ACC: acetil-CoA carboxilasa, AGL: ácido graso libre, cAMP:
monofosfato de adenosina cíclico, AR: receptor adrenérgico, FAS: sintasa de ácidos grasos,
G3P: glicerol 3 fosfato, HSL: lipasa hormona sensible, IR: receptor de la insulina, IRS: substrato
del receptor de insulina, LPL: lipoproteína lipasa, MGL: monoglicérido lipasa, PDE:
fosfodiesterasa, PI3K: fosfatidilinositol 3- quinasa, PKA, proteína quinasa A, P: perilipina, AQP7:
acuoporina 7 (Modificado de Sethi y Vidal- Puig, 2007).
Introducción
12
1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino.
El tejido adiposo actúa como un órgano endocrino liberador de hormonas,
produciendo numerosas sustancias, llamadas adipocitoquinas, que incluyen varias
citoquinas, hormonas y factores de crecimiento. Han sido identificados más de 100 de
estos factores secretados. A través de estas sustancias, el tejido adiposo, no solo
influye sobre la propia biología adipocitaria sino también sobre la regulación de la
homeostasis energética, la sensibilidad insulínica, el metabolismo de lípidos y
carbohidratos, el crecimiento celular, la inflamación y el desarrollo de cáncer (Havel,
2004, Bays y col, 2008).
Hoy en día se considera que el TAB es un órgano muy dinámico con funciones
pleiotrópicas. En la tabla 1 se muestran ejemplos de receptores expresados por el TAB,
mientras que en la tabla 2 se enumeran algunas adipocitoquinas expresadas y
secretadas por este tejido como: la adipsina (Cook y col, 1985), el factor de necrosis
tumoral (TNFα) (Hotamisligil y col., 1995), la leptina (Friedman, 2000), la resistina
(Steppan y col., 2001b) y la adiponectina (Hu y col., 1996; Maeda y col., 1996; Nakano y
col., 1996; Keys y col., 1972).
Algunas pueden regular funciones como la reproducción, la función
cardiovascular y la inmunidad. La secreción de estas citoquinas por el TAB está
regulada entre otros factores por el ayuno, la ingesta y la obesidad (Hamilton y col.,
1995; Hotamilligil y col., 1995; Lefebvre y col., 1998). De esta manera, el adipocito se
ha convertido en el integrador central del programa metabólico del organismo y está
completamente establecido, que la función endocrina del adipocito ejerce una
influencia directa sobre otros órganos clave, como el cerebro, el hígado o los músculos
esqueléticos.
Introducción
13
Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB (Bays y col, 2008.
Revisión)
.
Receptores de membrana para hormonas Insulina (lipogénico / antilipolítico)
Glucagón (lipolítico)
GH
TSH
Receptores de hormonas nucleares y otros
receptores nucleares
Glucocorticoides
Andrógenos
Estrógenos
Hormona tiroidea
PPAR, PPAR /, PPARγ
Receptor de adipoquinas y citoquinas Leptina
Adiponectina
IL-6
TNFα
Receptores de catecolaminas β1,β2,β3 (lipolíticos)
α1,α2 (antilipolíticos)
Receptores de factores de crecimiento y
otros receptores
FGF, EGF, IGF, …
Cannabinoides, melanocortinas, NPY
Lipoproteínas
Introducción
14
Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con funciones
endocrinas / paracrinas / autocrinas (Bays y col, 2008. Revisión).
Adipoquinas y Citoquinas Leptina
TNFα
IL-6
Proteínas relacionadas con el sistema
inmunitario
MCP-1
Proteínas implicadas en el sistema
fibrinolitico
PAI-1
Factor tisular
Proteínas del complemento y relacionadas Adipsina
Adiponectina
Lípidos y proteínas del metabolismo y
transporte de lipidos
LPL
Apolipoproteina E
Otras Resistina
A continuación haremos una breve descripción de algunas de las más
importantes adipocitoquinas secretadas por el TAB. Como la segunda parte de esta
tesis está relacionada con los efectos de la leptina, ésta será analizada con más detalle.
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα).
EL TNFα es una citoquina identificada inicialmente en macrófagos y linfocitos
en respuesta a un estimulo inflamatorio. Dentro del tejido adiposo, TNFα se expresa
en adipocitos y células estromales vasculares (Fain y col., 2004). Se sintetiza como una
proteína transmembrana de 26 kDa que sufre la degradación por una
metaloproteinasa que libera a la circulación la molécula soluble de TNF- α de 17 kDa
(Kriegler y col., 1988).
Los adipocitos aislados y diferenciados son capaces de producir TNF-α y aunque
el tejido adiposo está compuesto de una variedad de tipos celulares incluyendo
adipocitos, células del estroma, células del sistema inmune y células endoteliales
Introducción
15
vasculares, todas capaces de producir citoquinas, los adipocitos son la fuente
predominante de TNF-α (Ruan y col., 2003).
Aunque inicialmente se sospechó que TNF- podría estar jugando un papel
importante en la caquexia, hoy se sabe que está implicado en la patogénesis de la
obesidad y la resistencia a la insulina (Fernández-Real y Ricart, 2003; Ruan y Lodish,
2003). La expresión del TNFα de TAB está aumentada en ratones y humanos obesos y
se correlaciona positivamente con la adiposidad y la resistencia a insulina (Ruan y
Lodish, 2003; Hotamisligil y col., 1993; Hotamisligil, 2003). Sus acciones en tejido
adiposo incluyen la represión de genes involucrados en la captación y el
almacenamiento de AGL y glucosa y de genes implicados en la adipogenesis como
PPARγ y el cambio en la expresión de otras adipocitoquinas como leptina, adiponectina
e IL-6 (Ruan y col., 2002). Por otro lado, TNFα deteriora la señalización de insulina
mediante la alteración del estado de fosforilacion de IRS-1 y 2 (Hotamisligil, 2003).
Estos efectos pueden producirse de forma directa e indirectamente a través del
aumento de AGL (Ruan y Lodish, 2003). El modelo de deficiencia de TNFα en ratón
presenta mejor insulinemia, mejor tolerancia a la glucosa y protección para el
desarrollo de la obesidad y la resistencia a la insulina cuando se administra una dieta
rica en grasas (Uysal y col., 1997; Ventre y col., 1997).
1.4.2- IL-6.
La IL-6 es una citoquina proinflamatoria, de la cual se estima que un tercio de
sus valores circulantes provienen del TAB, correlacionándose con el IMC (Fruhberck y
col., 2001; Fernández-Real y Ricart, 2003). Sin embargo, la mayor parte de la IL-6
derivada del tejido adiposo proviene de las células de la fracción del estroma vascular
(Galic y col., 2010). Los valores circulantes de IL-6 están incrementados en individuos
obesos, aspecto que podría estar mediado por el TNFα, ya que se ha demostrado su
capacidad de estimular la expresión de IL-6 en adipocitos (Fruhbeck y col., 2001). En
humanos, los valores circulantes de IL-6 se han correlacionado positivamente con
resistencia a la insulina, fenómeno al cual podría contribuir, ya que la IL-6 incrementa
la concentración de FFA circulantes e inhibe la actividad de la LPL (Bastard y col.,
Introducción
16
2000). Los niveles plasmáticos de IL-6 se encuentran elevados en obesidad y RI
(Mohamed-Ali y col., 1997; Bastard y col., 2000; Vozarova y col., 2001). Según
Frühbeck y col., (2001) la leptina induce la expresión de IL-6 en los adipocitos. Por otra
parte se ha descrito que la IL-6 inhibe la producción de adiponectina (Yu y Ginsberg,
2005), adipoquina asociada al incremento de sensibilidad a la insulina. Sin embargo, el
papel de IL-6 en la resistencia a la insulin, la obesidad y la inflamación no se conoce del
todo. Otros estudios la implican tanto en procesos que promueven la inflamación
como en procesos resolutorios de la inflamación (Allen T.L. y col., 2010). Los resultados
publicados por (Sadagursky M y col., 2009) (Tabla 3) postulan que la IL-6 incrementa
las acciones de la leptina.
1.4.3- PPARγ.
Es un miembro de la familia de receptores nucleares activados por
proliferadores de peroxisomas que se expresan fundamentalmente en TA y
macrófagos. Su función es clave en la regulación transcripcional de la adipogénesis.
Agonistas de PPAR-γ como las TZDs (tiazolidinedionas), promueven la diferenciación de
los adipocitos y mejoran la sensibilidad a la insulina en modelos animales de diabetes
tipo II, así como en pacientes con diabetes tipo II (Olefsky, 2000).
Las vías de señalización mediadas por TNFα y PPAR γ son mutuamente
antagónicas. Se plantea que la activación de PPAR γ puede atenuar los efectos
metabólicos negativos de TNFα tanto “in vitro” como “in vivo” (Szalkowki y col.,
1995;Milles y col., 1997; Souza y col.,1998).
También cabe destacar que PPARγ estimula la captación de los ácidos grasos, a
través del aumento de la proteína transportadora de ácidos grasos, de la LPL, de la acil-
CoA sintasa, y la esterificación de los triglicéridos en una acción concertada con otro
factor de transcripción SREBP-1c que regula la lipogénesis para el llenado de las gotas
lipídicas (Evans y col., 2004).
Introducción
17
1.4.4- Resistina.
La resistina es una proteína de 94 aminoácidos que se describió inicialmente en
el adipocito maduro de roedores (Steppan y col., 2001b). En humanos la resistina
circulante proviene fundamentalmente de los macrófagos, células del sistema inmune.
En roedores, la resistina produce resistencia a la insulina y aumenta la producción
hepática de glucosa. Sin embargo, la contribución de la hiperresistinemia al desarrollo
de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, continúa siendo objeto de una gran
controversia. Según estudios iniciales, las concentraciones de resistina están
aumentadas en modelos de obesidad inducida o genética (Steppan y col., 2001a)
mientras que la neutralización de la misma empleando anticuerpos específicos contra
resistina, disminuía la hiperglucemia y mejoraba la resistencia a la insulina en estos
modelos.
En humanos las discrepancias son aún mayores, aunque se ha demostrado
correlación entre los niveles circulantes de resistina y el peso corporal, la adiposidad o
la resistencia a la insulina (Janke y col., 2002; Savage y col., 2001).
Diferentes factores afectan la síntesis de resistina en roedores, entre los que se
encuentran la edad y el estado nutricional así como la localización anatómica del tejido
adiposo. En la rata Wistar, la expresión de resistina por el tejido adiposo epididimal
disminuye con el envejecimiento. Por otra parte, la restricción calórica moderada,
disminuye la expresión de resistina por el tejido adiposo visceral así como los niveles
circulantes de esta adipoquina, solo en animales jóvenes y maduros (Fernández y col,
2009).
Con el objetivo de profundizar en las funciones de las resistinas humana y de
roedores se crearon ratones deficientes en resistina derivada del tejido adiposo, pero
que producían resistina humana de forma similar a como la producen en humanos los
macrófagos (ratones transgénicos humanizados). Cuando estos animales son
alimentados con dieta alta en grasa desarrollan rápidamente inflamación en el tejido
adiposo, a la par que aumenta la lipolisis y los niveles séricos de AGL. La inflamación
del tejido adiposo se desencadena a partir del incremento en MCP-1 dependiente de
resistina. Con el tiempo, estos animales acumulan lípidos en el músculo (incluyendo
Introducción
18
DAG) y desarrollan resistencia a la insulina en este tejido relacionada con el aumento
de la fosforilación en serina del IRS-1. Estos resultados demostraron que tanto la
resistina de roedores como la humana exacerba la inflamación del tejido adiposo y
genera resistencia a insulina en músculo esquelético (Qatanani M y col, 2009).
1.4.5- Adiponectina.
La adiponectina es una proteína de 30 kDa producida abundantemente por el
tejido adiposo que sufre numerosas modificaciones postraduccionales (Maeda y col.,
1996; Scherer y col., 1995). A diferencia de la resistina, la adiponectina disminuye la
producción hepática de glucosa. Además, la expresión de adiponectina se encuentra
disminuida en todos los procesos relacionados con estados de inflamación y resistencia
a la insulina, como en la obesidad, la diabetes mellitus y la enfermedad coronaria
(Hotta y col., 2000; Weyer y col., 2001; Adamczak y col., 2003; Kishida y col., 2003). De
modo que es la única adipoquina con efectos saludables sobre diferentes tipos de
células y tejidos, efectos que generalmente se asocian al aumento de actividad de la
enzima AMPK (Yamauchi y col, 2002).
Los niveles de adiponectina aumentan cuando la sensibilidad a la insulina
mejora, ya sea por la disminución del peso corporal o por tratamientos con drogas
sensibilizadoras de la insulina (Chandran y col., 2003; Diez e Iglesias, 2003). Los ratones
deficientes en adiponectina desarrollan de forma prematura intolerancia a la glucosa y
resistencia a la insulina inducida por dieta muestran, elevados valores de FFA séricos y
una incrementada proliferación de células del músculo liso vascular en respuesta al
daño tisular (Kubota y col., 2002; Maeda y col., 2002). Por otra parte, la
sobreexpresión de adiponectina en ratones conduce a una mejora en la sensibilidad a
la insulina, la tolerancia a la glucosa y los niveles séricos de FFA (Combs y col., 2004).
Se plantea que numerosos fármacos con efectos hipolipémicos como los ácidos
grasos omega 3, las estatinas y fibratos así como la niacina, que mejoran el pérfil
lipídico del organismo, no afectan la liberación de TNF, resistina o leptina, sin
embargo, incrementan la producción de adiponectina por el tejido adiposo (Wanders y
col, 2010).
Introducción
19
1.4.6- Leptina.
La leptina es una hormona peptídica de 16 kDa y no presenta modificaciones
post-traduccionales (Halaas y col., 1995). Esta hormona codificada por el gen ob, es
producida y secretada por los adipocitos y en menor medida se ha detectado en la
placenta, donde estimula el crecimiento y la sobrevivencia de los trofoblastos
(Masuzaki y col., 1997; Gambino y col, 2012), en la mucosa gástrica, donde potencia la
respuesta vagal aferente frente a la distensión gástrica (Bado y col., 1998; Kentish y
col, 2013) y en el músculo esquelético (Wang y col., 1998).
La secreción de leptina por los adipocitos tiene lugar en proporción directa a la
masa de tejido adiposo y al estado nutricional (Frederich y col., 1995). La síntesis y
secreción de leptina está regulada por una compleja red de señales neuroendocrinas y
endocrinas que reflejan el estado fisiológico del organismo. Los niveles circulantes de
leptina están asociados con la masa del tejido adiposo y también reflejan cambios
inmediatos en el estado nutricional ya que disminuyen, poco después del comienzo del
ayuno (Becker y col., 1995). En condiciones normales, sus niveles plasmáticos
aumentan en casos de balance energético positivo, es decir, cuando la ingesta y la
absorción de nutrientes exceden el gasto energético global. De esta forma, se
comporta como un marcador del estado de las reservas del organismo. La impresión
inicial después de su descubrimiento en 1994, fue que la leptina (del griego leptos,
delgado) era una señal dirigida al cerebro para inhibir la ingesta de alimentos y
disminuir el peso corporal (Zhang y col., 1994). Este concepto fue impulsado en parte
por la observación de que los seres humanos y roedores que carecen de leptina
funcional manifiestan un apetito exagerado y obesidad.
La leptina limita el depósito graso en el tejido adiposo protegiendo de la
lipotoxicidad (Unger, 2002; Kahn y col., 2005). Estimula la oxidación de los ácidos
grasos (Muoio y col., 1997; Minokoshi y col., 2002) y la captación de glucosa por los
músculos esqueléticos (Haque y col., 1999; Kamohara y col., 1997). Estos efectos
metabólicos de la leptina se encuentran en parte mediados por la activación del eje
hipotálamo-sistema nervioso simpático (Buettner y col., 2008; Minokoshi y col., 2002).
Muchos de estos efectos metabólicos tienen lugar demasiado rápido para ser atribuido
Introducción
20
a los cambios transcripcionales (señalización JAK-STAT) e involucran la activación de la
señalización de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) como fue descrito en el
músculo y el hígado por Kahn y col., (2005).
La leptina puede tener efectos autocrinos y paracrinos en el metabolismo del
adipocito (Fruhbeck y col., 1997): la incubación de adipocitos de ratón con leptina
estimula la lipólisis de los triglicéridos intracelulares, dicho efecto no fue observado en
ratones db/db carentes de receptores de leptina y la sobreexpresión de leptina en
adipocitos reduce la expresión de la acetil-CoA carboxilasa. La leptina también reduce
la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c
(SREBP1c) en tejido adiposo, lo que contribuye a inhibir la lipogénesis en este tejido
(Yu y Ginsberg, 2005).
Aunque la leptina regula, a través del SNC, una multitud de funciones
fisiológicas como la ingesta y el balance energético (Friedman y col., 1998), la función
inmune y reproductiva (Lord y col., 1998; Hileman y col., 2000), la hematopoyesis
(Margetic y col., 2002) la homeostasis de la glucosa (Friedman y Halaas, 1998), cabe
destacar sus efectos antilipogénicos (Gallardo y col, 2007; Warne y col, 2011),
antidiabéticos tanto en diabetes tipo I como tipo II y que éstos efectos son
independientes de la regulación del peso corporal y la ingestión de alimentos (Coppari
y Bjørbæk, 2012).
La observación fundamental que permitió relacionar la leptina con los procesos
de regulación del peso corporal proviene de estudios realizados con ratones ob/ob, en
los cuales la falta de leptina funcional provoca hiperfagia, obesidad y una disminución
de la tasa metabólica. Por otra parte la administración de leptina es capaz de revertir
las alteraciones causadas por la ausencia de esta hormona (Zhang y col., 1994; Rentsch
y col., 1995; Maury y Brichard, 2010). Sin embargo, la noción de la leptina como una
hormona anti-obesidad fue puesta en duda debido a que la obesidad se asocia
típicamente con niveles altos de leptina y resistencia a la leptina (Ahima, 2008). Se
conoce que humanos obesos y diversos modelos animales de obesidad inducida y
genética (excepto el modelo ob/ob) presentan hiperleptinemia, condición indicativa de
Introducción
21
resistencia a esta hormona que se normaliza tras la pérdida de peso (Maffei y col.,
1995).
Se han propuesto varios mecanismos que intentan explicar la resistencia
central a la leptina como son los defectos en el sistema de acceso de la leptina al
sistema nervioso central dado que el transporte a través la barrera hematoencefalica
es saturable. Defectos en la expresión del receptor largo de leptina Ob-Rb en el
hipotálamo y/o de la señalización mediada por el receptor, que incluye el aumento en
niveles de SOCS-3. Defectos en los circuitos neuronales que regulan el balance
energético. Estrés crónico del retículo e inflamación a nivel de los núcleos
hipotalámicos (El Haschimi y col., 2000; Morris y Rui, 2009; Ozcan y col, 2009; Zachary
y col, 2010; Olofsson y col, 2013). No obstante, se ha propuesto utilizar el término
resistencia selectiva a la leptina cuando se analizan ciertos desórdenes metabólicos
como la obesidad y la diabetes, debido a que la resistencia no afecta por igual a todas
las células, a todos los órganos diana o a todas las vías de señalización en las que está
implicada esta hormona ( Könner y Brüning JC, 2012).
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina.
La leptina al igual que la insulina regula el peso corporal y el metabolismo a
través de circuitos neuronales. La leptina ejerce sus acciones biológicas uniéndose a
sus receptores. El gen db, que codifica para el receptor de leptina (ObR), se aisló por
primera vez en el plexo coroideo de ratón (Tartaglia y col., 1995). Los receptores de
leptina pertenecen a la superfamilia de receptores de citoquina clase 1. El splicing
alternativo del gen db da origen a las 6 isoformas de los receptores: la forma soluble
Ob-Re, la cual carece de dominio citoplasmático; cuatro formas con dominios
citoplasmáticos cortos (Ob-Ra, Ob-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf), y la forma Ob-Rb, la cual se
encuentra en casi todos los tejidos y podría ser la única forma capaz de transducir la
señal de la leptina al menos en el SNC (Friedman y Hass, 1998; Lago y col., 2007).
La leptina controla el balance energético y el peso corporal porque regula la
actividad neuronal en el hipotálamo, estas acciones implican fundamentalmente la vía
Introducción
22
JAK/STAT. La unión de la leptina a su receptor (Ob-Rb), conduce a la autofosforilación
de la quinasa citosólica JAK2 y a la fosforilación de STAT3 mediada por JAK2 (Figura 3).
La activación de STAT3 regula la transcripción de neuropéptidos como POMC, CART,
AgRP y NPY. Esta vía es importante para las funciones anti-obesidad de la leptina, es la
vía de regulación de la homeostasis de energía. La activación de STAT3, a su vez,
incrementa la expresión del inhibidor de la señalización por citoquinas SOCS3
(Frühbeck, 2006; Olofsson, 2013).
La leptina también actúa a través de la vía PI3K-AKT en determinados núcleos
hipotalámicos (Figura 3). Se sugiere que esta vía es la que contribuye a regular la
homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a la insulina de todo el organismo. Así, esta
vía media las acciones antiesteatóticas de la leptina sobre el tejido adiposo inhibiendo
la lipogénesis en tejido adiposo blanco en respuesta a leptina (Bates SH y col., 2003;
Bates SH y col nature 2003; Ernst MB y col., 2009; Morris DL y col., 2009).
Figura 3. Señalización de leptina.
Introducción
23
Por otra parte, el sistema nervioso, además de ser un blanco de acción para la
leptina, constituye el medio para la transmisión de la señal de ésta a tejidos periféricos
claves en la regulación del metabolismo energético (German y col, 2011; Morton y
Schwartz MW, 2011). Sin embargo las vías neurales que soportan las acciones
indirectas de la leptina sobre los tejidos periféricos no se han descrito completamente.
1.4.8- Secreción de leptina por el TAB.
Se ha observado que la expresión y secreción de leptina por el TAB, está
modulada por numerosos factores, por ejemplo: se incrementa por la insulina, por
glucocorticoides, por el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), estrógenos; y disminuye
con la actividad β-adrenérgica, andrógenos y agonistas del receptor activador de la
proliferación peroxisomal γ (PPAR-γ) (Vettor y col., 2005; Margetic y col., 2002).
La respuesta de la insulina a la ingesta es el principal mediador de los cambios
en la producción de leptina observadas durante el ayuno/restricción de energía y
realimentación y de la variación diurna de los niveles circulantes de leptina (Havel,
2001). Trabajos realizados en adipocitos aislados y estudios clínicos en seres humanos
apoyan la idea de que la insulina aumenta indirectamente la producción de leptina, a
través de sus efectos estimulatorios del metabolismo oxidativo de la glucosa en
adipocitos (Havel, 2004). Por su parte la leptina, a través de los circuitos del sistema
nervioso autónomo y actuando directamente sobre las células beta del páncreas,
disminuye la secreción de insulina (Covey y col, 2006).
Por el contrario, el ayuno disminuye la secreción de leptina por el tejido
adiposo. La disminución de la leptina se produce con rapidez en respuesta al ayuno y
provoca cambios profundos en el balance energético y hormonal a través del
hipotálamo. Niveles bajos de leptina inducen sobrealimentación y suprimen el gasto de
energía, la liberación de las hormonas tiroideas y reproductivas y la inmunidad. Las
adaptaciones metabólicas mediadas por los bajos niveles leptina pueden haber
evolucionado como una protección contra la carencia de alimentos, al limitar el uso de
energía y mejorar su almacenamiento (Ahima, 2008).
Introducción
24
1.5- Insulina.
La insulina es una hormona polipeptídica sintetizada y secretada por las células
β del páncreas. En los mamíferos la insulina es una de las hormonas que regula la
homeostasis de glucosa en la sangre. Los principales tejidos sobre los que la insulina
ejerce su acción son: el hígado, el musculo esquelético y cardíaco y el tejido adiposo,
además de las células alfa del páncreas y otras.
En cuanto al metabolismo energético del tejido adiposo, la insulina secretada
tras la ingesta estimula la captura de glucosa por el tejido adiposo, así como de los
ácidos grasos de los TAG a partir de los quilomicrones circulantes. El metabolismo de la
glucosa provee el esqueleto carbonado al que se unen los AG para formar los TAG. Por
otro lado, esta hormona suprime la liberación de los AG por el tejido adiposo, ya que
bloquea la activación de la lipasa sensible a hormona en dicho tejido. Del mismo modo,
la insulina bloquea en el hígado la exportación de TAG en forma de VLDL a la sangre
(Frayn KN, 2002).
1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina.
La insulina estimula la captación, utilización y almacenamiento de
carbohidratos, lípidos y proteínas de la sangre por los tejidos periféricos, inhibiendo a
la vez el catabolismo de estas biomoléculas. La insulina ejerce sus efectos fisiológicos a
través de la unión a su receptor específico en la membrana plasmática de las células
diana. Esta unión provoca la autofosforilación del receptor de insulina, así como la
fosforilación de moléculas efectoras, interacciones proteína-proteína, proteína-lípidos
y cambios en la localización subcelular de una serie de sustratos y efectores
intracelulares que el receptor utiliza para transmitir la señal al interior celular. Un
esquema de las principales vías mediadas por la insulina se recoge en la Figura 4.
Durante la acción de la insulina la vía IR-AKT2 media los efectos sobre la
captura de glucosa, la conversión de glucosa en ácidos grasos y la síntesis de TAG. La
acción prolongada de la insulina produce resistencia a la hormona a través de la
degradación del sustrato IRS-1, de esta forma muchos inductores de resistencia a la
insulina activan quinasas del IRS-1. Entre las quinasas que fosforilan en serina al IRS-1
Introducción
25
se encuentra mTOR. Muchos estudios indican que mTOR integra las señales de
factores de crecimiento, hormonas, nutrientes y estado energético celular para regular
el crecimiento y la sobrevivencia de la célula. La activación crónica de la vía de mTOR,
ya sea por nutrientes o por tratamiento prolongado con insulina produce resistencia a
la insulina por degradación de IRS-1.
Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal de la insulina (Saltiel AR y col.,
2001).
1.6- Interacción leptina-insulina.
La leptina, junto con la insulina, forma parte de las señales que regulan, a
través del SNC, la ingesta y la oxidación tanto de los glúcidos como de las grasas en los
diferentes tejidos periféricos, existiendo mecanismos fisiológicos que regulan los
niveles de ambas hormonas. En este sentido, se ha propuesto la existencia de un eje
adipo-insular, por el cual la insulina estimula la expresión de la leptina en el TAB, la
cual, a su vez disminuye los niveles y la secreción de insulina por el páncreas, así como
los niveles de glucosa plasmáticos en el estado post-absortivo en ratas normales, lo
cual se traduce en un aumento de la sensibilidad a insulina (Kieffer TJ y col., 2000).
Introducción
26
El efecto de la leptina sobre la sensibilidad a insulina es específico de tejido, ya
que aunque en sóleo, diafragma, corazón y tejido adiposo marrón se produce un
incremento del transporte de glucosa estimulado por insulina, en el tejido adiposo
blanco el efecto de la leptina es el contrario (Cusin I y col., 1998). En algunos tejidos
ambas hormonas cooperan, en otros actúan de manera independiente y en otros
pueden tener efectos antagónicos. Las vías de señalización de leptina e insulina están
interconectadas a varios niveles como son el IR, los IRS, la PI3-K, la MAPK, el STAT-3, la
fosforilasa a, la PTP1B, la PD3B, SOCS-3. (Kraus D y col., 2002; Szanto I y col., 2000; Kim
JB y col., 1998; Kim YB y col., 2000; Aiston S y col., 1999; Zobolotny J y col., 2002; Zhao
AZ y col., 2002; Krebs DL y col., 2003).
La asociación entre leptina e insulina se ha estudiado también en modelos
animales que presentan obesidad. En estos animales se ha observado que los niveles
de leptina en sangre no son los responsables de la inducción de la resistencia a la
insulina, sino que la causa más probable sería la disminución de la señalización de
leptina a nivel central (Lin J y col., 2003), por lo que la resistencia a leptina también
conduce a un estado de resistencia central a insulina. En la mayoría de los casos de
obesidad humana y en roedores concurren tanto la resistencia a insulina como la
resistencia a leptina.
1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad a la
insulina.
Numerosas evidencias indican que el SNC es un regulador clave de la
homeostasis de la glucosa y que la señalización de insulina y de leptina en el
hipotálamo juega un papel fundamental en el control a través del SNA, de la
homeostasis de glucosa y en el desarrollo de resistencia a insulina. Por esta razón los
estudios acerca de la contribución de la leptina al metabolismo energético han
adquirido gran importancia en las investigaciones sobre resistencia a insulina y
diabetes mellitus tipo 2. El hipotálamo ajusta el tono del SNA a las condiciones
externas, a las necesidades de energía, modulando el funcionamiento del páncreas, el
hígado, el tejido adiposo, el sistema cardiopulmonar etc. Estudios encaminados a
dilucidar las vías de regulación por el SNA del TAB visceral indican que áreas
Introducción
27
hipotalámicas como el arcuato envían proyecciones simpáticas sobre el TAB y que esta
inervación simpática es la iniciadora de la lipólisis, proceso regulado en parte por el
sistema de melanocortinas (Bates SH y col., 2005; Marino JS y col., 2011).
Además, la leptina tiene acciones en otras áreas cerebrales como la corteza y zonas
límbicas y en los tejidos periféricos (células α y β del páncreas, hígado y células del
sistema inmunológico), sin embargo, la acción de la leptina en el cerebro y, en
particular, el hipotálamo es la mejor caracterizada en lo que respecta a la homeostasis
de la energía (Badman y Flier, 2007; Morris y col., 2009; Olofsson y col., 2013).
1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de funcionalidad.
El ciclo de la vida, desde el mismo momento de la concepción de cualquier
organismo vivo, se caracteriza por el desarrollo de una serie de capacidades y
funciones hasta alcanzar la madurez (definida esta como la adquisición de la capacidad
reproductiva) para posteriormente, sufrir una degradación progresiva de la capacidad
fisiológica y funcional que conduce al incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad
a la enfermedad y culmina con la muerte del organismo.
En 1991, Fairwather definió “envejecer” como el conjunto de procesos que
contribuyen a incrementar progresivamente la tasa de mortalidad específica para la
edad en una población que vive en condiciones ideales para la supervivencia. No tiene
una causalidad única y no es ni una enfermedad, ni un error evolutivo.
No existe una teoría global que explique el concepto de envejecimiento, puesto
que el desarrollo del mismo varía en función de los diferentes organismos, tejidos y
células, y se manifiesta a todos los niveles de organización de los mismos. En
mamíferos, existen numerosas evidencias que sugieren, al menos, la existencia de
cinco características comunes al envejecimiento, sea cual sea el nivel de organización.
(Bruce y Troen, 2003).
Así con la edad se producen:
1. Incremento de la mortalidad a partir de la madurez.
2. Cambios en la composición bioquímica de los tejidos.
Introducción
28
3. Disminución progresiva de la capacidad fisiológica.
4. Reducción de la habilidad de adaptación a los estimulos medioambientales.
5. Incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad a contraer enfermedades.
Los mecanismos moleculares sobre el desarrollo del envejecimiento aun no han
sido completamente esclarecidos y existe una gran controversia sobre los mismos
debido a la complejidad del problema en cuestión. Para los investigadores del campo,
el desarrollo del envejecimiento continua siendo un enigma, A pesar de esto, parece
clara la implicación de, al menos, cuatro grandes procesos fisiológicos en el desarrollo
del envejecimiento de un individuo: capacidad metabólica, respuesta a situaciones de
estrés, desregulación genética, y estabilidad génica. (Jazwinski, 2000). A partir de la
finalización del proceso de desarrollo del individuo, la inestabilidad génica influenciada
por el efecto de los factores ambientales, tanto intrínsecos como extrínsecos, induciría
una progresiva degradación de las funciones celulares debido a una acumulación de
errores que no pueden ser subsanados por los mecanismos de reparación,
disminuyendo la viabilidad y, en ultimo termino, ocasionando la muerte del individuo
(Jazwinski, 1996).
A lo largo de la historia se han desarrollado múltiples teorías para tratar de
explicar el por qué del envejecimiento, pero ninguna de ellas ha sido, hasta la
actualidad, capaz de dar respuesta a todas las preguntas formuladas. El estrés
oxidativo, la glicosilación de proteínas, y la pérdida de telómeros de los cromosomas,
son fenómenos implicados en la alteración y degeneración de las funciones vitales de
cualquier organismo (Leslie, 2001), pero la teoría más sorprendente es la que sugiere
la existencia de un sistema conservado de regulación del ciclo vital.
Estudios en los organismos comúnmente utilizados como modelos de
envejecimiento (C.elegance, D.melanogaster, S.cerevisae, M.musculus), han
comenzado a descubrir importantes genes y vías de señalización que parecen regular
el ritmo del envejecimiento, y que han sido notablemente conservados durante la
evolución. Estos estudios presentan la ventaja de poder utilizar aproximaciones
genéticas para la búsqueda directa de mutaciones que modifican el ciclo vital,
haciendo posible la identificación de los mecanismos implicados de una manera
Introducción
29
independiente a cualquier otro modelo preconcebido sobre el envejecimiento
(revisión de Guarante y Kenyon, 2000).
Además de la expresión o represión de genes, el sistema de regulación del
envejecimiento incluye el control de los estados denominados “inactivos”, en los
cuales el organismo pospone su reproducción en respuesta a condiciones
medioambientales adversas. Un aspecto muy llamativo en este sentido ha sido
descubrir que las vías de señalización celular medadas por insulina y el IGF-1 están
directamente implicadas en la regulación del envejecimiento en C.elegans,
D.melanogaster y S.cerevisae (Kenyon, 2001), y cabe la posibilidad de que este sistema
también sea operativo en mamíferos (Clancy y col., 2001; Tatar y col., 2001).
Desde el punto de vista de esta ultima teoría, el envejecimiento sería un
proceso metabólico más y, por tanto, puede ser regulado. En esta línea, algunos
científicos están pensando en el envejecimiento como una enfermedad, por lo que
están buscando su cura, y mientras esto sucede, la población sigue envejeciendo día a
día, y en 2050 se estima que al menos 1 de cada 5 personas superará los 60 años de
edad, por lo que las enfermedades asociadas con el envejecimiento cobraran si cabe
una mayor importancia en la investigación.
1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta.
Existen numerosos estudios sobre la restricción calórica (RC) y sus efectos.
Desde hace más de 70 años se sabe que la RC retarda el envejecimiento y por lo tanto,
incrementa el tiempo de vida (McCay et al., 1935). La RC se refiere a un régimen
dietario entre un 30-50% menor en calorías que el consumo de un animal control, sin
llegar a desnutrición. Dietas bajas en calorías han provocado un aumento en la
esperanza de vida media, así como una disminución de las enfermedades propias del
envejecimiento en una amplia variedad de organismos entre los que se incluyen las
levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Cortés-Rojo y col., 2007), el gusano
(Caenorhabditis elegans), la mosca (Drosophila melanogaster), roedores (ratas y
ratones) y primates (Weindruch, 1996; Koubova y Guarente,2003).
Introducción
30
Se han propuesto diversos mecanismos para explicar este fenómeno: el retardo
del crecimiento, la disminución de la apoptosis, la reducción del daño oxidativo, la
alteración en la utilización de la glucosa, cambios en la expresión de genes, la mejora
de la respuesta al estrés. Ciertas evidencias sugieren que la RC ocasiona importantes
respuestas metabólicas en el proceso de envejecimiento por medio de sistemas tanto
intracelulares como extracelulares de transducción de señales que afectan a
numerosos órganos y sistemas fisiológicos. En algunos tejidos la RC produce un
incremento del metabolismo, de la resistencia al daño oxidativo y al estrés térmico
(Sohal, 2002).
La RC ocasiona, a nivel general, una disminución del peso corporal con respecto
a los animales control. En cuanto a nivel genético, la RC eleva los niveles de SIRT1
(sirtuinas) en mamíferos y estos niveles se reducen por la insulina. Las sirtuinas
producen cambios metabólicos que afectan a las células beta del páncreas y de esta
forma se inhibe la síntesis y liberación de insulina al plasma. En el sistema neuro-
endocrino la SIRT1 inhibe la síntesis y liberación de la hormona de crecimiento (GH)
por la hipófisis y del factor de crecimiento de insulina-1 (IGF-1), finalmente a nivel del
tejido adiposo blanco se inhibe la acción de la leptina y se incrementa la acción de la
adiponectina (Bordone y Guarente, 2005).
Utilizando roedores como modelos de RC, modelos genéticos de ratones y
ratones knockout para el receptor IGF-1 en el tejido adiposo (fat-specific insulin
receptor knockout mice, FIRKO) se ha visto que la reducción de los niveles plasmáticos
de insulina y/o IGF-1 o la reducción de la señalización insulina/IGF-1 se correlaciona
con incrementos en la longevidad y el retraso del envejecimiento (Richardson et al.,
2004).
HIPÓTESIS
Y
OBJETIVOS
Hipótesis y objetivos
31
1.10- Hipótesis y objetivos.
Conociendo que el envejecimiento en la rata Wistar no produce alteraciones de la
glucemia y la insulinemia en ayunas. Sin embargo, estos animales incrementan la
adiposidad con la edad, presentan esteatosis hepática y dislipemia en ayunas y
exhiben alteraciones de la sensibilidad global a la insulina y central a la leptina y la
insulina, se decidió profundizar en este trabajo, en aspectos relacionados con las
alteraciones de la funcionalidad del tejido adiposo visceral en este modelo de
envejecimiento, teniendo en cuenta que los mecanismos específicos que generan
dislipemias, resistencia a la insulina y diabetes no están del todo esclarecidos.
Para ello nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo.
Con el envejecimiento aumenta de forma moderada la masa de tejido adiposo blanco
visceral y se modifican sus actividades metabólicas para ajustarse a las condiciones
fisiológicas del organismo envejecido. Las alteraciones de la funcionalidad estarán
relacionadas con cambios en la actividad lipogénica y lipolítica del tejido, cambios en la
composición y metabolismo de la gota lipídica y disminución del control
neuroendocrino del metabolismo adipocitario. Que la señalización hipotalámica de la
leptina tiene una fuerte implicación en el sistema neuroendocrino de control del
metabolismo adipocitario, pudiendo ser la resistencia a la leptina y la insulina
adaptaciones metabólicas, que propician un incremento moderado de la masa adiposa
y como consecuencia de ello se depositan lípidos en otros tejidos y el estado de
hiperlipemia es permanente, en ayunas y en estado postprandial. Que a pesar de estas
alteraciones los animales envejecidos mantienen la homeostasis de glucosa y el estado
prediabético. Que la restricción nutricional sigue siendo un buen recurso para frenar
los desórdenes del metabolismo energético.
Hipótesis y objetivos
32
Para responder a nuestra hipótesis de trabajo desarrollamos el estudio del estado de
funcionalidad del tejido adiposo visceral se desarrolló en seis direcciones:
1.- Desarrollar un ensayo de infusión oral de grasa y analizar los cambios en la
respuesta de la rata Wistar a la administración de un bolo de grasa. Efectos de la edad
y la restricción nutricional.
2.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de absorber la grasa circulante y
almacenarla en forma de TAG en estado de ayunas y en estado de alimentación:
Capacidad lipogénica y de síntesis de TAG. Efectos de la edad y la restricción
nutricional.
3.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de hidrolizar los TAG y liberar NEFA
y glicerol: estudio de la lipolisis en estado de alta demanda energética (ayuno
prolongado) y en respuesta a agonistas de beta-adrenérgicos. Efectos de la edad y la
restricción nutricional.
4.- Analizar la capacidad de respuesta del tejido adiposo a la insulina: Estudio de los
efectos anti-lipolíticos de la insulina dependiendo del estado de ayuno o de
alimentación. Efectos de la edad y la restricción nutricional.
5.- Estudiar los niveles de proteínas relacionadas con los procesos que tienen lugar en
la superficie de la gota lipídica, la formación de la gota lipídica y la hidrólisis de los
lípidos almacenados en la gota lipídica en los estados de ayuno y de alimentación.
6.- Demostrar en animales jóvenes, la capacidad de la leptina de regular a través del
Sistema Nervioso Autónomo, el metabolismo de los lípidos del tejido adiposo visceral y
la sensibilidad global a la insulina.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
Materiales y métodos
33
2- MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1- Materiales.
Todos los reactivos y productos utilizados en este trabajo son de grado analítico
y han sido suministrados por distintas casas comerciales. Se han empleado además
otros productos más específicos cuya procedencia se indica en el texto.
2.2- Modelos de experimentación.
Como modelo de experimentación se utilizaron ratas macho de la raza Wistar
albinas procedentes del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de la
Universidad Autónoma de Madrid (CBMSO-UAM); los animales fueron mantenidos con
ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas, una humedad relativa entorno al 50%, una
temperatura de 20-25ºC, y acceso libre a la comida y al agua.
Los procedimientos experimentales realizados estaban aprobados por el comité
de bioética de la UCLM, y el tratamiento de los animales se llevó a cabo de acuerdo
con las leyes de la Unión Europea y con las pautas dictadas por el Instituto Nacional de
la Salud, con respecto al uso de animales de experimentación reduciendo al mínimo
tanto el número de animales como el sufrimiento de los mismos.
En este estudio se han utilizado diferentes condiciones experimentales, las
cuales se proceden a desarrollar a continuación.
2.2.1- Modelo animal de envejecimiento.
En este trabajo continuamos con el estudio del envejecimiento en la rata
Wistar. Estos estudios se realizan en ratas machos de 3, 8 y 24 meses de edad. Se
considera que el control del experimento es la rata madura de 3 meses de edad (3m), y
para el análisis de los cambios asociados a la edad se emplean animales de 8 (8m) y 24
meses (24m). Esta raza se ha elegido como modelo porque su proceso de
envejecimiento presenta ciertas características similares a las del humano. Con la edad
aumenta la adiposidad y el peso corporal, aunque se mantienen los niveles de
normoglucosa y normoinsulinemia en ayunas (Escriva y col, 1997; Escriva y col, 2007).
Materiales y métodos
34
Se sabe que los animales de 8 meses de edad tienen resistencia a insulina en tejido
adiposo pero no en músculo esquelético, mientras que las ratas de 24 meses de edad
muestran resistencia a la insulina del tejido adiposo y ciertos músculos esqueléticos y
un mayor nivel de resistencia global a la hormona (Escriva y col, 2007). Además se ha
demostrado que las ratas de 8 y 24 meses de edad son hiperleptinémicas y presentan
diferente grado de resistencia a las acciones hipotalámicas de la leptina y la insulina.
(Carrascosa y col, 2011).
Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum.
2.2.2- Modelo animal de restricción calórica.
Durante más de 20 años, se ha empleado la restricción calorica en este modelo
de envejecimiento, para determinar si los cambios observados en la sensibilidad a
insulina o leptina con la edad son consecuencia exclusiva de las variaciones en la
adiposidad, o si están causados por otros mecanismos asociados al envejecimiento. En
este tipo de régimen los animales en restricción calorica (FR), ingieren un 80% de las
calorias que ingieren sus congéneres de la misma edad y alimentados ad-libitum (AL)
dando como resultado una diferencia de peso entorno a un 15% inferior en la rata FR
con respecto al que tendría la rata de la misma edad alimentada ad libitum (AL). Este
tipo de restricción calórica seria equiparable a una dieta hipocalórica saludable en
humanos. Los animales sometidos a restricción calórica (denominados en este trabajo
FR, por las siglas inglesas food-restriction), poseen niveles inferiores de adiposidad
visceral que sus congeneres de la misma edad pero alimentadas ad-libitum (AL) y
similares a los de las ratas controles de 3 meses (Escriva y col, 1997; Escriva y col,
2007). La restricción se lleva a cabo en animales de 5 y 21 meses de edad durante un
Materiales y métodos
35
período total de tres meses hasta alcanzar las edades de 8 y 24 meses,
respectivamente. Utilizando este modelo de restricción calórica moderada se ha
comprobado que la resistencia a la insulina en la rata Wistar, puede revertirse en ratas
de 8 meses, pero no en ratas de 24 meses de edad (Escrivá y col, 2007).
2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos.
De experimentos in vivo (sobrecarga oral de glucosa) realizados en el modelo
experimental descrito en el apartado 2.2.1.1 , se conoce que las ratas de 8 y 24 meses
de edad requieren mayor concentración de insulina para normalizar los niveles de
glucosa en sangre. El incremento en la secreción de insulina es fruto de la resistencia
periférica a la hormona que desarrollan estos animales.
En este trabajo se ha decidido realizar un test in vivo de sobrecarga oral de
lípidos. Este ensayo se llevó a cabo con la finalidad de conocer la capacidad de
respuesta de la rata Wistar a una sobrecarga oral de grasas en función de la edad y del
estado nutricional.
El test se realizó 5 grupos de ratas ayunadas 16 horas: 3m AL, 8m AL, 8m FR,
24m AL y 24 m FR. Durante el ensayo se administró oralmente un bolo de aceite de
oliva (0.1 ml/100 gr peso corporal). La sangre fue sustraída de la vena de la cola de la
rata a distintos tiempos: 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 y 240 minutos, y se empleó en la
determinación de los niveles de la hormona insulina y de los siguientes metabolitos:
La concentración de glucosa en sangre se determinó utilizando el analizador
Accutrend Glucose Analyser (Roche), la concentración de triglicéridos en sangre se
determinó utilizando el analizador Accutrend tryglicerides Analyser (Roche), Los TAG,
los NEFA se midieron mediante un kit específico (Wako). Mientras que los niveles de
insulina en suero se midieron mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).
2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación.
Se realizó con el objetivo de estudiar la adaptación del TAB a los estados de
ayuno-realimentación en diferentes edades. Se llevó a cabo en ratas Wistar macho de
3, 8 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum o sometidas a restricción calórica,
utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m
FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,
parte de los animales de cada grupo fueron sac
animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos
(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura
sacrificio de los animales se realizó por decap
Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,
8 y 24 meses de edad, alimentados
calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser
sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min
(grupo RE 30 min) o de 3 horas (grupo RE
2.5- Ensayo de Liposisis.
Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido
adiposo, se realizaron en explant
regulada por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un
agonista de receptores β-
insulina, la cual inhibe la lipolisis.
2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e
Este estudio se llevó a cabo en los explantes de tejido adiposo
Las muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120
mM NaCl; 4,75 mM KCl; 1,2 mM MgSO
2mM Glucosa durante 3 hora, 37 ºC , en cabina de CO
distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la
segunda incubada con medio
3 meses
Ad libitum
Ayuno 30 minutos
180 minutos
libitum
Ayuno minutos
Materiales y métodos
36
utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m
FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,
parte de los animales de cada grupo fueron sacrificados (grupo ayuno), y el resto de los
animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos
(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura
sacrificio de los animales se realizó por decapitación tras la administración de
Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,
8 y 24 meses de edad, alimentados ad libitum (AL) o sometidos previamente a restricción
calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser
sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min
(grupo RE 30 min) o de 3 horas (grupo RE 3 h). En total, se generaron 15 grupos de animales.
Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido
adiposo, se realizaron en explantes de tejido adiposo (ex vivo). Para estudiar la lipolisis
a por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un
-adrenérgicos), el cual activa la lipolisis, y en presencia de
insulina, la cual inhibe la lipolisis.
Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS.
Este estudio se llevó a cabo en los explantes de tejido adiposo epididimal
as muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120
mM NaCl; 4,75 mM KCl; 1,2 mM MgSO4; 10 mM Na2HPO4) 1,2 mM CaCl
Glucosa durante 3 hora, 37 ºC , en cabina de CO2, sin agitación.
distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la
segunda incubada con medio KRP al que se le a adiccionado Isoproterenol 1µM, y la
Ratas wistar
8 meses
Ad libitum
30 minutos
180 minutos
FR
Ayuno 30 minutos
180 minutos
24 meses
Ad libitum
Ayuno 30 minutos
180 minutos
utilizando animales de 3 meses AL como control (3m AL, 8m AL, 8m FR, 24m AL y 24m
FR). Los animales fueron sometidos a un ayuno prolongado de 36 horas, tras el cual,
rificados (grupo ayuno), y el resto de los
animales fueron sometidos a una realimentación de 30minutos (R30) o 180 minutos
(R180), con acceso libre a la comida, tras la cual fueron sacrificados (Figura 6). El
itación tras la administración de CO2.
Modelo experimental utilizado en este trabajo. El ensayo se realizó en animales de 3,
(AL) o sometidos previamente a restricción
calórica (FR). Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 36 horas para ser
sacrificados inmediatamente después (grupo Ayuno), o tras una realimentación de 30 min
3 h). En total, se generaron 15 grupos de animales.
Los estudios de capacidad lipolítica basal y mediada por hormonas del tejido
Para estudiar la lipolisis
a por hormonas se realizaron incubaciones en presencia de isoproterenol (un
adrenérgicos), el cual activa la lipolisis, y en presencia de
epididimal (100mg).
as muestras se colocaron en placas de cultivo con 1 ml de medio KRP a pH=7,4 (120
) 1,2 mM CaCl2; 1% BSA;
, sin agitación. Las muestras se
distribulleron en 3 condiciones experimentales, la primera incubada con medio KRP, la
soproterenol 1µM, y la
24 meses
FR
Ayuno 30 minutos
180 minutos
tercera condición la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de
Isoproterenol y 1µM de Insulina.
recogieron los explantes y los medios de incubación
su posterior utilización (Figura
Figura 7. Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,
teniendo en cuenta que este ensayo se realiza por triplicado.
2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con
Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el
comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la
leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (
(Halaas y col, 1997) de mini
USA) cargadas con leptina específica de rata (Sigma), para liberar 0.2
o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones est
hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces
superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang
y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante
días. A los animales controles se les infundió suero salino (SS).
Materiales y métodos
37
la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de
Isoproterenol y 1µM de Insulina. Una vez terminado este proceso de incubación, s
los explantes y los medios de incubación por separado y se congelaron para
r utilización (Figura 7).
Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,
teniendo en cuenta que este ensayo se realiza por triplicado.
Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con
Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el
comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la
leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (
(Halaas y col, 1997) de mini-bombas osmóticas (Alzet, modelo 2001, Palo Alto, Calif.
USA) cargadas con leptina específica de rata (Sigma), para liberar 0.2 μg de leptina/d
o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones est
hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces
superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang
y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante
días. A los animales controles se les infundió suero salino (SS).
la cual fue incubada con medio KRP al cual se le adiccionó 1µM de
ado este proceso de incubación, se
por separado y se congelaron para
Podemos observar un esquema de la distribución de las muestras en la placa,
Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular (ICV) con Leptina.
Este estudio se realizó en ratas de 3 meses de edad, que corresponde con el
comienzo de la etapa adulta del animal. Para estudiar los efectos metabolicos de la
leptina a nivel central, se llevó a cabo la implantación vía intracerebroventricular (i.c.v.)
bombas osmóticas (Alzet, modelo 2001, Palo Alto, Calif.
μg de leptina/día
o suero salino (PBS), las bombas se mantuvieron a 37ºC y en condiciones estériles
hasta su implantación. La dosis de leptina empleada en este estudio es 100 veces
superior a lo concentración fisiológica en el líquido cefalorraquídeo (LCR) según Wang
y col., (1999). Las bombas tienen capacidad para mantener el tratamiento durante 7
Materiales y métodos
38
Las ratas fueron ayunadas 12 horas antes de la cirugía estereotáxica y
anestesiadas mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de anestésico de
ketamina (PARKE-DAVIS), valium (Diazepam, Roche) y atropina (Braun) (50, 4 y 0,2
mg/Kg de peso, respectivamente). Una vez anestesiado se colocó el animal en un
estereotáxico (koft Instruments Tujunga, CA USA) y se realizó una incisión sobre la piel,
desde la zona anterior de los ojos hasta el principio de la musculatura del cuello,
quedando el cráneo perfectamente fijado en los planos horizontales y verticales, se
separó la piel que recubre el cráneo y se sujetó a ambos lados mediante pinzas
hemostáticas, esto permitió la localización del punto Bregma, empleado como punto
de referencia (Figura 8). Este punto corresponde a la unión de las suturas sagital y
coronal en la superficie del cráneo, permitiéndo calcular las coordenadas
extereotáxicas correspondientes, de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson para
ratas Wistar (Paxinos y Watson, 1986).
Posteriormente se realizó una perforación unilateral del hueso craneal,
empleando un taladro dental [en las coordenadas (-0.8 anterior,+1.6 lateral) con
respecto del bregma, y a una profundidad de 3,4 mm por debajo de la línea interaural]
(Figura 9) y se implantó una cánula (4x0.36, longitud x diámetro en mm) que queda
conectada a la mini-bomba de leptina o suero salino. Se fijó la canula con cemento
dental (KETAC CEM radiopaque. Glass Ionomer Cement, ESPE) y la mini-bomba se
colocó por debajo de la piel, en la región interescapular, en un espacio creado
mecánicamente con una pinza. La herida en el cuero cabelludo fue suturada con
grapas quirúrgicas (Autoclip Wound Clips, #427631, Becton Dickinson, USA). El empleo
de las minibombas osmóticas permite la liberación continuada de leptina o salino al
SNC durante 7 días, con un flujo prácticamente constante, sin conexiones externas, sin
restricción del movimiento ni manipulación frecuente de los animales.
En estas coordenadas, la mini-bomba libera su contenido en el LCR del
ventrículo lateral, que conecta directamente con el hipotálamo, el cual, entre otras
funciones, regula la homeostasis de todo el organismo. Las ratas implantadas con mini-
bombas de leptina (n=6) y de suero salino (n=6) fueron alimentadas ad libitum. Un
tercer grupo de ratas también recibió tratamiento con suero salino, pero recibió la
misma cantidad de alimento que el consumido por los animales tratados con leptina
Materiales y métodos
39
(pair-fed), con el objetivo de determinar aquellos efectos de la leptina que son
independientes de sus propiedades anorexígenas. Este grupo constituye el verdadero
control del experimento.
Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las minibombas osmóticas. La
cánula conectada a una minibomba osmótica cargada con leptina o salino, se implanta a través
de una perforación unilateral en el ventrículo lateral, de manera que su contenido se infunde
en el líquido cefalo-raquídeo (representado de color azul en el esquema del corte sagital del
cerebro) que comunica todo el sistema de ventrículos cerebral.
Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico. VL – ventrículo lateral. (Tomado
de Paxinos y Watson, 1997).
Materiales y métodos
40
2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal.
Este experimento se realizó en los animales tratados con leptina o suero salino,
transcurrida una semana de la operación ICV. El ensayo se realizó con el objetivo de
estudiar los efectos de la infusión central de leptina sobre la sensibilidad global a la
insulina.
El test se realizó en ratas ayunadas (16 horas) de los 3 grupos de ensayo
SS/PF/Lep, mediante la inyección intraperitoneal de un bolo de glucosa (2g/Kg de
peso) a partir de una solución concentrada de glucosa, y extrayendo sangre de la vena
de la cola de la rata a distintos tiempos (0, 15, 30, 60 y 120 minutos), para medir la
variación de glucosa mediante un Glucosímetro (Accuntrend Glucose Analizer) y de
insulina en sangre mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).
2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina.
El tratamiento con insulina se realizó en los tres grupos de animales SS/PF/Lep.,
al cabo de los 7 días de la infusión de leptina o suero salino. Para ello cada grupo se
dividió en dos y se les administró insulina (1UI/100g) o suero salino respectivamente, a
través de la vena safena. Los grupos experimentales quedaron agrupados de la
siguiente forma: SS-insulina, SS+insulina, PF-insulina, PF+insulina, LEP-insulina,
LEP+insulina. Al cabo de 30 minutos, los animales fueron sacrificados mediante
decapitación, se recolectó la sangre y se diseccionaron y pesaron los tejidos adiposos
epididimal (TAE) y perirrenal (TAP) y otros tejidos de interés. Todas las muestras se
congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -70ºC hasta su uso.
2.6.3- Denervación del tejido adiposo.
La operación de denervación se realizó en las ratas Wistar de 3 meses de edad
dos semanas antes de realizar la operación ICV, este periodo de espera fue utilizado
para que los animales se recuperasen totalmente de la operación.
Para poder confirmar, que los efectos producidos por la leptina sobre el tejido
adiposo blanco se deben a la acción central de la hormona, se procedió a la
denervación quirurgica del sistema nervioso autónomo del tejido adiposo perirrenal
(Figura 10). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del
animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete
inervado, que funcionaría como control de la denervación.
Para demostrar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del
sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de
tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de
ambos paquetes el contenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un
ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).
Figura 10. Imagen de la denervación quirurgica.
F. del Lab. Buijs).
2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG).
Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de
(≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo
se realizó en explantes de los animales con infusión de leptina
explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía
estereotáxica.
Materiales y métodos
41
). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del
animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete
inervado, que funcionaría como control de la denervación.
ar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del
sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de
tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de
ontenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un
ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).
Imagen de la denervación quirurgica. Endocrinology 2006, 147: 1140
de captura de glucosa (2DOG).
Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de
≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo
se realizó en explantes de los animales con infusión de leptina o salino vía ICV y en
explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía
). De esta forma se denervó el paquete correspondiente al lado izquierdo del
animal, con lo que así podríamos tener un paquete denervado y el otro paquete
ar la eficiencia de la denervación quirúrgica y la implicación del
sistema nervioso autónomo en las acciones de la leptina, se pesaron los paquetes de
tejido adiposo perirrenal inervado y denervado y se determinó en extractos totales de
ontenido total del neurotransmisor norepinefrina mediante un
2006, 147: 1140 – 1147 (Keier,
Los ensayos de captura de glucosa se realizaron en explantes o secciones de
≈20mg) de tejido adiposo perirrenal de los animales sometidos a estudio. Este ensayo
o salino vía ICV y en
explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía
Materiales y métodos
42
Para estudiar la captura de glucosa se empleó 2 desoxiglucosa (0,2 mM) y como
trazador 2μCi/ml de 3H-2-desoxiglucosa. En todos los casos, el medio de incubación
empleado fue el siguiente: medio KRH (Krebs-Ringer Hepes) pH=7.4 suplementado con
1,2mM CaCl2 y 2% BSA y mantenido a 37ºC.
Los explantes de los animales con infusión de leptina o suero salino vía ICV, se
incubaron en ausencia o presencia de 80 nM insulina durante 10 minutos, a 37 ºC.
Los explantes provenientes de animales que no fueron sometidos a la cirugía
estereotáxica, se incubaron en primer lugar, durante 2 horas, en ausencia o presencia
de 30ng de resistina y posteriormente, durante 10 minutos en ausencia o presencia de
80 nM insulina, siempre a 37 ºC.
Transcurrido el tiempo de incubación, se contó la radioactividad en un
Contador Beckman de centelleo líquido.
2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero.
En todos los ensayos realizados, las muestras de sangre extraídas, se dejaron
coagular 30 minutos, aproximadamente, a temperatura ambiente y se centrifugaron
en microfuga a 2000g durante 15 minutos. En el suero se determinaron, con el empleo
de kits específicos las concentraciones de TAG mediante el kit Triglyceride LiquiColor
(Stanbio, Cat. No. 2201), AG libres mediante el kit NEFA C (Wako), el Glicerol, mediante
un kit especifico (Cayman), el Lactato mediante el analizador Accutrend Lactate
Analyser (Roche), la insulina en sangre mediante un ELISA específico de rata, y la
norepinefrina mediante un ensayo ELISA (Demeditec Diagnostic GmH, Kiel, Germany).
En todas las determinaciones se siguió el protocolo recomendado por el fabricante y se
emplearon 3 réplicas por muestra. La determinación de glucosa se realizó utilizando el
analizador Accutrend Glucose Analyser (Roche). Los niveles de insulina, de leptina y de
resistina se midieron mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).
2.8- Extracción de ARN.
Para la extracción del RNA total el método empleado se basó en la diferente
solubilidad de las distintas biomoléculas (RNA, DNA, proteínas, lípidos) en disolventes
Materiales y métodos
43
orgánicos (fenol y cloroformo). Para la misma se ha utilizado el método del trizol
(invitrogen).
Se parte de no más de 100mg y no menos de 40mg de tejido adiposo para obtener un
buen rendimiento y cantidad suficiente de RNA para realizar las medidas posteriores.
Este tejido se homogeniza con 1ml de Trizol, mediante la utilización de un Potter-
Dounce, realizando 10 pases con el pistillo A y 10 pases con el pistillo B. Una vez, que
se ha realizado este proceso, para permitir una disociación completa de los complejos
núcleo-proteicos se deja el homogeneizado en reposo a temperatura ambiente
durante 5 minutos, posteriormente se añaden 200µl de cloroformo, agitando
vigorosamente en un vortex durante 5 segundos, y dejando reposar la mezcla durante
4 minutos. A continuación se centrifuga a 12.000g durante 15 minutos, en frio (4ºC).
Una vez concluido este proceso, se transfiere la fase acuosa a un tubo limpio, al cual
añadiremos 500µl de isopropanol, (el isopropanol disminuye la polaridad del medio e
insolubiliza el RNA) incubándolo 10 minutos a temperatura ambiente para favorecer la
precipitación, y centrifugando después a 12.000g durante 10 minutos en frio (4ºC). El
pellet resultante se lava añadiendo 1ml de etanol al 75% y se centrifuga a 7.500g
durante 5 minutos. El segundo pellet resultante, se deja secar durante varias horas,
procediendo a su posterior resuspensión en 50µl de H2O libre de ARNasas.
Posteriormente se cuantifica la concentración de RNA en un espectofotómetro
(Synergy HT, BioTec), basándonos en la propiedad que tienen las bases nitrogenadas
de absorber luz a 260 nm. Se calcula la relación de absorbancias A260/A280 que da
idea del nivel pureza del RNA cuyo valor optimo es de 2, el cual disminuirá
significativamente con la contaminación por proteínas o fenol.
2.9- Transcripción inversa.
La retrotranscripción es el proceso por el cual a partir de RNA podemos obtener DNAc
(DNA complementario al RNA). El DNAc es mucho más estable que el RNA y por lo
tanto permite un manejo más cómodo y seguro de la muestra.
Materiales y métodos
44
Para la síntesis del DNA complementario se parte de 3 µg de RNA, el cual, fue
tratado con DNasaI libre de RNasas (2U/µg de RNA) (Roche)30 min a 37ºC, en
presencia de RNasin (4U/µg) (Promega) y DTT 8 mM, para eliminar la posible
contaminación con DNA. Seguidamente se incubó 5 min a 95ºC para desnaturalizar la
DNasaI, y se procedió a la copia del mRNA a cDNA (Sambrook y col., 1989). Se
emplearon 4U/µL de transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina de
Moloney (M-MLV) (Gibco BRL) en 20 µL de tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM pH
8.3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM), 1 mM de cada dNTP, 50 nM de p(dN)6 (Boheringer
Mannheim) y el resto de los componentes del tratamiento previo con la DNasaI. Se
incubó 1h a 37ºC y luego se inactivó la RT a 95ºC, 5 min. El cDNA así generado se
guardó a –20ºC hasta su posterior uso.
2.10- Real-time PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy utilizada en
biología molecular. Se denomina RT-PCR cuando se parte de DNA obtenido a partir de
mRNA mediante retrotranscripción. En 1993, Higuchi y colaboradores describieron lo
que hoy en día se conoce como PCR a tiempo real (real-time PCR).
El DNA complementario obtenido se utilizó para realizar una cuantificación
relativa de los niveles de mRNA de los genes de interés. Mediante la reaccion en
cadena de la polimerasa a tiempo real (real-time PCR) según el protocolo facilitado por
TaqMan usando sus sondas específicas para cada gen (Pre-Developed TaqMan Assay
Reagents, PE Applied Biosystem). Se utilizó el RNA ribosomal 18S como control
endógeno para estandarizar la cantidad de DNA complementario incluido en cada
muestra. Estos experimentos se llevaron a cabo empleando un termociclador ABI
PRISM 7500 FAST Sequence Detection System y su software correspondiente (PE
Applied Biosystem, Foster City, CA). Mediante el método ∆∆Ct se calcularon las
diferencias relativas de expresión de los genes en cuestión entre los distintos grupos
de animales. En la siguiente tabla (Tabla 3) se especifican las sondas utilizadas:
Materiales y métodos
45
Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio.
Gen Ensayo Taqman-MGB Casa Comercial
ACC Rn00573474_m1 Applied Biosystems
AQ 7 Rn00576331_m1 Applied Biosystems
ATGL Rn01478869_m1 Applied Biosystems
CHERBP Rn00591943_a1 Applied Biosystems
FAS Rn00685720_m1 Applied Biosystems
GDPH Rn00573596_m1 Applied Biosystems
Glut4 Rn00562597_m1 Applied Biosystems
HSL Rn00689222_m1 Applied Biosystems
LRP-1 Rn01503901_m1 Applied Biosystems
LPL Rn00561482_m1 Applied Biosystems
CD36 Rn00580728_m1 Applied Biosystems
PEPCK Rn01529014_m1 Applied Biosystems
PGC -1α Rn00580241_m1 Applied Biosystems
PPARγ Rn00565707_m1 Applied Biosystems
Resistina Rn00584229_m1 Applied Biosystems
SOCS-3 Rn00585674_s1 Applied Biosystems
TNFα Rn99999017_m1 Applied Biosystems
18S rRNA VIC 4319413E Invitrogen
Materiales y métodos
46
2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco. Obtención de extracto
total, membrana plasmática, membrana interna, gota lipidica y citosol.
2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares.
El tejido adiposo congelado se troceó y homogeneizó en tampón de
homogeneización (0.1 M sacarosa, 50 mM HEPES pH 7.4), 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 50
mM Na-pirofosfato, 5 mM NaN3, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 mM Na3VO4, 10 µg/mL
leupeptina, 10 µg/mL aprotinina y 1 µg/mL pepstatina. Se empleó un homogeneizador
manual Dounce de vidrio-vidrio, realizando 10 pases con el pistilo A y 10 con el B,
obteniendo el “homogenado total”. Este se centrifugó 5 minutos a 800g y se guardó
una alícuota de “extracto total” (sobrenadante). El resto del sobrenadante se
centrifugó 20 minutos a 11.500 rpm, obteniendo en el pellet la fracción de membrana
plasmática cruda (MP cruda) (Massague y Czech, 1982) la cual se purificó sobre un
colchón de 35% sacarosa (10mM TRIS-HCL, 1mM EDTA y 35% sacarosa), y se centrifugó
a 29.000rpm durante una hora,para obtener la “MP” purificada en la interfase la cual
se guardó a -80ºC. El sobrenadante de esta última centrifugación corresponde al
citoplasma celular (CYT) (Simpson y col., 1983).
Para la obtención de la fracción de membrana interna (MI) se centrifugó a
45000rpm, durante 45 minutos, a 4ºC el sobrenadante correspondiente a la
centrifugación del “extracto total” que se comentó en el párrafo anterior. En el pellet
se recogió la MI la cual se resuspendió en 50µl de tampón de homogenización y se
guardo a -80ºC, y el sobrenadante que corresponde a la fracción citosólica se guardo a
-80ºC. Todo el fraccionamiento celular se llevó a cabo en baño de hielo (Figura 11).
2.11.2- Gota lipídica.
En este trabajo hemos abordado el estudio de la gota lipídica (GL). Para obtenerla,
se extrajo la grasa de la primera centrifugación del homogenado total a 800g, la cual se
colocó en tubo limpio y se incubó en tampón de homogeneización especifico para la
extracción de la gota lipídica (0.1 M sacarosa, 50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM
EGTA, 50 mM Na-pirofosfato, 5 mM NaN3, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 10 µg/mL
leupeptina, 10 µg/mL aprotinina y 1 µg/mL pepstatina, 2% SDS) en una relación p/v de
Materiales y métodos
47
1 ml de tampón por cada gramo de grasa. Se agitó vigorosamente en un vortex 10
segundos, repitiendo este proceso 3 veces. A continuación se dejó incubar a 37ºC con
agitación suave durante 30 minutos, en un baño atemperado a 37ºC. Tras esta
incubación, se procedió a sonicar las muestras durante 3 minutos, y se volvió a agitar
vigorosamente en un vortex, durante 10 segundos, tras lo cual, se centrifugó a 800g
durante 5 minutos, extrayendo el infranadente que constituye la fracción GL, el cual se
guardó a -80ºC para posteriores análisis.
Figura 11. Representación esquemática del protocolo de centrifugación diferencial utilizada para aislar
las distintas fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma celular a partir del TAB.
Materiales y métodos
48
2.12- Determinación de la concentración de proteínas.
Para determinar la concentración de proteínas, se utilizaron 2 métodos de
cuantificación de proteínas, ya que el SDS interfiere con la reacción de Bradford dando
valores erróneos.
2.12.1- Mediante el método Bradford.
Se cuantificó el contenido en proteínas de extracto total, MP, MI, y citosol por
el método de Bradford (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976) (reactivo de BIO-
RAD Protein Assay, BIO-RAD) usando albúmina de suero bovino (BSA) como proteína
patrón y efectuando la lectura en espectrofotómetro Synergy HT (BioTek) a 595 nm.
2.12.2- Mediante el método Lowri.
Se cuantificó el contenido en proteínas de la gota lipidica por el método de
Lowry (Lowry,1951; Methods of Enzymology Vol III, 448) usando albúmina de suero
bovino (BSA) como proteína patrón y efectuando la lectura en espectrofotómetro
Synergy HT (BioTek) a 750 nm. añadiendo a esta curva el mismo porcentaje de urea y
SDS que presentan las diluciones de las muestras en las que se midió la absorbancia.
2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS), e Inmuno detección de
proteínas mediante Western Blot.
Las muestras con igual cantidad de proteínas, se resuspendieron en tampón de
Laemmli (62mM Tris-HCL pH=6.8, 10% Glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 2% SDS y
0.001% azul de bromofenol) y se hirvieron durante 5 minutos a 100 ºC. Las muestras
destinadas al estudio del GLUT4 no se trataron ni con β-mercaptoetanol ni con calor,
puesto que el anticuerpo primario utilizado en su detección sólo presenta afinidad por
la proteína sin desnaturalizar. Todas las muestras se sometieron a electroforesis, en
geles de poliacrilamida/SDS del 7,5% o 10% en función del tamaño de poro que
necesitásemos, en tampón de electroforesis (25 mM Tris, 192 mM glicina pH 8.3, 0.1 %
SDS). Utilizando marcadores de peso molecular (10, 15, 25, 30, 35,50, 75, 105,160 y
250 kDa) (BIO-RAD 161-0374).
Materiales y métodos
49
Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (NTC) empleando
un sistema de transferencia semiseca y sus kits específicos (iBlot Gel Transfer Stacks
Nitrocellulose, Invitrogen). Una vez realizada la transferencia, se bloqueó la NTC con
leche desnatada al 5% durante 30 minutos, y se realizaron 3 lavados de 10 minutos con
tampón PBS-Tw20. A continuación las membranas se incubaron con el anticuerpo
primario correspondiente durante toda la noche a 4ºC. Tras la incubación de la NTC
con el anticuerpo primario, se lavaron 3 veces durante 5 minutos cada una, y se
incubaron con el anticuerpo secundario especifico durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Se lavaron nuevamente (3 lavados de 5 minutos cada uno) y se revelaron.
Los inmunocomplejos formados se detectaron por quimioluminiscencia usando kits de
detección por un sistema ECL (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ). Las bandas
se visualizaron y cuantificaron en un densitómetro G:Box Chemi (Syngene, UK)
utilizando el software suministrado con el equipo (GeneSnap y GeneTools). Como
controles de carga se emplearon beta-actina (extracto total) y Na+-K+-ATPasa
(marcador de membrana cruda total). En la siguiente tabla (Tabla 4) se resumen los
anticuerpos utilizados.
2.14- Caracterización de fracciones subcelulares.
Para establecer la pureza de las fracciones subcelulares aisladas (Lei y col.,
2004) se llevó a cabo la inmunodetección de proteínas que nos sirven como
marcadores por localizarse en las fracciones de membrana de interés (Figura 12). Así,
se utilizaron los anticuerpos específicos para descartar contaminaciones cruzadas
entre GL, CYT, MI y MP. El marcador especifico de MP es la Na+/K+-ATPasa, el marcador
especifico de MI es la GM130 el de GL es la perilipina, y el de la fracción citosólica es la
GW182.
Materiales y métodos
50
Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores en fracciones
subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. Se utilizaron 30 µg de proteína de las
distintas fracciones subcelulares. Media ± SEM de 3-6 animales de cada condición, en el caso
de la Na+/K+-ATPasa, el tampón carecía de β-mercaptoetanol y no se hirvieron las muestras,
para evitar la formación de agregados de proteínas.
Como control de carga para las diferentes medidas de western-blot realizadas
en este estudio, se midieron en todas las condiciones que se han estudiado las
proteínas específicas de cada extracto (Figura 13).
Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de marcadores en fracciones
subcelulares de cada condición de tejido adiposo blanco epididimal. Se utilizaron 30 µg de
proteína de las distintas fracciones subcelulares. Media ± SEM de 3-6 animales de cada
condición.
Materiales y métodos
51
Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio.
Anticuerpo
primario
Dilución
de uso
Casa comercial Anticuerpo
secundario
Dilución de
uso
Casa
comercial
P-S1101-IRS-1 1:1000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
P-S307-IRS-1 1:1000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
IRS-1 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-STAT-3 1:1000 Cell signaling GAM-PO 1:2000 Bio-Rad
STAT-3 1:1000 Santa Cruz GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
SCOS-3 1:5000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
Resistina 1:5000 Chemicon GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
β-actina 1:5000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
AQ 7 1:200 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
ATGL 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
LPL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-ser565 HSL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-ser563 HSL 1:200 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
HSL 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-ACC 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
ACC 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-ser133 CREB 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
CREB 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-Tre172 AMPK 1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
P-ser(485,491)
AMPK
1:1000 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
AMPKα1+α2 1:500 Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
PERILIPINA 1 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
PPARγ 2 µg/mL Abcam GAR-PO 1:5000 Bio-Rad
Na+-K+-ATPasa 1:500 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
GM130 1:5000 Abcam GAM-PO 1:5000 Bio-Rad
GAR-PO: Goat anti-rabbit conjugated to horseradish peroxidase. GAM-PO: Goat anti-mouse conjugated to
horseradish peroxidase.
Materiales y métodos
52
2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico.
Los datos cuantitativos se presentan como el valor medio ± SEM. La
significatividad de las diferencias entre las medias se determinó mediante análisis
Anova seguido de test Tukey. Se consideraron estadísticamente significativas las
diferencias con un valor de probabilidad p<0,05. Para este tratamiento estadístico, se
utilizó el programa GraphPad Prism versión 3.03 para Windows (GraphPad Software).
En casos específicos se compararon los datos mediante un test t-student. Se considero
estadísticamente significativas las diferencias con un valor de probabilidad p<0,05.
RESULTADOS
Resultados
53
3- RESULTADOS.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del tejido adiposo
blanco durante el envejecimiento:
3.1.- Resultados de la sobrecarga oral de grasas.
3.2.- Ensayo ayuno-realimentación. Resultados de los estudios de lipolisis.
Características biológicas y bioquímicas de los animales sometidos a estudio.
Como se describió en el apartado de materiales y Métodos, en estos estudios
se emplearon ratas machos de la raza Wistar de 3, 8 y 24 meses de edad, alimentadas
ad limitum o sometidas a restricción nutricional. En la tabla 1 se muestran las
características generales de estos animales. Los resultados expuestos en la tabla 5,
confirman que en los animales con pleno acceso a la comida (ad libitum), se produce
un aumento de peso corporal con el envejecimiento así como una tendencia a
acumular grasa, como vemos reflejado en el aumento del tejido adiposo blanco
visceral. Por otra parte, la acumulación de grasa y el peso corporal, se reduce
drásticamente con la restricción calórica, que supuso la ingestión de un 20% menos de
alimento. Se corrobora además que el envejecimiento en la rata Wistar no conduce a
alteraciones apreciables de la glucemia y la insulinemia en ayunas.
Tabla 5. Características biológicas de los animales.
EDAD 3m AL 8m AL 8m R 24m AL 24m R
Peso corporall (g) 329±7a 435±7b 381± 6** 554± 24c 477± 16**
Peso tejido adiposo visceral (TAE+TAP) (mg)
9,9±2a 17.2±1b 10,3±2** 26.7±2b 16.4±2**
Glucosa en suero (mmol/L)
6,5±0,1a 7,1±0,3a 7,9±0,06a 6,9±0,3a 6,7±0,5a
Glicerol en suero (mmol/L)
3,3±0,4a 5,1±0,5a 3,9±0,1a 4,2±0,4a 3,2±0,5a
NEFA (mmol/L) 1,0±0,04a 1,3±0,1a 0,9±0,1a 1,0±0,03a 0,9±0,06a
Insulina en suero (ng/mL)
2.6±0.6a 2.3±0.1a 3.8±0,1a 3.08±1a 2.8±0,1a
Los resultados constituyen la media ± SEM de 9-16 ratas por tratamiento. Anova seguido de
test Tukey. Símbolos diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
Resultados
54
Los datos de la tabla 5 reflejan además, que tras 16 horas de ayuno, los valores
de glicerol y NEFA en sangre aunque tienden a incrementarse a los 8 meses con
respecto a los observados a los 3 meses de edad, pero, en un principio, la lipolisis basal
(sin capacidad de distinción entre paquetes adiposos), no cambia significativamente
con la edad.
3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas.
Este experimento se realizó in vivo, inoculando aceite a los animales por vía oral (0.1
ml / 100 g peso corporal). Se llevó a cabo en los 5 grupos de animales y se utilizaron entre 6 y
10 animales por grupo. Las medidas se realizaron en sangre extraída de la vena de la cola.. Los
resultados más importantes se recogen en las figuras 14 y 15.
Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de TAG, NEFA, glucosa e insulina
de animales de 8 meses de edad alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por
tratamiento (**p<0.05).
0 100 200 3000
250
500
3m 8mAL
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
deTA
G (
mg/
dl)
0 100 200 3000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
deN
EFA
(m
mol
/L)
0 100 200 3000
100
200
300
3m 8mAL
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
degl
ucos
a (m
g/dl
)
0 50 100 150 2000
1
2
3
4
5
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
dein
sulin
(ng
/ml)
Resultados
55
Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de TAG, NEFA, glucosa e insulina
de animales de 24 meses de edad alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por
tratamiento (**p<0.05).
0 100 200 3000
250
500
3m 24mAL
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
deTA
G (
mg/
dl)
0 50 100 150 2000
5
10
15
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
dein
sulin
a (n
g/m
l)
0 100 200 3000
100
200
300
24mAL3m
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
degl
ucos
a (m
g/dl
)
0 100 200 3000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tiempo (min)
Niv
eles
circ
ulan
tes
deN
EFA
(m
mol
/L)
Resultados
56
Figura 16. Área bajo la curva expresada como mg/min/ml-1 correspondiente a los cambios en
los niveles de TAG, NEFA, glucosa e insulina, respectivamente, de los animales de 3, 8 y 24
meses de edad (AL), durante el ensayo de sobrecarga oral de grasa.. Los cálculos se realizaron
con el programa GraphPad Prism versión 3.03 para Windows (GraphPad Software). Los datos
corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey.
Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).
Como podemos observar en las Figuras 14 y 15, las ratas de 8 y 24 meses de
edad parten de niveles elevados de TAG en sangre en ayunas, en comparación con las
de 3 meses de edad. La infusión de un bolo de grasa incrementó los niveles de TAG y
de NEFA en estos animales en el estado postprandial. Estos niveles continuaron
aumentando hasta los 180 minutos después de la carga oral de grasas, a partir de ese
momento, comenzaron a disminuir sin llegar a alcanzar los niveles basales a los 240
minutos (4 horas), momento que se puede considerar como el final de un estado
postabsortivo, teniendo en cuenta que la insulina ya ha alcanzado los niveles basales.
Glucosa
3m 8m 24m0
10000
20000
30000
40000
a ab
Áre
a ba
jo c
urva
(mg/
min
/ml
-1)
TAG
3m 8m 24m0
25000
50000
75000
100000
a
b
c
Áre
a ba
jo c
urva
(mg/
min
/ml
-1)
NEFA
3m 8m 24m0
100
200
300
400
500
aa
b
Áre
a ba
jo c
urva
(mg/
min
/ml
-1)
Insulina
3m 8m 24m0
500
1000
1500
a a
bÁ
rea
bajo
cur
va
(mg/
min
/ml
-1)
Resultados
57
Las figuras 14 y 15 demuestran que los animales de 24 meses de edad,
necesitan incrementar, de forma significativa, los niveles de insulina circulantes, para
mantener la normoglucemia, no obstante, al final del ensayo, se observa un
incremento notable de la glucemia provocado, probablemente, por un aumento de la
producción hepática de glucosa y una disminución de la captura de glucosa por los
tejidos sensibles a insulina, mediada por el exceso de disponibilidad de ácidos grasos.
Cuando se analizan las áreas bajo las curvas, se observa que ya a los 8 meses de
edad, los animales disponen de altos valores de NEFA durante el ensayo, pero
mantienen la normoinsulinemia y la normoglucemia, altos niveles de NEFA, se han
relacionado habitualmente con el desarrollo de resistencia a la insulina
fundamentalmente en hígado, músculos esqueléticos y páncreas (Randle y col, 1963;
Varman S, 2010).
Este ensayo de sobrecarga de grasas, se realizó también en animales de 8 y 24
meses de edad en restricción nutricional. En la tabla 6, se indican los valores de las
áreas bajo las curvas de TAG, NEFA, glucosa e insulina respectivamente, con el objetivo
de conocer los efectos de la restricción nutricional.
Tabla 6. Área bajo la curva (mg/ml/min-1) de los niveles de TAG, NEFA, glucosa e insulina
respectivamente. Efectos de la restricción nutricional.
Los datos corresponden a la media ± SEM de 6-10 ratas por tratamiento. Tets t´student
(**p<0.05).
Edad 8m Al 8m R 24m Al 24m R
TRIGLICERIDOS 63693±1617 40913±1027** 70974±570 39025±6463**
NEFA 356±15 263±7** 306±7 278±9
GLUCOSA 30304±581 34935±518 32816±510 27430±724**
INSULINA 354±47 496±76 1087±38 1025±40
Resultados
58
Como se muestra en la tabla 6, la restricción nutricional temprana acerca el
perfil de lípidos al observado en los animales de 3 meses de edad. Es interesante
destacar que en los animales de 24m R, alcanzan al final del ensayo los valores basales
de la glucemia, pero no los de la insulinemia.
Los datos globales del ensayo de sobrecarga oral de grasas demuestran que con
el envejecimiento se desarrolla intolerancia a las grasas, que como resultado se
producen incrementos de los lípidos en sangre, fundamentalmente,
hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia (datos no mostrados), que puede deberse a
un metabolismo alterado de las lipoproteínas plasmáticas. Como el objeto de estudio
de esta tesis es el tejido adiposo visceral, se decidió analizar los niveles de expresión
de dos proteínas estrechamente vinculadas con la retirada de lípidos de la sangre por
el tejido adiposo, la LPL y la proteína relacionada con el receptor de LDL.
Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína relacionada con el receptor
de LDL (LPR-1) en tejido adiposo de animales de 3, 8 y 24 meses de edad.
Genes 3m 8mAL 8mR 24mAL 24mR
LPL 1.0±0.01a 1.18±0.1a 1.06±0.03a 2.05±0.09b 1.16±0.1a
LRP-1 1.0±0.02a 0.79±0.02b 0.81±0.05b 0.83±0.02b 1.24±0.03c
Los datos corresponden a la media ± SEM de 8-10 ratas por tratamiento. Anova
seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).
Los resultados de la tabla 7 indican que la expresión de LPL está incrementada
al doble en el tejido adiposo de ratas de 24 meses, este dato es también un indicador
de disminución de tono simpático de este tejido. Sin embargo, a partir de los 8 meses
de edad disminuyen los niveles del transcripto de LPR-1. Como para la captura de los
ácidos grasos y de los TAG y ésteres de colesterol de las lipoproteínas plasmáticas es
importante la participación conjunta de la enzima LPL y de los receptores LPR-1 (LDL
receptor protein related-1), estos resultados reflejan una disfunción del tejido adiposo
visceral, en relación con el aclaramiento de las lipoproteínas plasmáticas.
Resultados
59
ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD DEL TEJIDO ADIPOSO
3.2.- Ensayo ayuno-realimentación.
El envejecimiento es un proceso que implica la pérdida progresiva de la
capacidad de adaptación a diferentes estados de estrés celular. En esta sección del
trabajo abordamos el efecto del envejecimiento sobre la capacidad del tejido adiposo
visceral de responder a una situación de ayuno prolongado (36h) y al cambio al estado
de alimentación. Para iniciar el estudio analizamos los niveles de TAG, NEFA y glicerol
en sangre de las ratas de 3, 8 y 24 meses de edad (AL y FR) sometidas a estudio.
Los resultados de la tabla 8 no reflejan diferencias significativas en los niveles
circulantes de NEFA y glicerol con el envejecimiento, aunque los valores superiores de
NEFA se observan a los 8 meses de edad. Sin embargo, la restricción calórica produce
un aumento significativo de NEFA en los animales de 24 meses de edad. Por otra parte,
los resultados del experimento indican que los niveles de TAG son significativamente
superiores en las ratas de 24 meses respecto a los valores observados en ratas de 3 y 8
meses ayunadas. Es importante tener en cuenta que en estas condiciones los TAG
detectados son los TAG-VLDL.
Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero.
EDAD 3m AL 8m AL 8m R 24m AL 24m R
Glicerol en suero (mM) 4.22±0.11a 3.15±0.28a 2.29±0.28 4.20±0.86a 3.78±0.37
NEFA en suero (mM) 0.62±0.18a 0.72±0.07a 0.69±0.17a 0.63±0.14a 1.34±0.5*
TAG en suero (mM) 0.47±0.06a 0.31±0.04a 0.29±0.11b 0.75±0.10c 0.25±0.04b
Los resultados constituyen la media ± SEM de 9-16 ratas por tratamiento. Anova seguido de
test Tukey. Símbolos diferentes indican diferencias significativas entre animales de diferente
edad (p<0.05). Test t´student * p<0.05
Resultados
60
Estudio de la lipolisis basal del tejido adiposo en el tránsito ayuno-alimentación.
3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la restricción calórica.
Como ya hemos avanzado en la introducción, la lipólisis del tejido adiposo, es el
proceso de degradación de los triglicéridos almacenados en este tejido, los cuales son
hidrolizados hasta ácidos grasos y glicerol. En esta parte del trabajo se analizó
inicialmente la lipolisis basal, en explantes (100 mg) de tejido adiposo blanco, a través
de la determinación (después de 3 horas de incubación) de la liberación de glicerol y
NEFA al medio de incubación de los explantes. Como la lipolisis y la reesterificación son
procesos que están relacionados entre sí (Van Harmelen y col, 1999; Wan y col, 2013),
se determinó el cociente NEFA / glicerol, un indicador de la capacidad de recaptura de
NEFA por el tejido adiposo y de la reesterificación a TAG.
Además, se midió en muestras de tejido adiposo (100 mg), los niveles de mRNA y de
proteína de las enzimas ATGL y HSL, ya que juegan un importante papel en este
proceso, fundamentalmente la enzima ATGL que es la limitante de la lipolisis basal, así
como los del canal de glicerol AQ7. Se prestó especial énfasis en la obtención de
secciones de 100 mg de tejido para todos los estudios relacionados con la lipolisis y los
niveles de proteínas y enzimas involucradas en este proceso.
Como podemos observar en las Figuras 17 Y 18, después de un ayuno de 36
horas, los niveles de glicerol y NEFA liberados al medio de incubación, así como de
expresión de las hormonas HSL y ATGL, disminuyen a los 24 meses de edad con
respecto a los observados a los 3 y a los 8 meses de edad, lo que indica una
disminución de la capacidad lipolítica basal del tejido adiposo de los animales de 24
meses de edad en las condiciones de ayuno estudiadas. La restricción calórica
temprana (8mFR) y tardía (24mFR) incrementó significativamente la liberación de
glicerol respecto a la observada en los animales alimentados ad libitum.
Resultados
61
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0
5
10
15
20
b
a
bGlic
erol
libe
rado
(mm
oles
/g te
jido/
h)
*
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0
5
10
15
20
b
a
bNE
FA li
bera
do(m
mol
es/g
tejid
o/h)
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0
1
2
a
b
a
*
NE
FA /
Glic
erol
Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio de incubación (3 horas) de los
explantes (100 mg) de tejido adiposo después del ayuno de 36 horas y determinación del
cociente NEFA / glicerol en cada caso. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-
4 animales de cada condición, ensayados por triplicado. Anova seguido de test Tukey. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
En la figura 17 se observa una disminución significativa en la liberación de
NEFA y glicerol por los explantes de tejido adiposo de animales de 8 y 24 meses de
edad con respecto a animales de 3 meses de edad, estos resultados indican que la
velocidad de liberación de estos metabolitos por el tejido adiposo visceral, disminuye
con el envejecimiento. Además, el aumento significativo del cociente NEFA / glicerol
observado en la figura 17, para los explantes de animales de 24 meses de edad,
confirma la reducción de la capacidad lipolítica y también de la capacidad de
reesterificación del tejido adiposo visceral con el envejecimiento cuando los animales
se someten a un ayuno de 36 horas, superior al normal. En cambio, la restricción
calórica temprana (8mFR) incrementa notablemente ambos procesos, por lo que se
corrobora que este tipo de intervención mejora la funcionalidad del tejido adiposo
visceral.
Resultados
62
La realimentación durante 30 minutos y 3 horas, no produjo cambios en los
niveles de NEFA liberados al medio respecto a los valores observados en ayunas, sin
embargo si se observó una tendencia a la disminución paulatina (no significativa) de
los niveles de glicerol liberados al medio de incubación (datos no mostrados).
La figura 18 muestra los niveles de mRNA de ATGL, HSL y AQ7 en el tejido
adiposo de los animales estudiados durante el ayuno de 36 horas y la transición ayuno-
realimentación. Inicialmente se observa que la abundancia de los transcriptos de HSL y
ATGL, presenta, aproximadamente el mismo patrón de variación con el
envejecimiento, incrementándose a los 8 meses y disminuyendo a los 24 meses de
edad, siendo el cambio de HSL más notable y significativo y que se correlaciona,
además, con los niveles de NEFA en el plasma de los animales (tabla 8). Se corrobora
que cuando se incrementa la resistencia a la insulina disminuye la expresión de estas
enzimas y que el aumento de adiposidad sumado al envejecimiento disminuye la
expresión de las principales enzimas lipolíticas en el tejido adiposo. Por otra parte se
observa que la expresión de AQ7 se incrementa con la edad.
Además en esta figura se aprecia que el tejido adiposo de animales de 24
meses no tiene igual respuesta frente a la transición ayuno-alimentación, que el tejido
adiposo de animales de 3 y 8 meses de edad. De hecho, la expresión de HSL no se
modifica y la de ATGL y AQ7 continúa disminuyendo, lo se puede interpretar como una
disfunción del tejido o una disminución del tono simpático del tejido adiposo en las
ratas de 24 meses de edad. La restricción calórica temprana tiende a disminuir la
expresión de los 3 genes estudiados y generar un perfil de expresión similar al
observado a los 3 meses de edad.
Si consideramos la disminución de la expresión de ATGL y AQ7 a las 3 horas de
iniciada la realimentación en ratas de 24 meses, podría favorecer la capacidad de
esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo de estos animales, al disponer de
glicerol en el tejido durante más tiempo. En esta situación particular, podría activarse
la expresión génica de la enzima glicerol quinasa, como se ha descrito por otros
autores (Frasson y col, 2012).
Resultados
63
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
Niv
eles
rel
ativ
os d
e m
RN
Ade
HS
L en
TA
E
a
a
a
b
b
ab
ac
c
ac
ac
ac
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
Niv
eles
rel
ativ
os d
e m
RN
Ade
AT
GL
en T
AE
aa
bb
bba
bab
c
ac
ac
ac
ac
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
1.0
1.5
a
ca
ab
ab
ac
cac a
c
a
bb
Niv
eles
rel
ativ
os d
e m
RN
Ade
AQ
7 en
TA
E
Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL y ATGL y del transportador de
glicerol AQ7 en condición basal. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-
4 animales de cada condición, ensayados por triplicado. Anova seguido de test Tukey. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=
envejecimiento; c= restricción calórica.
A continuación, se determinaron los niveles de las proteínas HSL, ATGL y AQ7
en el tejido adiposo visceral, así como el estado de activación de la enzima HSL.
La figura 19A demuestra que los niveles proteicos de la enzima ATGL, limitante
de la lipolisis basal, están reducidos significativamente con el envejecimiento en las
condiciones estudiadas (ayuno 36 horas). Estos resultados se corresponden con la
disminuida capacidad lipolítica y de reesterificación mostrada por el tejido adiposo de
ratas envejecidas en la figura 14. También se observa que la restricción calórica
incrementa los niveles de ATGL. Cuando se analizó el efecto de la realimentación
(figura 19B), se observó una disminución paulatina de los niveles de ATGL en los 3
grupos de animales alimentados AL.
Resultados
64
En la figura 20A, vemos que los niveles proteicos de AQ7, al igual que los de
mRNA (figura 18), se incrementan con el envejecimiento. En relación con los niveles de
perilipina, una proteína que interviene en la formación de la gota lipídica y en el
metabolismo de los lípidos neutros contenidos en este compartimento, los resultados
indican que los niveles de perilipina son superiores en el tejido adiposo de animales de
24 meses con respecto a los de 8 meses de edad, probablemente debido a que en los
primeros se ha reducido menos el tamaño de la gota lipídica.
La restricción calórica temprana modifica los niveles de AQ7, en cambio se
observa un contenido menor de perilipina tanto cuando se lleva a cabo en etapas
tempranas como tardías de la vida. Por otra parte, la realimentación no produjo
modificaciones importantes de los niveles de AQ7 y perilipina (datos no mostrados).
La HSL es la enzima limitante de la lipolisis mediada por catecolaminas. La
figura 20A, muestra que con el envejecimiento (24 meses de edad) disminuye la masa
de HSL, además de la de ATGL. Por otra parte, se conoce que la fosforilación en serina
563 (mediada por PKA), activa a la HSL, mientras que la fosforilación en serina 565
(mediada por AMPK), impide la activación de la HSL por la PKA. Al analizar la relación
entre las formas activada y no activada, se observa una disminución significativa del
estado de activación de esta enzima, con el envejecimiento. La restricción calórica
incrementa la forma activada de HSL en el estado de ayuno.
La realimentación, como indica la figura 20B, produce un descenso gradual del
estado de activación (p-ser-563 / p-ser-565) de la HSL en animales de 3 meses de edad
y en los sometidos a restricción calórica temprana (8mFR).
Resultados
65
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
ATGL AQ7 Perilipina0
1
2
33mAL 8mAL 8mFR24m AL 24mFR
Niv
eles
de
prot
eína
y d
eac
tivac
ión
de H
SL
b bc
c
b
cc cb
0.0
0.5
1.0
1.53mAL
a
bcA
TGL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
Ay Re30 Re1800.00
0.05
0.10
0.15
a
Ay Re30 Re180
8m AL
ATG
L(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
a
a
0.075
0.100
0.125
0.150a
a
a
Ay Re30 Re180
24m AL
ATG
L(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
a
b
c
Ay Re30 Re180
8m FR
ATG
L(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
a
b
Ay Re30 Re180
24m FR
a
ATG
L(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total de tejido
adiposo visceral. A) Niveles en ayuno de 36 horas. Efectos del envejecimiento y de la
restricción calórica. B) Efectos de la realimentación en los niveles de ATGL. Los resultados
mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a=
ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
A
B
Resultados
66
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
HSL total p-ser-563-HSL p-ser-565-HSL p-ser-563 / p-ser-565 HSL0.0
0.5
1.0
1.5 3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
b
c
c
bb
c
c
bb
b
b
c
c
Niv
eles
de
prot
eína
y d
eac
tivac
ión
de H
SL
0.0
0.5
1.0
1.53mAL
Ay Re30 Re180
P-5
63H
SL/
P-5
65H
SL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
b
c
a
0.2
0.3
0.4 8mAL
P-5
63H
SL/
P-5
65H
SL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
Ay Re30 Re180
a a
b
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Ay Re30 Re180
24mAL
P-5
63H
SL/
P-5
65H
SL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
a
a
b
0.0
0.5
1.0
1.5
Ay Re30 Re180
8mFR
P-5
63H
SL/
P-5
65H
SL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
a
b b
0.00
0.25
0.50
0.75
Ay Re30 Re180
24mFR
P-5
63H
SL/
P-5
65H
SL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
a a
b
Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas de la enzima HSL en extracto total de tejido adiposo visceral. A) Niveles en estado de ayuno de 36 horas. Efectos del envejecimiento y de la restricción calórica. B) Efectos de la realimentación en el estado de activación de HSL. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas
entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
A
B
Resultados
67
3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral. Efectos del isoproterenol y la
insulina.
Los resultados que se muestran a continuación, corresponden al estudio en
explantes (100 mg) de tejido adiposo visceral, de los efectos del isoproterenol y la
insulina sobre la lipolisis, para analizar la capacidad del tejido adiposo de respuesta a
los agonistas de β-adernérgicos y de respuesta a las acciones antilipolíticas de la
insulina. El estudio se centró en el análisis de la liberación de glicerol al medio de
incubación (3 horas incubación), teniendo en cuenta que es la medida más efectiva de
la lipolisis cuando se estudia en secciones de tejido adiposo.
Los resultados de este ensayo se presentan en la Figura 21. En esta figura se
demuestra que los explantes de tejido adiposo de animales de 8 y 24 meses de edad
AL y FR, muestran una pobre respuesta a las acciones lipolíticas del ISO, a diferencia de
los explantes de ratas de 3 meses de edad, en los que se incrementa notablemente la
liberación de glicerol al medio en las tres condiciones estudiadas, ayuno, 30 minutos y
3 horas de realimentación, predominando las acciones lipolíticas del ISO a las acciones
antilipolíticas de la insulina.
En esta figura 21, también se observa que en los explantes de ratas de 24
meses de edad predominan los efectos antilipolíticos de la insulina a los efectos del
isoproterenol.
Además de las medidas de glicerol, también se realizaron medidas de lactato en
los medios de incubación de los explantes, y como podemos observar en la Figura 22,
la liberación de lactato al medio, como reflejo de la capacidad del tejido de
metabolizar la glucosa, depende de la edad y de la situación fisiológica. El ISO detiene
la liberación de lactato y la insulina revierte los efectos del ISO e incrementa la
transformación de glucosa en lactato en explantes de ratas de 3 meses de edad
ayunadas o después de 3 horas de ser alimentadas.
Resultados
68
Ayuno
3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0
50
100
150
aa
ab a
a a aa
Glic
erol
(%
)
Realimentación 30 min
3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0
50
100
150
aa
a a
Glic
erol
(%
)
b
b b
Realimentación 3horas
3mAL 8mAl 24mAl 8mR 24mR0
50
100
150
aa
ab
a a a
Glid
erol
(%
)
ab
ab
ab
Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes en estado basal, tratados con
isoproterenol y tratados con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados
corresponden al estudio de 3-4 animales de cada condición, ensayados por triplicado,
expresados en % de estimulación sobre el basal. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Los explantes de ratas de 24 meses de edad no muestran variaciones en la
liberación de lactato en respuesta a insulina cuando provienen de animales en estado
postprandial. Se confirma con estos resultados que el tejido adiposo de ratas
envejecidas no responde adecuadamente a los efectos de la insulina de estimular la
oxidación de la glucosa, al menos a lactato.
Resultados
69
Ayuno
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
50
100
150
a
a
ba
a
b b
ab
c
c
ac
ac
ac
ac
Lact
ato
(%)
Realimentación 30 Minutos
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
50
100
150
a
a
b
a
b
c
ab
ab
Lact
ato
(%)
Realimentación 3 horas
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
50
100
150
a
b
cab
ac
bb
c ac
ca
Lact
ato
(%)
Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes en estado basal, tratados con
isoproterenol y tratados con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados
corresponden al estudio de 3-4 animales de cada condición, ensayados por triplicado,
expresados en % de estimulación sobre el basal. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Por otra parte, se consideró relevante estudiar la capacidad de estimulación de
la enzima HSL por isoproterenol en los explantes de tejido adiposo con el
envejecimiento y la restricción calórica.
Resultados
70
3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL en tejido adiposo. Efectos de
isoproterenol y la insulina.
En la figura 23 se muestran las variaciones en el estado de activación de la
enzima HSL (p-ser-563-HSL / p-ser-565-HSL) que produce el tratamiento con
isoproterenol y el tratamiento con ISO más insulina de los explantes. En la figura se
observa que solo los explantes de tejido adiposo visceral correspondientes a animales
de 3 meses de edad reflejan lo esperado, incremento de activación de HSL por
isoproterenol y disminución de activación de HSL por ISO más insulina.
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
100
200
300
a
Act
ivac
ión
de H
SL
(% s
obre
bas
al)
Figura 23. Representación de los cambios en la activación de la enzima HSL (cociente p-ser-
563 / p-ser-565) en los explantes (30mg de extracto total) durante el ensayo de lipolisis. Se
consideró como 100% la condición basal. Todos los resultados mostrados corresponden al
estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican
diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c=
restricción calórica.
Resultados
71
La disminución del estado de activación de HSL se debe fundamentalmente al
incremento en la fosforilación en serina 565-HSL. Este residuo es fosforilado por la
enzima AMPK, la cual se activa en situaciones de estrés energético y oxidativo.
3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los niveles proteicos de ATGL, AQ7
y perilipina en los explantes de tejido adiposo.
La figura 24 refleja el resultado de las modificaciones que produce el
tratamiento con isoproterenol en los niveles totales de AQ7, ATGL y perilipina. Los
resultados más notables muestran que el isoproterenol incrementa el contenido
proteico de ATGL mientras que ISO más insulina los disminuye, en los explantes de
animales de 3, 8 y 24 meses de edad, alimentados ad limitum y bajo restricción
calórica.
Los efectos sobre los niveles de perilipina son totalmente opuestos. El
isoproterenol disminuye mientras que ISO más insulina incrementa generalmente los
niveles de perilipina. En el caso de la AQ7 las modificaciones solo se observan en
animales de avanzada edad o bajo restricción calórica.
Resultados
72
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
7.5
b b b
b
ab
ab
c c c
ac
ac
ac
AQ
7(3
0µ g
de
extr
acto
tota
l)
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
a a
ab b
ab
c
c
ac
ac
ac
ATG
L(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
a a
b bb b b b
c
cac
ac
ac
ac
PE
RIL
IPIN
A
Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total de los explantes de tejido
adiposo visceral en condición basal (B), tratados con isoproterenol (ISO), y tratados con
isoproterenol e insulina (ISO+Ins). Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6
animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK en tejido adiposo. Efectos
del envejecimiento y la restricción nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina.
A continuación se estudiaron los cambios en el estado de activación de la AMPK
por ser un importante sensor energético y regulador clave del metabolismo en todos
los tejidos. El estrés nutricional y energético (altos niveles de AMP), estimula la
Resultados
73
fosforilación en la treonina 172 y la activación de la AMPK. Por otra parte, se sugiere
que la fosforilación en residuos de serina disminuye el estado de activación de la
AMPK.
En la figura 25 se observa que el contenido de AMPK aumenta con el
envejecimiento y disminuye con la restricción calórica. Sin embargo, el estado de
activación de esta enzima (cociente p-thr-172-AMPK / p-ser-485,491-AMPK) es mayor
en el tejido adiposo de ratas de 3 meses de edad en ayuno de 36 horas. De hecho lo
que se observa en la figura 25, es un incremento significativo de la forma no activada
de AMPK (p-ser-485,491) con el envejecimiento y la restricción calórica que podría
relacionarse con un mecanismo de protección a largo plazo contra el exceso de
lipolisis, de oxidación de ácidos grasos y de incremento del estrés oxidativo.
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
AMPK total P-thr AMPK P-ser AMPK P-thr/P-serAMPK0
1
2
3
4
5
b bc b b
b
cc
c
c
c
b
b b
3 m A L 8 m A L 2 4 m A L 8 m F R 2 4 m F R
Niv
eles
de
prot
eina
y d
e
activ
ació
n de
AM
PK
Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies fosforiladas y de la masa de
AMPK. Efectos del envejecimiento y de la restricción calorica. Todos los resultados mostrados
corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=
envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
74
Por otra parte la activación de la lipolisis en explantes, por isoproterenol,
incrementa de forma significativa la forma activada de la AMPK (figura 26) en el tejido
adiposo de las ratas de 3, 8 y 24 meses de edad y el tratamiento con insulina la
aumenta de manera significativa en ratas de 3 meses de edad. Se sugiere que la
activación de AMPK por catecolaminas podría promover a largo plazo la inactivación,
por fosforilación en residuos de serina, de la enzima HSL en las ratas viejas, de modo
que con el envejecimiento disminuye el contenido proteico de HSL y estaría
fundamentalmente en estado de menor activación, de esta forma se ve limitada la
lipolisis en animales en los que ha disminuido significativamente la masa magra
(Escrivá, 2007).
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
100
200
300
a
a
a a
a
aa
a a
Act
ivac
ión
de A
MP
K(%
sob
re e
l bas
al)
Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la enzima AMPK (cociente p-thr-
172-AMPK / p-ser-485,491) en los explantes (30mg de extracto total) durante el ensayo de
lipolisis. Se consideró como 100% la condición basal. Todos los resultados mostrados
corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b=
envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
75
Teniendo en cuenta que la lipolisis es la movilización de los lípidos almacenados
en la gota lipídica del tejido adiposo blanco y que este proceso supone la activación de
enzimas lipolíticas así como la correcta localización subcelular de las proteínas
implicadas, se procedió a estudiar los niveles de ATGL, HSL, perilipina y AQ7 en
diferentes fracciones subcelulares obtenidas a partir de un extracto total del tejido
adiposo y del fraccionamiento de los explantes que fueron incubados con ISO y con ISO
más insulina. El siguiente apartado refleja el efecto del envejecimiento sobre los
movimientos de proteínas hacia la gota lipídica o desde la gota lipídica hacia el citosol
en el tejido adiposo visceral de ratas Wistar de 3, 8 y 24 meses de edad.
3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular de proteínas durante la
lipolisis. Efectos del envejecimiento y la restricción calórica.
Las proteínas y enzimas relacionadas con la hidrólisis de los lípidos neutros se
asocian físicamente a la gota lipídica en todos los mamíferos, tres de estas proteínas
son la ATGL que cataliza el primer evento en la hidrólisis de los TAG, la perilipina que
forma la cubierta de la gota lipídica y la HSL que cataliza la hidrólisis de los DAG
(Sturley S y Hussain MM, 2012).
En las figuras 27-31, se presentan en la parte superior, los resultados del
fraccionamiento subcelular de secciones de 100 mg de tejido adiposo y en la parte
inferior, los resultados del fraccionamiento subcelular de los explantes (100 mg),
incubados durante 3 horas con el medio de incubación, medio más ISO y medio más
ISO más insulina.
Los resultados que se presentan en la figura 27(A,B) indican que en el tejido
adiposo de ratas de 3 meses de edad, la ATGL se encuentra distribuída entre la gota
lipídica y el citosol. Con el envejecimiento disminuye el contenido total y se localiza
mayoritariamente en el citosol. En todos los animales estudiados, tras la lipolisis
inducida por isoproterenol, la ATGL se desplaza, pasando a encontrarse
mayoritariamente en la gota lipídica.
Resultados
76
Figura 27A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la ATGL del citosol a la gota
lipídica tras la lipolisis.
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
1.0
1.5
ATG
L(3
0µg
de
gota
lipí
dica
)
b bb
b
ab
ab
c
c
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
1.0
1.5
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0µg
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l)
b
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ab
ab
ab
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c
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
1.0
1.5
a
b b bb b
b
c c cc c a
c
ATG
L(3
0µg
de g
ota
lipíd
ica)
Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal (transición Ayuno
realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los
resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados
por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
77
Las figuras 28 y 29 (A,B) muestran la localización basal y el movimiento de la
HSL y de la forma fosforilada en serina 565 de HSL. Como podemos ver, en el tejido
adiposo de los animales sometidos a estudio, la HSL se distribuye entre el citosol y la
gota lipídica (figura 28A). Sin embargo, la estimulación de la lipolisis, promueve en
general, el movimiento de HSL hacia la gota lipídica (figura 28B). Por otra parte, hay
que destacar que la forma fosforilada en serina 565 de HSL solo se encuentra en el
citosol en el tejido adiposo figura (29A) y se mueve a la gota lipídica cuando se
exponen los explantes al medio de incubación y al medio más ISO y más ISO e
insulina(figura 29B). Igualmente, se observa el aumento de esta forma menos activa de
HSL, en la gota lipídica con el envejecimiento, lo que limitaría la movilización de los
depósitos grasos en el tejido adiposo visceral de estos animales.
Figura 28A. En esta figura se puede observar cómo la masa de HSL se mantiene repartida
equitativamente entre la gota lipidica y el citosol, tanto antes como después de la incubación.
Resultados
78
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
HS
L(3
0µµ µµ g
de
gota
lipí
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c
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ab
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
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ab
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ac
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0µ g
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
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L(3
0µ g
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lipí
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
HS
L(3
0µ g
de
cito
sol)
a b b ab
b b bc c
a ac
Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal (transición Ayuno
realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los
resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados
por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
79
Figura 29A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la forma inactiva de la HSL del
citosol a la gota lipídica tras la lipolisis.
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
3
4
P-5
65H
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HS
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0µg
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l)
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a
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
3
4
a
a b b ab
bcc c
c ac
ac
P-5
65H
SL/
HS
L(3
0µ g
de
gota
lipí
dica
)
Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada inactiva de HSL en condición
basal (transición Ayuno realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con
isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6
animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Finalmente, en relación con la gota lipídica y la lipolisis, estudiamos los
movimientos de la perilipina y como indican las figuras 30 (A,B), la perilipina se localiza
en la gota lipídica del tejido adiposo de todos los animales sometidos a estudio. No
obstante, tras la lipólisis, parte de esta proteína se mueve de la gota lipídica al citosol,
Resultados
80
fundamentalmente en explantes de ratas de 3 meses de edad y de ratas sometidas a
restricción calórica, facilitando el acceso a las enzimas lipolíticas. En los explantes de
todos los animales alimentados ad limitum, la presencia de insulina incrementa de
nuevo el contenido de perilipina en la gota lipídica.
Figura 30A. En esta figura se puede observar cómo se trasloca la perilipina de la gota lipídica al
citosol tras la lipolisis, aunque sigue estando mayoritariamente en la gota lipídica.
Resultados
81
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
3
4
5
Per
ilipi
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0µg
de g
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lipíd
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ab
ab a
b
ab c c a
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
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4
5
Per
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
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ilipi
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0µg
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lipíd
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
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b a c aac
ac
ac
Per
ilipi
na(3
0µg
de c
itoso
l)
Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en condición basal (transición Ayuno
realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los
resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados
por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
A continuación, estudiamos los cambios en la localización subcelular de la AQ7
con el envejecimiento y la situación nutricional. En las figuras 31 (A,B) se observa que
esta isoforma de acuaporina se localiza en el tejido adiposo de todos los animales
estudiados, fundamentalmente, en las membranas internas y en menor proporción en
la membrana plasmática. La estimulación de la lipolisis en los explantes, induce la
salida de esta proteína a la membrana plasmática, aunque en las ratas viejas sigue
observándose mayor contenido de AQ7 en la MI.
Resultados
82
Figura 31A. En esta figura se puede observar cómo no se produce ninguna traslocación de la
AQ7 entra las distintas membranas.
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
7.5
a
b
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ab
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0µg
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
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b
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bc cc
ac
ac
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7(3
0µg
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embr
ana
plas
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
ab b
ab b b
ab c
cac
ac
AQ
7(3
0µg
de
mem
bran
a in
tern
a)
Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática y membrana interna de AQ7 en condición basal (transición Ayuno realimentación), tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e insulina. Todos los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican
diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
83
3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de novo de ácidos grasos y
de captura de lípidos por el tejido adiposo para la síntesis de TAG.
Se ha descrito en la literatura que la transformación de glucosa en ácidos
grasos está disminuida en el tejido adiposo de ratas Wistar con el envejecimiento
(Escrivá, 2007). En esta tesis hemos determinado los niveles de los transcriptos del
factor de transcripción ChREBP, relacionado con la síntesis de ácidos grasos y del
receptor nuclear PPARγ, relacionado con la adipogénesis y la lipogénesis en el tejido
adiposo. Los resultados que se muestran en la figura 32 indican que la expresión
génica de estos factores disminuye con la edad, y aumenta con la restricción calórica
ya sea temprana o tardía.
Por otra parte, se observa que la expresión de ChREBP varía en función de la
situación nutricional ya que disminuye al inicio de la realimentación pero se
incrementa significativamente transcurridas 3 horas del inicio de la realimentación, de
manera que prepara al tejido para la asimilación del exceso de nutrientes en las
siguientes etapas de alimentación. El caso más relevante es el de 24 meses FR.
En el caso de PPARγ, se observa una tendencia al incremento de expresión a los
8 meses y a la disminución de la expresión a los 24 meses de edad.
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
1
2
3
a
a
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ab
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0
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2
3
4
5
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E
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b
ab
ab
ac
c
ac
c
ac
Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ en tejido adiposo visceral. Efectos del
envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de
3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
84
A continuación se analizó la expresión de dos genes que están regulados por
ChREBP: ACC y FAS. Nuestros resultados (Figura 33) indican que los niveles de mRNA
de estas enzimas que son clave para la síntesis de novo de ácidos grasos, disminuyen
con el envejecimiento, y aumentan con la restricción calórica.
Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de ACC así como su estado de
fosforilación, teniendo en cuenta que el estado de activación de esta enzima (no
fosforilado) regula fuertemente la síntesis de novo de ácidos grasos. Nuestros
resultados de la figura 34 indican, que los niveles proteicos de ACC disminuyen
drásticamente con el envejecimiento y que la restricción calórica temprana produce un
incremento de éstos en estado de alimentación. También vemos que la ACC está
fundamentalmente en forma inactiva (p-ACC) en el tejido adiposo de ratas de 24
meses de edad (Figura 34).
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
1.0
1.5
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b
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ativ
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RN
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
0.5
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Niv
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ativ
os d
e m
RN
Ade
AC
C e
n T
AE
Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido adiposo visceral. Efectos del
envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de
3-6 animales de cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
85
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24mFR
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24mFR
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CC
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0 1 2 3 41.25
1.50
1.75
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CC
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0µg
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1.75
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24m FR
P-A
CC
/AC
C(3
0µg
de e
xtra
cto
tota
l)
Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. Efectos del envejecimiento y el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición, ensayados por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
B
A
Resultados
86
Finalmente se analizaron los niveles de expresión génica y proteica de proteínas
involucradas en la captura de glucosa, ácidos grasos y lípidos de las lipoproteínas,
teniendo en cuenta no solo el envejecimiento sino también el estado de alimentación.
En primer lugar, la figura 35 indica que después de 36 horas de ayuno no se
aprecian cambios significativos en los niveles de mRNA de los transportadores de
ácidos grasos y de glucosa CD36 y Glut4, con el envejecimiento. Sin embargo, los
niveles se incrementan significativamente con la restricción calórica tardía (Figura 36).
Por otra parte el tránsito ayuno-alimentación produce a los 3 y 8 meses de edad un
cambio significativo en la expresión de ambos transportadores en el tejido adiposo que
no se observa a los 24 meses de edad.
3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
2.5
5.0
7.5
a a
b
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3m AL 8m AL 24m AL 8m FR 24m FR0.0
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mR
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de
LRP
-1 e
n T
AE
c
Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. Efectos del envejecimiento y
el estado nutricional. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de
cada condición, ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas
entre tratamientos (p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
Resultados
87
Por otra parte y aunque al inicio de este trabajo se analizaron los cambios con
el envejecimiento de la enzima LPL y del receptor de lipoproteínas LRP-1 (Tabla 7), en
la figura 35 se observa que el tránsito ayuno-alimentación disminuye la expresión de
LPL pero aumenta significativamente la de LRP-1 en el tejido adiposo de ratas de 24
meses de edad, indicando una forma alternativa de capturar los lípidos provenientes
de la dieta que podría relacionarse con mayor re-esterificación solo en condiciones de
alta glucosa y/o nutrientes en sangre.
Por otra parte la figura 36 muestra los niveles proteicos de la enzima LPL. La LPL
está presente en el endotelio capilar del tejido adiposo y cataliza la hidrólisis de los
TAG de las lipoproteínas VLDL y quilomicrones. Nuestros resultados indican que la
lipoproteína lipasa (LPL) a nivel de expresión génica aumenta con el envejecimiento y
disminuye con la restricción calórica y la realimentación a 30 minutos (tabla 7, figura
35). Sin embargo, en cuanto a nivel de expresión proteica, ocurre lo contrario,
disminuye significativamente a los 24 meses de edad y aumenta con la restricción
calórica. Por último, en las 3 edades estudiadas se observa que 3 horas después de
iniciada la realimentación, aumentan los niveles proteicos de la LPL, indicando que la
acumulación de grasas en el tejido adiposo, en general, es un proceso que se activa en
un momento determinado para ser eficiente en estados postprandiales posteriores en
el tiempo.
Resultados
88
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR
AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R AY 30R 180R
3mAL 8mAL 24mAL 8mFR 24mFR0
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a
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ext
ract
o to
tal)
0 1 2 3 40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
24m ALLPL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
a
a
0 1 2 3 40.00
0.25
0.50
0.75
1.00 a
b
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LPL
(30µ
g de
ext
ract
o to
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0 1 2 3 40
1
2
a
b
c
24m FR
LPL
(30µ
g de
ext
ract
o to
tal)
Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal, y niveles de expresión
proteica de LPL en condición basal, tratadas con isoproterenol, y tratadas con isoproterenol e
insulina. Los resultados mostrados corresponden al estudio de 3-6 animales de cada condición,
ensayados por duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
(p<0.05). a= ay-re; b= envejecimiento; c= restricción calórica.
B
A
Resultados
89
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido adiposo
blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Teniendo en cuenta la importancia de la inervación del tejido adiposo blanco
para su correcta funcionalidad, en este capítulo abordamos los efectos de la infusión
ICV de leptina sobre la capacidad lipogénica y lipolítica del TAB.
Características biológicas de los animales.
Entre los efectos mejor descritos de la leptina está la reducción de la ingesta de
alimentos y del peso corporal. Los resultados de este experimento demuestraron que
en las ratas Wistar de 3 meses de edad con infusión central de leptina se produce una
disminución significativa de la ingestión de alimentos y del peso corporal así como de
los niveles de insulina en sangre con respecto al grupo PF (Gallardo y col, 2007;
Bonzón-Kulichenko y col, 2009, 2011). A continuación se abordará los efectos de la
leptina sobre la funcionalidad del tejido adiposo blanco.
3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo del tejido adiposo blanco
en ratas de 3 meses de edad. Papel del SNA en la transmisión de la señal de la
leptina.
Un aspecto importante de este trabajo consistió en demostrar que los efectos
de la infusión ICV de leptina sobre el metabolismo del tejido adiposo se producen de
forma indirecta, vía sistema nervioso autónomo y no se producen de forma directa (vía
receptor de la leptina en el TAB). Para ello llevamos a cabo 2 controles:
Tras la infusión icv de leptina, los niveles de leptina en el suero de los animales
tratados no se ven modificados (Tabla 9), lo que implica que los efectos observados
tras la realización de los experimentos con la hormona se deben a la actuación de la
hormona a través de los circuitos hipotalámicos y del sistema nervioso autónomo.
Resultados
90
Tabla 9. Niveles de leptina en suero de los animales tras el tratamiento icv con leptina.
TRATAMIENTO SS PF Lep
Leptina en suero (ng/mL) 5.9 ± 0.5 a 5.4 ± 1
a 5.2 ± 0.8
a
Los resultados constituyen la media ± SEM de 6 – 10 ratas por tratamiento. Anova seguido de
test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
En segundo lugar, utilizamos como control, la medida en extractos de TAB del
estado de activación de STAT-3, el cual es un factor de transcripción, que se fosforila
en residuos de tirosina en respuesta a la activación del receptor de leptina. Como
podemos observar en la Figura 37, la fosforilación en tirosina de STAT3 en el tejido
adiposo no se modifica tras el tratamiento ICV con leptina, lo que constituye otro
indicio de que los efectos de la leptina que se observan en este tejido se producen a
través del sistema nervioso central y no por las acciones directas de la leptina sobre
sus receptores en el tejido adiposo blanco.
SS PF Lep0
1
2
3
4
a a a
ST
AT
-3-P
Y /
ST
AT
-3(U
.A)
Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot representativo de STAT3. Los datos
constituyen la media ± SEM 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad del TAB y la sensibilidad a la
insulina. Resultados del test de tolerancia a glucosa.
Este ensayo se realizó con el objetivo de estudiar los efectos de la infusión
central de leptina sobre la sensibilidad global a la insulina, antes de continuar
profundizando en la influencia de la leptina sobre la capacidad lipogénica y lipolítica
del TAB.
SS PF Lep
STAT-3
p-tyr-STAT-3
Resultados
91
Los resultados demuestran que la administración central de leptina aumentó de
forma significativa la sensibilidad global a la insulina. Como se observa en la Figura 38,
tras la infusión intraperitoneal de un bolo de glucosa, los animales tratados con leptina
requirieron menos insulina para bajar los niveles sanguíneos de glucosa. El ratio AUC
insulina: AUC glucosa se utilizó como un indicador de la sensibilidad global a la insulina,
en este sentido, los valores significativamente más bajos que se observan en los
animales tratados con leptina, indican un incremento notable de la sensibilidad a la
insulina.
SS PF Leptina
AUC Insulina / AUC glucosa 0.026±0.008a 0.021±0.007a 0.006±0.003 b
Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal. Los resultados
constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa en respuesta a insulina por el
TAB.
Los resultados que aquí representamos (Figura 39A), demuestran que la
administración central de leptina disminuye la sensibilidad a insulina del tejido adiposo
blanco en relación con la captura de glucosa. Como se observa en la figura, el
tratamiento con leptina central reduce la respuesta a la insulina del tejido adiposo
perirrenal, resultados similares a los descritos por Bonzón-Kulichenko, Tesis Doctoral,
2007 para el tejido adiposo epididimal. De modo que durante el tratamiento con
Resultados
92
leptina, la insulina no promueve la captura de glucosa en ambos tipos de tejido
adiposo blanco, disminuyendo el contenido de grasa visceral (TAE + TAP) de los
animales tratados con leptina (Figura 39B).
Podemos apreciar también que los efectos de la leptina se producen a través
del sistema nervioso autónomo. Para demostrarlo realizamos la denervación del
sistema nervioso autónomo del tejido adiposo perirrenal. Como se observa en la figura
36A, la denervación bloquea los efectos inhibidores de la leptina sobre la captura de
glucosa por el tejido adiposo, en respuesta a la insulina.
PF PF+ins Lep Lep+ins Lep-d Lep-d+ins0
10
20
30 b
b
a a a
Cap
tura
de
[3H
]-2D
OG
por
el
TA
P (p
mol
2D
OG
/mg
tejid
o)
SS PF Lep0.0
2.5
5.0
7.5
c
ab
TA
E +
TA
P (
gram
os d
egr
asa
visc
eral
)
Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica del tejido adiposo. A: Test de
captura de glucosa comparado con el grupo PF, ya que el grupo tratado con SS no se muestra
en esta figura. Los resultados constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Anova
seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
(p<0.05). B: Contenido de grasa visceral (TAE+TAP) en los animales sometidos a tratamientos
ICV leptina o ICV salino. Los resultados constituyen la media ± SEM de 6 – 10 ratas por
tratamiento. Anova seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas
entre tratamientos (p<0.05).
A
B
Resultados
93
Tal y como se describió en el apartado de materiales y métodos, solo se
denervó un paquete adiposo, por esa razón, para confirmar la efectividad de la
denervación se pesaron ambos paquetes adiposos y se midió el contenido total de
norepinefrina en cada uno (inervado y denervado). Como se puede ver en la figura 40,
la denervación fue efectiva, ya que el lado denervado tiene más peso, tal y como se ha
descrito en la literatura (Kreier F y col., 2006). Por otra parte, los niveles de
norepinefrina en el paquete denervado, son significativamente menores que en el
paquete inervado por el sistema nervioso autónomo, lo que permite sugerir que, la
inervación del tejido adiposo blanco, a través del SNA y probablemente la vía
simpática, es necesaria para transmitir la señal de leptina hacia este tejido.
Intacto Denervado Intacto Denervado0.0
2.5
5.0
7.5
**
PF Lep
Pes
o de
TA
P (
g)
TAP inervado TAP denervado0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
a
ng N
E /
g d
e te
jido
Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de norepinefrina con la denervación. Los
resultados constituyen la media ± SEM de 3-4 ratas por tratamiento. Test T de student. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA.
La tabla 10 muestra el resultado de la denervación sobre la expresión de genes
del tejido adiposo blanco. Los datos indican que la denervación disminuyó los niveles
de mRNA del factor regulador de la transcripción PGC-1α y de la hormona lipolítica
HSL, que son indicadores de tono simpático y que intervienen en la estimulación de la
vía lipolítica en este tejido. En ese sentido es importante destacar que la expresión de
estos genes está significativamente disminuida en el tejido adiposo de ratas de 24
meses de edad en ayunas de 16 horas (datos no mostrados) y de 36 horas, lo que
Resultados
94
puede relacionarse con la disminución de la capacidad lipolítica de este tejido con el
envejecimiento.
Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con el tono simpático del tejido
adiposo.
GENES Inervado Denervado
HSL 1.0 ± 0.6 0.28 ± 0.05 a
PGC-1α 1.0 ± 0.09 0.8 ± 0.1 a
Los resultados constituyen la media ± SEM de 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido adiposo blanco por la
leptina a través del SNA.
La disminución de la capacidad lipogénica se estudió analizando la expresión de
genes implicados en la síntesis de TAG a partir de glicerol y ácidos grasos en estados de
bajos niveles de insulina y altos niveles de insulina. Para ello determinamos los niveles
de mRNA de la enzima GPDH (glicerol fosfato deshidrogenasa) y la PEPCK. (Tabla 11).
Como se puede observar la expresión de PEPCK, enzima que genera el glicerol-
3P en condiciones de ayuno (bajos niveles de insulina) para la esterificación de los
ácidos grasos se reduce significativamente con el tratamiento con leptina, mientras
que la expresión de GDPH, enzima que genera glicerol-3P en condiciones de
alimentación (altos niveles de insulina) para la síntesis de TAG, se reduce
significativamente cuando se suma el tratamiento de leptina e insulina (Tabla 11).
Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la síntesis de glicerol-3p y de TAG en
el tejido adiposo.
SS - INS SS + INS PF - INS PF + INS LEP - INS LEP + INS
GPDH 1.0±0.2 a 0.7±0.2
a 1.9±0.07
b 1.2±0.06
a 1.8±0.2
b 0.2±0.08
c
PEPCK 1.0±0.2 a 0.5±0.01
c 1.4±0.1
b 1.0±0.2
a 1.0±0.08
a 0.15±0.2
d
Los resultados constituyen la media ± SEM de 4 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco
regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las
enzimas LPL, ATGL y HSL.
La figura 41 muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).
Esta enzima se requiere para hidrolizar los TAG
de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como
se observa en la figura 41, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en
el tejido adiposo con respecto al grupo PF.
Exp
resi
ón p
rote
ica
deLP
L (1
00m
g de
ext
ract
oto
tal)
Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras e
resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey.
LPL
Β-Actina
Resultados
95
Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco
regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las
muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).
Esta enzima se requiere para hidrolizar los TAG-QM y los TAG-VLDL y para la liberación
de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como
, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en
el tejido adiposo con respecto al grupo PF.
SS – INS / PF – INS / LEP – INS
SS- PF- L-0.0
0.5
1.0
1.5
a a
b
Niveles proteicos de LPL en extracto total tras el tratamiento ICV con leptina.
resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Actina
Para estudiar los cambios en la funcionalidad del tejido adiposo blanco
regulada por la leptina a través del SNA, se analizaron los niveles de proteínas de las
muestra los niveles proteicos de la enzima lipasa lipoproteica (LPL).
VLDL y para la liberación
de la AG en el tejido adiposo blanco que serán almacenados en forma de TAG. Como
, el tratamiento con leptina disminuye el contenido de LPL en
l tratamiento ICV con leptina. Los
resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del
blanco por la leptina.
Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la
leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco
(Gallardo y col, 2007). En este trabajo determinamos,
de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como po
observar en las figuras 42
significativamente por la acción de la leptina.
SS- PF-0
1
2
3
a
Niv
eles
de
mR
NA
de
ATG
L en
TA
E
Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.
Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
a –Ins y al control PF-Ins respectivamente.
Resultados
96
Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del
Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la
leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco
En este trabajo determinamos, además, los niveles de mRNA y
de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como po
observar en las figuras 42 los niveles de mRNA y proteína de la ATGL, aumentan
significativamente por la acción de la leptina.
SS – INS / PF – INS / LEP
Lep-
a,b
ATGL
SS- PF-0.0
0.5
1.0
1.5
aa
Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.
Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
Ins respectivamente.
ATGL
Β-Actina
Incremento del tono simpático y de la capacidad lipolítica del tejido adiposo
Datos de la literatura y de la primera parte del estudio de los efectos de la
leptina ICV, indican que la leptina incrementa la lipolisis del tejido adiposo blanco
además, los niveles de mRNA y
de proteína de algunas enzimas implicadas en el proceso de lipólisis. Como podemos
los niveles de mRNA y proteína de la ATGL, aumentan
INS / LEP – INS
L-
b
Niveles de expresión génica y proteica de ATGL tras el tratamiento ICV con leptina.
Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova seguido de test
Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05) respecto
Resultados
97
Además en la figura 43 se observa que la disminución de la ingesta tanto en el
grupo PF como leptina produjo un incremento significativo en la masa de la enzima
HSL. Sin embargo el tratamiento con leptina incrementó significativamente los niveles
de la forma fosforilada en serina 565 de HSL, indicando que a largo plazo el aumento
de la señalización de la leptina sobre el tejido adiposo, a través del SNA, produce
inactivación de la enzima HSL, probablemente como mecanismo protector de las
reservas energéticas del organismo.
SS – INS / PF – INS / LEP – INS
SS- PF- L-0.0
0.5
1.0
1.5
Rel
ació
n P
-565
HS
L/H
SL
(100
mg
Ext
.tota
l)
a
b
a
Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido adiposo tras el tratamiento ICV
con leptina. Los resultados constituyen la media ± SEM de 3 ratas por tratamiento. Anova
seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
(p<0.05) respecto a –Ins y al control PF-Ins respectivamente.
DISCUSIÓN
Discusión
99
4- DISCUSIÓN.
Como es bien sabido, el envejecimiento es un problema que nos atañe a todos,
el cual es ineludible, y provoca un deterioro progresivo del organismo, desde aumentar
la tasa de mortalidad de una especie una vez alcanzada la edad adulta, pasando por
modificar la composición bioquímica de ciertos tejidos llegando incluso a perder su
funcionalidad, y disminuyendo la capacidad de adaptación a un entorno, provocando
por tanto una mayor vulnerabilidad a las enfermedades. Por ello, hemos optado por
estudiar el comportamiento y la evolución del tejido adiposo con el envejecimiento,
puesto que tiene funciones determinantes en el mantenimiento de la homeostasis de
energía en los organismos vivos.
Por otro lado, también se decidió incluir en los experimentos el factor
producido por una restricción calórica, y los efectos que ella podría conllevar sobre el
organismo, ya que desde hace más de 70 años se sabe que la restricción calórica
retarda el envejecimiento y por lo tanto, incrementa el tiempo de vida del individuo.
Otra consecuencia de la restricción calórica es un aumento en la calidad de vida, ya
que un organismo que se somete a una dieta baja en calorías obtiene una disminución
de las enfermedades propias del envejecimiento.
Como en esta tesis se discuten las alteraciones del metabolismo y sabiendo que
los niveles tanto hormonales como de los diferentes metabolitos varían en función de
si el individuo se encuentra en un estado de ayuno, o en un estado post-prandial,
también se decidió incluir el ciclo de ayuno-realimentación en este trabajo.
La relación entre la diabetes mellitus y la adiposidad se discute en la literatura
científica desde hace más de 40 años. La diabetes mellitus y la obesidad pueden
asociarse con la resistencia a las acciones de la insulina en humanos y en roedores. En
la actualidad la resistencia a la insulina se observa en individuos con diabetes tipo 2 y
además en individuos con diabetes tipo 1 y obesidad. Se conoce que realmente, la
resistencia a la insulina resulta evidente cuando la adiposidad se acompaña de
hiperinsulinemia (Porte Jr D y col., 1970).
Discusión
100
Al analizar las características generales de los animales sometidos a objeto de
estudio en este trabajo se corroboran los resultados publicados por nuestro grupo de
trabajo en diferentes ocasiones: el envejecimiento en la rata Wistar no conduce a
alteraciones de la glucemia y la insulinemia en ayunas, de este modo cuando se calcula
el índice HOMA (un indicador de resistencia a la insulina) no se observan
modificaciones que sean significativas desde el punto de vista estadístico en las ratas
de 24 meses de edad. Sin embargo, estos animales incrementan la adiposidad con la
edad y aunque son tolerantes a la glucosa, exhiben alteraciones de la sensibilidad
global a la insulina, cuando se someten a un test de tolerancia oral a glucosa y a un
clamp euglicémico-hiperinsulinémico, resistencia a la insulina que se manifiesta a
partir de los 8 meses de edad y que se desarrolla inicialmente en el tejido adiposo.
(Villar. M y col., 2006.; Escrivá F y col., 2007; Serrano R y col., 2009).
Sin embargo, para ampliar el conocimiento de la funcionalidad del tejido
adiposo y de los mecanismos que generan un estado de resistencia a la insulina con el
envejecimiento, se consideró interesante realizar un test oral de tolerancia a grasas y
por otra parte estudiar los efectos de un ayuno de 36 horas y el paso al estado de
alimentación.
Se conoce que en los minutos iniciales del estado postprandial (después de la
alimentación) se elevan en sangre los TAG en forma de TAG-QM. La vía de distribución
de estas lipoproteínas (primero conducto torácico y después circulación sanguínea)
permite descargar gran parte de los AG de los TAG de la dieta en los tejidos
extrahepáticos, entre ellos el tejido adiposo blanco. Durante el período postprandial, el
hígado sintetiza lípidos a partir de glucosa y exporta VLDL. Los TAG-LP (QM y VLDL) son
capturados y procesados por el tejido adiposo y los músculos esqueléticos. En el tejido
adiposo se esterifican al glicerol-P para formar TAG. La actividad de la enzima LPL
asociada a los capilares de estos tejidos (adiposo y muscular) así como la actividad de
los receptores de lipoproteínas LRP-1 (LDL receptor protein related-1) y LDL,
vinculados con el tejido adiposo y el hígado juegan en ello un papel fundamental.
La LPL es una enzima multifuncional producida por muchos tejidos como el
tejido adiposo, el corazón, los músculos esqueléticos, los macrófagos, que juega un
Discusión
101
papel clave en la distribución de los AG y MAG derivados de las lipoproteínas
enriquecidas en TAG, los QM y las VLDL hacia los tejidos periféricos donde se
almacenan como lípidos neutros en el tejido adiposo y los macrófagos (TAG y ésteres
de colesterol) y se oxidan o almacenan como TAG en los músculos y el corazón. (Wang
H y col., 2009).
La forma LRP-1 del receptor de LDL se expresa en muchos tejidos, incluyendo el
hígado que es el sitio fundamental de aclaramiento de los remanentes de
quilomicrones. Se ha descrito que ratones deficientes del receptor LRP-1 en tejido
adiposo tienen deficiencias en la captura de TG-LP en estado postprandial, fenotipo
obeso, disminución del gasto energético y de la lipolisis del tejido adiposo. Por otra
parte ratones deficientes del receptor de lipoproteínas LRP-1 en cerebro demuestran
que LRP-1 regula la señal de leptina y la homeostasis de energía en el sistema nervioso
central. (Hofmann SM y col., 2007; Masson O y col., 2009; Liu Q y col.,2011).
En el trabajo que aquí se presenta se muestran resultados que indican que en
las ratas de 8 y 24m al consumir un bolo de grasas se elevan significativamente los TAG
y NEFA circulantes. Estos resultados apuntan a que con el envejecimiento disminuye la
capacidad del tejido adiposo blanco de almacenar la grasa exógena ya sea la
suministrada durante el test de tolerancia a grasa como la contenida en el pienso
normal de laboratorio que consumen ad limitum ya que en ambos casos, 30 minutos
después de la ingestión, el suero de las ratas de 24 meses de edad exhibe niveles
extraordinariamente elevados de TAG plasmáticos. En el caso de la ingestión de
grasas, los niveles de TAG y NEFA continúan aumentando hasta los 180 minutos
durante la carga oral de grasas, a partir de 180 minutos comienzan a disminuir y no
llegan a alcanzar los niveles basales a los 240 minutos de la carga oral, que podemos
considerar el final de un estado postabsortivo, teniendo en cuenta que la insulina ya ha
alcanzado los niveles basales. Situación similar se observa para los NEFA.
Los resultados de este trabajo indican que los niveles de mRNA de LPL están
incrementados con la edad, aunque no se observa el mismo comportamiento con los
niveles de proteína. El incremento de expresión de LPL es un indicador de disminución
de tono simpático basal del tejido adiposo, ya que la LPL disminuye su expresión en
Discusión
102
respuesta a la estimulación simpática. Igualmente son indicadores de bajo tono
simpático la disminución de expresión de HSL y PGC-1α en este tejido (J Gómez-
Ambrosi y col, 2001; Hatakeyama y col., 2004). Además de la participación de la LPL,
para la captura de los ácidos grasos y de los TAG y ésteres de colesterol de las
lipoproteínas plasmáticas es importante la participación de los receptores LRP-1 (LDL
receptor protein related-1), en este trabajo se observó una disminución en la
expresión de LRP-1 con el envejecimiento. Estos resultados en conjunto, reflejan una
disfunción del tejido adiposo visceral, en relación con el aclaramiento de las
lipoproteínas plasmáticas en el estado de ayuno.
Sin embargo, en todos los animales estudiados (3-, 8- y 24-meses) observamos
que 30 minutos después de iniciar la realimentación después de un ayuno prolongado,
disminuyen significativamente los niveles de mRNA y de proteína de la LPL en el tejido
adiposo. En este sentido, podríamos sugerir que la regulación transcripcional de esta
enzima se inicia en el estado postprandial, primero tiene lugar la desregulación,
mediada probablemente por beta-adrenérgicos que estimularían la actividad de la
enzima en los músculos para después incrementar los niveles de mRNA en tejido
adiposo 3 horas más tarde en el estado postabsortivo. La insulina sería la hormona
responsable de regular la correcta actividad de la LPL en los capilares del tejido
adiposo blanco. Podría pensarse que en las ratas viejas, hay resistencia a la insulina en
las células del tejido endotelial que sumado a la resistencia a la insulina del tejido
adiposo y de algunos músculos mantiene significativamente elevados los niveles de
TAG-QM respecto a animales de 3 meses de edad. Cuando se trata de la infusión del
bolo de grasa empeora aún más el perfil lipídico del suero de los animales de 24-meses
de edad.
En el caso de LRP-1 se produce un incremento drástico de su expresión en ratas
de 24 meses en el tránsito ayuno-alimentación, demostrando que en estado
postprandial se incrementa en el tejido adiposo de ratas viejas la capacidad de
internalizar lipoproteínas plasmáticas.
Discusión
103
Los estados de resistencia a la insulina se han asociado generalmente a niveles
incrementados de NEFA así como de insulina en sangre. Por una parte la
hiperinsulinemia se considera el resultado de la resistencia a la insulina de los tejidos
periféricos, y niveles altos de NEFA circulantes se asocian al aumento de la lipólisis del
tejido adiposo. (Langin D, 2006; Shulman GI y col., 2000; Wajchenberg BL, 2000). Sin
embargo, un resumen detallado de estudios desarrollados en humanos obesos entre
1990-2008 revela que la concentración de NEFA en plasma varía mucho entre
individuos e individualmente en diferentes situaciones (ayuno, realimentación, género,
dieta, etc) y no se correlaciona con la masa de tejido adiposo ni el índice de masa
corporal. (Karpe F y col., 2011). En el caso de la rata Wistar, se conoce que incrementa
su masa adiposa con el envejecimiento y presenta situaciones de hiperinsulinemia en
estado postprandial. Estos momentos de hiperinsulinemia podrían disminuir la
liberación de AGL por el tejido adiposo ya que los estudios de lipolisis en explantes
demuestran que predominan los efectos antilipolíticos de la insulina sobre los efectos
lipolíticos del isoproterenol en el tejido adiposo de ratas de 24 meses de edad.
La hiperglucemia en ayunas también es señal de resistencia a la insulina. En
este trabajo se presentan datos que apuntan a que en el estado postabsortivo la
glucemia se eleva de forma significativa en las ratas viejas, señal de incremento de
glucagón, descenso de insulina y falta de regulación de la producción hepática de
glucosa. Como en el estado postabsortivo más del 80% de la glucosa plasmática
proviene del hígado, está claro que la carga de lípidos produce resistencia hepática a la
insulina. Por lo tanto, los animales viejos son más susceptibles de desarrollar
enfermedades metabólicas derivadas de la resistencia a la insulina que los jóvenes. Sin
embargo, es posible que la leptina esté favoreciendo la homeostasis de glucosa y
lípidos de modo que muchos animales envejecen en estado prediabético.
En este sentido los resultados del test de tolerancia a grasas demuestran que
en las ratas de 24 meses de edad, los niveles de insulina aumentan de forma
significativa tras la infusión del bolo de grasa, comenzando el incremento a los 30
minutos de infundir el bolo y duplicando, a los 60 minutos, los valores observados en
animales de 3 y 8 meses de edad. En las ratas de 8 meses de edad, a pesar de
presentar niveles superiores de TAG y NEFA con respecto a las de 3 meses de edad,
Discusión
104
pasadas 4 horas exhiben valores similares de glucemia, insulinemia, TAG y NEFA que
las ratas de 3 meses de edad. Sin embargo, las ratas de 24 meses de edad pasadas las 4
horas presentan hiperglucemia y niveles superiores a los basales de TAG y NEFA. Al
calcular el área bajo la curva tanto para los NEFA como para los TAG se observan
valores incrementados desde los 8 meses de edad. De modo que podemos afirmar que
la rata Wistar desarrolla intolerancia a los lípidos hiperlipemia, resistencia a la
capacidad de la insulina de mantener la homeostasis de los lípidos y como resultado de
ello hiperinsulinemia antes que se manifieste la incapacidad de la insulina de mantener
la homeostasis de la glucosa.
Además podemos afirmar que la resistencia a la insulina asociada al
envejecimiento en la rata Wistar, resulta evidente, después de ingerir un bolo de
grasa, ya que se produce hiperinsulinemia seguida de hiperglucemia. Este
razonamiento refuerza la importancia de la correcta funcionalidad del tejido adiposo
para la adecuada acción de la insulina de todo el organismo durante toda la vida. El
exceso de tejido adiposo puede tener consecuencias adversas fundamentalmente si se
alteran las actividades endocrinas e inmunológicas de este tejido. (Bays HE y col.,
2008). Realmente, la resistencia a la insulina resulta evidente cuando la adiposidad se
acompaña de hiperinsulinemia (Porte Jr D y col., 1970).
También se ha planteado en la literatura que la inanición, como tratamiento de
la obesidad, exacerba la resistencia a la insulina de los individuos obesos. (Bray GA,
1969). La introducción de un ayuno prolongado en el diseño de este trabajo nos ha
permitido demostrar que en la rata Wistar de 24 meses de edad, al igual que sucede
en humanos obesos, el ayuno prolongado (36 horas) aumenta la resistencia global a la
insulina. En este sentido, observamos que el ayuno prolongado incrementa
aproximadamente 5 veces los niveles de insulina en sangre de los animales de 24-
meses de edad, con respecto a los animales de 3-meses de edad.
Según (Arner y col, 1981), la inanición incrementa la sensibilidad a la insulina de
determinados paquetes de tejido adiposo, por ejemplo, el tejido adiposo femoral pero
no del abdominal. Por otra parte la obesidad disminuye la respuesta a la insulina del
tejido adiposo abdominal pero no afecta al femoral.
Discusión
105
En humanos y en roedores, la hiperinsulinemia y la hiperglucemia en ayunas
son considerados estados prediabéticos (Bloomgarden ZT, 2008). La diabetes se
desarrolla cuando la secreción de insulina no es suficiente para compensar la
resistencia a la hormona. Los individuos que no son capaces de secretar suficiente
insulina para compensar la resistencia a insulina inducida por AGL (probablemente por
razones genéticas) terminan desarrollando T2DM. (Terauchi Y y col., 2007). La
diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina y disfunción de las células
beta del páncreas. (Kahn SE, 2003).
El término prediabetes se emplea cuando, en presencia de resistencia a la
insulina, se produce más insulina para evitar la diabetes. Pero esta situación está
relacionada con hiperglucemia en ayunas y/o intolerancia a la glucosa. La rata Wistar
no desarrolla intolerancia a la glucosa pero son resistentes a insulina (Escrivá, 2007),
en este caso, el defecto reside en la deficiente captura de glucosa en respuesta a la
insulina, por los tejidos insensibles a la acción de la hormona (tejido adiposo y en
segundo lugar algunos músculos). La resistencia periférica a la insulina es lo que
caracteriza también a individuos con intolerancia a la glucosa, mientras que la
resistencia hepática a la insulina, caracteriza a individuos con hiperglucemia en ayunas.
Podemos sugerir que el envejecimiento conduce a un estado de resistencia a la
insulina que en situaciones especiales, en las que se modifica la demanda energética, a
la alza o a la baja, puede producir hiperinsulinemia en ayunas (36h ayuno) e
hiperglucemia después de una sobrecarga de lípidos (4h después de SOG), que
correspondería a un estado postabsortivo. Como en el estado postabsortivo más del
80% de la glucosa plasmática proviene del hígado, está claro que la carga de lípidos
produce resistencia hepática a la insulina. Por lo tanto, los animales viejos son más
susceptibles de desarrollar enfermedades metabólicas derivadas de la resistencia a la
insulina que los jóvenes. Sin embargo, es posible que la leptina esté favoreciendo la
homeostasis de glucosa y lípidos de modo que muchos animales envejecen en estado
prediabético.
Discusión
106
Sin embargo, en todos los animales estudiados (3-, 8- y 24-meses) observamos
que 30 minutos después de iniciar la realimentación después de un ayuno prolongado,
disminuyen significativamente los niveles de mRNA y de proteína de la LPL en el tejido
adiposo.
En este sentido, podríamos sugerir que la regulación transcripcional de esta
enzima se inicia en el estado postprandial, primero tiene lugar la desregulación,
mediada probablemente por beta-adrenérgicos que estimularían la actividad de la
enzima en los músculos para después incrementar los niveles de mRNA en tejido
adiposo 3 horas más tarde en el estado postabsortivo. La insulina sería la hormona
responsable de regular la correcta actividad de la LPL en los capilares del tejido
adiposo blanco. Podría pensarse que en las ratas viejas, hay resistencia a la insulina en
las células del tejido endotelial que sumado a la resistencia a la insulina del tejido
adiposo y de algunos músculos mantiene significativamente elevados los niveles de
TAG-QM respecto a animales de 3 meses de edad. Cuando se trata de la infusión del
bolo de grasa empeora aún más el perfil lipídico del suero de los animales de 24-meses
de edad.
El siguiente factor a tener en cuenta es el receptor nuclear PPARg. Se conoce
que PPARγ estimula la expresión del gen de LPL en el tejido adiposo y la captura de AG
por el tejido (Schoonjans y col., 1996; Semple y col., 2006). Con el envejecimiento no
se observan cambios en los niveles proteicos de PPARγ, sin embargo, estos niveles se
incrementan a las 3 horas de iniciada la realimentación o sea en el estado
postabsortivo. De este modo, podría colaborar en la acumulación de la grasa en el TAB
mecanismo que podría activarse de forma retardada, favoreciendo inicialmente la
entrada de la grasa a los músculos, el hígado y el corazón y que prepara tardíamente al
tejido adiposo para guardar el exceso de grasa que posiblemente provenga de una
comida posterior. Estos resultados preliminares van en la misma dirección descrita por
el grupo de Labbé SM y col. en el año 2011.
La captura de AG y su esterificación al glicerol para formar TAG en el TAB es un
proceso que requiere en paralelo de la captura de glucosa y su transformación en
glicerol-3P. Resultados previos del grupo han demostrado que con el envejecimiento
Discusión
107
en la rata Wistar, disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina, aunque
está incrementada la captura basal. Esto podría explicar que durante los primeros 30
minutos no se produzca la adecuada hidrólisis de los TAG-QM y no se estimule la
entrada de NEFA a los adipositos y su esterificación con glicerol-3P, por la menor
capacidad de las células de responder a la insulina y de capturar y transformar la
glucosa. Transcurridas 3 horas, ya en estado postabsortivo, el proceso que debe
predominar es el de síntesis de novo de glicerol y de ácidos grasos para formar TAG y
PL. Este proceso de reesterificación parece estar favorecido en el tejido adiposo de
ratas viejas (Escrivá y col, 2007) y podríamos añadir que el lactato puede ser el
precursor de glicerol (gliceroneogénesis) en estas condiciones. En este sentido es
importante destacar que durante el experimento de lipolisis en el medio de incubación
de los explantes el lactato se incrementa a los 30 minutos (probablemente como
resultado de la oxidación incompleta de la glucosa) pero disminuye a las 3 horas.
Retomando el tema de la captura de glucosa y con el objetivo de profundizar en
la capacidad del TAB de las ratas viejas de responder a la insulina incrementando la
lipogénesis, analizamos los niveles de mRNA de factores de transcripción y enzimas de
la vía lipogénica. Los resultados que aquí se presentan nos permiten afirmar que con el
envejecimiento disminuye la capacidad lipogénica del TAB, inicialmente porque
disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina y en segundo lugar porque
disminuye de forma significativa la expresión de ChREBP y de sus genes diana, ACC y
FAS.
La funcionalidad del tejido adiposo es fundamental para la homeostasis de la
glucosa, los lípidos (Scherer T. y col, 2011). La disminución de la síntesis de novo de AG
en el TAB disminuye la síntesis y liberación del palmitoleato, una especie de ácido
graso con efectos sensibilizantes a la insulina (Scherer T. y col, 2011). En efecto, en el
plasma de las ratas viejas se observan una tendencia a tener niveles inferiores de este
ácido graso (4.34 ± 0.1 en ratas de 3m vs 3.0 ± 0.5 en ratas de 24m DATOS NO
MOSTRADOS). La disminución de la síntesis de novo de AG se asocia a resistencia a la
insulina. No obstante, a los 30 minutos de la realimentación no se observan cambios
en la expresión de ChREBP, factor que está regulado fundamentalmente por glucosa.
Discusión
108
Gran parte de los estudios realizados en esta tesis iban dirigidos a analizar los
cambios en la capacidad lipolítica del tejido adipsoso con el envejecimiento. La lipólisis
es el proceso de hidrólisis de los TAG almacenados en los diferentes depósitos grasos
del organismo para liberar NEFA y glicerol. Aunque se conocen muchos aspectos de la
bioquímica de la lipólisis, los mecanismos que estimulan este proceso y los que utiliza
la insulina para inhibirlo no se están totalmente esclarecidos. Algunos trabajos
sugieren que la función de la insulina en humanos es la de controlar la lipólisis basal
(Jocken JW y col., 2007). Así como que la lipólisis basal está elevada mientras que la
inducida por catecolaminas está suprimida en humanos y roedores obesos. La lipólisis
en humanos y roedores está regulada por las enzimas: ATGL, HSL y MGL.
No obstante, en condiciones normales, se observa en el tejido adiposo de ratas
viejas disminución del tono simpático (menor expresión de HSL y PGC-1α). Debemos
comenzar el análisis de la lipólisis en el envejecimiento destacando que la expresión de
HSL y de PGC-1α está significativamente disminuída en el TAB de las ratas viejas. Bajos
niveles de expresión de HSL y PGC-1α demuestran bajo tono de los nervios simpáticos
que inervan el tejido adiposo (Gómez-Ambrosi y col, 2001; Hatakeyama y col., 2004).
La LPL del TAB se desregula por estimulación simpática a través de receptores
b-adrenérgicos. Además, la expresión de la enzima limitante del proceso lipolítico, la
ATGL, también está disminuída en un 50% en el TAB de la rata vieja. Para corroborar
que es la disminución del tono simpático lo que disminuye la capacidad lipolítica del
TAB analizamos el estado de activación del factor regulador de la transcripción CREB,
que se activa por la enzima PKA, la quinasa que se estimula por incremento del tono
simpático. Los resultados que aquí se muestran indican que a los 24m los niveles de
CREB son significativamente inferiores a los de animales jóvenes. Sin embargo están
incrementados los niveles de la AQP7, un canal de glicerol que puede favorecer la
salida y entrada de este metabolito a la célula, tejido en el que la expresión de glicerol
quinasa es baja.
Sin embargo, los niveles de perilipina no se modifican con el envejecimiento.
Por esa razón estudiamos mediante fraccionamiento celular el movimiento de
proteínas y enzimas lipolíticas entre diferentes fracciones subcelulares, incluyendo la
Discusión
109
gota lipídica. En nuestras manos, en las ratas viejas está disminuída la lipolisis basal así
como la lipolisis mediada por el SNA.
Es interesante destacar que los niveles proteicos de ATGL y de HSL aumentan
de forma significativa a las 3h del inicio de la realimentación, es decir previo al estado
de ayuno, para garantizar la lipólisis basal de los TAG almacenados en el tejido
adiposo. En ayuno prolongado, la inhibición de la lipólisis por la insulina no aumenta
cuando se añaden agentes lipolíticos e insulina. Según los resultados de los estudios
realizados en los explantes a los 8m predomina el efecto del ISO sobre la hidrólisis de
los TAG en ayunas y durante la realimentación. A los 24m en ayuno prolongado
predomina el efecto antilipolítico de la insulina. Después de 30 minutos de
realimentación se bloquean los efectos de ISO, probablemente porque predomina el
efecto antilipolítico de la insulina.
Los lípidos se almacenan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica,
sin embargo los estudios en gota lipídica son escasos, de hecho se piensa que se forma
a partir del retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. No
obstante nos planteamos como hipótesis de trabajo la siguiente: Con la edad se
producen cambios en la composición y metabolismo de la gota lipídica en el tejido
adiposo blanco. Estos cambios van a estar relacionados con desórdenes del
metabolismo energético como la obesidad y la esteatosis hepática.
En este trabajo analizamos los niveles de determinadas proteínas que de alguna
manera están relacionadas con los procesos que tienen lugar en la superficie de la gota
lipídica, la formación de la gota lipídica y la hidrólisis de los lípidos almacenados en la
gota lipídica. El estudio lo hemos realizado en animales de diferentes edades en estado
de ayuno y alimentación.
Los resultados de nuestro trabajo nos permiten corroborar que en la medida en
que los animales envejecen se mantiene la homeostasis de la glucosa pero se pierde la
capacidad de controlar la liberación de TAG-VLDL por el hígado. Sin embargo los
niveles circulantes basales de NEFA y glicerol no se modifican con el envejecimiento, lo
cual podría ser interpretado como una correcta señalización de la insulina
Discusión
110
A la vista de los resultados que aquí se presentan podríamos afirmar que a
partir de los 8 meses de edad los animales requieren más insulina para capturar
glucosa y ácidos grasos libres y provenientes de los TAG-QM y TAG-VLDL, además de
glucosa como se ha descrito con anterioridad (Escrivá y col, 2007). Como los niveles
circulantes de glucosa y NEFA no se alteran, la insulina consigue mantener niveles
normales de dos metabolitos conocidos por producir glucotoxicidad así como
lipotoxicidad y lipoapoptosis.
Se ha acuñado el término lipotoxicidad para describir el efecto dañino que
provoca la elevación crónica de los AGL sobre la secreción de insulina en las células b
del páncreas y otros tejidos. Se plantea que el exceso de lípidos promueve la
formación de especies lipídicas químicamente reactivas que alteran la funcionalidad
metabólica de las células, conduce a la muerte celular y por consiguiente al deterioro
de los órganos y tejidos (Unger RH y col., 2001; Kusminski CM y col., 2009; Unger RH y
col., 2010; Vidal-Puig A y col., 2010). De modo que la homeostasis de glucosa y NEFA
en la rata Wistar, se mantiene a costa de transformarles respectivamente en TAG, una
clase de lípidos menos activa y perjudicial. En este sentido, la elevación de los niveles
circulantes de TAG a la edad de 8 meses es ya un indicador de acumulación de lípidos
en tejidos no adiposos (corazón, hígado, músculos esqueléticos, páncreas) por falta de
funcionalidad de determinados paquetes de tejido adiposo blanco.
Esta compensación fisiológica puede no funcionar en situaciones
comprometidas, cuando la demanda de energía es diferente al estado basal. Por
ejemplo después de la SOG la hiperinsulinemia no evita la aparición de hiperglucemia
en estado postabsortivo en la rata vieja. Por otra parte, después de 36 horas de ayuno,
una situación que incrementa la hidrólisis de los TAG del tejido adiposo, se observa
hiperinsulinemia en las ratas de 24m. En paralelo se observan valores de glucemia
ligeramente superiores a los que presentan animales de 3 y 8 meses de edad. Los
niveles de TAG se mantienen elevados pero no aumentan los de NEFA, que son
inferiores a los observados a los 3m.
Discusión
111
Estos resultados implican que: 1- En la rata vieja el tejido adiposo responde
peor al estrés del ayuno, liberando menos NEFA o que el bloqueo de la lipólisis por la
insulina, en la rata Wistar, se consigue con menos cantidad de insulina. 2- En la rata
vieja está afectado el eje hipotálamo-tejido adiposo. 3- El bloqueo de la liberación de
glucosa en la rata Wistar requiere mayor cantidad de insulina que el bloqueo de la
lipólisis del tejido adiposo.
Los resultados del experimento indican que los niveles de glucosa y TAG
tienden a aumentar en las ratas viejas respecto a los valores observados en ratas de
3m ayunadas. Sin embargo, los niveles de NEFA son superiores a los 8m respecto a 3m
y 24m. Se ha sugerido que la sensibilidad a la insulina y la lipólisis basal en humanos,
están estrechamente vinculadas tanto cuando la lipólisis es normal como cuando está
acelerada como ocurre con la obesidad y la diabetes (Arner and col, 1981) y que en
este mecanismo deben intervenir acciones que tienen lugar a nivel del receptor de
insulina y acciones que tienen lugar tras el receptor de insulina.
Por otra parte, estos autores observan que la inhibición de la lipólisis basal por
la insulina no aumenta cuando se incrementa la lipólisis basal mediada por
noradrenalina (NA), por el hecho de que cuando se incuba el tejido adiposo con NA u
otro agente lipolítico, la hidrólisis de los TAG no es completa y se acumulan DAG y
MAG, mientras que en la lipólisis basal, la hidrólisis de los TAG es completa a AGL y
glicerol. Además cuando se aíslan adipocitos, el tratamiento con colagenasa altera la
lipólisis basal y los efectos de las catecolaminas y de la insulina. Cuando se incuban los
explantes con dosis altas de insulina, la lipólisis basal disminuye pero la estimulada por
NA aumenta. Por esa razón se realizó un estudio de la lipólisis exvivo, empleando
explantes de tejido adiposo visceral que fueron incubados un período de tiempo de 3h
con el agente lipolítico isoproterenol. Además de haberlo realizado en adipocitos.
Los resultados muestran que los efectos antilipolíticos de la insulina disminuyen
a los 8m, pero no están alterados a los 24m. Cuando se incuban los explantes de tejido
adiposo de ratas con ISO la lipólisis, medida a través de la liberación de glicerol,
aumenta y cuando se incuban con ISO más dosis altas de insulina, la lipólisis basal
disminuye pero la estimulada por ISO aumenta a los 8 meses de edad. Resultados
Discusión
112
similares se han encontrado en estudios realizados en humanos (Arner and col, 1981),
y en ratas (Desai KS y col., 1973). Se ha sugerido que la sensibilidad a la insulina y la
lipólisis basal en humanos, están estrechamente vinculadas tanto cuando la lipólisis es
normal como cuando está acelerada como ocurre con la inanición, la obesidad y la
diabetes (Arner and col, 1981), sin embargo estos autores sugieren que los efectos
antilipolíticos de la insulina no son los que median la resistencia a la insulina en la
obesidad.
Con el envejecimiento la rata Wistar desarrolla resistencia global a la insulina y
disminución de la captura de glucosa en respuesta a la insulina en primer lugar en el
tejido adiposo blanco. En situación de ayuno prolongado, que se ha asociado
normalmente a incremento de la lipólisis, nuestros datos indican que, en las ratas
viejas aumentan los niveles circulantes de insulina y no se incrementa la lipólisis. En
este sentido las acciones antilipolíticas de la insulina no parecen estar alteradas en las
ratas viejas de 24m, ya que en situación de hiperinsulinemia (ayuno 36h), los niveles
de glicerol en los medios de incubación de los explantes son inferiores a los
observados en ratas de 3m y de 8m. En esas condiciones además, los niveles proteicos
de las hormonas HSL y ATGL disminuyen con el envejecimiento.
Nuestros resultados corroboran la hipótesis planteada por Arner y col, 1981
pero aplicado al envejecimiento, sugerimos que los efectos antilipolíticos de la
hiperinsulinemia bloquean la lipólisis y no aceleran la resistencia a la insulina durante
el envejecimiento. Ya que la señalización temprana de insulina es similar en las ratas
de 8- y 24-meses ( ), los resultados indican la participación de algún factor
autocrino/paracrino del TAB visceral en la potenciación del efecto anti-lipolítico de la
insulina con el envejecimiento, lo que podría contribuir al incremento en la adiposidad
observada en estos animales con la edad.
La lipolisis basal y la expresión de los genes lipolíticos como HSL y ATGL se
incrementan de forma significativa en las ratas sometidas a restricción calórica y se
inducen en la transición ayuno-realimentación en las ratas alimentadas ad-libitum
mientras que se inhibe en las ratas con restricción nutricional, lo que sugiere una
Discusión
113
adaptación metabólica diferencial en la regulación de las reservas energéticas del
tejido adiposo visceral.
Cuando los animales son realimentados y por consiguiente se incrementan los
niveles de insulina en sangre a los 30 minutos de la realimentación, el glicerol continúa
elevado en sangre. A las 3 horas, los niveles de insulina de las ratas de 24m son
significativamente superiores a los observados en las ratas de 8m. En efecto la
inanición exacerba el estado prediabético en las ratas viejas. Las ratas viejas son
prediabéticas. El término prediabetes se emplea cuando, en presencia de resistencia a
la insulina, se produce más insulina para evitar la diabetes. Pero esta situación está
relacionada con hiperglucemia en ayunas y/o intolerancia a la glucosa. La rata Wistar
no desarrolla intolerancia a la glucosa pero son resistentes a insulina (Escrivá, 2007),
en este caso, el defecto reside en la deficiente captura de glucosa en respuesta a la
insulina, por los tejidos insensibles a la acción de la hormona (tejido adiposo y en
segundo lugar algunos músculos). La resistencia periférica a la insulina es lo que
caracteriza también a individuos con intolerancia a la glucosa, mientras que la
resistencia hepática a la insulina, caracteriza a individuos con hiperglucemia en ayunas
(Abdul-Ghani, 2006).
La disfunción del TAB juega un importante papel en la patogénesis de la
obesidad y de la diabetes tipo 2 y hemos indicado hasta el momento que la
disfuncionalidad del tejido adiposo con el envejecimiento podría estar mediada por
una menor inervación del sistema nervioso autónomo. Para demostrar la importancia
de la inervación autonómica y de la correcta señalización central de la leptina, una
adipoquina que regula la actividad del SNA, se finalizó la tesis estudiando los efectos
de la leptina y la denervación sobre la regulación del metabolismo del tejido adiposo
blanco en ratas de 3 meses de edad.
En este trabajo demostramos que la administración ICV de leptina en ratas
wistar de 3 meses de edad regula la lipólisis y la lipogénesis del TAB. Concretamente
aumenta la lipólisis y disminuye la lipogénesis, con lo cual se reduce la masa del TAB.
En este sentido se sugiere que mejora la funcionalidad del tejido adiposo blanco y su
capacidad de regular la homeostasis de la glucosa y los lípidos. Una de las funciones
Discusión
114
principales de este tejido es la de liberar AGL a la circulación en condiciones en las que
se incrementa la demanda de energía como es el estado de ayuno. En este sentido, los
resultados que aquí se presentan demuestran que la leptina actuando a través de
circuitos neuronales interviene en la adaptación al estado de ayuno, incrementando la
liberación de AGL del TAB.
La lipólisis del TAB y la consiguiente liberación de AGL a la circulación es un
proceso en el que participan fundamentalmente 3 enzimas: la ATGL, la HSL, y la MGL.
Siendo las 2 primeras las que impulsan verdaderamente la lipólisis de los TAG. En este
sentido la infusión de leptina estimula la expresión de los genes que codifican para
ATGL y los niveles proteicos de ATGL y HSL y del transportador de glicerol AQ7 (datos
no mostrados). Sin embargo 7 días de tratamiento con leptina incrementa la forma
menos activa de la HSL, indicando un posible mecanismo de protección contra el
exceso de lipolisis.
Los estudios de denervación del tejido adiposo resultan útiles para estudiar la
importancia de la regulación metabólica de este tejido por el SNA. La denervación
puede ser quirúrgica o química. La denervación quirúrgica (la que implica el corte de
un nervio) permite denervar un solo paquete adiposo de modo que el otro paquete
constituye el control inervado, tiene como inconveniente que no es selectiva porque
se ven afectados tanto los nervios autonómicos como sensores (que van juntos), de
modo que la denervación quirúrgica reduce la inervación simpática y sensorial. Por el
contrario, la denervación química (con agentes químicos como guanethidine o 6-
hidroxi-dopamina), es una denervación global por eso no la empleamos en este
estudio. Numerosas evidencias (Barntness y col, 2007) indican que la inervación
simpática del TAB es la principal vía que regula la movilización de los lípidos y que
tanto la vasculatura como los adipositos están inervados. Mientras que otros autores
(Keier F y col, 2006) sugieren que al TAB también lo inerva el parasimpático.
Sin embargo, es importante destacar que los diferentes paquetes adiposos se
comunican a través del SNC, de modo que el SNC integra la información proveniente
de cada paquete adiposo a través de las fibras sensoriales (aferentes) y las simpáticas
eferentes para elaborar una respuesta única que llega a los paquetes adiposos por la
Discusión
115
vía del simpático. Por esta razón en determinadas condiciones en las que se denerva
un paquete adiposo, se produce el agrandamiento compensatorio de los paquetes
adiposos intactos. (Harris RB, 2012).
La leptina regula la ingesta de alimentos, el metabolismo y el estado
neuroendocrino, a través de circuitos hipotalámicos. Se conoce que la leptina
disminuye el apetito y el peso corporal en parte mediante la activación del sistema
nervioso simpático, aumentando la termogénesis y la liberación de la energía
(Elmquist JK, 2001). El núcleo PVN del hipotálamo está constituído por diferentes
secciones que regulan las actividades neuroendocrinas, el comportamiento y las
actividades autonómicas involucradas en el control homeostático del balance
energético. Estas secciones reciben señales de las neuronas del núcleo arcuato en
forma de los neuropéptidos AgRP (orexigénico) y POMC (anorexigénico). La leptina
dirige las señales específicas que debe recibir el PVN del ARC contribuyendo a la
regulación del balance energético. (Bouyer K y col., 2013).
El empleo del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal nos permitió estudiar,
de manera global, la capacidad de la leptina de regular la homeostasis de glucosa y por
lo tanto de incrementar la sensibilidad a la insulina. Se conoce que las neuronas POMC
del hipotálamo sensan los niveles de glucosa del organismo (Parton LE y col., 2007). Sin
embargo no se ha establecido aún en qué sitios y qué mecanismos permiten sensar los
niveles de lípidos o ácidos grasos y de qué forma su funcionamiento contribuye al
desarrollo de obesidad (Caspi L y col., 2007).
CONCLUSIONES
Conclusiones
117
5- CONCLUSIONES.
La acumulación del exceso de energía en el tejido adiposo de la rata Wistar se
activa de forma retardada, favoreciendo inicialmente la entrada de la grasa a los
músculos, el hígado y el corazón y preparando tardíamente al tejido adiposo para
guardar el exceso de grasa que posiblemente provenga de una comida posterior.
Después de un ayuno de 16 horas los niveles circulantes de NEFA y glicerol,
glucosa e insulina no se modifican con el envejecimiento, esto podría ser interpretado
como una correcta señalización de la insulina, en esas condiciones. Sin embargo se
observa hipertrigliceridemia.
La infusión aguda de lípidos agudiza la hipertrigliceridemia, aumenta los niveles
de NEFA y glicerol en sangre desde los 8 meses, aumenta la insulinemia en 8 y 24
meses y produce hiperglucemia en estado postabsortivo a los 24 meses.
En la rata Wistar como en humanos el aumento de la trigliceridemia en estado
postprandial jugar un importante papel en el desarrollo de enfermedades metabólicas
como la esteatosis hepática y sus complicaciones, la aterosclerosis y enfermedades
cardiovasculares como de la diabetes tipo 2.
La ingestión de grasas de forma aguda empeora la resistencia a la insulina con
el envejecimiento, produciendo hiperglucemia e hiperinsulinemia en ayunas de modo
que aumenta la susceptibilidad de las ratas viejas de desarrollar enfermedades
metabólicas derivadas de la resistencia a la insulina.
El ayuno prolongado produce hiperglucemia e hiperinsulinemia en los animales
de 24-meses de edad, con respecto a los animales de 3-meses de edad, aumentando la
resistencia a la insulina.
Las situaciones de estrés energético ayuno prolongado e ingestión de grasa de
forma aguda, empeoran el estado de resistencia a la insulina en la rata vieja.
A la vista de los resultados que aquí se presentan podríamos afirmar que a
partir de los 8 meses de edad los animales requieren más insulina para capturar
glucosa y ácidos grasos libres y provenientes de los TAG-QM y TAG-VLDL.
Conclusiones
118
En la rata Wistar, la insulina consigue mantener niveles normales de dos
metabolitos conocidos por producir glucotoxicidad así como lipotoxicidad y
lipoapoptosis con el envejecimiento (glucosa y NEFA).
Con el envejecimiento se observa resistencia a la insulina del tejido endotelial
que sumado a la resistencia a la insulina del tejido adiposo y de algunos músculos
mantiene significativamente elevados los niveles de TAG-QM respecto a animales de 3
meses de edad.
Con el envejecimiento se observa una disfunción del tejido adiposo visceral, en
relación con el aclaramiento de las lipoproteínas plasmáticas por parte de este tejido
en estado de ayunas.
Con el envejecimiento disminuye la capacidad lipogénica del TAB, porque
disminuye la captura de glucosa en respuesta a la insulina y en segundo lugar porque
disminuye de forma significativa la expresión de ChREBP y de sus genes blanco, ACC y
FAS.
De modo que la homeostasis de glucosa y NEFA en la rata Wistar, se mantiene a
costa de transformarles respectivamente en TAG, la elevación de los niveles
circulantes de TAG a la edad de 8 meses es ya un indicador de acumulación de lípidos
en tejidos no adiposos por falta de funcionalidad de determinados paquetes de tejido
adiposo blanco. Esta compensación fisiológica puede no funcionar en situaciones
comprometidas, cuando la demanda de energía es diferente al estado basal.
En la rata vieja el tejido adiposo responde peor al estrés del ayuno, liberando
menos NEFA o que el bloqueo de la lipólisis por la insulina, en la rata Wistar, se
consigue con menos cantidad de insulina.
El bloqueo de la liberación de glucosa en la rata Wistar requiere mayor cantidad
de insulina que el bloqueo de la lipólisis del tejido adiposo.
Con el envejecimiento disminuye el tono simpático del tejido adiposo visceral,
disminuye la capacidad lipolítica y de reesterificación en estado de ayunas.
Conclusiones
119
La capacidad lipolítica basal del tejido adiposo blanco visceral está disminuida
con el envejecimiento, siendo de especial relevancia la disminución del contenido de
las enzimas lipolíticas ATGL y HSL, de la proteína perilipina.
La disminución de la masa magra del viejo estimularía la lipolisis y conduciría a
pérdida progresiva de peso corporal. En este sentido la menor capacidad lipolítica del
tejido adiposo protegería de la eliminación de estas reservas y compensaría la falta de
tejido magro en el envejecimiento.
En estado postprandial se incrementa la capacidad de captura de lípidos de las
lipoproteínas circulantes y la esterificación a glicerol-3P proveniente de la oxidación de
la glucosa a lactato.
La inervación del tejido adiposo blanco es importante para la correcta
funcionalidad de este tejido. La denervación disminuye la capacidad lipolítica del
paquete adiposo denervado.
La leptina a través de circuitos neuronales estimula la lipolisis y disminuye la
lipogénesis, bajando el contenido de grasa acumulada en el organismo y aumentando
la sensibilidad global a la insulina.
El tratamiento crónico con leptina intracerebroventricular aumenta el
contenido de ATGL y HSL en el tejido adiposo pero atenúa el estado de activación de la
enzima lipolítica HSL siendo éste un posible mecanismo de protección contra el exceso
de lipolisis.
La hiperleptinemia sostenida en el tiempo podría estar implicada en la
disminución de la capacidad lipolítica del tejido adiposo observada con el
envejecimiento.
La leptina, al favorecer la homeostasis de glucosa y lípidos en el organismo,
interviene en el hecho de que la rata Wistar envejezca en estado prediabético.
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