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TEMA 8 LOCALIZACIÓN DE ANTÍGENOS
1) TISSUE PRINTING
Aprovechando que hay membranas que absorben proteínas, usamos esta característica
para hacer una impresión de un tejido consistente.
A) Tallo de un vegetal hacemos un corte y ese corte lo puedo imprimir sobre el papel.
B) Hacemos una réplica sobre el papel, una vez realizada la impresión dejamos secar y las
proteínas se quedan en el papel, ese papel lo puedo tratar, primero saturamos con unas
proteína inespecífica incubamos con el primario luego con el secundario y puedo
localizar proteínas y saber en qué estadio del desarrollo se expresa esa proteína.
Se puede hacer con tejidos animales, podemos saber en qué zona anatómica está
expresándose la proteína, también en patógenos para seguir como avanza la
patogénesis.
Lo más habitual son las técnicas de inmunohistoquímica, vamos a utilizar 3 tipos de técnicas, las histológicas, la
inmunológica y la bioquímica para localizar un determinado Ag en un corte histológico y vamos a ver dónde se
expresa o dónde están localizados. Se localizan por la reacción con su Ab correspondiente, debemos marcar el
Ab para poderlo detectar. Se mezcla la histología (inclusión,fijar,mo) con la reacción Ab-Ag y después detectar
la marca (reacción bioquímica) además de enzimas se pueden utilizar fluoróforos o metales. Muchas veces los protocolos histoquímicos llevan un paso de fijación pero se debe saber que las fijaciones son muy
invasivas para los Ags. A veces los Ab no reconocen a los Ag después de los tratamientos histológicos a los que
sometemos las muestras después de esos cortes finos. En los casos en los que se pueda se deberá evitar la fijación.
Es crucial tener en cuenta como son las fijaciones y es mejor usar la congelación.
Los marcajes enzimáticos: normalmente son indirectos (ab secundario marcado con una enzima) cuando es directo
se marca con enzima el ab primario, el indirecto amplifica la señal, cuando queremos aumentar la sensibilidad y hay
muy poco ag , debemos amplificar al máximo porque hay muy poca señal y por eso usamos los indirectos. Los
sustratos son de 3 tipos: cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes.
Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se
mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos, en
presencia del sustrato adecuado.
Muchas veces nos dan KITs en los protocolos, es muy importante al principio bloquear para aumentar la
especificidad con proteínas específicas de forma que el Ab no se pegue de manera inespecífica y busque el Ag.
Tabla de diferentes sustratos cromogénicos, la peroxidasa de rábano es la enzima que más se utiliza, lo que tienen
son sustratos comerciales. Muchos tejidos los debemos teñir y debemos tener en cuenta si el producto de reacción
lleva asociado un color. Debemos tener en cuenta el precipitado del producto de la reacción para elegir un tinte y
que se haga un buen contraste.
Un problema es la baja cantidad de Ag que tenemos y con ello problema de amplificación, lo
normal es hacer un marcaje indirecto a veces debemos hacer un tercer paso que es amplificar la
señal. Para visualizar mejor muchas veces se adicionan metales. Si le añadimos plata hacemos que
los precipitados se vean muy bien (aumentan la sensibilidad de la detección) otro sistema es tener
Ab contra el enzima que vamos a utilizar. Si pueden ser Ab hechos en el mismo organismo que
tenga el Ab primario. Cuando utilicemos los Ab 2 estos al tener 2 brazos por un lado m reconocen al
primario q tengo contra el Ag y el otro al primario asociado a la peroxidasa.
Otros métodos: Biotina/avidina en rojo los Ab primarios en gris los secundarios que son usados
para amplificar. Biotinizamos los ab secundarios y usamos Avidina que tiene el enzima, utilizando
ab secundarios y el sistema este puedo conseguir un montón de ab-enzima unido covalentemente
a la avidina
Sistema ABC: El complejo abc es aquel en el que la avidina forma una red entre el enzima
biotinilado y los ab biotinilados, la avidina hace de puente entre esas moléculas biotinilados.
Uso de fluoróforos marcando los ab, se usa en inmunofluorescencia , fotobleaching se deben tener
ciertas precauciones.
Se utiliza mucho microscopia confocal que permite eliminar el ruido de la fluorescencia no
enfocada.
Si es directa IF y si es indirecta IFI y marcamos un ab2. Se puede hacer la técnica de sándwich y se
consigue ampliar la señal cuando hacemos los test indirectos. Los fluoróforos que más se utilizan:
los Alexa fluor y FITC lo importante es que los espectros no sean solapantes.
Nos permite distinguir las células beta y alfa pancreáticas, tengo que tener un marcador específico
de cada una de las células. Tengo un fluoróforo asociado a un ab contra una carboxilasa que es
específica de un tipo celular. Debemos tener otro marcador que reconozca el otro tipo de célula y
marcar con otro fluoróforo distinto.
Estos marcajes multiples permiten hacer cosas como vienen ahí, en técnicas de localización nos piden que
tengamos los controles con sueros preinmunes porque nos puede dar ruido de fondo, este control negativo me
debe servir para ver como es la fluorescencia base. Es muy importante tener los controles negativos y los positivos y
ver una diferencia clara. Para tintar usamos dapi que me sirve para orientarme en el tejido y saber donde esta
localizado mi proteína. Debemos solapar esas imágenes y ver si realmente se ha marcado en el sitio de interés.
Análisis reciente de la parte inmunológica, pruebas de autoinmunidad.
Citometro de flujo: las poblaciones celulares se pueden distinguir porque expresan
diferentes marcadores. Podemos tener anticuerpos antiCD3..
Con una población celular podemos añadir ab marcador con distintos fluoroforos y
cada uno de ellos me reconocen un marcador celular. Las células quedaran marcadas
cada una con un fluoroforo según lo que estén expresando. Nos permite el citometro
pasar las células de una en una para que las células se alineen de una en una y nos
permite determinar los fluoroforos y nos dara un resultado de las poblaciones
celulares para saber que tipos tengo.
FACs separación de las células asociadas, estos tienen unos imanes que lo que hace
es que según la fluorescencia de esta celula se va a desviar, desvia las células según la
fluorescencia que llevan asociada. Podremos recoger y separar las células según la
marca que llevan.
Conjugación con metales que se utilizan para microoscopia electrónica, hay diferentes tipos de
microoscopios electrónicos, se dividen en transmisión y barrido, según el que sea deben ser cortes
ultrafinos, en el barrido es en la superficie. Se deben conjugar los ab en una proteína que almacena
hierro que se llama ferritina, el hierro es denso al paso de electrones y acumula un atomo de hierro
en su interior y nos permite verlo al microscopio.
La distancia si importa, queremos saber exactamente donde en una celula en un
determinado orgánulo se determina un ag, en mo electrónica a veces lo que se
utilizan son fragmentos de ab. Un nanoab debemos reducir al máximo el tamaño. Se
utiliza tradicionalmente oro coloidal, son sales de oro que al reducirla forma unos
coloides.
Como unir el oro a los ab se hace de manera covalente.
Podemos seguir el procesado de un determinado ag con una forma no procesada que lleva un tamaño de oro
diferente en el mismo corte
Puentes de metileno y tb entrecruzamientos de aldehídos entre las proteinas y esto impiden q los ab
puedan actuar con los ag, se llama enmascaramiento.
Solución: recuperación de la antigenicidad y hay dos tipos de técnicas:
enzimática: las proteasas que rompen las uniones covalentes y dejan los determinantes ag otra vez expuestos
Técnicas químicas: calentar y usar unos tampones adecuados haciendo que se recupere esta actividad antigénica