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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
PRESENTADO POR: EMERSON TURPO BALDÁRRAGO
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¿Qué son las Técnicas de Diagnóstico
Molecular?
• Son procedimientos basados en la caracterización
física de moléculas de ácidos nucleicos.
• Permiten llegar al diagnóstico rápido de las
enfermedades infecciosas en aquellos casos donde
el diagnóstico convencional no pueda ser
utilizado.
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Esquema General
Obtención y preparación de la muestra
Liberación del material genético
Purificación del material extraído
Cuantificación y amplificación del material genético
Aplicación de técnicas moleculares
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Aislamiento y purificación de ADN
Un procedimiento suave de lisis
de las células y de solubilización
del ADN.
Una segunda fase con uno o
varios métodos enzimáticos o
químicos de eliminación de
contaminantes (proteínas, ARN y
otras macromoléculas).
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Purificación de ARN
La lisis de las células se produce por:
La utilización de detergentes.
La lisis celular utilizando
tiocianato de guanidinio, que es el
método más utilizado para la
extracción de ARN de tejidos.
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Cuantificación de Ácidos Nucleicos
Determinación por espectrofotometría
ADN y ARN: Absorción de Luz UV 260 nm.
Utilizar cubetas de cuarzo.
ADN: 50 µg/mL; ARN: 40 µg/mL
Método de tinción con Bromuro de etidio
Bromuro de etidio Compuesto fluorescente.
Al unirse al ADN su fluorescencia aumenta.
La fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de ADN
presente.
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TÉCNICAS DE
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
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Electroforesis en campo pulsante (PFGE)
• Consiste en la separación
electroforética de grandes
moléculas de DNA inmersas
en gel de agarosa, alternando
la orientación del campo
eléctrico.
• El tiempo de activación de
cada campo → Pulso.
• El tiempo de reorientación es
D.P. al tamaño de la molécula.
Fundamento
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Electroforesis en campo pulsante (PFGE)
Arma epidemiológica para comparar
genéticamente cepas pertenecientes a una
misma especie.
Diferenciar cepas pertenecientes a especies
distintas.
Requiere una preparación muy elaborada
de la muestra y equipamiento especializado.
Características
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Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
“En cada ciclo de reacción
se duplica la cantidad de
material genético presente
en la muestra”
A.N. de doble cadena
Primers/ Cebadores
Taq Polimerasa
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Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
Alta sensibilidad y especificidad.
Producto final: ácido nucleico de doble cadena.
El producto final puede ser analizado en
tamaño, secuencia y cantidad.
Útil para la búsqueda de material genético de un
agente infeccioso en una muestra clínica.
Útil para la identificación de aislamientos.
Características
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Amplificación aleatoria (RAPD)
• Su fundamento es similar al del
la PCR, pero utiliza Cebadores
aleatorios para la amplificación
arbitraria del ADN.
• Los fragmentos de DNA
generados se separan mediante
electroforesis en gel de agarosa.
• Se obtienen patrones y
mediante comparación permite
la identificación de patógenos.
Fundamento
Patrón RAPD para E. coli
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Amplificación aleatoria (RAPD)
• Aplicación en estudios epidemiológicos.
• Útil para la comparación de aislamientos
pertenecientes a una misma especie.
• Útil para discriminar entre variedades y
aislamientos de patógenos.
Características
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Polimorfismo de Longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP)
• Se fundamenta en la utilización
de Restrictasas que rompen el
DNA en dianas o secuencias
específicas.
• La molécula de ADN es
digerida en diferentes sitios y da
lugar a fragmentos de diferente
longitud, que dan lugar a
Patrones de restricción.
Fundamento
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Polimorfismo de Longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP)
• Utilizada para generar patrones electroforéticos
(marcadores genéticos) de aislamientos
pertenecientes a una misma especie o a especies
diferentes.
• Utilidad en Epidemiología molecular.Características
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Hibridación
• Se fundamenta en la formación
de moléculas de doble
cadena, cuyas hebras tienen
distinto origen.
• Requieren dos elementos
básicos: La secuencia dianade ácido nucleico y un
fragmento corto de ácido
nucleico conocido como
Sonda.
Fundamento
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Hibridación
• Encontramos diferentes tipos, siendo las más comunes:
Southern blot y Dot blot.
• El Southern blot permite la transferencia de fragmentos de
ADN originados por endonucleasas de restricción y posterior
hibridación con una sonda marcada, permitiendo la
comparación de patrones genéticos.
• El Dot blot permite la detección cualitativa de una agente
infeccioso en muestra de sangre, heces, esputos, etc.
Características
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Secuenciación
• Se fundamenta en la
interrupción controlada de la
síntesis de una hebra
complementaria durante una
replicación in vitro.
• La principal característica de
este método es el uso de
didexosinucleótidos que
provocan la detención de la
reacción de la síntesis de ADN.
Fundamento
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