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TECNICA HISTOLÒGICA
DANY LEANDRO PIEDRAHITA G.RESIDENTE DE GINECOLOGÍA U CALDAS
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TECNICA HISTOLÒGICA
Conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.
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Pasos de la técnica histológica
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Técnicas histológicas • Hay dos técnicas principales para proceder a la
preparación y tinción de los cortes histológicos de los tejidos.
Técnica de la Parafina
• Obtención de la muestra – tinción
Biopsia por congelación
• Solidificar el fragmento mediante congelación
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Técnicas Histológicas: Fijación Es el tratamiento del tejido con sustancias químicas que tiene los siguiente objetivos:
Preservar
• Tejido de la putrefacción y autolisis.
Conserva
• Citoarquitectura y ultraestructura
Dureza
• Aumenta la dureza—preparaciòn de finas peliculas de muestra.
Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles.
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Fijadores: Como actuan?
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Condiciones de un buen fijador
Impedir aparición de procesos autolíticos
Poder de penetración
Poder de difusión
Fácil manipulación
NO disolver componentes tisulares
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Fijadores: ClasificaciónOxidante
s
Bicromato de potasio
Bicloruro de mercurio
Acido ósmico
Acido acético
Reductores
formaldehído
Glutaraldehído
Alcohol metílico
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Fijadores: Clasificación
GaseososFormaldehido
Líquidos Acido acètico, etílico
Sólidos Bicloruro de mercurio
Simples Compuestos
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Fijadores: Clasificación
• Formol: coagulación de proteínas
• un buen poder de penetración y difusión
Simples
• Formol - fosfato (formol tamponado)
• Formol - bicloruro de mercurio: tejido hematopoyètico
Compuestos
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Fijadores compuestos
Tejidos hematopoyético y Linfaticoreticularfibras colágenas y células conjuntivasInmunohistoquimica
fijación de embriones y fetos pequeños ejerce poder descalcificante
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Criterios para obtener una buena fijación
Elección del fijador• fijador universal”
Tamaño de las muestras• Pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2
Volumen del fijador• 1 a 20 (muestra – fijador)
Tiempo de fijación• Intervalo entre la interrupción del aporte sanguíneo y
la inmersión de las muestras en la solución fijadora.• Respetarse los tiempos recomendados para cada tipo
de fijador.Temperatura • fijación a bajas temperaturas ( 4 C.)
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Inclusión • Los tejidos se infiltran con sustancias denominadas “de
inclusión” y dureza que produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgados y transparentes
Sustancias de inclusión tienen la propiedad de incorporarse e infiltrarse al interior de las células y tejidos con la finalidad de servirles de soporte.
Solubles en agua
Gelatina
Carbowax
Glicol metacrilato
Solventes orgánicos
Parafina
Celoidina
Resinas epòxicas
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Inclusión en Parafina•Parafina: Medio de inclusión insoluble en
agua y alcohol.
Deshidratación
1Aclaraciòn
2Formación del bloque
3
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Deshidratación •Extraer el agua de los tejidos fijados.•Debe ser completa , el solvente no actúa
de forma adecuada y el bloque de inclusión no alcanza la dureza requerida.
Alcohol etílico
A. Isopropili
coDioxano Cloroform
o
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Deshidratación
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Diafanización o AclaramientoLa parafina tampoco es soluble en alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que sean capaces, simultáneamente, de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina.
La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los tejidos los vuelven transparentes.
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Inclusión y formación del bloque de parafina•Se clasifican en:
• punto de fusión de 45o C 52o C• inmunohistoquímicaBlandas
• Parafina que se emplea con mayor frecuencia
Semiduras
• de fusión de 60o C - 65o C.Duras
La penetración de la parafina al interior de los tejidos se efectúa cuando ésta se encuentre en estado líquido
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Inclusión y formación del bloque de parafina
La inclusión o formación del bloque de parafina se efectúa empleando moldes de diversos materiales y diferentes áreas y profundidades.
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MICROTOMIA (OBTENCIÓN DE LOS CORTES)
•Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados para que en forma mas o menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se denominan: Micrótomos.
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Micrótomo
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Se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque que contiene el tejido incluido.
• Uso más frecuente
• de 4 a 7 mm de espesor.
Rotación tipo Minot
• Cortes horizontales
• Porciones voluminosas de tejidos
De deslizamiento
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Extensión y adhesión de los cortes al portaobjetos.•Los cortes se extienden al depositarlos
sobre la superficie del líquido extendedor contenido en un recipiente denominado “baño de flotación” (éste mantiene la temperatura entre 40o a 45o C).
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COLORACION O TINCION.
•El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante.
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ColoranteHidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas.
• Anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales
Esqueleto incoloro
• Aporta el color
Cromóforo
• Posibilita la unión a elementos del tejido
Auxocromo
Cromógeno
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Clasificación: naturaleza química del radical auxocromo.
Básicos
• Son sales en las que la base aporta el color
• S. ácidas del tejido como el ADN o componentes de la matriz extracelular
Ácidos
• Union a sustancias básicas.
• Estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y el colágeno
Indiferentes
• No se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos
Neutros
• Porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color
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Técnica Hematoxilina-eosina
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Técnica de Hematoxilina-eosinaConsidera como la técnica de tinción de uso más frecuente en el estudio de células y tejidos, a través del microscopio fotónico.
• los núcleos mediante una hematoxilina,
• Colorean de azul, azul morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de
Nùcleos
• Eosina que les confiere diversos grados de color rosado
Citoplasma y
material extracelul
ar
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Tinciòn PAS
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Tinción negro de Sudan
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BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA
Identificación del tipo de tejido
Naturaleza benigna o maligna del tejido
Valoración del estado de los márgenes de resección
Compromiso de los ganglios
Decisión del cirujano
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• 1895 a Thomas Cullen, del Johns Hopkins Hospital, al describir la primera técnica de uso de biopsias por congelación durante un procedimiento quirúrgico en.
• William Welch, del Johns Hopkins School of Medicine, fue el primer patólogo americano en utilizar la técnica de biopsia por congelación durante una cirugía.
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BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA•Duración del procedimiento desde el
momento en que llega la muestra al servicio de patología hasta que se encuentra lista para la lectura en el microscopio es de 15 minutos en promedio
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BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA
Ingreso de la muestra en fresco
Realiza los cortes
Improntas en fresco sobre láminas portaobjetos.
corte deseado por el patólogo sobre resina de congelación.
Criostato, donde se congela a -30º C durante 3
se realiza el corte con espesores de 5 a 6 micras.
Tinción.