Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 1 de 7
1. OBJETIVO
Determinar histamina y otras aminas biógenas por HPLC con detector UV. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas biógenas, principalmente productos hidrobiológicos frescos o procesados, harina de pescado, quesos y cecinas, recepcionados en la Sección Química de Alimentos.
3. FUNDAMENTO
Extracción de aminas biógenas en ácido tricloroacético, derivatización precolumna mediante cloruro de dansilo y posterior análisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con detector UV. 4. REFERENCIAS
Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiológicos “Determinación de histamina y otras aminas biógenas”- Método HPLC con detector UV. 5. TERMINOLOGÍA
5.1 Aminas biógenas: compuestos alergénicos generados por la degradación de aminoácidos que están contenidos en pescados y otros alimentos como derivados lácteos, cecinas, hígado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser consumidos pueden causar reacciones alérgicas o cuadros de intoxicación.
5.2 HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución 6. MATERIALES INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 MATERIALES Y EQUIPOS Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a
continuación esté disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesón de trabajo:
6.1.1 Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable.
6.1.2 Balanza analítica 0.0001 g.
6.1.3 Balanza de precisión 0.01 g
6.1.4 Agitador mecánico de tubos
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 2 de 7
6.1.5 Baño termorregulado a 60 °C
6.1.6 Centrífuga 2000 a 3000 rpm
6.1.7 Tubos de centrífuga con tapa rosca de 50 mL
6.1.8 Micropipetas de 100 – 1000 µL
6.1.9 Papel filtro Whatman N° 1, 4 o equivalente
6.1.10 Filtros de membrana de 0.22 µm
6.1.11 Viales con tapa de 2 a 3 mL
6.1.12 Columna C-18 fase reversa, 125-4 (5 µm) o equivalente
6.1.13 Equipo de filtración con filtro de membrana de 0.45 µm
6.2 REACTIVOS
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a
continuación esté disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesón de trabajo:
6.2.1 Acetona p.a.
6.2.2 Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO3 y llevar a un matraz de 250 mL, aforando con agua desionizada filtrada.
6.2.3 Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz de 5 mL aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase ámbar bien cerrado.
6.2.4 Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con estándar interno de efedrina 250 ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 mL, agregar 0.125 g de efedrina p.a. y aforar con agua para análisis.
6.2.5 Fase móvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente).
6.2.6 Estándares: Aminas biógenas: Putrecina Cadaverina Tiramina Histamina Espermidina.
6.2.6.1 Preparar una solución patrón de 1000 mg/L de cada una de las aminas biógenas: Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 mL con solución de TCA 5% con estándar interno.
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 3 de 7
6.2.6.2 Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3 niveles desde 50 a 500 ug/mL para la curva de calibración. Aforar cada vez con TCA 5% con estándar interno.
7. DESARROLLO
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto
materiales, insumos y reactivos esté disponible.
A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica con el
método leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad.
Profesional Jefe de Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas es responsable de supervisar y/o preparar estándares y fortificados, supervisar tratamiento de la muestra, analizarla e informar los resultados.
Técnico Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas es responsable de efectuar las distintas etapas del procedimiento analítico. 7.1 RECEPCIÓN DE LA MUESTRA
7.1.1 Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los rotulados en la muestra.
7.1.2 Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el análisis lo más pronto posible. En caso de ser necesario postergar el análisis, ésta se debe mantener a –18 °C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 °C y 4 °C si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar más de 36 h en esta condición y a temperatura ambiente si la muestra corresponde a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad.
7.1.3 Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de eliminación de desechos de laboratorio (Bolsa roja y/o amarilla). Anotar fecha de eliminación de la muestra en los antecedentes de la misma en Registro 711.00-074 “Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas”
7.2 PREPARACIÓN DE MUESTRA
7.2.1 Conservas: Si el líquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 4 de 7
7.2.2 Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un máximo de 4 h y drenar.
7.2.3 Productos pesqueros salados: Preparar una solución saturada de cloruro de sodio y sumergir en ella el producto en salazón algunos segundos para retirar la sal superficial. Sacar la muestra de la solución y secar con papel absorbente, eliminar las espinas, trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.
7.2.4 Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados cárnicos: Preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.
7.2.5 Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60 s como se indica a continuación:
a) Pescados de tamaño pequeño (≤ 15 cm): en su totalidad.
b) Pescados de tamaño mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas; cortar en filetes para obtener toda la carne y piel.
c) Pescados de tamaño grande: De cada uno de más de tres pescados cortar tres rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrás de la aleta pectoral, en el medio y después de la abertura anal. Eliminar las espinas.
7.2.6 Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar. 7.3 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
7.3.1 Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un minuto.
7.3.2 Pesar 5 g en un tubo de centrífuga de 50 mL y agregar exactamente 10 mL de TCA 5% con estándar interno y tapar.
7.3.3 Agitar por 30 min en agitador mecánico.
7.3.4 Centrifugar a 2000-3000 rpm por 15 min.
7.3.5 Filtrar el sobrenadante a través de un embudo con papel filtro.
7.3.6 Filtrar el extracto a través de filtro 0.22 µm. 7.4 REACCIÓN DE DANSILACIÓN
7.4.1 En un vial de vidrio con tapa se adicionan consecutivamente:
100 µL de extracto o soluciones estándares
400 µL de bicarbonato de sodio 0.25 M (pH 8 a 9)
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 5 de 7
200 µL de solución de cloruro de dansilo
300 µL de acetona p.a.
7.4.2 Cerrar herméticamente el vial e incubar a 60 °C en baño termorregulado por 1 hora.
7.4.3 Enfriar a temperatura ambiente.
7.4.4 Inyectar 20 µL de la muestra en HPLC.
7.4.5 Utilizar como blanco solución de TCA 5% con estándar interno y dansilar de igual forma que los estándares y las muestras.
7.5 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Flujo de la fase móvil: 1 mL/min Programa de gradiente de fase móvil Tiempo (min) Metanol (%) Agua (%)
0 70 30 20.0 75 25 20.1 100 0 22.0 100 0 22.1 70 30 30 70 30
7.5.1 Estabilizar por 15 minutos.
7.5.2 Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificados on line.
7.5.3 Limpiar la jeringa y el inyector con agua después de cada inyección.
7.5.4 Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min.
7.5.5 Los tiempos de retención aproximados son:
Amina biógena Tiempo de retención (min)
Efedrina 4 a 6
Putrecina 6 a 7
Cadaverina 7 a 9
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 6 de 7
Amina biógena Tiempo de retención (min)
Histamina 12 a 14
Tiramina 19 a 21
Espermidina 22 a 25
7.6 EXPRESIÓN DE RESULTADOS
7.6.1 Calcular el nivel de histamina en ug/mL entregado por el HPLC utilizando estándar interno usando la siguiente fórmula:
Cm = {(Am/Asi)-b} / m
Cm = Concentración de la amina biógena en el HPLC ug/mL
Am = Área de la amina biógena de la muestra
M = Pendiente de la curva de calibración
B = Intercepto de curva de calibración
Asi = Área del estándar interno
7.6.2 La concentración total de aminas biógenas se realiza sumando las concentraciones de cada amina biógena.
7.6.3 Para determinar la concentración de cada amina biógena en la muestra, usar la siguiente fórmula:
C = Cm x 10 g
Donde:
C = concentración de amina biogénica en mg/kg, de la muestra
Cm = concentración de amina biogénica de la muestra en ug/mL obtenida de la curva de calibración
g = peso de la muestra en gramos
Fecha emisión: 2002 Revisión: 2
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA) Método HPLC Fecha revisión:
21-07-2011 Sección Química de Alimentos y Nutrición
PRT-711.04-070
Página 7 de 7
7.3 CONTROL DE CALIDAD
- Realizar cartas control de los resultados de recuperación y pendiente de histamina.
- Participar en ensayos interlaboratorios cuando estén disponibles. 8. REGISTRO
8.1 Registro preparación de soluciones de estándares puros
8.2 Registro de control de cromatogramas 9. ANEXOS
No Aplica
