Proyecto CGPI 20060807
������������
Estudio del aislado Bacillus sp DAF1 y
de su acción antibiótica.
Dr. Ramón Cruz Camarillo
Director del proyecto
ENCB-IPN
������������
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������1
������������
ESTUDIO DEL AISLADO Bacillus subtilis DAF-1; SU PERFIL EXOENZIMÁTICO Y
SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA
1.0 INTRODUCCION
1.1 Procedencia y características relevantes de la cepa DAF-1
En la Isla de Trinidad en Sudamérica, algunas personas utilizan de manera empírica las
hojas de una planta (Spondia mombin) para tratar las micosis dérmicas. El tratamiento consiste
en la frotación de las hojas sobre las zonas enfermas.
Como es frecuente en estos casos, no existen estudios sobre la efectividad de este
tratamiento, y se desconoce también cual pudiera ser el mecanismo de acción. De haber un
efecto antibiótico real, éste podría deberse a alguna sustancia vegetal que es liberada de las
hojas durante los frotamientos sobre la piel dañada. Menos probable sería la participación de
una flora microbiana con capacidad antifúngica, que se encuentre en el filoplano de las hojas
utilizadas, porque habría que aceptar que aún cuando su concentración celular es baja, es capaz
de producir y acumular una suficiente cantidad de antibiótico sobre la superficie de las hojas.
Por lo tanto, puede ser sólo un hecho casual que se haya aislado de una muestra de las
hojas de Spondia mombin una bacteria que secreta un antibiótico muy activo contra una cepa de
Trichophyton rubrum. El aislamiento de esta bacteria fue realizado en el laboratorio de los
doctores David Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de
Trinidad, en Sudamérica. Preliminarmente la bacteria fue denominada: Bacillus sp. DAF-1 (de
Dermatophyte Anti-Fungal ).
Resulta oportuno indicar que el aislamiento de bacterias productoras de antibióticos con
acción antifúngica, a partir de la superficie de hojas vegetales es un hecho conocido y reportado.
Por ejemplo, en la patente 20030186852 (USA), referente a la producción de formulados para el
control biológico de cultivos de interés agrícola, se menciona el uso de una cepa de Bacillus
subtilis que produce sustancias insecticidas, antifúngicas y antibacterianas. Esta cepa particular
fue aislada de hojas de una planta silvestre (Heins et al. 2003). La presencia de una flora
antimicótica en la superficie foliar, ha permitido suponer que se trata de un mecanismo natural
que permite proteger a las plantas del ataque de hongos fitopatógenos.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������2
������������
Por todo lo anterior sería importante estudiar un microorganismo que ha sido aislado de
la superficie de una planta y con posible actividad antifúngica y sobre otro tipo de
microorganismos y que también pudiera producir algún otro compuesto de interés
biotecnológico.
Es así que se estableció un convenio extra-oficial de colaboración científica entre el
laboratorio de los Doctores David Ammons y Joanne Rampersad y el de Enzimas Microbianas
de la ENCB, basado en un interés mutuo en el área de la Biotecnología Microbiana. En el caso
concreto del aislado DAF-1 interesa conocer por una parte su identidad taxonómica y sus
características morfológicas y bioquímicas; y por otro, investigar su potencial como productor
de sustancias de interés económico como antibióticos y enzimas extracelulares.
Uno de los primeros pasos de la presente investigación fue identificar la cepa DAF-1,
para definir si este microorganismo pudiera ser patógeno. En el Laboratorio de Bacteriología
Médica de la ENCB, la cepa DAF-1 fue identificada como Bacillus subtilis por pruebas
bioquímicas API 50 CHB y posteriormente con apoyo del Dr. Jorge E. Ibarra del CIVESTAV
Irapuato se verificó su identidad mediante la secuenciación de genes en su 16S rDNA;
por las pruebas anteriores se tiene un 99 % de seguridad que la cepa en estudio es Bacillus
subtilis.
1.3 Generalidades sobre Bacillus subtilis
Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva, aerobia facultativa. Es un bacilo unicelular
que rara vez se agrega en cadenas, y que produce una endospora resistente al calor y otros
agentes físicos y químicos. Además presenta motilidad mediante flagelos perítricos. Su pared
celular está compuesta de 75 % de fosfolípidos. Es una bacteria que puede crecer en un medio
mínimo sin requerir factores de crecimiento, por lo que se puede aislar de agua, suelo, aire y
residuos de plantas en descomposición. También se le ha aislado de suelos contaminados
(http://textbookofbacteriology.net/resantimicrobial.html).
B. subtilis puede producir gran cantidad y variedad de enzimas extracelulares que le
permiten degradar pectina y otros polisacáridos de origen vegetal como el almidón. También
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������3
������������
produce proteasas, DNasas, lipasas, y otras. Esto le permite degradar una gran variedad de
sustratos, lo que propicia su crecimiento en una diversidad de habitats. ������������
Una de las características más importantes de B. subtilis es su elevada velocidad de
crecimiento, y también que puede secretar una gran cantidad de enzimas. Algunas veces éstas
pueden producirse en gran cantidad, tal es el caso de la celulasa extracelular producida por la
cepa B. subtilis KMS-635, la cual se produce a niveles de 20-25 g/L (Schallmey et al. 2004).
Por estas razones y por ser una bacteria con pocas exigencias nutricionales, inocua y de fácil
manejo, B. subtilis se ha utilizado en multiples procesos industriales. Las principales enzimas
producidas en el ámbito industrial por esta bacteria son amilasas, proteasas alcalinas (8.5 y
10.3-10.8), pectinasas, β-glucanasas, celulasas, y xilanasas. Además, esta especie es utilizada
también para producir nucleótidos, vitaminas como riboflavina y suplementos alimenticios
como el ácido poli-γ- glutámico ( Rao et al. 1998, Dauner et al 2002, Schallmey et al. 2004).
Es interesante resaltar que aunque dentro del género Bacillus se encuentran B.
anthracis, un microorganismo en extremo patógeno hacia el hombre y algunos animales, así
como B. cereus que causa gastroenteritis en humanos, B. subtilis es una especie libre de
exotoxinas y endotoxinas, por lo que la Food and Drug Administration (USA) le ha otorgado el
status de organismo GRAS, o generalmente seguro (generally regarded as safe) (Stein 2005).
Por otra parte es conveniente aclarar, que B. subtilis es la bacteria Gram-positiva, más
estudiada; en particular la cepa Marburg 168, de la cual se conoce su genoma completo desde
1997, encontrándose que al menos 4 % de los 4.2 Mbp de tal genoma codifican para proteínas
involucradas en la biosíntesis de metabolitos antimicrobianos (Kunst et al. 1997). Esto explica
porqué B. subtilis es uno de los microorganismos más utilizados en procesos biotecnológicos.
En años recientes la mayoría de los estudios referentes a esta especie se han enfocado a la
producción de proteínas heterologas, por ser posible controlar sus niveles de expresión y hacer
posible la sobreproducción de sustancias de interés mediante la modificación de zonas
promotoras en genes de expresión ( Westers et al. 2003).
Por lo anterior, no es de extrañar que una de las áreas de estudio con esta especie, y en
general con el género Bacillus sea la producción de antibióticos, la cual comenzó en los años
70s y continua vigente en nuestros días. Refiriéndose sólo a B. subtilis se han descrito
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������4
������������
alrededor de 24 antibióticos, los cuáles presentan gran diversidad estructural como se refiere a
continuación.
1.4 Generalidades en relación con los antibióticos del género Bacillus
En 1977 Katz y Demain publicaron una revisión de los compuestos con actividad
antibiótica producidos por el género Bacillus. Sus características más relevantes son:
� La mayoría tienen naturaleza peptídica y están compuestos enteramente de
aminoácidos, pero pueden poseer también residuos de ácidos grasos.
� Sus pesos moleculares son menores al de las proteínas, y van desde 270
(bacilisina) hasta 4,500 (licheniformina).
� Un mismo microorganismo puede producir familias de antibióticos, los cuales
pueden diferir en unos cuantos aminoácidos.
� La mayoría de los antibióticos peptídicos son de estructura cíclica. Unos pocos
son de estructura lineal (edeina, gramicidinas).
� Frecuentemente los antibióticos peptídicos contienen aminoácidos que son
únicos, y por tanto no se encuentran en las proteínas, tales como
D-aminoácidos, aminoácidos básicos (ornitina, ácido diaminobutirico),
β-aminoácidos, dehidroaminoácidos (dehidroalanina) y aminoácidos con
átomos de azufre (lantionina).
� Los antibióticos peptídicos de Bacillus no contienen residuos de ácidos
N-metilamino, como ocurre con los péptidos sintetizados por hongos y
actinomicetos.
� Los péptidos-antibióticos de Bacillus son generalmente resistentes a la hidrólisis
por peptidasas y proteasas de origen animal y de plantas.����
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������5
������������
Entre los principales productores de antibióticos del género Bacillus se encuentran: B.
brevis (gramicidina, tirotricina); B. cereus (cerexina, zwittermicina); B. circulans (circulina); B.
laterosporus ( laterosporina); B. licheniformis (bacitracina); B. Polymyxa (polimixina, colistina);
B. pumilus (pumulina); B. subtilis (bacitracina A, plipastatina, surfactina, bacilisina,
bacilomicina, fengicina, subtilina, micobacillina, etc.).(Ozcengiz, et al. 1990; Vollenbroich et
al. 1997; Tsuge et al. 1999, Yu –Shu et al. 2002).
1.5 Antibióticos producidos por B. subtilis
Los antibióticos producidos por esta bacteria se pueden clasificar en dos clases. Los de
origen ribosomal como: Tas A, subtilisina y sublacina, los cuales son sintetizados durante la
fase de crecimiento exponencial, y los de origen no ribosomal, que se producen en la fase
estacionaria, los cuales generalmente son oligopéptidos cíclicos que contienen una cadena de
ácidos grasos como ocurre en la surfactina, iturinas, bacilomicinas , fengicina y micosubtilina
(Feigneir et al. 1996, Stöver y Driks 1999).
1.5.1 Antibióticos de origen ribosomal
Stöver y Driks (1999) estudiaron la secreción de un agente proteico antibacteriano al
que llamaron Tas A, con peso molecular de 31 kDa, la cual era secretada al comienzo de la
esporulación, y luego incorporada dentro de las esporas. Sus estudios mostraron que esta
proteína era activa contra algunas bacterias de interés clínico como Enterobacter cloacae,
Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, pero no contra E. aerogenes y Pseudomonas
aeruginosa. Por su parte Schnell et al. (1988), reportaron otro antibiótico de origen ribosomal,
producido por la cepa de B. subtilis ATCC 6633, al que se denominó subtilina lantionina. Esta
sustancia posee puentes meso-lantionina y 3-metil-lantionina. Además contiene aminoácidos
inusuales como deshidroalanina y deshidrobutirina. Se encontró que su estructura es muy
similar al de la nisina, un antibiótico usado como conservador en los alimentos. La subtilina es
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������6
������������
activa contra bacterias Gram-positivas como Propionibacterium acnes, Micrococcus lentus, y
algunas especies de los géneros Staphylococcus, Streptococcus y Clostridium.
1.5.2 Antibióticos de origen no ribosomal
Rogers et al. (1965) reportaron que la cepa de B. subtilis A14 producía durante la fase
estacionaria un compuesto antibacteriano activo contra S. aureus, al cual se denominó
bacilisina. Se encontró que se trataba de un dipéptido L-alaninil-[2,3–epoxiciclohexano-4]-L-
alanina). El mismo compuesto fue aislado en B. subtilis 168 por Hilton et al. en 1988.
Por otro lado, la surfactina es un antibiótico cicloheptapeptídico con una unión B-hidroxi
a grupos carboxilo e hidroxilo de un ácido graso. Este antibiótico lo produce no solamente B.
subtilis, sino también B. pumilus, B. licheniformis y B. amyloliquefasciens (Peypoux et al. 1999
y Stein 2005). Mucho se ha especulado sobre la función de este antibiótico, y estudios
recientes parecen indicar que está involucrado en la formación de biopelículas (Hofemeister et
al. 2004).
Aún cuando el estudio de los antibióticos de B. subtilis es un área cada vez más
compleja, dista mucho de haberse agotado. La búsqueda de antibióticos de origen microbiano
va en incremento, pues la mayoría de los antibióticos sintéticos causan efectos secundarios no
deseados.������������
Como es lógico, un paso importante en el estudio de los antibióticos es establecer su
espectro de acción, su naturaleza química, y de ser posible llevar a cabo su purificación. A
continuación se presentan algunos casos.
1.6 Antibióticos de origen bacteriano. Su purificación y espectro de acción
Wakayama et al. (1984), realizaron la purificación parcial por cromatografía en capa fina
de un antibiótico producido por un aislado identificado tentativamente como Bacillus cereus
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������7
������������
SW . Encontraron que el péptido estaba compuesto por ácido aspártico, serina, ácido glutámico,
leucina, tirosina, prolina y un ácido desconocido, en una proporción 2:1:1:1:1:1:1. Este
antibiótico inhibía el crecimiento de hongos y levaduras, como Conidiobolus lamprauges,
Fusarium oxysporum, Aspergillus nidulans, Eurotium chevalieri, Mucor rouxianus, Penicillium
chrysogenum, Cryptococcus luteolus, Hansenula wingei y Saccharomyces cerevisiae. Sin
embargo no inhibía el crecimiento de las bacterias S. aureus, B. subtilis, E. coli, Serratia
marcescens y Proteus vulgaris.
Zheng et al. (1999), reportaron la purificación de la bacteriocina subtilosina, producida
por la cepa B. subtilis JH64.2. Este compuesto fue purificado mediante cromatografía de
intercambio iónico y por filtración en gel.
Por su parte Hagelin et al. (2004), reportaron una familia de 20 nuevos péptidos cíclicos
con actividad antibiótica, al que denominaron complejo maltacina, el cual es activo contra C.
albicans, T. Mentagrophytes, A. Fumigatus y S. aureus. La cepa utilizada fue aislada del suelo
e identificada como B. subtilis. La caracterización de los péptidos fue llevada a cabo mediante
espectrometría de masas y espectrofotometria UV-IR.
Ström et al. en 2002, encontraron dipéptidos cíclicos con actividad antifúngica, pero con
un espectro de acción pequeño, pues solamente eran activos contra unos cuantos hongos y
levaduras. Estos compuestos fueron producidos por Lactobacillus plantarum cepa MILAB 393.
Dicha cepa fue aislada de pasto y el ensayo de su actividad inhibitoria se realizó en placa. Los
microorganismos sensibles fueron A. Fumigatus, Fusarium sporotrichoides y la levadura
Kluyveromices marxianus. La purificación de los antibióticos se llevó a cabo por HPLC, y la
identificación de las estructuras mediante el uso de resonancia magnética nuclear (RMN),
espectrofotometria de masas (MS) y por cromatografiía de gases (CG). Los dipéptidos
encontrados fueron ciclo (L-Phe-L-Pro) y ciclo( L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) y ácido fenil-láctico.
Un año después en 2003, Sjögren, & Magnusson reportaron que ácidos grasos 3-hidroxi,
secretados por otra bacteria ácido-láctica (Lactobacillus plantarum MiLAB14) presentaban
también actividad antifúngica. Los compuestos encontrados fueron ácido
3-(R)-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxi-5-cis dodecanoico y ácido 3-( R)-hidroxitetradecanoico
y la máxima producción de estos compuestos ocurría alrededor de las 38 h de incubación del
cultivo. Lo antes mencionado muestra la importancia de estudiar cómo se producen los
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������8
������������
compuestos antibióticos microbianos, que tan amplio es su espectro de acción, así como las
condiciones y el momento en que se producen. También da pistas sobre la metodología que se
emplea para su aislamiento, purificación y caracterización.
En suma, considerando que la cepa B. subtilis DAF-1, aislada del filoplano de las hojas
de Spondia mombin, presenta actividad contra una cepa de T. rubrum causante del pie de
atleta, se puede especular que pudiera actuar también contra otros hongos, y probablemente
contra diversas bacterias. Además, debe tener la capacidad de producir enzimas de interés
biotecnológico. La comprobación de estos supuestos constituye la base del presente estudio.
2. OBJETIVO
Estudiar el aislado B. subtilis DAF-1 en su capacidad para producir sustancias de
interés biotecnológico, como enzimas y antibióticos.
3. METAS
3.1 Estudiar el perfil enzimático extracelular de la cepa B. subtilis DAF-1.
3.2 Reunir una colección, lo más amplia posible, de bacterias y hongos de interés
médico, agrícola y biotecnológico, que sirva como blanco para estudiar el espectro
antibiótico de DAF-1.
3.3 Averiguar cualitativamente la capacidad antibiótica de B. subtilis DAF-1 sobre el
aservo microbiano reunido previamente.
3.4 Establecer un ensayo para evaluar cuantitativamente el efecto antibiótico de los
filtrados de DAF-1 sobre microorganismos de interés médico.
3.5 Investigar la cinética de producción del antibiótico usando microorganismos de
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������9
������������
interés médico como blanco.
3.6 Fraccionar por métodos cromatográficos o mediante extracción con solventes, el o los
antibióticos más activos.
3.7 Identificar la naturaleza química de las sustancias activas usando las técnicas
analíticas pertinentes.
4 JUSTIFICACIÓN
El estudio de la producción de sustancias de interés biotecnológico por el aislado
B. subtilis DAF-1 se justifica por las siguientes razones:
4.1 Bacillus sp. DAF-1, ya ha sido identificado por pruebas bioquímicas como
B. subtilis; esta especie es considerada como generalmente segura (GRAS), y por
tanto su empleo biotecnológico no ofrece riesgos a la salud.
4.2 Se tiene como antecedente que B. subtilis DAF-1 produce un antibiótico activo
contra una cepa del hongo dermatofito T. rubrum; por lo tanto podría actuar
también sobre otros microorganismos de interés médico.
4.3 Dado el incremento en las infecciones por hongos, resulta de interés el estudio de
nuevas cepas que eventualmente pudieran producir antimicóticos más eficaces.
4.4 Considerando que B. subtilis es una bacteria productora de diversos compuestos
de interés económico, puede especularse que B. subtilis DAF-1 debe producir
también gran cantidad de enzimas extracelulares. Algunas de estas podrían
tener importancia biotecnológica.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Integración de la colección microbiana
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������10
������������
Para estudiar el aislado B. subtilis DAF-1, se procedió a conformar una colección
bacteriana y de hongos que abarcaran microorganismos de interés médico, agrícola y
biotecnológico. A continuación se mencionan los laboratorios que nos proporcionaron los
microorganismos.
Microorganismos de interés médico.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB;
Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San
Luis Potosí y el Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco.
Microorganismos de interés agrícola.- Laboratorio de Fitopatología de la ENCB.
Microorganismos de interés biotecnológico.- Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco
y el Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB.
5. 2. Conservación de los microorganismos
5.2.1 A corto plazo
Para la conservación a corto plazo de la mayoría de los microorganismos, se hicieron
resiembras en tubos inclinado de agar nutritivo (AN), y agar soya triptocaseina (TSA) para las
bacterias; y de agar extracto de papa (PDA) y agar dextrosa Sabourad (SDA) para los hongos.
Las bacterias y hongos levaduriformes se sembraron por estría; los hongos filamentosos por
picadura. Una vez que se realizó la siembra, se incubó a 28°C durante 24 h para las bacterias y
de 48 h a 120 h para los hongos. Una vez que el microorganismo creció, se conservó en
refrigeración a 4°C. Las resiembras se repitieron de la misma forma cada mes para bacterias, y
cada tres meses para hongos.
5. 2. 2 A largo plazo
La cepa B. subtilis DAF-1 se conservó a largo plazo por liofilización de la siguiente
manera. Primero se cultivó en matraz Erlenmeyer de 125 mL, conteniendo 25 mL de caldo
nutritivo, a 28 °C durante 24 h a 180 rpm. Posteriormente se sembró masivamente en placas
de agar nutritivo, y se colocaron tiras de papel filtro estéril. Se incubó a 28 °C durante 24 h.
Luego cada tira de papel filtro con crecimiento microbiano fue colocada en tubos de plástico
estériles y que previamente se habían sellado por calor en un de sus extremos. Los tubos con
las tiras de papel fueron transferidos a un frasco estéril, y sometidos a congelación en una
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������11
������������
mezcla de hielo seco y alcohol. Se procedió enseguida a liofilizar por un periodo aproximado
de 8 h. Después los tubos fueron sellados por calor. Finalmente se verificó la pureza del
liofilizado reactivando la cepa en un medio líquido de caldo nutritivo y haciendo luego una
resiembra en placa de agar nutritivo. Después de una incubación de 24 h, se verificó la pureza
colonial y microscópica.
5.3. Evaluación del perfil exoenzimático de DAF-1
5.3. 1 Ensayos en medio sólido
El medio base utilizado estaba compuesto por NaCl 0.250 g; KH2PO4 0.375 g, Na2CO3
0.375 g, MgSO4 0.275 g; extracto de levadura 1 g y casaminoácidos 1 g, para 1 L de agua. El
pH se ajustó a 6.5. Como fuente de carbono se añadieron los diferentes inductores (Ver tabla 1)
y se adicionó finalmente el agar bacteriológico al 1.5 %.
La inoculación se realizó mediante picadura usando palillos estériles, a partir de
cultivos frescos (24 h) crecidos a 28 °C en placas de agar nutritivo. Una vez realizada la
inoculación, se incubó a 28°C durante periodos desde 24 hasta 120 h, dependiendo de la
enzima a evaluar. La actividad se determinó mediante la relación diámetro del halo de hidrólisis
entre el diámetro de la colonia. En algunos casos fue necesario añadir reveladores para
observar mejor los halos de hidrólisis. La tabla 1 resume información concerniente a estas
pruebas, y las cepas utilizadas como testigos positivos.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������12
������������
Tabla 1.- Enzimas evaluadas en medio sólido
ACTIVIDAD
EXOENZIMATICA
INDUCTOR
INDICADORES
Y/O AGENTE
REVELADOR
TESTIGO
POSITIVO
OBSERVACION
FUENTE
BIBLIOGRAFICA
Amilasas Almidón al 1 %
Solución de lugol al 1% (solución reveladora)
B. thuringiensis Halos de hidrólisis, sobre un fondo azul producido por la reacción del yodo (lugol) con el almidón remanente.
Dhawale et al. 1982.
Esterasas Tween 80 No requiere S. marcescens Halos granulosos de oleato de calcio formados alrededor de las colonias.
Lovell & Bibel, 1977.
Elastasas Elastina al 0.3 %
No requiere B. thuringiensis
Halos transparentes de hidrólisis de elastina.
Kaur et al. 1998, Janda 1986.
Fosfolipasas Yema de huevo al 3 %
No requiere B. thuringiensis
Halos opacos alrededor de las colonias producidas por las lecitinasas.
Crisope et al. 1976.
Lipasas Mantequilla Resarzurina al 5% (solución indicadora)
S. marcescens Halos de hidrólisis de color rosa producidos por el vire del indicador resarzurina.
Nava 1995.
Nucleasas (DNasas)
DNA al 0.03%
Azul de ortotoluidina al 0.0025 % (solución indicadora)
S. marcescens Halo de hidrólisis de color rosa alrededor de la colonia por el vire del indicador azul de ortotoluidina.
Lachica et al. 1971.
Pectinasas Pectina al 1 %
Cetrimida al 5 %
Erwinia carotovora
Halo transparente de hidrólisis alrededor de la colonia que es revelado al adicionar la solución de Cetrimida.
Hubbel et al. 1978.
Proteasas Caseina al 2 %
HgCl2 al 1% S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la digestión de caseína.
Rojas Avelizapa et al. 1999.
Quitinasas Quitina coloidal al 10 %
No requiere S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la hidrólisis de la quitina.
Rojas Avelizapa et al. 1999.
Quitosanasas Quitosana coloidal al 2.5 %
No requiere B. thuringiensis Halos transparentes alrededor de la colonia por hidrólisis de la quitosana.
Sánchez Pérez, 2000.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������13
������������
5.3.2 Ensayos en medio líquido
Las actividades de quitinasas, celulasas, queratinasas y colagenasas se evaluaron
mediante técnicas en cultivo sumergido, utilizando 5 mL del medio sintético basal ya descrito,
adicionando los diferentes inductores que se presentan en la tabla 2. Los cultivos fueron
incubados a 28°C, 180 rpm, durante periodos de 24 h hasta 120 h.
Algunas pruebas se basan en medir la absorbancia a 595 nm, del colorante azul
brillante de remazol liberado de los diferentes sustratos teñidos, los cuales son solubilizados por
las correspondientes actividades enzimáticas. Como testigos positivos se inocularon matraces
con cepas productoras patrón, y como testigos negativos se utilizaron matraces sin inocular.
Sólo en el caso de las quitosanasas se utilizó como inductor un sustrato sin teñir
(quitosana). La enzima secretada al medio degrada el polímero hasta pequeños oligosacáridos,
los cuales tienen capacidad reductora, y por lo mismo pueden ser evaluados mediante la técnica
de Miller con ácido 3,5 dinitrosalicílico. El compuesto anaranjado formado se evaluó a 535 nm
( ver tabla 2).
Tabla 2.- Enzimas evaluadas en medio líquido.
ACTIVIDAD EXOENZIMATICA
INDUCTOR � max TESTIGO POSITIVO FUENTE BIBLIOGRAFICA
Quitinasas
Quitina coloidal al 2% (teñida con azul brillante de remazol)
595 nm
S. marcescens
Gómez Ramírez, 1999.
Queratinasas
Lana al 0.4 % (teñida con azul brillante de remazol).
595 nm
B. thuringiensis
Cedillo Robles, 1998.
Celulasas
Celulosa coloidal al 5 % (teñida con azul brillante de remazol).
595 nm
Trichoderma viridae
Poincelot and Day, 1972.
Colagenasas Colágeno al 0.4 % (teñido con azul brillante de remazol)
595 nm
S. marcescens
O´Brien & Davis
et al. 1982
Quitosanasas
Quitosana coloidal al 2.5 %
535 nm
B. thuringiensis
Sánchez-Pérez, 2003.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������14
������������
5.4 Determinación del espectro antibacteriano de la cepa DAF-1
5.4.1 Preparación de las “placas césped”
Las bacterias “blanco” a estudiar se inocularon por asada en matraces Erlenmeyer de
125mL, conteniendo 25 mL de caldo nutritivo, y se incubaron a 28°C, durante 18 h a 180 rpm.
Posteriormente se realizaron 3 pases sucesivos, inoculando cada vez 0.1 mL de suspensión
bacteriana fresca en 25 mL de caldo nutritivo. Del último cultivo se tomó una alícuota de 0.5
mL y se mezclo suavemente con 50 mL de agar nutritivo fundido y mantenido a 50 °C.
Finalmente se adicionaron 4 mL de esta mezcla sobre placas conteniendo 21 mL de agar
nutritivo ya solidificado.
5.4.2 Ensayo del efecto antibacteriano
Las placas césped se inocularon en la parte central por picadura con la cepa
DAF-1, usando palillos estériles. El inóculo de DAF-1 provenía de placas de agar nutritivo
sembradas por estría cruzada, e incubadas a 28°C, durante 24 h. Las placas “césped” inoculadas
se incubaron a 28 °C durante 24 a 48 h. La acción antibacteriana se apreció por los halos de
inhibición formados alrededor de la cepa DAF-1.
5.5. Determinación del efecto antifúngico de la cepa DAF-1
Para la determinación de la actividad antifúngica en hongos levaduriformes se
utilizó la metodología de las “placas césped”, en agar dextrosa Sabourad.
Para evaluar la actividad antifúngica contra hongos filamentosos, cada uno de
éstos se sembró en el centro de una placa de agar papa dextrosa y se incubó a 28°C, por
periodos de 24 h o 48 h. Posteriormente se hicieron cuatro inoculaciones simétricas por
picadura de la cepa DAF-1 en torno a la colonia fúngica y se continuó incubando bajo las
mismas condiciones por periodos de hasta 2 semanas. La acción antifúngica se manifestó como
halos de inhibición alrededor de la cepa DAF-1.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������15
������������
5.6 Ensayo de la acción antibiótica usando un extracto libre de células de DAF-1
5.6.1 Cinética de crecimiento y producción de compuestos antibacterianos de DAF-1
B. subtilis DAF-1 se cultivó en matraces de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo
nutritivo. La incubación se llevó a cabo a 28°C, 180 rpm. Cada 3 h se colectaron muestras en
las primeras 24 h de incubación. Posteriormente se tomaron muestras cada 6 h hasta
cumplirse las 222 h que duró el estudio. Utilizando una alícuota de 0.1 mL de las muestras
colectadas se determinó la concentración bacteriana por cuenta viable. El resto de la muestra se
centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se filtró por membranas Millipore
(Millex, con tamaño de poro de 0.22 µm, en condiciones de esterilidad. Los filtrados obtenidos
se sometieron a un tratamiento térmico a ebullición durante 10 minutos para eliminar la acción
de enzimas extracelulares, y finalmente se conservaron en congelación.
5.6.2 Preparación del filtrado libre de células.
Inicialmente se evaluó la acción antibiótica utilizando los filtrados libres de células. Sin
embargo, para obtener efectos más claros, dichos filtrados se concentraron 10 veces mediante
liofilización. Posteriormente se impregnaron discos de papel filtro en condiciones de esterilidad,
con 200 µL del filtrado concentrado.
5.6. 3. Ensayo de la acción antibiótica contra cepas tipo.
Para ensayar el efecto antibiótico del filtrado libre de células ya concentrado, se
eligieron los siguientes microorganismos blanco. Como representativa de bacteria Gram (+) se
escogió a Staphylococcus aureus ATCC 25923. Como representativa de bacteria Gram (-) se
utilizó Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Como hongo levaduriforme se escogió
Candida albicans EH-155.
Se prepararon las “placas césped” como se mencionó anteriormente, y se colocaron
radialmente varios círculos de papel filtro impregnados con 200 µL del extracto concentrado.
Las placas se incubaron a 28°C, durante un lapso de 24 a 48 h y se midieron los halos de
inhibición.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������16
������������
6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Perfil exoenzimático 6.1.1 Evaluación en medio sólido
La cepa de interés, Bacillus subtilis DAF-1, fue proporcionada por los Dres. David
Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de Trinidad en
Sudamérica. Los datos concernientes a su perfil enzimático utilizando ensayos en placa, se
muestran en la Tabla 3. En cada caso la actividad de la cepa problema se compara con la de un
testigo positivo, generalmente un buen productor de la enzima en cuestión.
Tabla 3. Evaluación mediante ensayos en placa de algunas enzimas extracelulares de Bacillus subtilis DAF-1
Enzima Cepas utilizadas � colonia (mm)
� halo de hidrólisis (mm)
Relación de diámetros
Enzimas proteolíticas Proteasa Testigo (+) Sm WF 5 24 4.8
DAF-1 10 32 3.2 Elastasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 19 2.38
DAF-1 8 13 1.62 Enzimas que degradan lípidos o sustancias similares
Lipasa Testigo (+) SmWF 2 5 2.5
DAF-1 1 3 3 Fosfolipasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 21 2.62
DAF-1 11 13 1.18 Esterasa Testigo (+) SmWF 2 7 3.5
DAF-1 6 14 2.33 Enzimas que degradan polímeros
Amilasa Testigo (+) Bt-HD1 12 16 1.33
DAF-1 7 12 1.71 Pectinasa Testigo (+)
Erwinia carotovora 3 9 3
DAF-1 3 12 4 Quitinasa Testigo (+) SmWF 11 22 2.2
DAF-1 3 NSD - Quitosanasa Testigo (+) Bt-132 10 14 1.4
DAF-1 2 NSD - Nucleasa (DNasa) Testigo (+) SmWF 4 22 55
DAF-1 0.5 5 4 NSD.- No se observó halo de actividad enzimática.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������17
������������
6.1.2. Evaluaciones en cultivo sumergido.
Los resultados de las cinéticas de producción de colagenasa, queratinasa, quitinasa y
celulasa, que se realizaron en cultivo sumergido, pusieron de manifiesto que la cepa DAF-1
llegó a producir mayores niveles de queratinasa y colagenasa que las cepas patrón. Como es
habitual en este tipo de cinéticas, los trazos fueron completamente distintos e individuales para
cada cepa utilizada.
También se hizo un estudio de la producción de celulasas en cultivo sumergido,
utilizando celulasa coloidal teñida con azul de Coomassie. En este estudio se utilizó el hongo
celulolítico Trichoderma viridae como testigo positivo. Al cabo de 96 h, las lecturas a 595nm
fueron 1.3 para el testigo y 0.203 para DAF-1, lo que permite, suponer que esté último produce
celulasas en baja proporción. Cabe agregar que en los ensayos en placa, los resultados fueron
dudosos tanto para quitinasa como para celulasa, pero al realizar las pruebas en cultivo
sumergido en presencia de los sustratos teñidos correspondientes, se encontró que DAF-1
producía bajos niveles de quitinasa y celulasa.
Si se examinan globalmente los datos referentes a la producción de enzimas
extracelulares por B subtilis DAF-1, cabría hacer los siguientes comentarios. DAF-1 produjo
niveles elevados de la mayoría de las enzimas ensayadas, por ejemplo amilasa, pectinasa,
proteasa (caseinasa), elastasa, colagenasa, queratinasa, lipasa, fosfolipasa y esterasa. En cambio
produjo modestas cantidades de quitinasa, DNasa y celulasa.
La alta capacidad amilolítica de DAF-1 no es sorprendente, pues la producción
industrial de este tipo de enzimas se lleva a cabo con cepas debidamente seleccionadas de B.
subtilis. Lo mismo ocurre para la producción de proteasas de muy diversos tipos. Una prueba
de la capacidad proteolítica de DAF-1, es que produjo enzimas capaces de hidrolizar
substancias proteicas tan diversas como caseína, queratina, elastina y colágena. Algo semejante
ocurrió al estudiar las lipasas, pues DAF-1 produjo enzimas extracelulares capaces de hidrolizar
lípidos típicos, como los presentes en la mantequilla, o lípidos más complejos como las
lecitinas presentes en la yema de huevo, por las fosfolipasas. También produjo esterasas
capaces de hidrolizar sustratos semejantes a los lípidos, por tener ácido oleico o esteárico,
������������
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������18
������������
unido por un enlace ester a una molécula más compleja como ocurre en el detergente Tween
80.
Adicionalmente, otra enzima producida abundantemente por DAF-1 fue la pectinasa.
Esta enzima se considera típica de B. subtilis, y es una enzima muy utilizada en diversos
procesos industriales. Cabría añadir por último, que la cepa en estudio B. subtilis DAF-1
produjo niveles bajos de quitinasa y celulasa, pero nada de quitosanasa, lo cuál es típico de
diversas especies del género Bacillus. Lo mismo ocurrió con la producción de DNasas.
En suma, B. subtilis DAF-1 es una bacteria interesante en cuanto a su perfil enzimático
extracelular. Sería conveniente hacer un estudio más amplio al respecto, con el objeto de
encontrar enzimas novedosas que pudieran ser de interés biotecnológico. Una que pudiera ser
interesante es la queratinasa, para aprovechar biotecnológicamente algunos desechos
industriales como las plumas de aves, que en enormes cantidades se producen en los rastros
respectivos.
La cepa DAF-1 presenta una mayor actividad enzimática que las cepas testigo, en las
pruebas de proteasas, elastasas, pectinasas, colagenasas y queratinasas. Esto indica que sería
importante realizar estudios posteriores para tener mayor información sobre estas actividades
enzimáticas, que podrían ser de interés biotecnológico.
Cabe resaltar que B. subtilis por su capacidad de producir enzimas, es utilizado también
para la producción de saborizantes. Además por sobrevivir en un amplio intervalo de pH
alcalino (6.5 - 8.5) es utilizada también para el tratamiento de aguas residuales que contienen
materiales de origen orgánico, junto con otras bacterias del mismo género como B.
licheniformis. De este modo se logra la disminución de carbohidratos, proteínas, grasas, aceites
e incluso papel. Por otro lado, B. subtilis también es empleado como ingrediente en alimentos
para animales, debido a su status de bacteria GRAS, y en humanos se ha utilizando en la
industria panadera, y como ingrediente de algunas comidas y bebidas (©2006 BIO-CAT INC).
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������19
������������
6.2 Ensayo de la acción antibiótica de DAF-1
6.2.1 Integración de la colección microbiana, para realizar los ensayos
6.2.1.1. Colección bacteriana
Se conoce que las bacterias de la especie B. subtilis son capaces de secretar una gran
variedad de sustancias antibióticas. Para conocer el espectro de acción de los antibióticos
producidos por DAF-1, se procedió a conformar una colección microbiana. La tabla 4 muestra
la colección bacteriana reunida. Dentro de esta colección se incluyeron principalmente
bacterias de interés médico.
Tabla 4. Colección bacteriana reunida para la presente investigación
Microorganismo / cepa Forma Gram Área de interés Característica especial Procedencia
Aeromonas hydrophila Sch3
Bacilo
-
Médico sanitario
Contaminantes en alimentos marinos y agua.
LBM
Aeromonas hydrophila 839T
Bacilo
-
Médico sanitario
Contaminantes en alimentos marinos y agua.
LBM
Aeromonas hydrophila 54W
Bacilo
-
Médico sanitario
Contaminantes en alimentos marinos y agua.
LBM
Aeromonas hydrophila 56 W
Bacilo
-
Médico sanitario
Contaminantes en alimentos marinos y agua.
LBM
Aeromonas hydrophila 65 W
Bacilo
-
M édico sanitario
Contaminantes en alimentos marinos y agua.
LBM
Bacillus thuringiensis HD1
Bacilo
+
Biotecnológico
Producción de cristales insecticidas
LEM
Bacillus thuringiensis NGRA
Bacilo
+
Biotecnológico
Producción de cristales insecticidas.
LEM
Erwinia carotovora
Bacilo
-
Fitopatógeno
Produce pectinasas, es responsable de la pudrición blanda de la papa.
LEM
Escherichia coli 0536 Bacilo
-
Médico
Causa diarrea en niños.
LBM
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Bacilo
-
Médico
Puede invadir y causar infecciones de diversa gravedad.
LBM
Salmonella typhi 6539
Bacilo
-
Médico
Puede producir fiebre tifoidea si presenta el serotipo específico
LBM
Salmonella typhimuriumm 14028
Bacilo
-
Médico sanitario
Aislado de toxiinfecciones alimentarias.
LBM
Serratia marcescens WF
Bacilo
-
Médico�
Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.
LBM
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������20
������������
Serratia marcescens NIMA
Bacilo
-
Médico������������
Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.
LEM
Serratia marcescens WTR
Bacilo
-
Médico�
Origen hospitalario. Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.
LEM
Staphylococcus aureus ATCC 25923
coco
+
Médico������������ Presenta varios factores de virulencia como: proteína A, hemolisinas, exotóxinas. Resistencia a agentes antimicrobianos.
LBM
LBM.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB. LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB.
Tomado de (http://textbookofbacteriology.net/staph.html)
Las bacterias Gram (-), poseen una pared celular compuesta de lipopolisacáridos (LPS),
la cual les confiere ciertas características patógenicas. Dentro de este grupo se encuentran las
enterobacterias, que tienen importancia médica por producir infecciones nosocomiales y
septicemia, En la tabla 4 se resumen algunas características relevantes de las diferentes bacterias
incluidas como blanco para probar los antibióticos de DAF-1. Con respecto a las bacterias Gram
(+), solo se trabajó con S. aureus Este microorganismo es importante en el área médica ya que
puede producir infecciones con inflamación en las heridas, que pueden llegar a ser de tipo
sistémico y ocasionar la muerte; esto ocurre, cuando la infección no es correctamente tratada y
el microorganismo llega al torrente sanguíneo (http://textbookofbacteriology.net/staph.html).
6.2.1.2 Colección de hongos filamentosos y levaduriformes.
Con respecto a la colección fúngica reunida, está se presenta en la tabla 5. Se incluyen
principalmente tres áreas de interés:médica, fitopatológica y entomopatogenica.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������21
������������
Tabla 5. Colección de hongos reunida para la presente investigación
Nombre Clase Pared celular Área de interés Procedencia Hongos filamentosos
Alternaria sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano Entomopatógeno CIEP Aspergillus flavus Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista,
productor de micotoxinas entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.
LEM
Aspergillus flavus sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista, productor de micotoxinas, entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.
LF
Aspergillus fumigatus Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. LEM Aspergillus niger H-179 Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista.
Biotécnológico LEM
Aspergillus niger Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico.
CIEP
Curvularia sp. Quitina-β-glucano������������ Produce queratitis ocular. CIEP Fusarium sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LF Helmintosporium sp. Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LF Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500
Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno Fitopatógeno.
LM
Metharizium anisopliae 4681 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno LM Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500
Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno. LM
Mucor rouxii 080503 Zigomiceto Quitina- quitosana Produce mucomicosis gástrica. Biotecnológico.
LEM
Paecilomycyces fumosoroseus EH-452
Quitina-β-glucano Entomopatógeno, bioinsecticida. LM
Paecilomyces fumosoroseus EH-506
Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno, bioinsecticida. LM
Paecilomyces fumosoroseus EH-511
Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno, bioinsecticida. LM
Penicillium sp. Euascomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico.
LF
Trichophyton rubrum Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico.
LM
Trichoderma viridae Euascomiceto Quitina-β-glucano������������ Celulolítico, antagonico de fitopatógenos. LEM Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LM Hongos levaduriformes Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano Entomopatógeno LM Candida albicans EH-155 Blastomiceto manano-β-glucano Patógeno oportunista LM Candida albicans Blastomiceto manano-β-glucano Médico CIEP Cryptococcus neoformans basidiomiceto Quitina-β-glucano Médico CIEP
CIEP.- Facultad de Ciencias Químicas. Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San Luís Potosí LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB. LF.- Laboratorio de Fitopatoligía de la ENCB. LM.- Laboratorio de micología de la UAM-Xochimilco.������������
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������22
������������
6.2.2 Espectro antibacteriano de la cepa DAF-1
De la colección utilizada en este punto, se consideraron como representativas dos
bacteria, una Gram (+) y otra Gram (-). La primera fue Staphylococcus aureus ATCC2593 y la
otra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; ambas proporcionadas por el laboratorio de
Bacteriología Médica de la ENCB. La figura 1 muestra los halos de inhibición alrededor de la
colonia DAF-1, sembrada por picadura al centro de una placa “césped” preparada con las
bacterias blanco. Puede observarse que en ambos casos hubo inhibición del crecimiento.
Figura 1 .- Acercamientos fotográficos que muestran los halos de inhibición del crecimiento de las bacterias representativas de interés médico. S. aureus (A) y P. aeuruginosa (B). Las fotografías fueron tomadas después de una incubación de 24 h a 28 °C.
��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���A
Bacterias representativas Gram ( + ) Gram ( - ) Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 ATCC 27853
��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���B
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������23
������������
Cuando se realizó el espectro de acción antibiótica de DAF-1 sobre diferentes enterobacterias
de interés médico, se encontró que todas las bacterias utilizadas en este punto presentaron efecto
inhibitorio alrededor de la colonia DAF-1.
De los resultados referidos puede concluirse que el espectro de acción antibacteriana de DAF-1
es muy amplio, pues inhibió el crecimiento de todos los microorganismos utilizados. Los halos de
inhibición fueron evidentes y bien definidos alrededor de la colonia de DAF-1.
6.2.3 Espectro antifúngico de la cepa DAF-1
Aproximadamente la mitad de los hongos filamentosos en estudio fueron sensibles a los
antibióticos producidos por la cepa B. subtilis DAF-1. Estos fueron: Alternaria sp.; Aspergillus
niger (2 cepas); Curvularia sp.; Fusarium sp.; Helmintosporium sp.; Mucor rouxii;
Trichoderma viridae y Paecilomyces fumosoroseus (3 cepas).
Los hongos filamentosos que no tuvieron sensibilidad antifúngica fueron: Aspergillus
flavus sp. (2 cepas), Aspergillus fumigatus, Metharizium anisopliae (3 cepas), Trichophyton
rubrum y Verticillium lecanii. La cepa T. rubrum no presentó inhibición en su crecimiento
hifal, este dato es distinto al observado previamente en ensayos realizados en la isla de Trinidad,
lo que sugiere que la sensibilidad entre cepas puede ser distinta. No es de extrañar que algunas
cepas adquieran la capacidad de resistencia a bacterias productoras de antibióticos. Un ejemplo
son los estudios realizados por Lee et al. (2005), quienes encontraron que ciertos hongos
entomopatógenos como, Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride, Paecilomyces
fumosoroseus, Paecilomyces tenuipes y Verticillium lecanii eran capaces de producir
sustancias que les conferían resistencia a bacterias productoras de antibióticos como B. subtilis.
Con respecto a los hongos levaduriformes ensayados, todas las cepas presentaron
inhibición de su crecimiento (ver figura 2). Esto es importante, puesto que en los últimos años se
ha encontrado que C. albicans se encuentra cada vez más frecuentemente en casos clínicos de
candidiasis, principalmente, como un patógeno oportunista. Cryptococcus neoformans en
cambio es patógeno primario involucrado en micosis sistémicas de pulmones, piel, huesos,
visceras, y sistema nervioso central.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������24
������������
Hasta este momento tenemos que B. subtilis DAF-1 es una bacteria que presenta un
amplio espectro de acción antifúngica, principalmente con los hongos levaduriformes. En la
figura 2 se pueden apreciar que los halos de inhibición alrededor de la colonia DAF-1, se
encuentran bien definidos, y hasta se podría considerar que el tamaño de éstos halos son
constantes en las tres cepas estudiadas. Los resultados obtenidos sugieren que C. Albicans y C.
neoformans serían buenos candidatos para probar los productos que se obtengan de las
cinéticas de producción del compuesto o los compuestos antibióticos. Si comparamos los
diámetros de halos de inhibición obtenidos en el espectro antibacteriano son de menor tamaño
que los obtenidos en los hongos levaduriformes. Siendo así, que sería recomendable elegir a
los hongos levaduriformes como microorganismos blanco para los próximos experimentos. Con
respecto a los hongos filamentosos, se puede afirmar que existe efecto inhibitorio, sin embargo
este efecto es parcial y de diferente proporción para los diferentes hongos. Aproximadamente
solo el 50 % de los hongos filamentosos fueron inhibidos en su crecimiento hifal.
Figura 2.- Fotografías que muestran los halos de inhibición del crecimiento de algunos hongos levaduriformes.
Las placas conteniendo la levadura se trabajaron de la misma forma que el césped bacteriano. El medio de cultivo
fue SDA. B. subtilis DAF-1 se inoculó al centro de una placa donde previamente se había sembrado en forma
masiva (“césped”) el microorganismo en estudio. Las fotografías fueron tomadas después de una incubación de 24 h
a 28 °C.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������25
������������
6.3 Curva de crecimiento y producción del antibiótico por DAF-1
La cinética de crecimiento y producción del antibiótico, se llevó a cabo en matraces
Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 25 mL de caldo nutritivo. Las muestras se tomaron cada
tres horas, las primeras 24 h y posteriormente en su mayoría se tomaron muestras cada 3 h. Se
realizó la cuenta viable, el resto de la muestra se centrífugó y se filtró por esterilización en
membrana de 0.22 µm, posteriormente se le dio un tratamiento térmico a ebullición durante 10
minutos y finalmente se conservó en congelación. Se realizaron 2 cinéticas de producción. En
la primera cinética tuvo una duración de 216 h y se observó que la fase logarítmica era de tan
solo 15 h; una vez en la fase estacionaria se observaron fluctuaciones en la población
microbiana (ver figura 3), por lo que fue necesario realizar una segunda cinética de mayor
duración (222 h) y con mayor cantidad de muestras. En los tiempos comprendidos durante la
��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���Figura 3.- Cinética de crecimiento y producción de antibiótico por DAF.-1
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������26
������������
fase estacionaria y que presentaron un incremento en la población microbiana, fue necesario
tomar las muestras cada 3 h, antes y después de esos puntos. La segunda cinética fue similar
a la primera y se consideró que los resultados de ambas cinéticas son representativos. Las
fluctuaciones en la población microbiana durante la fase estacionaria pueden deberse a la
naturaleza de B. subtilis DAF-1, debido a que se trata de un microorganismo esporulado. Este
comportamiento es semejante al reportado por Gómez Ramírez (1999) para Bacillus
thuringiensis (Bt- LIRA), otra bacteria formadora de esporas.
6.4 Determinación de los tiempos de obtención de antibióticos sobre cepas tipo.
Para la determinación de los tiempos en que se produce el antibiótico, era necesario
diseñar un método cuantitativo o semicuantitativo para evaluar su efecto inhibitorio. En primera
instancia se realizó un método espectrofotométrico, el inóculo provino de una suspensión de
crecimiento microbiano en 25 mL de caldo nutritivo a 18 h, 28 °C y 180 rpm. Como
anteriormente se mencionó, las cepas elegidas como representativas fueron S. aureus, P.
aeruginosa y C. albicans. De las diferentes suspensiones microbianas se inocularon alícuotas
de 0.1 ml en 5 mL de caldo nutritivo contenidos en tubos de ensaye estériles, una vez
inoculados con los microorganismos blanco, se procedió a adicionar diferentes volúmenes de
los extractos tratados y obtenidos de la cinética de crecimiento y producción de antibióticos. Se
eligieron 2 volumenes, uno de 0.5 mL y otro de 1 mL; posteriormente se dejaron incubando a
28 °C, durante 24 h y en condiciones estáticas. En el experimento se incluyó un testigo
negativo, que consistió en 5 mL de caldo nutritivo sin inocular; un testigo positivo que consistió
en un tubo inoculado con el microorganismo, pero sin el extracto tratado; en vez de éste, se
adicionó agua estéril. Posteriormente se utilizó el método turbidimétrico a 600 nm. Los
resultados obtenidos (no mostrados) no fueron concluyentes. También se consideró que los
volúmenes de extracto adicionado eran muy grandes en proporción al volumen total. Por lo que
fue necesario encontrar otro método más conveniente.
El procedimiento alternativo consistió en concentrar previamente el extracto a ensayar.
Esto se realizó mediante liofilización, hasta concentración de 10 veces.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������27
������������
Para este experimento se utilizaron 200 µl del concentrado, que se impregnaron en
discos estériles de papel filtro. Tales discos con extracto concentrado se colocaron sobre
placas “césped” de los microorganismos blanco y se incubaron 24 y 48 h a 28 °C.
. Los halos de inhibición obtenidos en las diferentes cepas tipo de C. albicans fueron
relacionados con la cinética de crecimiento de DAF-1 y en ellas se observó que existe diferente
sensibilidad en cada uno de los microorganismo. Esto sugiere que pudieran producirse
diferentes antibióticos en los diferentes tiempos.
Para S. aureus se observaron 3 intervalos pequeños con baja inhibición; una al inicio de
la fase logarítmica, y 2 comenzando la fase estacionaria. Posteriormente la inhibición
desapareció y se observó nuevamente inhibición alrededor 200 h y hasta el final de la cinética (
216 h). Este mismo comportamiento se observó con las otras cepas utilizadas. Para P.
aeruginosa se observaron 3 intervalos de inhibición, el primero comenzó a las 15 h (comienzo
de la fase estacionaria) y finalizó alrededor de las 56 h, cuando ocurría una ligera disminución
de la población de DAF- 1. El segundo intervalo inhibitorio comenzó a las 126 h y desapareció
a las 144 h. El tercer intervalo de inhibición comenzó a las 210 h, aunque desapareció
rápidamente.
Finalmente se observó que los extractos concentrados de DAF-1 tuvieron efecto
inhibitorio sobre C. albicans, hasta las 78 h. Su efecto se hace más evidente conforme pasa el
tiempo. En conclusión, los perfiles de inhibición fueron distintos según el microorganismo
utilizado para el ensayo, lo que sugiere que pudieran estarse formando distintos antibióticos.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������28
������������
777... BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRAAAFFFÍÍÍAAA
1. Cedillo Robles, M. S. 1998. Implementación de un método espectrofotometrico
para evaluaciones de queratinasas.. Tesis profesional- LEM-ENCB
2. © BIO-CAT INC, 2006. Empresa Líder en la Industria de las enzimas.
http://espanol.bio-cat.com/products.php?sortby=type&type_id=11
3. Crisope, G. L., Fox, C. W & Marshall, R.T. 1976. Lecihin agar for detection of
microbial phospolipases. Appl. Environ. Microbiol. 31: 784-786.
4. Dauner, M., Soneregger, M., Szyperski, T., Wuethrich, K., Omán, H., Sauer, U. &
Baily, J. E., 2002. Intracellular carbon fluxes in rivoflavin- producing Bacillus
subtilis during growth on two- carbon substrates mixtures. Appl. Environ.
Microbiol. 68:1760-1771.
��� ���Figura 4.- Relación de la inhibición antibiótica de los productos obtenidos de la cepa B. subtilis DAF- 1 sobre C. albicans
Cinética de crecimiento y producción de antibiótico de DAF 1
Halo de inhibición en C. albicans.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������29
������������
5. Dhawale, M. R., Wilson, J. J., Khachatourians, G. G. & Ingledew W. M. 1982.
Improved method for detection of starch hydrolysis. Appl. Environ. Microbiol.
44:747-750.
6. Duitman, E. H., Hamoen, L. W., Rembold, M., Venema, G., Saenger, S. H.,
Wolfram., Bernhard, F., Reinhardt, R., Schmidt, M., Ullrich, C., Stwein, T.,
Leenders, F. & Vater, J. 1999 The mycosubtulin synthetase of Bacillus subtilis
ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino
transferase, and a fatty acid synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13294-13299.
7. Feignier, C., Besson, F. & Michel, G. 1996. Characterization of iturin synthetase in
the wild-type Bacillus subtilis strain producing iturin and in an iturin deficient
mutant. FEMS Microbiology 136:117-122
8. Gómez Ramírez, M. 1999. Las quitinasas de Bacillus thuringiensis cepa LIRA.
Tesis profesional. LEM-ENCB-IPN.
9. Hagelin, G., Oulie, I., Raknes, Ä., Undheim, K. & Clausen, O. 2004. Preparative
high-performance liquid chromatographic separation and analysis of the maltacine
complex- a family of cyclic peptide antibiotics from Bacillus subtilis. J. Chrom.
811:243-251.
10. Harwood, C. R. 1989. Introduction to biotechnology of Bacillus. En Bacillus. C. R.
Harwood (Ed). Plenum Press. New York, pp :1-4.
11. Heins, S.D., Manker, D. C., Jimenez, D. R., McCoy, R. J., Marrone, P. G. &
Orjala, J. E. 2003. Compositions and methods for controlling plant pests. Patents
United States 20030186852
http://www.freepatentsonline.com/20030186852.html@{patent:20030186852.
12. Hilton, M. D., Alaeddinoglu, N. G. & Demian, A. L. 1988 Synthesis of bacilysin
by Bacillus subtilis branches from prehenate of the aromatic amino acid pathway.
J. Bacteriol. 170 : 482-484
13. Hofemeister, J., Conrad, B., Adler B., Hofmeister, B., Feeshe, J. & Kucheryava,
N. 2004. Genetic analysis of polyketide-like antibiotics iron uptake and biofilm
formation by Bacillus subtillis a 1/3. Mol. Genet. Genomics 272:363-378.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������30
������������
14. Hubbel, D. H., Morales, V. M. & Umali- Garcia, M. 1978. Pectolytic enzymes in
Rhizobium. Appl. Environ. Microbiol. 35: 210-213
15. Janda, J. M. 1986. Elastolytic activity among Sthaphylococci. J. Clin. Microbiol.
24: 945-946.
16. Katz, E. & Demain, A. L. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry,
biogenesis, and possible functions. Bacteriol Rev. 41: 449-474
17. Kaur, M., Tripathi, K. K., Gupta, M., Jain, P. K., Bansai, M. R & Gupta, K. G.
1988. Production and partial characterization of elastase of Bacillus subtillis
isolated from the cervices of human females. Can. J. Microbiol. 34: 855-859.
18. Kunst, F., N., Ogasawara, I., Moszer, A. M., Albertini, G., Alloni, V., Azevedo, M.
G., Bertero, P., Bessieres, A., Bolotin, S., Borchert, R., Borriss, L., Boursier, A.,
Brans, M., Braun, S. C., Brignell, S., Bron, S., Brouillet, C. V., Bruschi, B.,
Caldwell, V., Capuano, N. M., Carter, S. K., Choi, J. J., Codani, I. F., Connerton,
A., Cummings, R. A. & Danchin, & otros 136 autores. 1997. The complete
genome sequence of the grampositive bacterium Bacillus subtilis. Nature
390:249-266.
19. Lachica, R. V. F., Genigeorgis, C. & Hoeprich, P.D. 1971. Methacromatic agar-
difussion method for detecting sthaphylococcal nuclease activity. Appl. Microbiol.
21: 585-587.
20. Lee, S.Y., Nakajima, I., Ihara, F., Kinoshita, H. & Nihira, T. 2005. Cultivation of
entomopathogenic fungi for the search of antibacterial compounds.
Mycopathologia 160:321-325.
21. Lovell, J. D. & Bibel, D. 1977. Tween 80 medium for differentiating non
pigmented for Serratia from other enterobacteriaceae. J. Clin Microbiol.
5: 245-247.
22. Nava-Fonseca, M. R. 1995. El perfil de enzimas extracelulares como criterio
coadyuvante en la identificación de Serratia marcescens. Tesis professional, LEM-
ENCB.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������31
������������
23. O´ Brien, M. & Davis H. G. 1982. Enzymatic profile of Pseudomonas maltophilia.
J. Clin. Microbiol. 16: 417-421.
24. Ozcengiz, G., Alaeddinoglu, G. & Demain, A. 1990. Regulation of biosynthesis of
bacilysin by Bacillus subtilis. Ind.l Microbiol 6:91-100.
25. Peypoux, F., Bonmatin, J. M. & Wallach, J. (1999) Recent trends in the
biochemistry of surfactin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:553–563.
26. Poincelot, R. P. & Day, P. R., 1972. Simple dye release assay for determining
cellulolytic activity of fungi. Appl. Microbiol. 23:875-879.
27. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M.S., and Deshpande, V.V. 1998. Molecular
and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
62: 597-635.
28. Rogers, H. J., Newton, G. G. F. & Abraham, E. P. 1965. Production and
purification of bacilysin. Biochem. J. 97:573-578.
29. Rojas Avelizapa, L. I., Cruz Camarillo, R. Guerrero, M. I. Rodríguez Vazquez, R
& Ibarra, J. E. 1999 Isolation of proteo-chitinolytic strain of Bacillus thuringiensis,
able to grow in shrimp waste media. J. Microbiol. Biotechnol. 15: 261-268.
30. Sánchez Pérez, O. 2000. La quitosana extracelular de Bacillus thuringiensis.
Tesis de Maestría LEM-ENCB.
31. Schallmey, M., Singh A. & Ward, P. O. 2004. Development in the use of Bacillus
species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50: 1-17.
32. Schnell, N., Entian, K. D., Schneider, U., Götz, F., Zahner, H., Kellner, R. & Jung
G. 1988. Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic
with four sulphide-rings. Nature 333:276-278.
33. Sjögren, J. & Magnusson J. 2003. Antifungal 3-hidroxy fatty acids from
Lactobacillus plantarum MiLAB14. Appl. Environ. Microbiol. 69:7554-7557.
34. Stein, T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific
functions. Mol. Microbiol. 1:1-13.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������32
������������
35. Stöver, A. & Driks, A. 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of
TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. J. Bacteriol. 181:1664-1672.
36. Ström, K., Sjórgen, J., Broberg, A % Schnúrer, J. 2002. Lactobacillus plantarum
MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo (l-Phe-L-Pro) and
cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid. Appl. Environ.
Microbiol. 68:4322-4327
37. Tamehiro, N., Okamoto-Hosoya , Y., Okamoto, S., Ubukata, M., Hamada M.,
Naganawa, H., & Ochi, K. 2002. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic
produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 315-320
38. Tsuge, K., Ano, T., Hirai, M., Nakamura, Y. & Soda, M. 1999. The genes degQ,
pps, and Ipa-8 (sfp) are responsible for conversion of Bacillus subtilis 168 to
plipastatin production. Antimicrob. Agents Chemother. 43 : 2183-2192.
39. Tsuge, K., Akiyama, T. & Shoda, M. 2001. Cloning sequencing and
characterization of the iturin A operon. J. Bacteriol 183: 6265-6273.
40. Vollenbroich, D., Pauli, G., Özel, M. & Vater, J. 1997. Antimycoplasma properties
and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus
subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 63:44-49.
41. Wakayama, S., Ishikawa, F. & Oishi, K. 1984. Mycocerein, a novel antifungal
peptide produced by Bacillus cereus. Antimicrobial agents and chemotherapy.
26: 939-940.
42. Westers, H., Dorenbos, R., Maarten van Dijl, J., Kabel, J., Flanagan, T., Devine,
K. M., Jude, F., Séror, S. J., Beekman, A., Darmon, E., Eschevins C., De Jorng,
A., Bron, S., Kuipers, O. P., Albertini, A. M., Antelmann, H., Hecker, M.,
Zamboni, N., Sauer, U., Bruand, C., Ehrlich, D. S., Alonso, J. C., Salas, M., &
Quax W. J. 2003. Genome engineering reveals large dispensable regions in
Bacillus subtilis. Mol. Biol. Evol. 20:2076-2090.
43. Wills, E. W., Redinho, M. R., Perfect, J. R. & Del Poeta, M. 2000. New potential
targets for antifungal. Development emerging therapeutic targets 4: 1-32.
������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������33
������������
44. Yu-Shu, H., Huey-Lin, G., Chung-Wu, Y., Scheng, J., Tschen, S., & Tung-Liu, S.
Aminoacids actived by fengycin synthetase Fen E. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 292: 789-793.
45. Zheng, G., Yan, L., Vederas, J., & Súber, P. 1999. Genes of the sbo-alb locus of
Bacillus subtilis are required for Production of the antilisterial bacteriocin
subtilosin. Journal of Bacteriol. 181: 7346-7355.
���
���