Profesor Patrocinante Dr. Claudia Quezada Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias
ESTUDIO DEL TRANSPORTADOR DE RESISTENCIA MULTIPLE A DROGAS MRP1 EN CELULAS INICIADORAS DE GLIOBLASTOMA MULTIFORME H UMANO
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
JOSÉ DELLIS ROCHA PÉREZ
VALDIVIA – CHILE 2013
Agradecimientos
En primer lugar a mi familia por acompañarme en este proceso. A mi profesora tutora
por permitirme trabajar en su laboratorio. Finalmente al proyecto que permitió esta
investigación, Fondecyt 1121121
I
1. RESUMEN ................................................................................................................. 1
1.1 SUMMARY .............................................................................................................. 2
2. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 3
2.1 Introducción al problema. ........................................................................................ 3
2.2 Células iniciadoras o cáncer stem cells. ................................................................. 7
2.3 Tumores cerebrales y Glioma stem cells .............................................................. 10
2.4 Resistencia múltiple a drogas ............................................................................... 13
2.5 Marcador de superficie celular CD133 .................................................................. 17
2.6 Marcador de superficie celular CD44. ................................................................... 19
2.7 Tesis propuesta ..................................................................................................... 20
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................ 22
3.1 Hipótesis ............................................................................................................... 22
3.2 Objetivo general .................................................................................................... 22
3.3 Objetivos específicos ............................................................................................ 22
4. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 23
4.1 Materiales ............................................................................................................. 23
4.1.1 Material Biológico............................................................................................ 23
4.1.2 Reactivos ........................................................................................................ 23
INDICE DE CONTENIDOS
II
4.1.3 Equipos ........................................................................................................... 25
4.2 Métodos ................................................................................................................ 25
4.2.1 Cultivo de líneas celulares de GBM. ............................................................... 25
4.2.2 Cultivos de GSCs. ........................................................................................... 26
4.2.3 Extracción de RNA total de células de GBM. .................................................. 26
4.2.4 Extracción de RNA total de GSCs. ................................................................ 27
4.2.5 Síntesis de cDNA ............................................................................................ 28
4.2.6. PCR semi cuantitativo .................................................................................... 29
4.2.7. PCR tiempo real............................................................................................. 31
4.2.8 Análisis electroforético de productos de PCR en geles de agarosa................ 31
4.2.9 Ensayo de transporte por acumulación de 5-carboxifluoresceína diacetato
(CFDA) en células de GBM ..................................................................................... 32
4.2.10 Ensayo de transporte por acumulación de 5-carboxifluoresceína diacetato
(CFDA) en GSCs. .................................................................................................... 32
4.2.11 Extracción de proteínas totales ..................................................................... 33
4.2.12 Determinación de la concentración de proteínas totales .............................. 34
4.2.13 Análisis electroforético de proteínas en geles de poliacrilamida- SDS ......... 34
4.2.14 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF ........................... 35
4.2.15 Detección inmunológica ................................................................................ 36
4.2.16 Inmunocitoquímica de fluorescencia ............................................................. 37
III
4.2.17 Proceso de selección de GSCs/CD133+ y GSCs/CD133-............................ 38
4.2.18 Proceso de selección de GSCs/CD44+ y GSCs/CD44-. .............................. 39
4.2.19 Ensayo de quimiosensibilización en GSCs. .................................................. 39
4.2.20 Estadística .................................................................................................... 40
5. RESULTADOS ........................................................................................................... 41
5.1 Estandarización cultivo GSCs ............................................................................... 41
5.2 Análisis comparativo de la expresión, localización y actividad del transportador
MRP1 entre las células de GBM y las GSCs. ............................................................. 52
5.3 Comparación en la expresión, localización y actividad de MRP1 entre las células
CD133- y CD133+ ....................................................................................................... 61
5.4 Análisis de expresión de MRP1 en GSCs CD44+ y CD44-. .................................. 67
5.5 Estudio de la quimiosensibilización en GSCs CD44+ y CD44-. ............................ 70
6. DISCUSIÓN. .............................................................................................................. 73
7. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 81
IV
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo de resistencia a drogas por CSCs. ....................................................... 9
Figura 2. Comparación de respuesta de la línea celular G44 y T98 ante las condiciones
de cultivo para la generación de neuroesferas. .............................................................. 43
Figura 3. Seguimiento de la proliferación celular de la línea T98 en medio MNE. ......... 44
Figura 4. Seguimiento de la proliferación celular de la línea T98 sembradas en placas
de 6 pocillos. .................................................................................................................. 46
Figura 5. Análisis de la incidencia del medio de cultivo en la generación de
neuroesferas. ................................................................................................................. 49
Figura 6. Análisis de la proliferación celular de la línea T98 cultivadas en medio MNE. 51
Figura 7. Seguimiento de la proliferación celular y respuesta de la línea U87. .............. 53
Figura 9. Expresión de MRP1 en la línea U87 (células diferenciadas) y en las GSCs
provenientes de la misma línea celular por RT-PCR. ..................................................... 57
Figura 12. Análisis de la actividad de MRP1 en la línea U87 y las GSCs/U87. .............. 60
Figura 14. Diferencias en los procesos de diferenciación entre las células CD133- y
CD133+. ......................................................................................................................... 65
Figura 15. Expresión de MRP1 en las células CD133- y CD133+ por RT-PCR. ............ 66
Figura 16. Expresión y localización de MRP1 por inmunofluorescencia en las GSCs
CD133- y CD133+. ......................................................................................................... 68
Figura 17. Análisis de la actividad de MRP1 en las GSCs CD133- y CD133+. .............. 69
Figura 18. Expresión de MRP1 en las GSCs CD44+ y CD44-. ...................................... 71
V
Figura 19. Ensayo de quimiosensibilización usando la droga antitumoral vincristina en
las GSCs CD44+. ........................................................................................................... 72
VI
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Partidores y productos de PCR para la amplificación de los transcritos
de los genes en estudio..................................................................................................30
VII
LISTA DE ABREVIATURAS
ABC : ATP binding cassette.
ABCP : Placenta-specific ATP-binding cassette transporter.
B-27 : Suplemento de cultivo libre de suero
BCA : Bicinchoninic acid.
BSA : Bovine serum albumin.
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's medium.
DMEM-F12 : Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12.
DPBS : Dubelcco’s Phosphate buffered saline.
DTT : Dithiothreitol.
EGF : Epidermal growth factor
FGF : Fibroblastic growth factor.
FITC : Fluorescein isothiocyanate.
G44 : Células de glioma.
GBM : Glioblastoma multiforme.
GSH : Glutathion.
IL-2 : Interleukin-2.
LIF : Leukaemia inhibitor factor
MACS : Magnetic activated cell sorting
MDR : Multidrug resistance.
MNB : Neurobasal medium
MNE : Neurosphere’s medium
VIII
MEM : Minimum Essential Medium Eagle.
MRP1 : Multidrug resistance-associated protein 1.
MRPs : Proteínas de resistencia a múltiple a drogas.
NBD : Nucleotide-binding domain.
PCR : Polymerase chain reaction.
RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction.
T98 : Células de glioblastoma.
TAE : Tampón acetato EDTA.
TMD : Transmembrane domain.
U87 : Células de glioblastoma
UV : Ultravioleta.
1
1. RESUMEN
Hay un conjunto de evidencias que señalan que los tumores agresivos son
generados por una subpoblación de células iniciadoras auto renovantes y multipotentes
llamadas cáncer stem cells (CSCs). Estas células son intrínsecamente quimio
resistentes y por lo tanto se especula que ellas asumen el rol de mantención y
proliferación del tumor. Además, las CSCs tienen una alta expresión de transportadores
de múltiple resistencia a drogas (MDR), los cuales son proteínas especializadas
encargadas de la expulsión de drogas antineoplásicas al espacio extracelular evitando
así los daños citotóxicos.. En nuestro laboratorio, sabemos que el transportador MDR
más sobre-expresado en células diferenciadas de glioblastoma multiforme (GBM) es
MRP1, por lo tanto nos hemos planteado como hipótesis, que las GSCs tienen aún más
alta la expresión y actividad de este transportador que las células diferenciadas del
GBM, y por ello serían más quimiorresistentes al tratamiento quimioterapéutico.
Nosotros implementamos el método de cultivo celular para la generación de
neuroesferas como fuente de las GSCs para caracterizar al transportador MRP1 tanto a
nivel de expresión como actividad. Nuestros principales resultados nos muestran que la
quimiosensibilización de estas células estaría mediada principalmente por la
subpoblación GSCs/CD44+, ya que estas células poseen un mayor contenido del
transcrito de MRP1 (75%). Nosotros concluimos, que un mecanismo eficaz para inhibir
la quimioresistencia en este tumor, podría ser mediante la inhibición de la expresión o
actividad de transportadores MDR, específicamente en la subpoblación de las GSCs
positivas para el marcador CD44 donde se encuentra sobre-expresado el transportador
MRP1.
2
1.1 SUMMARY
There are several evidences suggesting that aggressive tumors are generated by a
subpopulation of self-renewing initiating and multipotent cells called cancer stem cells
(CSCs). These cells are inherently chemoresistant and therefore it is speculated that
they assume the role of maintenance and proliferation of the tumor. In iddition, CSCs
have high expression of multiple drug resistance (MDR) transporters, wich are
specialized proteins responsible for the expulsion of antineoplasic drugs into the
extracellular space thereby preventing cytotoxic damage. In our laboratory, we know that
the most overexpressed MDR transporter in differentiated cells of Glioblastoma
Multiforme (GBM) is MRP1, so we've hypothesized that GSCs have even higher
expression and activity of this transporter that differentiated cells of GBM, and therefore
would be more resistant to chemotherapeutic treatment. We implemented the cell
culture method for generating neurospheres as source of GSCs to characterize both
MRP1 transporter expression level and activity. Our main results show that
chemosensitization of these cells would be mediated primarily by GSCs/CD44+
subpopulation, since these cells have higher content of the transcript MRP1 (75%). We
conclude, that effective mechanism to inhibit tumor chemoresistance may be by
inhibiting expression or activity of MDR transporters, specifically in the subpopulation of
GSCs positive for CD44 which is overexpressed MRP1 transporter.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Introducción al problema.
Actualmente el cáncer es uno de los principales problemas de salud pública en el
mundo (Siegel, Naishadham et al. 2013). Se ha reportado que en Estados Unidos el
25% de las muertes serían causadas por esta enfermedad (Siegel, Naishadham et al.
2013), mientras que en Chile corresponde a la segunda causa de muerte,
representando el 23% en hombres y el 26% en mujeres. A pesar que la incidencia de
tumores cerebrales y del sistema nervioso central es baja, su mortalidad representa un
valor cercano al 3% del total de muertes por cáncer (O'Brien, Cokkinides et al. 2003;
Jemal, Siegel et al. 2010).
Los gliomas corresponden a un conjunto de tumores primarios cerebrales que
poseen características similares en morfología y expresión génica con la glía, astrocitos,
oligodendrocitos y sus precursores (Holland 2001), y se pueden clasificar
histológicamente en astrocitomas, oligodendrogliomas y oligoastrocitoma (Maher,
Furnari et al. 2001; Declèves, Amiel et al. 2006). La clasificación más utilizada es la
proporcionada por la Organización Mundial de la Salud (WHO) que los ha dividido en 4
grados, el astrocitoma pilocítico (grado I) el astrocitoma difuso o de bajo grado (grado
II), astrocitoma anaplásico (grado III) y el glioblastoma multiforme (grado IV) (Holland
2000; Kleihues and Sobin 2000; Louis, Holland et al. 2001). De todos los tumores
primarios cerebrales el Glioblastoma multiforme (GBM) representa el 50% de los casos
y corresponde al tumor de mayor agresividad y de peor pronóstico (Franco-Hernandez,
Martinez-Glez et al. 2007; Clarke, Butowski et al. 2010), además el tiempo de vida de
4
quienes lo padecen es dramáticamente bajo (Tran and Rosenthal 2010; Quezada,
Peignan et al. 2011). El tratamiento para combatir este tumor consiste esencialmente en
la remoción quirúrgica en conjunto con radio y quimioterapia (Colman and Aldape 2008)
apesar de ello, su mortalidad es dramáticamente alta y la sobrevida de estos pacientes
no supera los doce meses (Krex, Klink et al. 2007; Virrey, Golden et al. 2009). La alta
tasa de mortalidad de GBM se debe en parte a que la resección quirúrgica no garantiza
la eliminación definitiva de la masa tumoral, ya que este es un tumor altamente invasivo
e infiltrativo, lo cual favorece la reincidencia (Lu and Shervington 2008; Garrido, Munoz
et al. 2011). La incidencia de tumores cerebrales ha aumentado en las últimas décadas,
en Estados Unidos, por cada año unas 17.500 personas aproximadamente padecen de
cáncer cerebral (Rahman, Smith et al. 2010), representando el 2,4% de las muertes. En
Chile, la tasa de mortalidad varía de 1 a 2 cada 100.000 personas con una tendencia en
aumento y se estima que el porcentaje de incidencia de tumores cerebrales malignos es
similar a la mortalidad (1,5 cada 100.000 personas) (Quezada, Peignan et al. 2011). Las
principales características del GBM son su abundante vascularización y la
heterogeneidad celular, utilizados actualmente como criterios de diagnóstico (Ahluwalia
and Gladson 2010; Rahman, Smith et al. 2010; Takano 2012). Sin embargo, la
propiedad más trascendental y distintiva es su extremada quimio resistencia debido a
las importantes consecuencias clínicas implicadas, como la ineficacia de las terapias
convencionales usadas para su tratamiento (Rahman, Smith et al. 2010). Uno de los
mecanismos principales que confieren quimio resistencia a las células tumorales es la
sobrexpresión y actividad de transportadores de la familia ABC (poseen un dominio
ATP-binding cassette). Estos transportadores median la expulsión de drogas
5
antineoplásicas al espacio extracelular así protegiendo a estas células de los efectos
citotóxicos (Gatti, Beretta et al. 2009), ya que provocan una disminución de los niveles
intracelulares de estos fármacos (Declèves, Amiel et al. 2006). El transportador que
media la quimio resistencia en gliomas de alto grado es MRP1, siendo éste el más
sobre expresado y activo con respecto al resto de transportadores pertenecientes a la
misma familia (Peignan, Garrido et al. 2011). Se ha determinado que al tratar a
pacientes con gliomas de alto grado usando las drogas antineoplásicas vincristina, taxol
y etopósido no se observa respuesta al tratamiento, y una razón probable es que estas
drogas son sustratos de MRP1, cuya actividad disminuye la concentración de estas
drogas en el interior de la célula e impide la efectividad del tratamiento (Peignan,
Garrido et al. 2011).
Por otro lado, se ha descrito en ciertos cáncer, algunos de ellos el cáncer de
mama, melanoma, colon y el glioblastoma, que existe una sub población celular de
fenotipo multipotente y auto renovante, a las cuales se les ha denominado Cancer
stem-like cells (Azari, Millette et al. 2011; De Filippis and Binda 2012; Maugeri-Sacca, Di
Martino et al. 2013). En el caso de GBM, hay evidencias consistentes que demuestran
la existencia de está subpoblación de células tumorales y que tienen gran potencialidad
para la iniciación y repoblación tumoral, las cuales son conocidas como glioblastoma
stem-like cells (GSCs) o células iniciadoras de tumor (TICs) (Singh, Clarke et al. 2003;
Vescovi, Galli et al. 2006; Natsume, Kinjo et al. 2011; Tabatabai and Weller 2011)
(Huang, Cheng et al. 2010; Campos and Herold-Mende 2011). Se ha descrito que las
GSCs presentan una resistencia intrínseca tanto a la quimioterapia como a la
radioterapia, incluso más que las células que conforman la masa tumoral (Bulks cells)
6
(Bao, Wu et al. 2006; Liu, Yuan et al. 2006; Rich and Bao 2007; Bleau and Holland
2009; Jin, Zhao et al. 2010). Esto último, sumado a su capacidad multipotente, ha
permitido asignarles el rol protagónico en la recurrencia tumoral (Huang, Cheng et al.
2010; Zhao, Dong et al. 2010; Tabatabai and Weller 2011). Hay bastantes evidencias
que señalan que cultivos de tumores de meduloblastomas y GBM, son capaces de
promover la proliferación y crecimiento de las GSCs (cultivo de neuroesferas) y que
cuando son trasplantados en ratones inmunodeficientes, estas células muestran la
capacidad de inducir la formación de tumores (Singh, Clarke et al. 2003; Singh, Hawkins
et al. 2004). Se ha descrito, que estas células expresan en la superficie de membrana
distintos marcadores de células madre (Keysar and Jimeno 2010), uno de los más
utilizados ha sido CD133 (Uchida, Buck et al. 2000; Lee, Kessler et al. 2005). CD133 es
una glicoproteína de superficie de la familia de las promininas, siendo ésta la primera en
ser descrita dentro de esta familia, la cual es ampliamente utilizada como marcador de
GSCs (Wang, Chadalavada et al. 2010) siendo además reportada como esencial para
la mantención y del potencial tumorigénico del tumor (Brescia, Ortensi et al. 2013). Otro
marcador importante es CD44, cuya expresión se ha asociado a un mal pronóstivo de la
enfermedad, viabilidad celular y responsable en procesos infiltrativos y metastásicos
(Bates, Edwards et al. 2001; Marhaba and Zoller 2004; Anido, Saez-Borderias et al.
2010; Jijiwa, Demir et al. 2011).
Considerando las investigaciones previas de nuestro laboratorio, en donde se ha
demostrado que el transportador MRP1 es el más sobreexpresado en glioblastoma,
convirtiéndolo en un blanco terapéutico atractivo para la reversión de la resistencia
múltiple a drogas, y que en este tumor existe una subpoblación celular con
7
características de células troncales que pueden reestablecer una población tumoral y
que se ha descrito como altamente quimio y radioresistente, pensamos que el
fenómeno MDR estaría potenciado por estas células iniciadoras, las que deberían
tener sobreexpreado o más activo el transportador MRP1 que en el resto del tumor
(bulks cells); por lo que nos planteamos como hipótesis que en las GSCs hay una
mayor expresión y actividad de MRP1 con respecto a las células diferenciadas de GBM,
por lo que nuestro principal objetivo fue caracterizar y comparar dicha expresión y
actividad entre estas dos poblaciones, para determinar si la reincidencia tumoral o el
fracaso terapéutico en el GBM, podría estar dado por la alta expresión y actividad de
este transportador en las GSCs. Para ello, decidimos montar y estandarizar la técnica
de cultivo para la obtención de glioblastoma stem cells y realizar ensayos comparativos
para pesquisar posibles diferencias significativas en cuanto a la expresión, localización
y actividad de MRP1 en las GSCs y las bulks cells. Además de esto, realizamos
ensayos en las GSCs separadas por el marcador CD133 y CD44, para determinar si la
presencia de estos marcadores le otorga a estas células una mayor expresión y
actividad de MRP1 y por ende una mayor quimioresistencia.
2.2 Células iniciadoras o cáncer stem cells.
Los estudios en células madre hematopoyéticas y leucemia han traído el
concepto de “cáncer stem cells” (CSC) (Reya, Morrison et al. 2001), también conocidas
como células iniciadoras del cáncer (CIC). Las células madre son células que
mantienen la capacidad de auto-renovación y la capacidad de generar células maduras,
por lo general un pequeño grupo de células dentro de los tejidos tienen esta capacidad
8
(Lim, Llaguno et al. 2011). A la fecha un número de órganos han mostrado poseer de
éstas células madre, estos incluyen sangre, cerebro, próstata, colon, pulmón, páncreas,
piel y glándula mamaria (Cotsarelis, Sun et al. 1990; Gage, Coates et al. 1995;
Taniguchi, Toyoshima et al. 1996; Cornelius, Tchernev et al. 1997; Doetsch, Caille et al.
1999; Collins, Habib et al. 2001; Kim, Jackson et al. 2005; Shackleton, Vaillant et al.
2006; Barker, van Es et al. 2007). El aislamiento de las células madre depende en gran
medida de sus marcadores de membrana y de las condiciones de cultivo selectivos que
favorezcan su crecimiento, con respecto a las células diferenciadas (Lim, Llaguno et al.
2011). Para ciertos tipos de cánceres, se ha propuesto que estas células iniciadoras
son el origen del tumor (Lim, Llaguno et al. 2011; Moitra, Lou et al. 2011; Brescia,
Ortensi et al. 2013), esto conjunto con la propiedad de quimio resistencia intrínseca que
se le ha atribuido a estas células, reafirma su calidad de blanco terapéutico y el inicio de
numerosas investigaciones relacionadas con estas propiedades (Moitra, Lou et al.
2011). El modelo de la resistencia a drogas otorgado por estas cancer stem cells,
consiste en que dentro de una masa tumoral se encuentra esta subpoblación celular
con su progenie diferenciada, después de la exposición con la droga terapéutica
solamente las células con fenotipo stem-like cells sobreviven y resisten el tratamiento
Moitra, Lou et al. 2011). Posteriormente son estas mismas células las que se dividen y
repueblan el tumor con ambos tipos celulares stem-like cells y células diferenciadas
(Figura 1). Por otro lado, la participación de éstas células en la patogénesis de los
tumores cerebrales ya ha sido reportada, donde se han aislado células de tumores
primarios de humano utilizando el cultivo de neuroesferas, en donde las células
9
Figura 1. Modelo de resistencia a drogas por CSCs. El modelo indica que dentro de
un tumor existe una subpoblación celular conocida como Tumor stem cells o cáncer
stem cells. Estas células sobreviven una terapia con drogas y colonizan el tumor dadas
sus propiedades altamente proliferativas y auto renovantes (Moitra, Lou et al. 2011).
10
progenitoras crecen en condiciones libres de suero y suplementado con factores de
crecimiento. (Singh, Clarke et al. 2003; Singh, Hawkins et al. 2004). Cuando cultivos de
neuroesferas de meduloblastomas y GBM son transplantados en ratones
inmunodeficientes, estas CICs presentes en las neuroesferas mostraron inducir la
formación de tumores más rápido que el resto del tumor (Singh, Clarke et al. 2003;
Singh, Hawkins et al. 2004).
2.3 Tumores cerebrales y Glioma stem cells
Los gliomas son tumores derivados de células gliales que afectan al sistema
nervioso central (SNC), los cuales se pueden originar en la sustancia blanca y
desarrollarse, ya sea de novo dando origen a un tumor primario o a partir de un
astrocitoma de bajo grado (grado I o II) originando un tumor secundario, estos tumores
corresponden al 80% de todas las neoplasias malignas cerebrales (Bulnes, Bengoetxea
et al. 2012). Esta enfermedad ocurre tanto en niños como adultos y corresponde a la
segunda causa de muerte de cáncer pediátrico, estando en primer lugar la leucemia
(Valera, de Freitas Cortez et al. 2009; Cage, Mueller et al. 2012). En las dos últimas
décadas, han habido grandes avances tecnológicos para contribuir en la detección
temprana de este tipo de neoplasia, sin embargo no se han desarrollado mejoras para
el Glioblastoma Multiforme (GBM), el cual es la forma más común de tumores
cerebrales, y el que tiene el peor pronóstico (Van Meir, Hadjipanayis et al. 2010). Este
tumor es clasificado por la organización mundial de la salud como astrocitoma grado IV
(Clarke, Butowski et al. 2010; Quezada, Peignan et al. 2011). Dentro de las
características histológicas que permiten el diagnóstico de este tipo de cáncer, se
11
encuentra su heterogeneidad celular, atipia nuclear, elevada actividad mitótica, necrosis
y marcadores de proliferación endotelial (Rahman, Smith et al. 2010). Además, son
altamente infiltrativos y reincidentes pero raramente se produce metástasis fuera del
SNC. Es importante destacar que en estos pacientes la barrera hematoencefálica (BHE)
se encuentra dañada, con hiperplasia endotelial y pérdida de uniones estrechas entre
células endoteliales, lo que nos indicaría que la poca efectividad de la terapia no se
debe a la BHE, si no a propiedades específicas de las células del glioma (Davies 2002;
Lee, Kim et al. 2006).
En las últimas décadas la incidencia de los tumores cerebrales ha ido
incrementando notoriamente, cada año aproximadamente 17.500 personas padecen de
cáncer cerebral en Estados Unidos (Rahman, Smith et al. 2010) y la tasa de mortalidad
por cáncer cerebral en Chile varía de 1 a 2 por 100.000 habitantes con una marcada
proyección al ascenso (Díaz and Villegas. 2006). Se estima que el porcentaje de
incidencia de tumores cerebrales malignos es similar a la tasa de mortalidad, lo que
delata las falencias que existen en el manejo de estos pacientes (Quezada, Peignan et
al. 2011).
Actualmente el GBM es tratado primariamente por resección quirúrgica y su
ineludible recurrencia mediante quimioterapia con la droga temozolomida (TMZ), la cual
es un agente alquilante que en estudios clínicos ha demostrado un leve aumento de la
tasa de sobrevida de los pacientes desde 12 meses (solo radioterapia) a 15 meses
cuando la aplicación de drogas antineoplásicas es acompañada de radioterapia (Stupp,
Gander et al. 2001; Chang, Khuntia et al. 2007; Norden, Drappatz et al. 2009). Esta
pobre respuesta a la temozolomida en células de glioma se debe a una resistencia
12
particular a agentes alquilantes debido a la actividad de la enzima O-(6)-metilguanina-
DNA metiltransfera (MGMT), la cual es una proteína reparadora del DNA alquilado
(Hegi, Liu et al. 2008; Sengupta, Marrinan et al. 2012). Además, TMZ no tiene efecto y
no inhibe el proceso de autorenovación de las GSCs (glioblastoma stem-like cells)
(Huang, Cheng et al. 2010). Actualmente, está subpoblación es de gran interés por su
distintiva capacidad de producir el tumor y mantener la viabilidad celular a pesar del
tratamiento, siendo responsable del crecimiento y recurrencia (Zhao, Dong et al. 2010).
Las GSCs presentan características comunes con células madres normales, como la
capacidad de originar diversas poblaciones celulares (multilinaje) y autorenovación (Xu,
Wu et al. 2013). Por otro lado, también tienen el potencial para diferenciarse en
astrocitos, oligodendrocitos y neuronas inmaduras (Huang, Cheng et al. 2010). Esta
subpoblación celular crece en cultivo como neuroesferas no adherentes en ausencia de
suero bovino fetal, en un medio suplementado con bFGF (factor básico de crecimiento
de fibroblastos), EGF (factor de crecimiento epidérmico) y B27, pudiendo ser
identificadas y aisladas en base a sus marcadores de superficie celular (CD133, Sox2,
CD44 y Nestina), siendo uno de los más utilizados CD133, proteína de membrana de
unión a colesterol, originalmente identificada como un antígeno de superficie expresada
en células madres hematopoyéticas y cuya función biológica es aún desconocida
(Zhao, Dong et al. 2010; Xu, Wu et al. 2013). Actualmente, en tumores cerebrales se ha
correlacionado el nivel de expresión de los marcadores CD133 y CD44 con mal
pronóstico de la enfermedad (Liu, Yuan et al. 2006; Choy, Nagasawa et al. 2012;
Khoshnevisan 2012) A su vez, se ha sugerido que este pequeño grupo de células
podría tener un papel importante en invasión al tejido adyacente, específicamente en el
13
fenómeno de resistencia múltiple a drogas y angiogénesis (Tabatabai and Weller 2011;
Lathia, Li et al. 2012). Se ha propuesto que una GSC puede definirse como una célula
que es capaz de mantener y propagar un glioma mediante procesos de proliferación
celular continua y de auto renovación, manteniendo una copia fenotípica del tumor
parental. Además de eso, una GSC debe ser capaz de mantener su propia
subpoblación celular con la intención de generar células tipo stem-like, mediante
múltiples divisiones celulares, por lo tanto, una GSC incapaz de efectuar procesos auto
renovantes agota la fracción stem-like encargada de la propagación tumoral
(Heddleston, Hitomi et al. 2011). Por esto diseñar nuevas estrategias terapéuticas que
tengan como blanco las GSCs parece ser una alternativa prometedora para tratar este
tipo de tumor. Actualmente se utilizan las técnicas de sorting celular por activación
magnética (MACS) y sorting celular por activación fluorescente (FACS) para aislar
células que expresen los marcadores adecuados, en una muy alta variedad de tipos
celulares (Zhao, Ji et al. 2012).
Una característica que limita notablemente las alternativas terapéuticas no
invasivas, es que el GBM es altamente quimioresistente a un amplio espectro de drogas
antitumorales, fenómeno conocido como resistencia múltiple a drogas (MDR) (Morjani
and Madoulet 2010). Esto último pudiendo ser asociado a la subpoblación de stem cells
en este tumor.
2.4 Resistencia múltiple a drogas
A pesar que en condiciones normales el cerebro es una región de difícil acceso
farmacológico debido a la presencia de la barrera hematoencefálica (BHE) generando
14
un microambiente aislado de la circulación general (Persidsky, Ramirez et al. 2006;
Gerstner and Fine 2007), sabemos que en GBM esta barrera está dañada, lo que se
evidencia por una hiperplasia endotelial, pérdida de las uniones estrechas, aumento en
las fenestraciones, entre otros procesos (Abbott, Ronnback et al. 2006; Franco-
Hernandez, Martinez-Glez et al. 2007; Gerstner, Duda et al. 2007). Es por esto que, se
le ha atribuido la pobre respuesta a la terapia farmacológica de estos tumores a otras
causas como es la resistencia múltiple a drogas en el propio tumor dado por la
sobreexpresión y/o actividad aumentada de transportadores ABC (Groothuis, Lapin et
al. 1991; Papadopoulos, Saadoun et al. 2001; Davies 2002; Kemper, Boogerd et al.
2004; Abbott, Ronnback et al. 2006; Fruehauf, Brem et al. 2006). En las células
cerebrales normalmente no se expresan niveles altos de estos transportadores,
mientras que en las células de tumores cerebrales se ha observado una sobreexpresión
de alguna de ellas, lo que provocaría una reducción en la acumulación de las drogas
antitumorales al interior de éstas células (Regina, Demeule et al. 2001; Dallas, Miller et
al. 2006). Existen algunos estudios que caracterizan la expresión de los transportadores
ABC tanto en líneas celulares de gliomas como en xenografs de gliomas humanos
(Bronger, Konig et al. 2005; Calatozzolo, Gelati et al. 2005; Matsumoto, Tamiya et al.
2005; de Faria, de Oliveira et al. 2008). A pesar de que estos transportadores ABC
pertenecen a una familia de 49 miembros en humanos, la adquisición del fenotipo MDR
en gliomas de alto grado se ha asociado principalmente a la sobre expresión del
transportador MRP1 (Norris, De Graaf et al. 1996; Abe, Mori et al. 1998; Spiegl-
Kreinecker, Buchroithner et al. 2002; Lu and Shervington 2008). La sobre expresión de
este transportador se ha reportado y confirmado en una gran variedad de tumores
15
cerebrales como astrocitomas, meningiomas, neuroblastomas y oligodendrogliomas
pero principalmente en glioblastomas (Norris, De Graaf et al. 1996; Abe, Mori et al.
1998; Goto, Keshelava et al. 2000; Mohri, Nitta et al. 2000; Tews, Fleissner et al. 2001;
Benyahia, Huguet et al. 2004; Dallas, Miller et al. 2006; Deeley and Cole 2006).
Nuestros estudios en líneas celulares (T98G y G44) y en cultivo primario de GBM
confirman la sobre-expresión de MRP1 por sobre otros transportadores ABC como P-gp
y ABCG2 (Peignan, Garrido et al. 2011). A su vez, observamos que al inhibir la función
de MRP1 utilizando las moléculas MK571 o probenecid, aumenta la sensibilidad al
efecto citotóxico y anti-proliferativo de las drogas antineoplásicas vincristina, etopósido
y taxol (Peignan, Garrido et al. 2011).
Con respecto a las GSCs, no existe mucha información de los transportadores de
resistencia a drogas expresados en estas células. Estudios realizados en células madre
hematopoyéticas han permitido observar una fracción de células conocidas como "side
population" (SP), las cuales son capaces de expulsar el colorante Hoechst 33342,
propiedad utilizada para identificarlas y aislarlas. Dicha propiedad está dada por la
actividad del transportador ABCG2, sobre-expresado en estas (Zhou, Schuetz et al.
2001; Zhou, Zong et al. 2003). De igual manera, se ha identificado que la sub-población
de neuroesferas SP son CD133+, incluyendo las GSCs, por esta razón a este
transportador se le ha asignado un papel importante en quimiorresistencia (Li, Li et al.
2010; Wan, Zhang et al. 2010). Sin embargo, otros autores sostienen la hipótesis de
que en GSCs se sobre-expresan otros transportadores como MRP1, MRP3 o Pgp
(Nakai, Park et al. 2009; Angelastro and Lame 2010). En estudios realizados en la
subpoblación SP de GSCs que fueron expuestos a doxorubicina, no se observó
16
expresión de ABCG2, lo que nos estaría indicando que en este tipo de células ABCG2
no mediaría quimiorresistencia al exponerlas a drogas antineoplásicas (Broadley, Hunn
et al. 2011). Al contrario, en GSCs derivadas de la línea celular U251, los niveles de
expresión de MRP1 y MRP3 son significativamente mayores que en células
diferenciadas (Jin, Zhao et al. 2010). Sin embargo, solo se observó aumentos de los
niveles de expresión de MRP1 frente a la exposición a fármacos antitumorales, lo que
sugiere que este transportador podría ser el responsable de la quimiorresistencia en
GSCs.
Ensayos de inmunohistoquímica realizados ex vivo, sobre 50 muestras de tejido
de glioblastoma también mostraron una alta presencia de MRP1 en comparación con
otros transportadores ABC (Bronger, Konig et al. 2005; de Faria, de Oliveira et al. 2008).
Por otro lado, algunos estudios señalan que existe una sobre expresión del mRNA y de
la proteína de MRP1 en un 90% de los glioblastomas multiforme al compararlos con
tejidos controles (epilépticos y gliomas benignos) (Haga, Hinoshita et al. 2001; Dallas,
Miller et al. 2006; Louis, Ohgaki et al. 2007). De igual manera se observó que el 70% de
los pacientes con gliomas que no han recibido quimioterapia presentan expresión de
MRP1. La evaluación realizada en los mismos pacientes tras haber sido sometidos a un
régimen de quimioterapia, señala que el 100% de ellos expresa este transportador
(Abe, Mori et al. 1998; Goto, Keshelava et al. 2000; Dallas, Miller et al. 2006). Además
de eso, en otras investigaciones realizadas en cuatro líneas celulares de glioblastoma
(GL15, 8MG, G44 y G62), la expresión de MRP1 se correlaciona en forma positiva con
los perfiles de resistencia a drogas antineoplásicas como doxorubicina, etopósido,
cisplatino, metotrexato y vinblastina (Borst, Evers et al. 2000; Mohri, Nitta et al. 2000;
17
Benyahia, Huguet et al. 2004; Rosenbaum, Rohrs et al. 2005; Valera, de Freitas Cortez
et al. 2009). Particularmente se ha establecido que los tejidos de gliomas de grado III y
IV exhiben un aumento en la expresión de MRP1 comparado con gliomas de grado II,
mientras que en tejidos normales la expresión permanece muy baja, lo que indicaría
una relación directa entre el grado de malignidad tumoral y la expresión de esta
proteína (Haga, Hinoshita et al. 2001; Benyahia, Huguet et al. 2004).
2.5 Marcador de superficie celular CD133
CD133 o Prominina-1 es una glicoproteína de membrana que actualmente es
utilizada como un marcador de CSCs y es el primer marcador que se ha descrito para
aislarlas (Heddleston, Hitomi et al. 2011). El gen de la proteína CD133 consiste
básicamente en 37 exones localizados en el cromosoma 4, cuya longitud es cercana a
los 152 kb (Yu, Flint et al. 2002; Shmelkov, Jun et al. 2004). La proteína CD133 consiste
en 865 aminoácidos y su masa molecular es de aproximadamente 120 kDa (Yin,
Miraglia et al. 1997). La estructura de esta proteína incluye un extremo amino terminal
extracelular, dos anillos extracelulares grandes, 5 dominios transmembrana, dos anillos
intracelulares pequeños ricos en cisteínas y un extremo carboxilo intracelular. La
expresión de mRNAs de CD133 presentan un patrón dependiente de tejido, y la
transcripción de estos diferentes subtipos de mRNAs son regulados por 5 promotores
(P1 - P5). Se ha reportado que los promotores P1 y P2 presentan una actividad
marcadamente incrementada en comparación a los otros tres promotores cuya actividad
no cambia de manera aparente. La actividad del promotor puede ser inhibida por
metilación in vitro, por lo tanto se sugiere que la metilación pueda cumplir cierto rol en
18
su regulación (Shmelkov, Jun et al. 2004), entonces, el reconocimiento del promotor
tejido específico, funcionalmente activo, sería una manera efectiva para el aislamiento y
sorting de células stem o precursoras.
CD133 tiene dos subtipos: CD133-1 y CD133-2. El mRNA de CD133-2 es
predominante en muchos tipos de tejido fetal y adulto, mientras que el mRNA de
CD133-1 es predominante en cerebros fetales y músculo esquelético adulto, sin ser
detectado en otros órganos como hígado fetal, riñón fetal, páncreas adulto entre otros.
Entonces se sugiere que CD133-1 y CD133-2 podrían tener diferentes roles en el
desarrollo fetal y en procesos de maduración de órganos (Zhang and Li 2010). A su
vez, la expresión de CD133 también ha sido reportada en otros tejidos como por
ejemplo en, células precursoras endoteliales (Peichev, Naiyer et al. 2000), células
cerebrales fetales (Uchida, Buck et al. 2000), células epiteliales embrionarias (Corbeil,
Roper et al. 2000), células stem de epitelio prostático (Richardson, Robson et al. 2004),
células musculares (Torrente, Belicchi et al. 2004) entre otros.
Un conjunto de evidencias experimentales apoyan la hipótesis que CD133 podría ser
una molécula de membrana específica de CSCs, especialmente células stem de
tumores sólidos, sugiriendo que CD133 podría llegar a ser un blanco terapéutico
efectivo (Zhang and Li 2010). Algunos tumores corresponden a cáncer pancreático,
cáncer de colon, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, carcinoma renal,
carcinoma de laringe, melanomas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y tumores
cerebrales (Zhang and Li 2010).
Se ha reportado en estudios in vivo con neuroesferas CD133+ aisladas de GBM
que estas células tienen la capacidad de restablecer la heterogeneidad celular luego de
19
ser implantadas en cerebros de ratones inmunodeprimidos (Galli, Binda et al. 2004;
Singh, Hawkins et al. 2004; Lobo, Shimono et al. 2007). Una dosis de solamente 100
células CD133+ podrían generar un tumor y la heterogeneidad celular en ratones
inmunodeficientes, mientras que las células CD133- no mostrarían un potencial
tumorigénico aparente (Singh, Hawkins et al. 2004), lo que estaría apoyando la
participación de las GSCs en progresión, recurrencia y tumorigénesis
2.6 Marcador de superficie celular CD44.
CD44 es una proteína de superficie expresada en múltiples tipos de tumor y está
expresada en ciertos tejidos normales donde funciona en la regulación de la
proliferación celular, migración celular, transmisión de señales de supervivencia, y otras
interacciones célula-célula y célula-matriz (Gladson 1999; Goodison, Urquidi et al. 1999;
Marhaba and Zoller 2004; Gotte and Yip 2006; Xu, Stamenkovic et al. 2010).
CD44 existe como una gran familia de isoformas, producidas por empalme alternativo
de más de 20 exones (Naor, Sionov et al. 1997; Goodison, Urquidi et al. 1999). Los
exones 1-5 y los exones 16-19 se empalman juntos para formar el transcrito CD44s (s
de forma standard) el cual es expresado en un amplio rango de tejidos normales como
en tumores de origen ectodermal (Naor, Sionov et al. 1997). Los exones 6-15 son
empalmados alternativamente en el mRNA para formar los exones variables v1-v10
(Naor, Sionov et al. 1997; Iczkowski, Bai et al. 2003; Marhaba and Zoller 2004). Estas
isoformas variantes son expresadas en muchos órganos diferentes y se han
relacionado fuertemente a procesos de progresión tumoral en muchos tipos de cáncer
(Naor, Sionov et al. 1997; Bates, Edwards et al. 2001; Georgolios, Batistatou et al.
20
2006; Hovinga, Shimizu et al. 2010). La isoforma variante 6 (CD44v6) en particular se
ha asociado en muchos tipos de cáncer pero no en células somáticas (Christofori 2003;
Khan, Cook et al. 2005; Georgolios, Batistatou et al. 2006).
Dentro de las diferentes variantes de esta proteína, CD44v6 es la única isoforma
que fue detectada en tumores cerebrales y su inhibición pudo inhibir el crecimiento de
las GSCs CD44+ pero no de las células CD44- (Jijiwa, Demir et al. 2011). La
estimulación con el ligando de CD44v6, osteoponina (OPN), incrementó la expresión de
AKT fosforilada en células CD44 positivas, no así en las negativas. Se confirmaría
entonces que en GBM hay una sub población celular expresando el marcador CD44 y
que su crecimiento podría depender de la vía CD44v6/AKT(Jijiwa, Demir et al. 2011),
por lo que su expresión estaría fuertemente ligada a la progresión tumoral, haciendo de
CD44 un posible blanco terapéutico y un factor importante de estudio de la
quimioresistencia en GBM.
2.7 Tesis propuesta
Dada la importancia de encontrar nuevos blancos terapéuticos para el desarrollo
de estrategias que permitan ayudar a combatir el Glioblastoma Multiforme Humano,
realizamos una caracterización de las GSCs en función del transportador MDR mas
expresado en células diferenciadas (bulk cells) de este tipo de tumor, MRP1. Para ello,
montamos la técnica de cultivo para la obtención de neuroesferas como fuente de
GSCs y caracterizamos la expresión y actividad de MRP1 con respecto a las bulk cells
a partir de líneas celulares de GBM.
21
Además, mediante las técnicas de separación celular MACS y FACS, aislamos
GSCs/CD133+ y GSCs/CD44+ respectivamente, para determinar las diferencias que
pudieran conferirle a estas células, la expresión de estos marcadores de células stem,
con respecto al fenotipo MDR dependiente de MRP1 en glioblastoma.
22
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Hipótesis
La resistencia múltiple a drogas en las glioblastoma stem cells (GSCs), se debe
principalmente a la sobreexpresión y mayor actividad del transportador MRP1 en
comparación con las otras células del tumor (Bulks cells).
3.2 Objetivo general
Comparar la expresión y actividad del transportador de resistencia a drogas MRP1 en
GSCs aisladas de líneas celulares de glioblastoma con respecto a las otras células del
tumor.
3.3 Objetivos específicos
3.3.1 Estandarizar el método de cultivo para la generación de neuroesferas (GSCs) en
GBM.
3.3.2 Comparar los niveles de expresión, actividad y localización de MRP1 entre las
neuroesferas y las células bulks del GBM.
3.3.3 Montar la técnica de aislamiento de neuroesferas (CD133+ y CD44+) y comparar
los niveles de expresión, actividad y localización de MRP1 entre las subpoblaciones
positivas y negativas al marcador.
23
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Materiales
4.1.1 Material Biológico
Las líneas celulares utilizadas para el desarrollo de esta tesis corresponden a las líneas
de Glioblastoma Multiforme humano G44, T98 y U87.
4.1.2 Reactivos
Abcam: Anticuerpos primarios anti-MRP1 (ab3369)
BiosChile: partidores síntesis DNA específicos para los genes en estudio (Tabla 1).
Fermentas: Marcador preteñido de proteínas para geles de poliacrilamida
(PageRuler™ plus prestained protein ladder).
Gibco: Medio Neurobasal, Medio DMEM-F12, DMEM y MEM, Suero fetal bovino,
Tripsina 10X, Penicilina/estreptomicina 100x (10.000 unidades de penicilina, 10.000 gr
de estreptomicina, 29.2 mg de L-glutamina por ml de solución salina), Colagenasa tipo I
(205 unidades/ mg); persulfato de amonio.
Invitrogen: Set de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) 100 mM, inhibidor de
ribonucleasas (RNaseOUT) (40 U/µl), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine
Leukemia Virus) (200 U/µl), 0.1 M DTT, marcador preteñido de proteínas para geles de
poliacrilamida, agarosa ultra pura, acrilamida, bisacrilamida (N,N' metilenbisacrilamida),
bromuro de etidio, partidores específicos
J.T. Baker: ácido clorhídrico, acetato de potasio, cloruro de sodio.
Kibutz Beit Haemek: Suero fetal bovino.
24
Merck & Co., Inc.: ácido clorhídrico, ácido acético, azul de bromofenol, isopropanol,
formaldehído, metanol, cloroformo, alcohol isoamílico, Tritón X-100, N,N,N',N'-
tetrametiletilendiamina (temed), hidróxido de sodio, isopropanol, etanol, ácido fórmico,
acético, fosfato monoácido de sodio, fosfato diácido de sodio.
Milipore: Membrana de transferencia Immobilon®
PrepoTech: Factor de crecimiento epidermal (EGF), factor básico de crecimiento de
fibroblastos (bFGF).
Promega Co.: GoTaq®
Santa Cruz Biotechnologies: Anticuerpos primarios monoclonales anti-Mrp1 (sc-
18836 y sc-53130), anti β-actina (C4; sc-47778).
Sigma Chemical Co .: 2-mercaptoetanol, glicina, Tritón X 100, Monoclonal Anti-β- Actin
antibody producido en ratón, 5- carboxifluoresceína diacetato (CFDA), MTT Formazán.
Thermo Scientific: ECL Western Blotting Substrate, BCATM Protein Assay Kit.
Tocris bioscience: MK571
Winkler: Solución de Chomczysky con fenol, Acrilamida: bisacrilamida 29:1, PBS 10x
(NaCl 1,36 M, KCl 0,007 M, NaHPO4-7H2O 0,199 M, KH2PO4 0,066 M, pH 7,4), Alcohol
metílico y etílico, Agua libre de nucleasas, Cloroformo, Buffer de carga 6x azul-celeste
(glicina 30%, azul de bromofenol 0,25%, Xilen –Cianol FF 0,25%), marcador de DNA
escala de 100pb, TEMED, agarosa, dodecilsulfato de sodio (SDS), Tris HCl pH 9, Buffer
Fosfato pH 7,5, Borato de sodio 10-Hidrato, dimetil sulfóxido (DMSO), albúmina de
suero de bovino (BSA).
Miltenyi Biotec: Anticuerpo anti CD133 (130-092-395) Anticuerpo anti CD44-FitC (130-
095-195) CD133 microbeads kit (130-050-801).
25
4.1.3 Equipos
Termociclador Multigene II Labnet, termociclador Eppendorff (mastercycler
personal), Balanza analítica Radwag AS220/C/2, balanza Sartorius TE4101, pHmetro
Inolab WTW Series pH 720, micropipetas Gilson, horno microondas Somela (E 70 TF-
7), fuente de poder Labnet Endore Power supllies 300V, fuente de poder Bio-Rad
(PowerPac Basic 300 V, 400.A, 75 W), Espectrofotómetro Nanodrop 2000, centrífuga
eppendorf minispin, sonicador misonix QSonica LLC XL-2000 series, Heidolph Duomax
Rocking Orbit Platform Shaker, baño termorregulado Memmert, Incubadora de cultivo
Nuaire DH autoflow, Agitador termorregulado IKA®, centrífuga refrigerada Sigma 2-
16PK, microcentrífuga Labnet SNop11, capturador de imágenes Syngene Ingenius,
cámara de flujo laminar Nuair, sistema de transferencia Bio-Rad (semy-dry transfer cell
TRANS-BLOT SD), Fluorímetro Perkin Elmer modelo, LS-50, Cytospin Thermos
A78300101, Microscopio de fluorescencia LEICA DM2500.
4.2 Métodos
4.2.1 Cultivo de líneas celulares de GBM .
Las células G44, T98 y U87 fueron crecidas a confluencia en frascos de cultivo
T75 en medio DMEM-F12 suplementado con suero fetal bovino al 10% y con penicilina-
estreptomicina al 1% en condiciones estándares de 5% de CO2 y 37°C.
Los pasajes de células a otras placas se llevaron a cabo retirando el medio de
cultivo por aspiración y la monocapa de células se lavó con PBS 1x. Posteriormente se
prepara una solución de tripsina al 1% en PBS 1x y las células son incubadas con ella
durante 5 minutos a 37°C donde se despegan del frasco. La tripsina es neutralizada con
26
4 ml de medio de cultivo suplementado y las células se recuperaron por centrifugación
de 5 minutos a 1500xg descartando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet de
células a la densidad requerida. Finalmente las células se traspasan a frascos T75 o
placas de 6 o 24 pocillos según sea necesario. Las células recibían un cambio de medio
cada 3 a 5 días aproximadamente según su proliferación.
4.2.2 Cultivos de GSCs .
Se realiza un proceso de implementación y estandarización previo para cultivar
las GSCs. El procedimiento final consiste en despertar células U87 y sembrar 75000
células aproximadamente por cada pocillo de una placa de 6 pocillos en medio
Neurobasal suplementado con LIF (10ng/ml), B-27 1X, EGF (20 ng/ml) y FGF (20
ng/ml). Realizando un cambio de medio cada 5 días en caso de ser necesario y siendo
cosechadas el día 10 por aspiración.
4.2.3 Extracción de RNA total de células de GBM.
Las células fueron incubadas en placas de 60mm a confluencia. Posteriormente
se extrajo el RNA total utilizando solución de Chomczynski con fenol. Se adicionaron
0,5 ml de esta solución por pocillo y se ayudó al desprendimiento y lisado de las células
con un rastrillo para placas de cultivo. Luego se recolectó el extracto celular en tubos
Eppendorf de 1,5 ml; a cada Eppendorf se le adicionaron 0,2 ml de cloroformo y se les
agitó vigorosamente por 15 segundos para favorecer y apresurar la incorporación del
cloroformo a la mezcla, para luego ser centrifugadas a 12.000 x g por 15 minutos a 4ºC.
Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se precipitó el RNA con 0,5 ml de
27
isopropanol, esto se mezcló y se centrifugó a 12.000 x g por 15 minutos a 4°C. Se
eliminó el sobrenadante y el precipitado se lavó con 500 µl de etanol (75%) frío, se
mezcló suavemente y se centrifugó por 5 minutos a 7.500 x g a 4°C. Se eliminó el
sobrenadante cuidadosamente y se dejó secar el precipitado hasta que se evaporara
totalmente el etanol. Finalmente se resuspendió el pellet obtenido en 20 µl de agua libre
de nucleasas.
La cuantificación y determinación de pureza de los RNA extraídos fueron llevados
a cabo en un espectrofotómetro nanodrop, para lo cual se toma 1µl de nuestra muestra
y se midió la absorbancia a 260 nm y 280 nm.
4.2.4 Extracción de RNA total de GSCs.
La extracción de RNA total desde las GSCs se realizó utilizando el kit SV Total RNA
isolation system de Promega. Las células fueron centrifugadas a 500 x g por 5 minutos
a 4ºC, descartando el sobrenadante. El pellet se lavó con DPBS 1x y entonces se
centrifugó por 5 minutos a 300 x g a 4ºC. Nuevamente se descartó el sobrenadante y
sobre el pellet se agregaron 175 µl de buffer de lisis RNA + BME proporcionado por el
kit y se homogeniza para generar el extracto celular. Luego se hizo pasar este extracto
unas 4 o 5 veces por una jeringa con el fin de desintegrar el DNA genómico. Entonces
se recuperó en un nuevo Eppendorf al que se le añadieron 350 µl de buffer de dilución
de RNA (solución azul), esto se mezcló y se calentó a 70ºC por 3 minutos (utilizando un
el termociclador). Terminado este proceso se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos a
temperatura ambiente, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo, al que se le
añadieron 200 µl de etanol 95% de grado analítico, se mezcló bien y se transfirió a la
28
columna donde se dejó eluir la mezcla. Posteriormente se centrifugó a 12.000 x g por 1
minuto. Simultáneamente se mezcló en otro tubo y en el siguiente orden: 40 µl de buffer
yellow core, 5 µl MnCl2 0.09M y 5 µl de DNAsa I, lo que sé mezcló utilizando la
micropipeta, dejando la mezcla en hielo hasta su utilización. Al terminar la
centrifugación se agregaron 50 µl de la mezcla previamente realizada, directamente
sobre la membrana y se dejó incubar por 15 minutos a temperatura ambiente.
Inmediatamente después se añadieron 200 µl de solución de STOP DNAsa (también
sobre la membrana) y se centrifugó a 12.000 x g por 1 minuto. Se añadieron 600 µl de
solución RNA de lavado y se centrifugó nuevamente a 12.000 x g durante 2 minutos,
entonces se retiró la tapa de la columna del spin se puso un nuevo tubo y se añadieron
100 µl de agua libre de nucleasas. Esto se eluyó completamente y finalmente se
centrifugó a 12.000 x g por 1 minuto, esta solución se guardó a -80ºC.
4.2.5 Síntesis de cDNA
Se llevó a cabo la reacción de transcripción mediante una pre incubación de 2 µg
de RNA total de cada muestra con 0,25 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
y 100 pmol de oligo dT por 5 minutos a 65°C, inmediatamente después se transfirieron
los tubos al hielo durante tres minutos y se les adicionó tampón de reacción (50 mM
Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3), 10 mM DTT, 20 unidades de inhibidor de
ribonucleasa recombinante (RNAsaOUT) y 50 unidades de transcriptasa reversa (M-
MLV) en un volumen total de reacción de 20 µl y se incubó por 1 hora a 42°C.
Finalmente para la inactivación de la transcriptasa reversa la mezcla de reacción se
calentó a 72ºC por 10 minutos.
29
El cDNA sintetizado se almacenó a -20ºC para su posterior amplificación
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
4.2.6. PCR semi cuantitativo
La amplificación de fragmentos de la secuencia codificante de las distintas
proteínas involucradas en este estudio, se llevó a cabo utilizando los partidores
específicos para cada uno de ellos (Tabla I) y los cDNAs obtenidos de nuestras células.
Los partidores utilizados en este estudio fueron derivados desde las secuencias de los
mensajeros de humano anotados en la base de datos GenBank® del Instituto Nacional
de Salud de U.S. (NIH). Para la reacción se mezcló 1 µl de cDNA diluido en agua libre
de nucleasas en una relación 1:10, 7,5 µl de GoTaq® green master mix, 1 µl de partidor
sentido y anti sentido (10 µM) y 4,5 µl de agua libre de nucleasas completando 15 µl de
volumen final de reacción. El programa de amplificación utilizado en el termociclador
contenía las siguientes etapas: denaturación inicial a 94ºC por 3 minutos, seguido de 35
ciclos, cada uno compuesto de denaturación a 94ºC por 30 segundos, el apareamiento
a 55ºC por 30 segundos y extensión a 72ºC por 30 segundos; inmediatamente
terminados los 35 ciclos, se llevó a cabo la etapa de extensión final a 72ºC por 10
minutos. Para el control de la eficiencia de la transcripción reversa se realizaron
reacciones de amplificación del gen constitutivo β-actina.
30
Tabla I: Partidores y productos de PCR para la amplificación de los transcritos de los
genes en estudio
Gen Secuencia (Anti sentido/sentido) Tamaño
producto
β-actina
5'GGGGTCTTGAAGGTCTCA3'
165 pb
5'TGTCACCAACTGGGACGA3'
MRP1
5'GGACTTTCGTGTGCTCCTGA3'
174 pb
5'AGGTCAAGCTTTCCGTGTACTG3'
CD133
5'GGGAATGCCTACATCTGGAA3'
446 pb
5'GCATGCAAAAGCCATCATAG3'
Nestina
5'GGGCTCTGATCTCTGCATCTAC3'
145 pb
5'TTGCCTGCTACCCTTGAGAC3'
CD44
5'GCAGGGATTCTGTGTCTGTGCTG3'
258 pb
5'GCCCAATGCCTTTGATGGACC3'
31
4.2.7. PCR tiempo real.
Los niveles de transcrito de MRP1 en las poblaciones GSCs CD133+ y CD133-
se analizaron por PCR tiempo real, por medio del equipo Light Cycler 2.0 (Roche), se
utilizó el kit Light Cycler DNA SYBR Green I. La mezcla de reacción contenía 2 μl Mix
Master, 1 pmol de cada partidor y 1μl de cDNA. Los partidores utilizados para MRP1 y
β-actina fueron los descritos en la tabla I. Como controles negativos para cada PCR se
utilizó agua en lugar de cDNA. La especificidad de los productos de la PCR se controló
de forma rutinaria por análisis de la curva de fusión y por electroforesis en gel de
agarosa. La relación de MRP1/ β-actina se calculó para cada muestra. El análisis de los
datos se realizó utilizando Light Cyclersoftware 4.0.
4.2.8 Análisis electroforético de productos de PCR en geles de agarosa
El gel de agarosa utilizado (50 ml) fue preparado al 1,5%. Primero se procedió a
fundir la agarosa en buffer TAE 1x, la mezcla se dejó enfriar hasta que no se presentara
emisión de vapor y entonces se agregaron los 3 µl de bromuro de etidio. Los productos
de amplificación se cargaron directamente al gel, utilizando un volumen de 7 μl. El
estándar de tamaño molecular utilizado fue el marcador de DNA escala de 100 pb
Winkler del cual se cargaron 6 µl. La corrida electroforética se llevó a cabo aplicando un
voltaje de 90 volts durante 45 minutos aproximadamente en tampón TAE 1x. El DNA se
visualizó con el sistema Syngene InGenius (que consta de un transiluminador UV,
acoplada a una cámara digital), las imágenes fueron cuantificadas utilizando el
programa ImageJ.
32
4.2.9 Ensayo de transporte por acumulación de 5-car boxifluoresceína diacetato
(CFDA) en células de GBM
Para medir la actividad del transportador MRP1 se sembraron aproximadamente
1 x 105 células de GBM por pocillo en placas de 24 pocillos. Transcurridas 24 horas se
lavaron las células con PBS 1x y se incubaron a 37°C y 5% de CO2 con medio
incompleto suplementado con 500 nM de CFDA por 15 minutos. Posteriormente, las
células se lavaron 3 veces con PBS 1x y nuevamente se incubaron, esta vez por 30
minutos a 37ºC y 5% de CO2 con el inhibidor específico de MRP1 MK570 y solo con
medio incompleto, luego se lavaron con PBS 1x y fueron lisadas con PBS 1x-Triton X-
100 al 0.4%, utilizando un rastrillo para favorecer el desprendimiento de las células.
Posteriormente se recuperaron las células y fueron puestas en tubos Eppendorf y
sometidas a sonicación. De este extracto se tomó una alícuota para realizar la
cuantificación de proteínas mediante BCA y el resto se congeló a -20ºC hasta su
determinación. La fluorescencia intracelular se midió en un espectrofluorímetro, las
muestras se diluyeron 10 veces en PBS 1x, mantenidas en hielo y protegidas de la luz.
La solución resultante se traspasa a una cubeta de cuarzo de paso óptico de 1 cm. Las
longitudes de onda utilizadas en la medición fueron de 530 nm emisión y 488 nm
excitación.
4.2.10 Ensayo de transporte por acumulación de 5-ca rboxifluoresceína diacetato
(CFDA) en GSCs.
Las GSCs se dejan crecer en placas de 6 pocillos hasta el día 10. El contenido
celular de cada pocillo de la placa de 6 pocillos, fue traspasado a un pocillo de una
33
placa de 24 pocillos (aproximadamente 300.000 células) para realizar el experimento.
Las GSCs son sacadas de la placa de 6 pocillos por aspiración y pasadas a un tubo
falcón de 15 ml. Posteriormente son centrifugadas a 500xg por 5 minutos, descartando
el sobrenadante y lavando el pellet con DPBS 1x. Se vuelve a centrifugar a 500xg por 5
minutos y se resuspende el pellet en MNE con CFDA al 500nM y se deja en la placa de
24 pocillos. Se dejan incubar 15 minutos a 37°C y 5% de CO2 y se lavan 3 veces con
DPBS 1x, centrifugando 5 minutos a 500xg después de cada lavado. Después se aplica
el tratamiento con MNB con MK570 a µM durante 30 minutos. Luego de esto se realizan
tres lavados con DPBS de manera idéntica a la descrita anteriormente.
Las células en las placas de 24 pocillos son lisadas con 230 µL de DPBS-tritón 0.4%
seguido de la sonicación correspondiente, 25 µL son tomadas para la cuantificación de
proteínas y 200 µL para lectura en el espectrofluorímetro.
El proceso de lectura y las condiciones del equipo son idénticos a las utilizadas en
células GBM.
4.2.11 Extracción de proteínas totales
Las células de GBM y las GSCs fueron lisadas utilizando 150 a 200 µl de buffer
de lisis (tris HCl 63.5 mM pH 7.5, SDS 2%, 10% glicerol) más los inhibidores de
proteasas (pepstatina 1:1000, 1 tableta de complete mini por cada 10 ml de solución y
PMSF 1 mM). Para promover el desprendimiento de las células se utilizó un rastrillo
para placas de cultivo. Este procedimiento se llevó a cabo en hielo, para el correcto
funcionamiento de los inhibidores de proteasas. El producto de este proceso se recogió
y se guardó en tubos Eppendorf de 1.5 ml. Posteriormente las muestras se sometieron
34
a sonicación y se congelaron a -20°C, para ser cuantificadas y utilizadas en los
ensayos de western blotting.
4.2.12 Determinación de la concentración de proteín as totales
Las proteínas se cuantificaron utilizando el método del ácido bicinconílico (BCA),
para ello se confeccionó una curva de calibración entre 0 y 2 µg de proteína en un
volumen final de 225 µl. Como estándar se utilizó albumina de suero bovino (BSA 2
mg/µl proporcionado por el kit de cuantificación) diluido en agua desionizada.
El proceso de cuantificación consta de los siguientes pasos: a una placa de 96
pocillos se adicionaron 200 μl de reactivo de trabajo (reactivo A más reactivo B en una
relación 50:1 respectivamente, ambos reactivos son proporcionados por BCA™ protein
assay kit) por pocillo, más 25 µl de cada una de las distintas diluciones
correspondientes a los distintos puntos de la curva de calibración o de muestra. Como
blanco se utilizó el buffer de extracción utilizado en la extracción de nuestras proteínas.
Luego se incubó la placa por 30 minutos a 37°C. Finalmente se realizó la lectura en un
lector de placas a dos longitudes de onda 490 y 570 nm. Las concentraciones de
nuestras muestras se obtuvieron por interpolación de la curva de calibración.
4.2.13 Análisis electroforético de proteínas en gel es de poliacrilamida- SDS
Para el fraccionamiento de proteínas totales se utilizaron geles de poliacrilamida
en condiciones denaturantes. Para el montaje de los geles se utilizó el sistema de
electroforesis Mini Protean® tetra cell de la compañía Bio-Rad y separadores de 1,5
mm de espesor. El gel separador se preparó a una concentración del 10% de
35
poliacrilamida a partir de una solución de acrilamida: bis-acrilamida 29:1, que además
contenía Tris-HCl 375 mM (pH 8,8), SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,04% y temed
0,03%. El gel espaciador se preparó al 3.8% de poliacrilamida a partir de Tris-HCl 125
mM (pH 6,8), SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,04% y temed 0,03%.
La muestra cargada contenía aproximadamente 100 µg de proteínas y el buffer
de carga 10x necesario para completar un volumen final de 45 µl. Luego fueron
homogenizadas y calentadas por 5 minutos. Entonces las muestras fueron transferidas
inmediatamente a hielo para finalmente ser cargadas en los pocillos del gel, el cual se
encontraba sumergido en tampón de corrida TG-SDS 1x (Tris 8 mM, glicina 250 mM,
SDS 3 mM, pH 8.3). Para la migración electroforética el gel se sometió a una corriente
de 25 mA y por el tiempo necesario para que el frente iónico alcanzara el borde inferior
de nuestro gel.
4.2.14 Electrotransferencia de proteínas a membrana s de PVDF
Finalizada la separación electroforética, las proteínas se transfirieron a
membranas de PVDF utilizando el sistema de Bio-Rad Mini Trans-Blott® Cell. El
procedimiento se inició apilando secuencialmente sobre el cassette una esponja, un
trozo de papel filtro, el gel a transferir, la membrana de PVDF en contacto directo con el
gel (evitando la presencia de burbujas entre ellos), papel filtro y finalmente otra esponja,
todo esto embebido en el tampón de transferencia (Tris 8 mM, glicina 250 mM, SDS 3
mM, metanol 20%, pH 8.3). Luego se cerró el cassette y este conjunto se colocó en la
cámara de electrotransferencia, el que se rellenó con el mismo tampón y se dispuso de
forma que el gel quedase hacia el cátodo y la membrana hacia el ánodo, la
36
transferencia se realizó a una intensidad de 400 mA por 2 horas (durante este período
el sistema de transferencia fue mantenido en hielo para mantener la temperatura del
buffer). Transcurrido este tiempo, la membrana estaba lista para ser utilizada en la
inmunodetección.
Para comprobar que la transferencia se realizó satisfactoriamente se tiñó la
membrana con rojo ponceau (ponceau-S red 0.5%, ácido acético 1%) por
aproximadamente 5 minutos y luego se observó el patrón de transferencia de las
proteínas, una vez hecho esto se eliminó la tinción con lavados sucesivos con tampón
PBS 1x hasta la decoloración completa.
4.2.15 Detección inmunológica
Las membranas de PVDF fueron bloqueadas por 1 hora en solución de bloqueo
(BSA 1%, PBS 1x, tween-20 0.1%) a temperatura ambiente y con agitación constante.
Luego las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario correspondiente:
anti-MRP1 (dilución 1:500), anti-MDR1 (dilución 1:1000) y anti-ABCG2 (dilución 1:2000)
diluidas en solución de bloqueo, con agitación suave por toda la noche. Finalizado este
período las membranas se lavaron 5 veces por 5 minutos con PBS 1x-tween-20 al 0.1%
con agitación constante. En seguida se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo
secundario anti-mouse IgG-HPR (1:2000 diluido en PBS 1x-tween-20 al 0.1%). Al
finalizar se lavaron 5 veces con PBS 1x-tween-20 al 0.1% por 5 minutos.
El revelado se realizó utilizando el sistema de quimioluminiscencia (ECL) en
donde se mezclaron en partes iguales los reactivos: peróxido de hidrógeno y luminol
(proporcionados por el kit), los que se vertieron sobre la membrana para una incubación
37
de un par de minutos. Transcurrido este tiempo, se eliminó el exceso de reactivo de la
membrana y se expusieron a un film fotográfico por los minutos requeridos para cada
transportador. Posteriormente utilizó el sistema Ultra-lum, donde solo se requerían las
membranas sometidas al sistema de quimioluminiscencia.
Para la normalización de la concentración de proteínas, se sometió a las
membranas a inmunodetección utilizando el anticuerpo anti β-actina-HPR en una
dilución 1:20000, el que se incubo por una hora. Luego se lavó 5 veces por 5 minutos
con PBS 1x-tween-20 al 0.1%, e inmediatamente fue revelada de la misma manera que
se indicó para los transportadores.
4.2.16 Inmunocitoquímica de fluorescencia
Para las células de GBM se sembraron a una densidad de 5 x 104, en placas de
24 pocillos que contenían cubreobjetos, cuando las células estuvieron adheridas al
cubre objeto se lavaron 3 veces con PBS 1x, posteriormente fueron fijadas con
paraformaldehído al 3% por 10 minutos, se lavaran nuevamente con PBS 1x para
eliminar el exceso de paraformaldehído y se permeabilizaron por 15 minutos con PBS
1x, tritón X-100 al 0,3% e inmediatamente fueron bloqueadas durante 1 hora con BSA
1% en PBS 1x. Transcurridos los 10 minutos las células se lavaron 3 veces con PBS 1x
y luego se les incubó con el anticuerpo primario anti-mouse MRP1 (1:50) diluido en
solución de bloqueo, esta incubación se realizó en una cámara húmeda, bajo agitación
constante, durante toda la noche. Transcurrida la incubación con el anticuerpo primario,
se lavaron las células 3 veces por 5 minutos con PBS 1x e inmediatamente fueron
incubadas con el anticuerpo secundario anti-mouse Ig-G-FITC (1:100), el cual se diluyó
38
en solución de bloqueo. Esta incubación se llevo a cabo durante 1 hora, bajo agitación y
en una cámara oscura (para proteger la placa de la luz). Al terminar esta incubación las
células fueron lavadas 3 veces por 5 minutos con PBS 1x. Por último se realizó la
tinción de los núcleos con DAPI (1:1000) incubando las células por cerca de 2 minutos
con esta sustancia. Finalmente las células se lavaron y los cubreobjetos fueron pasados
por etanol, secados y montados en portaobjetos utilizando para ello el medio de
montaje para fluorescencia.
Para las GSCs, éstas fueron centrifugadas a 500xg durante 10 minutos, el pellet
fue resuspendido en un volumen tal que al sacar una alícuota de 400 µL haya
aproximadamente 100.000 células. Esta alícuota se posiciona en una citospin (Thermo),
y después de 10 minutos de centrifugación a 2000 RPM las células quedan adheridas a
un portaobjetos, para lo cual se continúa con el procedimiento experimental de manera
equivalente al mencionado para células GBM. Las células fueron observadas en un
microscopio LEICA DM2500
4.2.17 Proceso de selección de GSCs/CD133+ y GSCs/C D133-.
El proceso para aislar células CD133+ y CD133- fue llevado a cabo utilizando la
técnica de Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) utilizando perlas magnéticas con
anticuerpos anti CD133 acoplados. Para ello se determinó el número de células en
suspensión y centrifugar a 300xg por 10 minutos, aspirando el sobrenadante
completamente. Posteriormente se resuspendió el pellet celular en 300 µL de buffer
(contiene PBS pH 7.2, 0.5% de BSA y 2 mM de EDTA) por cada 108 células. Se agrega
100 µL de Reactivo bloqueador de FcR y 100 µL de las perlas magnéticas (CD133
39
Microbeads). Se homogeniza bien esta mezcla y se incuba durante 30 minutos a 4°C.
Después de esto se lavan las células adicionando 1 – 2 ml de buffer por cada 108
células y se centrifugan a 300xg durante 10 minutos, Aspirando el sobrenadante
completamente. Posteriormente se posiciona la columna en el campo magnético, y se
acondiciona con 500 µL de buffer. Después se aplica la suspensión celular en la
columna, y se recolecta el flujo líquido que cae de la columna correspondiente a las
células CD133-. Luego la columna es lavada tres veces con 500 µL de buffer, se
recolecta este volumen también. Finalmente, se quita la columna del campo magnético,
se pipetea medio MNE aproximadamente 2 ml en la columna y con un émbolo se
extraen las células que quedaron adheridas en la columna, correspondientes a las
GSCs CD133+. Todos los experimentos llevados a cabo en las células CD133+ y
CD133- fueron hechos de la misma manera que las GSCs.
4.2.18 Proceso de selección de GSCs/CD44+ y GSCs/CD 44-.
El procedimiento para separar células con respecto al marcador CD44 fue llevado
a cabo por la técnica FACS. Las células fueron cosechadas por aspiración y lavadas
con DPBS. Fueron incubadas con el anticuerpo CD44-FITC (Miltenyi) por 30 minutos,
lavadas y sometidas al proceso de sorting en citómetro de flujo BD FACSJazz en
modo de pureza para la separación GSCs positivas y negativas para CD44.
4.2.19 Ensayo de quimiosensibilización en GSCs.
Las GSCs fueron sometidas a la droga antineoplásica Vincristina durante 60
horas a una concentración de 10 nM. Posteriormente fueron cosechadas por aspiración
40
y se co incubaron con Yoduro de propidio 5μg/ml y el anticuerpo CD44-FITC (Miltenyi)
1:10. Posteriormente las células fueron lavadas y resuspendidas en DPBS para su
lectura en citómetro BD C6 Accuri. Las células viables fueron seleccionadas y se
expresaron los resultados en dot-plot de FITC vs SSC-H para determinar el porcentaje
de GSCs/CD44+ en nuestros cultivos.
4.2.20 Estadística
Los datos para los gráficos son presentados como el promedio ± desviación
estándar. La significancia fue evaluada utilizando la prueba t-student, considerando un
valor P < 0.01 y se utilizó el programa GraphPad Prism para la obtención de los gráficos
y los análisis estadísticos.
41
5. RESULTADOS
5.1 Estandarización cultivo GSCs
De acuerdo a la disponibilidad de líneas celulares de glioblastoma multiforme en
nuestro laboratorio, se seleccionaron las líneas G44 y T98 con el fin de comenzar la
estandarización del cultivo celular para obtener las GSCs mediante la generación de
neuroesferas (NEs). Los antecedentes bibliográficos describen estrategias de cultivo
carentes de suero, debido a que promueve la diferenciación celular, por lo tanto el
medio diseñado y los aditivos empleados deben ser libres de suero.
Hoy en día se encuentran disponibles diferentes medios de cultivo que son
diseñados especialmente para cumplir diferentes requerimientos; se seleccionó el
medio NeuroBasal (GIBCO) como base para el cultivo de GSCs. Los factores de
crecimiento epidermal (EGF) y fibroblástico (FGF) fueron añadidos al medio a una
concentración de 20 nM. El aditivo B-27 sin vitamina A (GIBCO) diseñado para el
crecimiento y mantención de cultivos celulares de origen neural libre de suero, también
fue seleccionado y el factor inhibidor de leucemia (LIF), el cual fortalece la inducción de
las GSCs y evita su diferenciación en el corto y mediano plazo. Este medio neurobasal
suplementado utilizado para la generación de neuroesferas fue llamado MNE.
El primer paso de nuestro estudio fue determinar cuál de nuestras líneas
celulares disponibles respondía mejor a las condiciones de cultivo para la generación
de las neuroesferas, por lo tanto, las células de las líneas G44 y T98 en expansión
fueron tripsinizadas y sembradas (aproximadamente 500.000 células) en placas T75
con MNE y se esperó 48 horas para iniciar las observaciones. Se realizó siempre un
42
seguimiento fotográfico para los primeros análisis exploratorios de manera comparativa
en cada línea celular y en cada condición de cultivo.
La figura 2 muestra que las células T98 respondieron de mejor manera que las
células G44 ante las condiciones para la generación de GSCs en el medio neurobasal
suplementado. Las células G44 no proliferaron como se esperaba, muchas se
adhirieron a la placa y no se observó una cantidad de esferoides satisfactoria (Figura
2A). En el caso de la línea celular T98, la cantidad de células en proliferación y
suspensión fue considerablemente mayor, y ya en los primeros días comenzaron a
aparecer algunas aglomeraciones celulares que dan indicios del comienzo de formación
de neuroesferas y por consiguiente la generación de GSCs (Figura 2B), de tal modo
que las células T98 fueron seleccionadas para continuar con el proceso de
estandarización del método de cultivo. Como las células G44 se encontraron en su
mayoría con escaso nivel de proliferación y con gran cantidad de células
aparentemente en estados de apoptosis (Figura 2A), se descartaron como posible
modelo experimental para obtener GSCs y continuamos el proceso de estandarización
con la línea T98.
Las células T98 sembradas en MNE fueron sometidas a un continuo seguimiento
fotográfico para evaluar la proliferación y comportamiento ante estas nuevas
condiciones (figura 3). Durante el segundo y tercer día la proliferación de las células fue
alta, manteniéndose en su mayoría como esferoides en suspensión y la generación de
algunas aglomeraciones celulares y neuroesferas durante 4 días (Figuras 3A y 3B). La
cantidad de células adherentes o en aparentes estados de diferenciación no fueron
evidentes. Las neuroesferas formadas a partir del cuarto día comenzaron a variar en
43
Figura 2. Comparación de respuesta de la línea celu lar G44 y T98 ante las
condiciones de cultivo para la generación de neuroe sferas. Fotografía de
microscopía óptica de los cultivos celulares bajo el método de obtención de
neuroesferas. Se sembraron aproximadamente 500.000 células en placas T75 en
medio MNE, y se esperaron 48 horas para comenzar el seguimiento fotográfico en las
líneas A) G44 y B) T98. Aumento 20x.
44
Figura 3. Seguimiento de la proliferación celular d e la línea T98 en medio MNE.
Fotografía de microscopía óptica donde se observa el crecimiento y comportamiento de
las células de la línea T98. Las células de GBM fueron sembradas y sometidas a un
seguimiento fotográfico para evaluar su respuesta y comportamiento a lo largo de A) 48
horas, B) 72 horas y C) 96 horas. Aumento 20x.
45
cuanto a la superficie alcanzada, ya que las neuroesferas comenzaron a aumentar su
tamaño, pero la cantidad de células individuales en suspensión dejo de ir en aumento.
Esto último fue hasta que la proliferación celular pareció detenerse y las células
comenzaron a adherirse. A su vez, los esferoides disminuyeron su número
considerablemente (Figura 3C).
Antecedentes experimentales indican que la obtención eficiente de NEs es
influenciada de manera importante por el espacio disponible que tengan las células
para su crecimiento y mantención; siendo estos procesos mayormente notorios y
eficientes en espacios un poco más reducidos que el espacio que entrega una placa
T75, por lo tanto se probaron las células T98 en crecimiento que fueron tripsinizadas y
sembradas en placas de 6 pocillos en MNE para evaluar su proliferación y mantención
en superficies más pequeñas, con la finalidad de ver si la cantidad de células que se
adhieren irreversiblemente a la placa, para comenzar los procesos de diferenciación, es
menor en espacios más reducidos. (Figura 4).
Sorprendentemente se vieron neuroesferas ya en menos de 24 horas de cultivo,
presentando una estructura homogénea y compacta, con la presencia de dos
morfologías celulares: células estrelladas adherentes correspondientes a células gliales
diferenciadas de glioblastoma multiforme, y células esféricas creciendo preferentemente
en suspensión y formando aglomeraciones celulares de diferentes tamaños. Se
mostraron además, algunos esferoides adheridos así como también neuroesferas
ancladas a la placa sin presentar una adherencia completa, pero estos casos no eran
los más usuales ni representativos (Figura 4A). Se les adicionó más medio
suplementado y se resuspendieron suavemente las células para revertir la adhesión y
46
Figura 4. Seguimiento de la proliferación celular d e la línea T98 sembradas en
placas de 6 pocillos. Fotografía de microscopía óptica, donde se aprecia el
comportamiento de las células sembradas en un espacio más reducido. A) 24 horas de
cultivo, B) 48 horas de cultivo, C) 7 días de cultivo D) Células adherentes diferenciadas
que fueron separadas de las neuroesferas en suspensión. Aumento 20x.
47
reprimir parcialmente la diferenciación. En 48 horas de cultivo la cantidad de
neuroesferas no se ve aumentada y el número de células diferenciadas es muy alto y
con tendencia a seguir aumentando, por lo que se concluye que requieren una re
suspensión mecánica frecuente (Figura 4B). Las células diferenciadas disminuyeron su
número y las neuroesferas tendieron a detener su crecimiento (Figura 4C). Aunque la
diferenciacion celular fue irreversible en algunos casos (Figura 4D).
Aunque el proceso de diferenciación aún era una dificultad constante para
obtener GSCs, nos quedó claro que la eficiencia en la obtención de neuroesferas de
GBM fue mayor en placas de 6 pocillos en comparación a otras como lo son las placas
T75, T25 y placas de 60mm, que también fueron probadas con resultados menos
satisfactorios (datos no mostrados).
Como un intento de evitar la posibilidad que las células adherentes ya
diferenciadas en nuestros cultivos puedan inducir la diferenciación de las que
permanecen aún en suspensión o ancladas, se decidió hacer una re suspensión
mecánica suave, extrayendo el medio de todas las placas y centrifugando las células
durante 10 minutos a 300xg, descartando el sobrenadante para después re suspender
las células y finalmente sembrarlas en placas de 6 pocillos nuevas.
Las células que ya se estaban diferenciando y creciendo como células
adherentes fueron sometidas al mismo medio para la generación de GSCs, pero este
proceso de diferenciación no se pudo revertir y las células pasaron a ser en su totalidad
células diferenciadas de GBM (Figura 4D)
Para determinar y re evaluar cuál es la incidencia que tiene el medio de cultivo en los
procesos de proliferación y diferenciación celular que estábamos notando en nuestras
48
células, se prepararon tres medios basados en medio Neurobasal pero suplementados
de diferente manera; se sembraron las células que fueron separadas de aquellas que
habían comenzado a diferenciarse y se realizó un seguimiento para pesquisar cuál de
los medios es el más eficiente para la generación de neuroesferas.
Las preparaciones de los medios suplementados se llevaron a cabo de la siguiente
manera:
• MNE1 : EGF, FGF, LIF
• MNE2 : EGF, FGF
• MNE3 : EGF, FGF, LIF, B27
Interesantemente, todos los medios fueron eficaces en cuanto a la capacidad de
generar neuroesferas (Figura 5), pero no todos los medios tuvieron la misma eficiencia.
El MNE2 (Figura 5B) fue el menos eficiente de los tres medios probados, debido a que
generó menos cantidad de neuroesferas por campo, el MNE1 (Figura 5A) presentó una
eficiencia media porque en el mismo lapso de tiempo pudo generar una mayor cantidad
de neuroesferas por campo. El medio MNE3 (Figura 5C) fue el más eficiente de todos
los medios, debido a que mostró una mayor cantidad de neuroesferas por campo y
éstas fueron generadas en un tiempo menor en comparación a las demás y por lo tanto,
optamos por la utilización del MNE3 para continuar con el estudio.
A pesar que se encontró una manera efectiva de generar neuroesferas con la línea
celular T98, nos afrontamos a la dificultad de que la población celular respondía al MNE
de manera heterogénea, habiendo siempre un grupo de células en forma de esferoides
49
Figura 5. Análisis de la incidencia del medio de cu ltivo en la generación de
neuroesferas. Fotografías de microscopía óptica de cultivos de células T98 en MNE
suplementados de diferente manera después de 5 días de cultivo. Previamente las
células T98 que estaban formando neuroesferas fueron aspiradas para separarlas de
las células que se estaban adhiriendo a la placa y comenzaban los procesos de
diferenciación celular. A) Cultivadas en MNE1 (EGF, FGF, LIF), B) Cultivadas con
MNE2 (EGF, FGF), C) Cultivadas con MNE3 (EGF, FGF, LIF, B-27). Aumento 20x.
50
y neuroesferas en suspensión, y un grupo de células diferenciadas o en proceso de
diferenciación que crecía de manera adherente y que al largo plazo inducirían la
adhesión y diferenciación de los esferoides y neuroesferas. Entonces, decidimos
cambiar la estrategia del proceso de sembrado, el cual consistía en sembrar las células
T98 en placas T75 para hacerlas crecer a hasta un 80% de confluencia, posteriormente
tripsinisarlas y sembrarlas en las nuevas placas con MNE, para comenzar la generación
de las GSCs. La nueva estrategia consistió en expandir la línea celular, para después
congelar y almacenar continuamente las células de GBM a -80°C; y posteriormente, en
un tiempo no menor a 24 horas de congelación, despertarlas en MNE y en placas de 6
pocillos, para determinar si de esta manera las células responderían al medio de
manera sincronizada y poder ver cambios más homogéneos y representativos.
Las células T98 despertadas en MNE mostraron una mayor proliferación y una
diferenciación considerablemente menor, aunque homogenización y separación de
células adherentes y células en suspensión fueron eventualmente necesarias.
Las células generaron neuroesferas a un rendimiento bastante mayor en
comparación a las pruebas anteriores, alcanzando su máximo crecimiento en el día 10
(figura 6).
Después de realizadas las pruebas en la línea celular T98, se decidió trabajar
con la línea U87, la cual ha sido descrita como una buena línea generadora de
neuroesferas y ver si con esta línea obteníamos mayor número de neuroesferas. De
modo que todos los procesos y estrategias implementadas en la línea T98 fueron
también llevados a cabo en la línea U87 y se le hizo un seguimiento similar al hecho
anteriormente. La línea celular U87 presentó una mejor respuesta que la línea T98, el
51
Figura 6. Análisis de la proliferación celular de l a línea T98 cultivadas en medio
MNE. Fotografías de microscopía óptica donde se observa la respuesta de las células
despertadas en el medio suplementado para la generación de neuroesferas. La línea
celular T98 fue expandida y almacenada, y después de al menos 24 horas fueron
despertadas y sembradas en placas de 6 pocillos en MNE para efectuar el seguimiento
fotográfico. A) 3 días de cultivo. B) 10 días de cultivo. Aumento 20x.
52
proceso de diferenciación era virtualmente nulo, la proliferación fue considerablemente
mayor y la generación de neuroesferas alcanzó su máximo en el día 10 (Figura 7) por lo
que se continuaron los estudios con la línea U87.
Una vez establecidos los parámetros de crecimiento para nuestras GSCs y
asegurándonos que la diferenciación celular en nuestros cultivos era despreciable,
comenzamos el proceso de caracterización de nuestro modelo experimental analizando
la expresión de distintos marcadores de stem cell neurales (Figura 8). Mediante un
ensayo de western blot pudimos notar la presencia de CD133 en 3 días diferentes de
cultivo (Figura 8A) y la presencia de transcritos de CD133, CD44 y Nestina (Figura 8B),
adicionalmente corroboramos la expresión de CD44 mediante inmunofluorescencia en
nuestros cultivos (Figura 8C). Todos estos datos en conjunto nos permiten concluir que
nuestros cultivos de GSCs, tienen el fenotipo stem-like que describe la literatura, por lo
que podemos confirmar que la implementación y estandarización de las GSCs fue
realizada con éxito.
5.2 Análisis comparativo de la expresión, localizac ión y actividad del transportador MRP1 entre las células de GBM y las G SCs.
Continuando con el estudio se realizó una comparación de expresión del
transportador MRP1 entre las células diferenciadas de la línea celular U87 y las GSCs.
Se llevaron a cabo ensayos de RT-PCR y western blot para comparar la cantidad de
transcritos y proteínas expresadas respectivamente, en nuestros diferentes cultivos bajo
condiciones normales. De manera contraria a lo que se esperaba, los resultados indican
que la cantidad de transcritos para MRP1 en las GSCs muestran una tendencia
53
Figura 7. Seguimiento de la proliferación celular y respuesta de la línea U87.
Fotografía de microscopía óptica donde se ven las células U87 en A) 24 horas,
aumento 4x. B) 24 horas aumento 40x. C) 10 días, aumento 20x, D) 10 días, aumento
40x.
54
A
B
C
55
Figura 8. Caracterización de los cultivos de neuroe sferas de U87. A) Western Blot
para el marcador de stem cells neurales CD133 en los días 5, 7 y 10. B) Productos de
amplificación de múltiples marcadores de stem cells neurales. C) Inmunofluorescencia
del marcador de stem cells neurales CD44. Las GSCs fueron colocadas en un porta
objeto mediante centrifugación usando una cito spin (Thermo), posteriormente fueron
fijadas con paraformaldehído y permeabilizadas. Finalmente incubadas con anticuerpo
anti-CD44 acoplado a FITC (1:10) Núcleos teñidos con DAPI (azul). n=3.
56
discretamente menor a nuestros controles que corresponden a células diferenciadas de
GBM, pero no presentaron una significancia estadística (Figura 9). De igual manera,
mediante los ensayos de western blot pudimos notar la misma tendencia de expresión,
donde los cultivos de GSCs presentaron una expresión con una tendencia
relativamente menor de MRP1 no estadísticamente significativa (Figura 10).
Para analizar la localización celular de MRP1, tanto en nuestros cultivos diferenciados
como en las GSCs, llevamos a cabo ensayos de inmunofluorescencia. Los cuales nos
permitieron correlacionarlos con los resultados obtenidos de los ensayos de expresión
por RT-PCR y western blot, observando una discreta señal de MRP1 en nuestros
cultivos (Figura 11).
Para poder evaluar si en las GSCs efectivamente MRP1 cumple un rol importante en el
fenotipo quimio resistente, desarrollamos un ensayo de actividad mediante el uso de un
sustrato fluorescente específico para este transportador (CFDA). Para ello, llevamos a
cabo los experimentos en nuestros diferentes cultivos, con este sustrato a una
concentración de 500 nM y usando un inhibidor específico para MRP1 MK571) a una
concentración de 20 µM. Los resultados muestran que MRP1 es un transportador
significativamente activo en las GSCs, pero éste es menos activo con respecto a las
células U87 diferenciadas. Los tratamientos con MK571 mostraron un nivel de inhibición
similar en ambos tipos celulares (Figura 12).
A pesar que la generación de neuroesferas es un método de cultivo que
promueve la proliferación de GSCs, se ha descrito que no todas las células dentro de
estas aglomeraciones expresan los marcadores descritos, restringiendo su expresión en
regiones específicas de la neuroesfera. Como uno de los primeros marcadores
57
Figura 9. Expresión de MRP1 en la línea U87 (célula s diferenciadas) y en las GSCs
provenientes de la misma línea celular por RT-PCR. Los productos de amplificación
por RT-PCR para β-actina y MRP1 fueron semicuantificados con el programa imageJ y
representan la relación entre los transcritos de MRP1 versus los transcritos del gen
constitutivo β-actina. n=3.
58
Figura 10. Análisis de expresión de MRP1 en la líne a U87 (células diferenciadas) y
en las GSCs provenientes de la misma línea celular mediante western blot. Las
proteínas totales de las células U87 y GSCs/U87 fueron electrotransferidas a una
membrana de PVDF para luego ser incubadas con el anticuerpo primario anti MRP1.
Posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente y fueron
reveladas con el sistema de quimioluminicencia ECL. Como control de carga se utilizó
β-actina, n= 3.
Figura 11 . Expresión y localización de MRP1 por inmunofluore scencia en la línea
celular U87 y en GSCs.
sembradas en placas con cubreobjetos, en cambio
porta objetos mediante la centrifugación usando
celulares fueron fijados con paraformaldehído, luego permeabilizadas y finalmente
incubadas con anticuerpo anti
secundario acoplado a alexa fluor 488 (1:100) y se realizó la tinción del material
genético con DAPI (1:1000). A) Células diferenciadas U87. B) GSCs
obtenida utilizando el objetivo de 63x.
. Expresión y localización de MRP1 por inmunofluore scencia en la línea
celular U87 y en GSCs. Las células de la línea celular U87 diferenciadas
das en placas con cubreobjetos, en cambio las GSCs fueron posicionadas en un
mediante la centrifugación usando cito spin (Thermo).
celulares fueron fijados con paraformaldehído, luego permeabilizadas y finalmente
icuerpo anti-MRP1 (1:50). Posteriormente se incubó con el anticuerpo
secundario acoplado a alexa fluor 488 (1:100) y se realizó la tinción del material
genético con DAPI (1:1000). A) Células diferenciadas U87. B) GSCs/U87
el objetivo de 63x.
59
. Expresión y localización de MRP1 por inmunofluore scencia en la línea
diferenciadas fueron
las GSCs fueron posicionadas en un
cito spin (Thermo). Ambos tipos
celulares fueron fijados con paraformaldehído, luego permeabilizadas y finalmente
MRP1 (1:50). Posteriormente se incubó con el anticuerpo
secundario acoplado a alexa fluor 488 (1:100) y se realizó la tinción del material
/U87. Magnificación
60
Figura 12. Análisis de la actividad de MRP1 en la l ínea U87 y las GSCs/U87. La
actividad fue medida por acumulación del sustrato fluorescente CFDA 500 nM en las
U87 y GSCs/U87. Como tratamiento se utilizó el inhibidor específico de MRP1, MK571;
durante 30 minutos a una concentración de 20 µM. La medición de la acumulación se
realizó a una excitación de 488 nm y emisión de 530 nm. La gráfica muestra la relación
entre unidades de fluorescencia y la concentración de proteínas en μg/µl. ** Diferencias
estadísticas entre el tratamiento en las GSCs con respecto a su control, P < 0,01. ***
Diferencias estadísticas entre el tratamiento de las células U87 respecto a su control, P
< 0,001, °°° Diferencias estadísticas entre los controles de las células U87 y las GSCs,
P < 0,001. Datos según análisis t-student (n=3).
61
descritos para stem cells neurales fue CD133, y aunque aún no se conoce a ciencia
cierta su función biológica; quisimos analizar la expresión de MRP1 en GSCs positivas
para CD133 con respecto a las negativas para este marcador para ver si la expresión
de este marcador podría influir en la quimio resistencia de nuestros cultivos. Se
implementó un método de aislación de células por la técnica MACS, técnica descrita
bibliográficamente por la eficiencia y pureza con la que puede aislar células mediante la
utilización de anticuerpos acoplados a perlas magnéticas.
5.3 Comparación en la expresión, localización y act ividad de MRP1 entre las
células CD133- y CD133+
Como en el proceso de caracterización de nuestros cultivos pudimos observar la
presencia de CD133 en los días 5, 7 y 10 de crecimiento, optamos por someter las
células al proceso de aislación el día 7 para dejarlas crecer hasta el día 10 y hacer los
experimentos correspondientes. Las células después de separadas, fueron sembradas
en placas diferentes en medio MNE y sometidas a un seguimiento fotográfico. Las
poblaciones de células CD133+ y CD133- mostraron diferentes características
morfológicas y proliferativas. Las células CD133+ mostraron ser una subpoblación
considerablemente menor en las neuroesferas, aproximadamente un 13% del total de
células como el máximo registrado después de haber sometido las GSCs a MACS. Las
células sometidas al sorting por afinidad magnética mostraron un comportamiento
diferente, las células CD133- comenzaron rápidamente a generar aglomeraciones
celulares y neuroesferas creciendo en suspensión y concentrándose en el centro de
cada pocillo de cultivo (Figura 13 A y 13 C), las células CD133+ en cambio mostraron
62
63
Figura 13. Separación celular por afinidad magnétic a usando el marcador CD133
de células iniciadoras del glioblastoma. Los cultivos de GSCs fueron sometidos a la
técnica MACS (Miltenyi Biotec) para seleccionar y aislar la sub población celular que
exprese el marcador CD133 de las que no lo expresan (CD133+ y CD133-,
respectivamente). A) Células CD133- formando neuroesferas. Aumento 10x. B) Células
CD133+ creciendo como esferoides. Aumento 10x. C) Células CD133- después de 10
días de cultivo. Aumento 20x. D) Células CD133+ después de 10 días de cultivo.
Aumento 20x. E) Células CD133+ formando neuroesferas. Aumento 10x. F) Células
CD133+ formando neuroesferas . Aumento 20x.
64
una proliferación elevada pero no necesariamente formando neuroesferas sino que
crecían de manera individual dispersas en todo el pocillo (Figura 13 B y 13 D). La
mayoría de las células positivas para CD133 crecieron en suspensión como esferoides
sin formar aglomeraciones pero su tiempo de vida fue inferior que las células negativas
para este marcador, no pudiendo superar los 10 días de crecimiento desde el momento
del sorting celular. Las células CD133- no presentaron este problema.
Las células positivas en algunos casos mostraron formación de neuroesferas,
pero no alcanzaban la cantidad de las que alcanzaron las negativas (13 E y 13 F). Lo
que si fue evidente es que las células CD133- eran más proclives a diferenciarse que
las células CD133+, mostrando una cantidad considerable de células diferenciadas
antes de llegar al día 10 (Figura 14).
Se procedió a medir la expresión de MRP1 en las células sometidas a MACS
para compararlas con nuestro control de células U87 diferenciadas mediante RT-PCR.
Los resultados muestran que no hay diferencias estadísticamente significativas de
MRP1 entre las células positivas y negativas para CD133, y tampoco con respecto a los
controles de la línea U87 diferenciada. Adicionalmente, probamos la expresión de
CD133, para garantizar la eficiencia y pureza de la separación por afinidad magnética,
pudiendo observar que los controles de células U87 no expresaron el marcador CD133,
tampoco lo expresan las células consideradas negativas para este marcador;
restringiendo entonces la expresión únicamente para las células consideradas positivas
según el procedimiento experimental, de modo que podemos confiar en que no hubo
falsos positivos por contaminación cruzada entre las dos sub poblaciones celulares
(Figura 15). Asimismo, llevamos a cabo ensayos de inmunofluorescencia a nuestras
65
Figura 14. Diferencias en los procesos de diferenci ación entre las células CD133-
y CD133+. Las células separadas por la técnica MACS crecieron de manera diferente y
mostraron patrones de diferenciación diferentes. A) Células CD133- generando
neuroesferas y comenzando a generar las prolongaciones celulares propias de las
células gliales de GBM, lo cual indica procesos de diferenciación celular. B) Células
CD133+ generando pequeñas aglomeraciones y con escasas señales de
diferenciación. Fotografía tomada el séptimo día de cultivo. Aumento 20x
66
Figura 15. Expresión de MRP1 en las células CD133- y CD133+ por RT-PCR. Los
productos de amplificación para β-actina y MRP1 fueron semi-cuantificados con el
programa imageJ y representan la relación entre los transcritos de MRP1 versus los
transcritos del gen constitutivo β-actina. n=3.
67
células sometidas al proceso de sorting, con el fin de confirmar la tendencia vista por
RT-PCR y ver si hay diferencias en la localización celular para MRP1. Los resultados
son concordantes con los datos obtenidos previamente; no presentaron diferencias de
expresión y localización celular significativas entre las células CD133- y CD133+ (Figura
16). Decidimos evaluar la actividad del transportador MRP1 entre estas mismas células
para ver si en este caso existen diferencias significativas. Los resultados muestran que
las células CD133+ y las células CD133- se comportan como dos tipos celulares
completamente diferentes. En ambos tipos de células se observa una actividad basal de
MRP1 y una inhibición evidente y estadísticamente significativa de este transportador
tras los tratamientos con MK571. Sin embargo la actividad MRP1 en las células
CD133+ mostró ser más elevada que en las células CD133-, al menos en las
condiciones basales. La inhibición con MK571 no incrementó los niveles de
fluorescencia en estas dos sub poblaciones celulares a valores semejantes entre sí
como ocurrió anteriormente entre las células U87 y las GSCs, debido a que las
GSC/CD133+ aumentaron su fluorescencia tras la inhibición en un 40%, mientras que
las GSCs/CD133- aumentaron su fluorescencia en un 20% después de ser inhibidas
con MK571, indicando la mayor actividad de MRP1 en las células positivas para CD133.
(Figura 17).
5.4 Análisis de expresión de MRP1 en GSCs CD44+ y C D44-.
Habiendo determinado la discreta diferencia de MRP1 en las GSCs en cuanto al
marcador CD133, quisimos determinar si había diferencias en la expresión de este
transportador usando otro marcador de células stems, CD44. Mediante qRT-PCR
68
Figura 16. Expresión y localización de MRP1 por inm unofluorescencia en las
células CD133- y CD133+. Las células fueron posicionadas en un porta objetos
mediante la centrifugación usando una cito spin (Thermo); posteriormente fueron fijadas
con paraformaldehído, luego permeabilizadas y finalmente incubadas con anticuerpo
anti-MRP1 (1:50). Posteriormente se incubó con el anticuerpo secundario FITC (1:100)
y se realizó la tinción del material genético con DAPI (1:1000). Magnificación obtenida
utilizando el objetivo de 63x.
69
Figura 17. Análisis de la actividad de MRP1 en las GSCs CD133- y CD133+ . La
actividad fue medida por acumulación del sustrato fluorescente CFDA en dos sub
poblaciones celulares producto del proceso de separación por afinidad magnética,
células CD133- y CD133+. Como tratamiento se utilizó el inhibidor específico de MRP1,
MK571; durante 30 minutos a 20 µM. La medición de la acumulación de fluorescencia
se realizó a una excitación de 488 nm y emisión de 530 nm. La gráfica muestra la
relación entre unidades de fluorescencia y el contenido de proteínas en μg/µL. Símbolos
sobre las columnas representan diferencias estadísticamente significativas: *
Tratamiento con MK571 con respecto al control en células CD133- P < 0,05. ** Entre el
tratamiento con MK571 y control en células CD133+ P<0,01. °° Entre los dos controles
CD133 positivas y negativas P<0,01. °°° Entre los tratamientos con MK571 entre las
células CD133 positivas y negativas P<0,0001. Según t-student ( n=3 ).
70
pudimos ver que hay diferencias significativas de expresión de MRP1 en células
CD44+, presentando un nivel de expresión 75% mayor en comparación a las células
CD44- (Figura 18).
5.5 Estudio de la quimiosensibilización en GSCs CD4 4+ y CD44-.
Debido a que notamos una mayor expresión de MRP1 en las células CD44+,
realizamos un ensayo de quimiosensibilización utilizando la droga antineoplásica
Vincristina (Vc) que es sustrato para este transportador. Esto lo hicimos para medir los
cambios en la viabilidad celular con este tratamiento farmacológico, rastreando
mediante citometría de flujo las poblaciones celulares expresando CD44. Los resultados
muestran que la población de GSCs/CD44 positivas, son más resistentes a los
tratamientos con Vc que las células negativas, debido a que inicialmente las
GSCs/CD44+ comprenden menos del 20% del total de células y después del
tratamiento este porcentaje subió a más del 40%, implicando entonces que la viabilidad
de las células CD44+ no fue mayormente afectada en comparación a las CD44- (Figura
19).
71
Figura 18. Expresión de MRP1 en las GSCs CD44+ y CD 44-. Las GSCs fueron
sometidas a una separación de células por citometría de flujo usando un anticuerpo anti
CD44. Se aisló RNA total desde GSCs CD44+ y CD44- y los niveles de transcrito de
MRP1 fueron amplificados por qPCR. Los gráficos describen los productos de
amplificación de MRP1. *, P<0,01 con respecto al control. n=3.
Figura 19 . Ensayo de
vincristina en las GSCs
CD44 acoplado a FITC y con yoduro de propidio, previo tratamien
antineoplásica vincristina cuando fue necesario. Las células viables fueron
seleccionadas para los análisis y se determinó
tratamiento. n=2.
. Ensayo de quimiosensibilización usando la droga antitumoral
CD44+. Las GSCs fueron marcadas con el anticuerpo anti
44 acoplado a FITC y con yoduro de propidio, previo tratamien
incristina cuando fue necesario. Las células viables fueron
seleccionadas para los análisis y se determinó el porcentaje de células CD44+ en cada
72
usando la droga antitumoral
arcadas con el anticuerpo anti
44 acoplado a FITC y con yoduro de propidio, previo tratamiento con la droga
incristina cuando fue necesario. Las células viables fueron
el porcentaje de células CD44+ en cada
73
6. DISCUSIÓN.
La hipótesis de las células madre cancerígenas sugiere que los tumores son
originados y mantenidos por una subpoblación de células iniciadoras con propiedades
auto renovantes y multipotentes llamadas cáncer stem cells. Esta hipótesis no está
restringida únicamente a GBM, sino que para otros tipos de cáncer también (Lim,
Llaguno et al. 2011). Sin embargo, este concepto ha llegado a ser controversial dentro
de la comunidad científica seguido de múltiples diferencias en resultados obtenidos en
los últimos años (Prestegarden and Enger 2010).
Actualmente, se utiliza el cultivo de esferas para aislar CSCs, pero se ha
demostrado que estas esferas pueden ser altamente dinámicas, y que pueden unirse
para generar estructuras quiméricas (Singec, Knoth et al. 2006) y además hay
resultados experimentales que mostrarían que la generación de esferas no es un pre
requisito para obtener células madre cancerígenas, y en el caso de gliomas las células
diferenciadas creciendo en monocapa, presentan características adjudicadas a las
CSCs como el potencial tumorigénico (Bexell, Gunnarsson et al. 2009). Sin embargo,
otras investigaciones que inducen la diferenciación de las células stem neurales,
pueden inhibir el desarrollo del tumor in vivo lo que sugiere que la tumorigénesis
necesita de al menos una subpoblación que tenga estas propiedades de células
troncales en un tumor. (Piccirillo, Reynolds et al. 2006); lo que nos estaría invitando a
poner en discusión a lo menos dos cosas, por un lado que el método de cultivo de
obtención de neuroesferas tienen una limitada sensibilidad y especificidad en cuanto al
aislamiento de las GSCs, y por otro lado que existen diferencias en los modelos
74
experimentales y/ó métodos entre las diferentes líneas de investigación que inciden en
resultados que sugieren hipótesis diferentes, lo que nos estaría explicando tal nivel de
controversia con respecto a esta área de investigación; por lo tanto, intentamos efectuar
un estudio no solamente de GSCs con respecto a la línea celular de GBM U87, sino
que también un análisis comparativo en células sometidas a una selección en virtud de
marcadores de stem cells neurales, el ampliamente utilizado marcador CD133 además
del marcador CD44.
Está descrito que las células madre o troncales tienen una elevada quimio y radio
resistencia (Bao, Wu et al. 2006; Jin, Zhao et al. 2010), y nosotros presentamos un
estudio comparativo de la expresión del transportador mayormente sobre expresado en
GBM, MRP1 con nuestros cultivos de GSCs y, a pesar que estas células presentaban
un gran nivel de expresión de éste; no vimos diferencias estadísticamente significativas
entre nuestras GSCs y la línea U87 de células diferenciadas, así como tampoco
diferencias de expresión entre las células CD133+ y CD133-. Los ensayos de actividad
de MRP1 en las GSCs muestran que si bien la actividad de este transportador es alta,
no es mayor que en las células diferenciadas de GBM, pero que las GSCs/CD133+
poseen una mayor actividad de MRP1 que las GSCs/CD133-. Considerando que la
expresión y actividad de MRP1 en las GSCs de igual manera es alta, queda en
discusión también si la quimio resistencia descrita en las GSCs asociada al fenómeno
MDR estaría supeditada a la expresión de otros transportadores pertenecientes a la
familia ABC y otros transportadores pertenecientes a otras familias génicas como MVP,
y en trabajos anexos a esta investigación se hicieron los primeros ensayos de expresión
de MDR1, MRP3 y ABCG2 mediante Western Blot (datos no mostrados); donde se
75
observó que estos miembros de la familia ABC como transportadores MDR presentan
una alta expresión en GSCs, por lo que no descartamos que en estas células la
presencia de otros transportadores MDR puedan estar involucrados en la alta
quimioresistencia descrita previamente, ( de hecho ya se ha descrito la mayor expresión
de algunos transportadores MDR en GSCs en comparación a las células bulk ) sin estar
únicamente supeditado a la expresión y actividad de MRP1 que es el más abundante
en GBM, aunque más procedimientos experimentales son necesarios para confirmar
esta hipótesis en nuestros modelos.
Además, notamos que la expresión de CD133 no hace la diferencia en cuanto a
la expresión de MRP1 en nuestros cultivos, aunque notamos un dinamismo
considerable en cuando a la morfología y comportamiento de las células CD133- y las
CD133+, mostrando una actividad de MRP1 completamente diferente, siendo ésta
considerablemente más alta en las células CD133-.
Aunque su función biológica sigue sin ser entendida en su totalidad, CD133 es
un marcador ampliamente utilizado para la aislación de células stem neurales, y de las
cuales hay una cantidad creciente de evidencias que apoyan este hecho (Zhang and Li
2010); a pesar que la utilidad de CD133 como un marcador universal utilizable para
aislar células madre de tumores cerebrales ha sido cuestionada en muchos estudios
(Beier, Hau et al. 2007; Joo, Kim et al. 2008; Wang, Sakariassen et al. 2008; Son,
Woolard et al. 2009; Chen, Nishimura et al. 2010) debido a la alta variabilidad de
expresión de CD133 en gliomas (desde 1 – 60%), además de la existencia de gliomas
con células CD133- capaces de auto renovarse y de generar tumores por ensayos
xenografts, lo que nos indica que la ausencia de CD133 no restringiría un fenotipo
76
stem-like cells en el caso de tumores cerebrales (Wang, Sakariassen et al. 2008; Chen,
Nishimura et al. 2010). Sin embargo también existe mucha evidencia que muestran la
importancia de CD133 en la proliferación y gliomagénesis.
Brescia y colaboradores, han descrito y demostrado experimentalmente la alta
variabilidad de los niveles de expresión de CD133 en neuroesferas provenientes de
cultivos primarios; y más importante aún, que al menos en neuroesferas derivadas de
pacientes con GBM, no habría un número considerable de tumores negativos para
CD133, esto debido a la presencia de transcritos de esta proteína en células
consideradas como negativas tras la separación celular por citometría de flujo. En estos
ensayos la proteína CD133 presentaba diferentes ubicaciones celulares y dividiría la
población de GSCs en dos sub poblaciones, una subpoblación con expresión de CD133
restringida al citoplasma (identificadas como CD133-) y otra subpoblación con la
expresión de este marcador a nivel citoplasmático y además en el plasmalema
(identificadas como CD133+), esto, debido a que las técnicas convencionales de sorting
celular (ya sea MACS o FACS) pueden separar diferentes poblaciones celulares en
cuanto a la presencia de los marcadores en la membrana, sin considerar la posible
ubicación citoplasmática, por lo que la implementación de técnicas de sorting con
procedimientos permeabilizantes además de técnicas de imaging con diferentes
fluorocromos para un mismo epítope permitieron describir un pool de CD133
citoplasmática en aquellas células consideradas como CD133-. Más aún, ellos
demostraron que en función del tiempo los diferentes patrones de expresión sufrían
procesos de intercambio entre las células negativas y positivas, por lo que se demostró
que en GBM no existe una jerarquía histológica entre las GSCs, lo que significa que las
77
células CD133- no tienen como precursoras a las células CD133+ ni vice versa
(Brescia, Ortensi et al. 2013). Independiente si CD133 es un buen marcador de GSCs
de stem cells neurales en general, si existen evidencias que la expresión de esta
proteína influye en la supervivencia celular, y cuya expresión es esencial para la
mantención tumoral y gliomagénesis, por lo que su consideración como blanco
terapéutico para GBM no debe ser descartada, como fue demostrada por estos mismos
autores mediante experimentos en xenografts (Brescia, Ortensi et al. 2013). El conjunto
de información controversial disponible con respecto a los estudios en GSCs y
marcadores como CD133 puede explicarse parcialmente por las diferencias en los
modelos experimentales utilizados y en las limitaciones de las técnicas de aislación
utilizando marcadores de membrana, más aun después de caracterizar la carencia de
jerarquía histológica entre GSCs/CD133+ y GSCs/CD133- generando subpoblaciones
celulares cuyo patrón de expresión es altamente dinámico y de gran variabilidad en la
población de personas que padecen de GBM. No queda duda que la utilización de
GSCs provenientes de líneas celulares y GSCs provenientes de cultivos primarios de
biopsias de pacientes con GBM son herramientas útiles para comprender la biología de
estas células iniciadoras del tumor, pero no podríamos esperar que todos los diferentes
modelos arrojen siempre los mismos resultados. Como ejemplo mencionamos este
estudio utilizando GSCs provenientes de la línea U87 separadas en función del
marcador CD133 utilizando MACS, donde la presencia de transcritos para CD133
estuvo únicamente en las células consideradas positivas en función de su marcador en
la membrana, pero esta propiedad no siempre se cumple ya que se han descrito GSCs
sometidas a sorting consideradas como CD133- que si presentan los transcritos para
78
CD133 pero que no necesariamente la proteína se encontrará en la membrana después
de ser traducida, siendo esta una fuente de limitaciones para el sorting de células
basándose en los marcadores de membrana siendo necesarios procedimientos
adicionales que permitan la permeabilización celular para permitir que los anticuerpos
necesarios para el marcaje puedan ingresar a la célula y unirse a sus epítopes
intracelulares en caso de que existan, en este caso, la técnica FACS presentaría una
ventaja con respecto la técnica MACS.
Debido a que en nuestros cultivos de GSCs notamos una alta expresión del
marcador CD44, más que CD133, realizamos algunos ensayos adicionales. Mediante
inmunoflorescencias hechas en neuroesferas cuyas células no fueron disgregadas
antes del proceso de fijación, quisimos determinar las posibles diferencias en las
ubicaciones estructurales de ciertos genes dentro de la neuroesfera, pudimos notar que
CD44 y que MRP1 comparten la misma localización dentro de esta estructura (datos no
mostrados) a diferencia de otros genes cuya expresión se encuentra en diferentes
partes de la neuroesfera, por lo tanto quisimos determinar la expresión de MRP1 en
GSCs/CD44+ y GSCs/CD44-. Notamos que en la población CD44+ existe una
considerable mayor expresión de MRP1 con respecto a las células CD44-. Además
observamos que el uso de tratamientos antineoplásicos con la droga vincristina,
sustrato de este transportador, mostraron que las células que expresan este marcador
fueran más quimioresistentes. La importancia de CD44 radica además en que está
íntimamente ligado a vías de señalización involucradas en la supervivencia celular,
como lo es la vía AKT (Jijiwa, Demir et al. 2011), además está íntimamente ligado al
receptor de TGF-β, el cual es un factor oncogénico que se está considerando en
79
estudios clínicos como un potencial blanco terapéutico y ya se ha relacionado
directamente con la expresión de CD44 en GSCs con un mal pronóstico de la
enfermedad (Anido, Saez-Borderias et al. 2010).
Otros resultados de nuestro laboratorio nos indican que en las GSCs hay una
alta expresión del receptor de adenosina A3 y de la ectoenzima CD73. Se ha descrito
que adenosina puede actuar como factor proliferativo para células de glioma en cultivo
(Morrone, Jacques-Silva et al. 2003) y el receptor A3, participa en mecanismos de
sobrevivencia celular y proliferación. Por medio de este receptor se incrementa los
niveles de invasión. Al utilizar antagonistas sistémicos contra el receptor A3 se observan
efectos antiproliferativos (Fishman, Bar-Yehuda et al. 2004). Por otro lado la enzima
ecto-5’-nucleotidasa (Ecto-5’NT), también conocida como CD73, se considera como la
enzima limitante en la generación de adenosina extracelular mediante la catálisis de la
hidrólisis de AMP (Picher, Burch et al. 2003; Colgan, Eltzschig et al. 2006; Stagg and
Smyth 2010).
La expresión de A3 y CD73 en GSC fue más alta que en las células de GBM
diferenciadas, esto es sumamente relevante ya que éstos genes participan en el
fenómeno de múltiple resistencia a drogas promoviendo además la expresión de MRP1
en este tipo de tumor (Quezada, Garrido et al. 2013).
Como conclusión, podemos decir que las GSCs incluyen un conjunto de
características que las harían más quimioresistentes que las células diferenciadas de
GBM, estas características incluyen la alta expresión de varios transportadores MDR, la
expresión de marcadores como CD133 y CD44 que están directamente ligados con la
gliomagénesis, con la proliferación celular, con la supervivencia celular, la capacidad
80
infiltrativa entre otras. Además estas células muestran una alta expresión y actividad de
genes relacionados con las vías de señalización de adenosina, los cuales se han
reportado como partícipes en la quimioresistencia del GBM, por lo que estos estudios
en GSCs serían de gran importancia para proponer a las GSCs como un potencial
blanco terapéutico en la terapia del Glioblastoma Multiforme Humano.
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