Producción heteróloga de péptidos
antimicrobianos en Lactococcus lactis.
Instituto de Productos Lácteos de Asturias
(IPLA-CSIC).
Diego. López. Luelmo
Junio/2017
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En este trabajo vamos a estudiar y poner de manifiesto el uso de microorganismos como factorías celulares, es decir, la producción recombinante de proteínas utilizando como huésped un microorganismo, en este caso serán cepas de Lactococcus lactis, que es una de las bacterias que forman parte de las llamadas bacterias del ácido láctico (BAL). Las proteínas que queremos expresar van a tener actividad antimicrobiana, y en particular una de ellas va a formar parte de un grupo de péptidos antimicrobianos conocido como bacteriocinas, muy utilizadas por ejemplo en la industria alimentaria; la otra proteína va a ser una endolisina, que también va a tener actividad antimicrobiana pero que no es una bacteriocina, aunque el efecto final de ambas será el mismo. Las secuencias génicas que codifican para ambas proteínas se encuentran bajo la acción de un promotor inducible (NICE), es inducible por una bacteriocina llamada nisina (usada como conservante de alimentos). Las proteínas que queremos obtener son las siguientes: una proteína de Streptococcus penumoniae homóloga a la Lactococina 972 y la endolisina del fago MG-3 de Lactococcus lactis.
En el trabajo se pretende tanto dar con las condiciones óptimas de producción de las proteínas así como demostrar su actividad; para esta última parte se utilizarán técnicas como bioensayos y zimogramas.
In this work we will study and highlight the use of microorganisms as cell factories, i.e. the production of recombinant proteins using a microorganism, as a guest in this case will be strains of Lactococcus lactis, which is one of the bacteria that are part of the so called bacteria of lactic acid (LAB). The proteins that we express will have antimicrobial activity, and in particular one of them is going to be part of a group of antimicrobial peptides known as bacteriocins, widely used for example in the food industry; other protein is going to be an endolisin, which is also going to have antimicrobial activity but is not a bacteriocin, although the final effect of both will be the same. The gene sequences that encode for both proteins are found under the action of an inducible promoter (NICE), inducible by a bacteriocin called nisin (used as a preservative in food). Proteins that we get are the following: a protein of Streptococcus penumoniae homologous to the 972 Lactococina and the endolisina of the phage MG-3 of Lactococcus lactis. Labour
intends both to find the optimal conditions for production of proteins as well as demonstrate their activity; for this last part will be used bioassays.
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Índice:
1. Introducción ........................................................................................................... 4
1.1 L. Lactis como factoría celular ............................................................................. 4
1.2 Péptidos antimicrobianos (bacteriocinas) ............................................................ 4
1.3 Clasificación de las bacteriocinas ........................................................................ 5
1.4 Síntesis y regulación de las bacteriocinas ........................................................... 5
1.5 Método de acción de las bacteriocinas ................................................................ 5
1.6 Espectro de acción de las bacteriocinas .............................................................. 6
1.7 Lactococina 972 .................................................................................................. 6
1.8 Sistema de inducción por Nisina ......................................................................... 7
1.9 Homólogo de la Lactococina 972 en Streptococcus pneumoniae ....................... 8
1.10 Endolisina-MG3 ................................................................................................. 8
1.11 Transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9 ................. 9
2. Objetivos ................................................................................................................... 9
3. Material y métodos .................................................................................................. 10
3.1 Microorganismos, medios y condiciones de cultivo ........................................... 10
3.2 Curvas de crecimiento ....................................................................................... 10
3.3 Electroforesis .................................................................................................... 11
3.4 Tinción de las bandas........................................................................................ 11
3.5 Ensayos en placa de actividad antimicrobiana .................................................. 11
3.6 Extractos para obtener la endolisina MG3 ......................................................... 11
3.7 Zimogramas ...................................................................................................... 12
3.8 Extracción del plásmido (MiniPrep) ................................................................... 12
3.9 Células competentes para la transformación ..................................................... 13
3.10 Transformación ............................................................................................... 13
4. Resultados y discusión ........................................................................................... 14
4.1 Estudio del efecto de la Nisina en las cepas ...................................................... 14
4.2 Ensayos de producción y actividad de la proteína de S. pneumoniae homóloga a
la Lactococina 972 .................................................................................................. 15
4.3 Ensayos de producción y actividad de la endolisina del fago MG-3 ................... 19
4.4 Transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9 ................................. 21
5. Conclusión .............................................................................................................. 22
6. Bibliografía .............................................................................................................. 23
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1. Introducción
1.1 L. Lactis como factoría celular
El trabajo se centrará en la producción heteróloga de proteínas en L. lactis, esta
bacteria es una de las llamadas bacterias del ácido láctico (BAL), a pesar de que se
asocie con productos de este tipo, la bacteria fue aislada originalmente de plantas, en
las que se encontraba en estado de quiescencia y solo era activada en el tracto
intestinal de los rumiantes que ingerían la planta ( Bolotin et al., 2001).
Las BAL son bacterias gram positivas que incluyen, entre otros, los géneros:
Lactococcus, Streptococcus y Lactobacillus, estas bacterias llevan usándose mucho
tiempo como cultivos iniciadores en procesos de fermentación de la leche para obtener
distintos productos lácteos (Alexandrescu et al., 1990).
Gracias al gran desarrollo en las últimas décadas de la tecnología del ADN
recombinante , junto con otras técnicas (como el sistema NICE, del que luego se
hablará), este microorganismo por su fácil manejo y condiciones de cultivo se ha
convertido en una buena "factoría celular", podemos obtener productos de origen
bacteriano, vírico, eucariota. En este trabajo, nos hemos centrado en la producción de
péptidos antimicrobianos o bacteriocinas.
1.2 Péptidos antimicrobianos (bacteriocinas)
El estudio de las bacteriocinas comenzó en los años 20 del pasado siglo,
describiéndose por primera vez en Escherichia coli (Gratia, 1925) y ampliándose
posteriormente a bacterias Gram-positivas (Jacob et al., 1953; Tagg et al., 1976).
Basándose en un estudio sobre colicinas por bacterias Gram-negativas, Tagg et al.
(1976) definieron los péptidos antimicrobianos producidos por los organismos Gram-
positivos, como compuestos proteináceos que inhiben el desarrollo de las bacterias
relacionadas taxonómicamente con la cepa productora.
Posteriormente, Konisky (1982) propuso la siguiente definición: " las bacteriocinas son
compuestos de naturaleza proteica y síntesis ribosomal que inhiben el crecimiento de
otros organismos y no provocan la muerte de la célula productora."
Probablemente las BAL (bacterias del ácido láctico) sean el grupo de bacterias que
producen una mayor cantidad de bacteriocinas. Aunque, como se comentará más
adelante, que sean el grupo con más producción, no significa que su espectro de
acción sea el de mayor interés, por ejemplo a nivel clínico.
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1.3 Clasificación de las bacteriocinas
Clasificación de las bacteriocinas (Nes et al., 1996 y Cleveland et al., 2001):
Clase I o lantibióticos: son péptidos pequeños (<5 KDa) que afectan a la permeabilidad
selectiva de las membranas. Contienen aminoácidos inusuales como la lantionina
metil-lantionina, dehidro-butirina y dehidro-alanina. Se subdividen a su vez en:
lantibióticos de tipo A, forman poros en las membranas y poseen estructuras flexibles
(como la nisina); lantibióticos de tipo B, no se han detectado bacteriocinas de este
grupo producidas por las BAL.
Clase II o no lantibióticos: son péptidos de hasta 10 KDa, termoestables, no presentan
aminoácidos modificados post-traduccionalmente; éstos se subdividen en: clase IIa,
clase IIb y clase IIc.
Clase III: este grupo está formado por proteínas de gran tamaño (>30 KDa),
termolábiles.
1.4 Síntesis y regulación de las bacteriocinas
Los genes que codifican para la producción de bacteriocinas se encuentran
organizados en operones, que se localizan en plásmidos, en transposones (Engelke et
al., 1992) o en el cromosoma bacteriano (Altena et al., 2000; Diep et al., 1996).
La biosíntesis de bacteriocinas depende de una estructura genética compuesta
generalmente por (Nes et al., 1996):
- El gen estructural: que codifica la prebacteriocina, aunque en el caso de
bacteriocinas de dos componentes existen dos genes estructurales.
- El gen de inmunidad: cuyo producto protege frente al efecto antimicrobiano de la
bacteriocina y que generalmente está estrechamente ligado al gen estructural e
incluso forma parte de la misma unidad de transcripción.
- Un gen que codifica para un transportador ABC: que excreta la bacteriocina y cataliza
el procesamiento del péptido señal.
- Un gen que parece codificar para una proteína accesoria: parece ser esencial para la
secreción de la bacteriocina.
1.5 Método de acción de las bacteriocinas
Para aquellas bacteriocinas de BAL cuyo modo de acción se conoce, se ha
demostrado que, dada su naturaleza catiónica e hidrofóbica, éstas interaccionan con la
membrana plasmática de las células sensibles formando poros que anulan su
permeabilidad selectiva (Moll et al., 1999), lo que provoca irremediablemente la muerte
celular. Debido a este tipo de interacción, los principales sistemas de resistencia frente
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a las bacteriocinas se basan en alterar la carga neta de la membrana para dificultar la
interacción de la bacteriocina con ella.
Sin embargo, no todas las bacteriocinas forman poros. Se han descrito otros modos
de acción como la inhibición de la síntesis de peptidoglicano o de la formación del
septo de división (Héchard y Sahl, 2002).
Los lantibióicos tipo A, como la nisina, son capaces de formar poros de forma
transitoria en la membrana celular, provocando la disipación del potencial de
membrana y la pérdida de metabolitos pequeños, como aminoácidos, nucleótidos y
ATP, dando lugar a la detención del metabolismo celular (Brötz et al., 1998; Héchard y
Shal, 2002).
El proceso de formación de poros de las bacteriocinas de la clase II no ha sido tan
exactamente estudiado como el de los lantibióticos. Se sabe que la facultad de estas
bacteriocinas de adoptar una conformación anfipática-helicoidal es uno de los factores
determinantes para la formación de poros (Ennahar et al., 2000).
Por otro lado, estudios realizados con análogos de bacteriocinas han demostrado que
el enantiómero de la leucina A es inactivo biológicamente (Yan et al., 2000), lo cual
indicaría la necesidad de interacciones quirales con una molécula receptora para la
actividad de dicha bacteriocina. Además, la necesidad de un receptor también
explicaría el espectro restringido de estas bacteriocinas.
1.6 Espectro de acción de las bacteriocinas
En general, la acción de las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-positivas
está restringida principalmente a otras especies de Gram-positivas. El rango de
organismos inhibidos por cada bacteriocina varía considerablemente : por ejemplo,
mientras que la nisina es activa frente a especies de una gran variedad de géneros
bacterianos ( Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria y Mycobacterium),
la bacteriocina de clase II, lactococina A, solamente es activa frente a Lactococcus.
El espectro de acción de las bacteriocinas de BAL es poco interesante desde el punto
de vista clínico, ya que ninguna de éstas suele tener un efecto patogénico sobre el ser
humano, por eso se busca e investiga en la producción de otras bacteriocinas más
interesantes desde este punto de vista.
1.7 Lactococina 972
La lactococina 972 es una bacteriocina producida por la cepa Lactococcus lactis
subsp. lactis IPLA 972 (lcn972) (Martínez, 1996), con características muy peculiares
respecto a su estructura y modo de acción. Es un péptido hidrofílico de 66
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aminoácidos biológicos. Es termosensible, activa en un rango de pH comprendido
entre 4,0 y 9,0 y poco susceptible a la acción de proteasas.
La información genética tanto de la producción de la lactococina 972 como de su
inmunidad, se encuentra en un plásmido de 10,9 KDa denominado pBL1. Se
identificaron dos orfs, que codificaban la prebacteriocina (lclA) y una proteína integral
de membrana (lclB) (Martínez et al., 1996).
La producción de lcn 972 es máxima durante la fase exponencial de crecimiento de la
cepa L. lactis IPLA972. Los estudios de los niveles de expresión del ARNm de los
genes lclA y lclB indicaron que ambos genes formaban una única unidad de
transcripción, siendo la abundancia del transcrito proporcional a la velocidad de
acumulación de lactococina 972 en el sobrenadante de los cultivos (Martínez et al.,
1999).
La peculiaridad más destacable de la lactococina 972 reside en su modo de acción
que ha sido parcialmente caracterizado. Esta bacteriocina es bactericida y, en algunos
casos bacteriolítica, para cultivos de Lactococcus en fase exponencial, aunque se
están comenzando a aislar cepas resistentes a su acción. A diferencia de otras
bacteriocinas descritas, lcn 972 no forma poros en la membrana plasmática de las
células sensibles; sino que inhibe la síntesis del peptidoglicano en el septo, afectando
así a un proceso crucial en el ciclo biológico celular como es la división celular.
1.8 Sistema de inducción por Nisina
Se trata del uso de un promotor inducible por la bacteriocina nisina que es muy útil
para la producción heteróloga de proteínas en L.lactis.
El sistema NICE (Nisin controlled expression system), consiste en el promotor
inducible por nisina (Pnis) que es activado por el regulador NisR, que junto a la histidín
quinasa NisK constituye un sistema de dos componentes que detecta la nisina. Por
tanto, una vez que la nisina activa este sistema, se induce la expresión del gen que
haya sido clonado a continuación de Pnis.
Figura 1. Sistema de inducción por
Nisina, en este caso el gen X sería
sprO600 y X su producto proteico
(Hernández de Rojas., 2005).
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1.9 Homólogo de la Lactococina 972 en Streptococcus
pneumoniae
Con la secuenciación de todos los genes involucrados en la síntesis y regulación de
lcn972 se hizo un rastreo de los mapas genéticos de bacterias de interés, fue el caso
de Streptococcus pneumoniae, donde se aisló una secuencia génica con altas
coincidencias respecto a la de la lactococina 972, en un principio se creyó que esta
secuencia podría ser una bacteriocina que por homología a Lcn 972 podría inhibir
específicamente a la misma especie bacteriana, en cuyo caso sí que sería de interés
clínico, ya que este microorganismo es patógeno del ser humano.
Previamente a este trabajo, el gen spr0600 que codifica dicha bacteriocina se introdujo
en el plásmido PNZ8020,dando lugar a la construcción plasmídica pBL9 (Figura 2), la
expresión de esta proteína recombinante está bajo el sistema de expresión NICE, esta
construcción plasmídica se introdujo en L. lactis y se realizaron estudios de inducción
con nisina para la producción heteróloga de esta proteína homóloga a la Lactococina
972.
Figura 2. Plásmido pBL9 (sprO600 es la secuencia del gen que codifica la proteína homóloga a
la Lactococina 972).
1.10 Endolisina-MG3
Las endolisinas son un producto proteico con actividad lítica producido por los
bacteriófagos, que en algunos casos se encuentran integrados en el genoma de las
bacterias como profagos. Confieren gran variabilidad a las especies y cepas que los
tienen, solo cuando están en ciclo lisogénico, es decir, que no inducen la lisis del
huésped.
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Cuando los profagos se activan, entrarían en el ciclo lítico, y provocan la lisis del
huésped en el cual participan las endolisinas, con ayuda de otro tipo de proteínas que
son las holinas.
Las holinas son unas proteínas de pequeño tamaño que se insertan en la membrana
bacteriana formando canales que permiten la salida de las endolisinas al espacio
periplásmico donde atacan al petidoglicano (uno de los principales elementos de la
pared bacteriana), la degradación de la pared bacteriana induce la lisis celular, ya que
la célula queda muy desprotegida frente a gradientes moleculares y aspectos
osmóticos del medio donde se encuentre.
En la cepa L. lactis subsp. cremoris MG1613 se han encontrado los siguientes
profagos (se usa este término cuando el bacteriófago está insertado en el genoma y
sigue un ciclo lisogénico): MG-1, MG-2, MG-3, MG-4, MG-5, t712.
Basándose en la longitud de los profagos se cree que solo MG-3 y t712 son profagos
completos, mientras que el resto son secuencias incompletas (Ventura et al., 2007).
La secuencia del gen que codifica la endolisina del profago MG-3 se clonó en un
plásmido (PUK200), baja el control del sistema NICE y se introdujo en L. lactis, para la
realización de ensayos de producción y comprobar su actividad lítica.
1.11 Transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200
con pBL9
Como experimento complementario a la producción del producto de la secuencia de S.
pneumoniae homóloga a la Lactococina 972, se realizó una transformación con pBL9
de las cepas NZ9000-400 y NZ9000-200, estas dos cepas llevan insertado en su
genoma el operón de la Lactococina 972 junto con los genes necesarios para su
inmunidad.
El plásmido pBL9 solo tiene clonado la secuencia correspondiente a la proteína
homóloga de la Lactococina 972, no se pudo lograr una construcción plasmídica con
los genes de la inmunidad frente a esta proteína.
Nuestro objetivo consistía en comprobar si al producir la proteína de S. pneumonie en
estas cepas se da un mejor rendimiento de producción, en caso de que esta proteína
afectara a Lactococcus, tanto por la forma de producirla o porque el huésped fuera
diana de su acción.
2. Objetivos
El objetivo fundamental de este trabajo es ensayar la producción recombinante de
diferentes proteínas en cepas de L. lactis.
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En primer lugar se procederá a la producción de la proteína de S. pneumoniae, y su
posterior detección mediante electroforesis de las muestras de sobrenadante de los
cultivos.
Después trataremos de producir la endolisina del fago MG-3, y demostrar su actividad
mediante zimogramas donde el microorganismo indicador será Lactococcus.
Por último, se purificará plásmido pBL9 y se transformarán las cepas NZ9000-200 y
NZ9000-400; para hacer una comparación entre este tipo de producción y la
producción en L.lactis.
3. Material y métodos
3.1 Microorganismos, medios y condiciones de cultivo
Las cepas empleadas fueron las siguientes: L. lactis NZ9000 que es una cepa
derivada de L. lactis MG1363, contiene los genes NisK y NisR y es receptora de
pNZ8020 y pNZ8048E (Kuipers et al., 1998); pBL54 que es una cepa derivada de
NZ9000, es una cepa productora de la Lactococina 972 (Hernández de Rojas., 2005).
Plásmidos empleados para transformar NZ9000: MG-3 contiene la secuencia del gen
de la endolisina del fago que lleva el mismo nombre y pBL9 (Figura 2) contiene la
secuencia de la proteína de S,pneumoniae homóloga a la Lactococina 972.
Por último, se realizó la transformación de las cepas NZ9000-400 y NZ-9000-200 con
el plásmido pBL9.
Las cepas de Lactococcus se propagaron en medio M17 (Oxoid, Baingstoke,
Hampshire, England) suplementado con glucosa al 0.5% y cloranfenicol a una
concentración de 10 µg/mL, a 32ºC y sin agitación. Para el caso de las cepas NZ9000-
400 y NZ9000-200 el antibiótico de selección fue la eritromicina a una concentración
de 5 µg/mL.
Para los bioensayos: mismo medio arriba indicado pero con agarosa al 1.2%.
3.2 Curvas de crecimiento
Se utilizó un espectrofotómetro (Eppendorf), para realizar las medidas puntuales de
densidad óptica (OD, de sus siglas en inglés) a una longitud de onda de 600 nm.
Para los estudios en los que necesitamos una medida de OD a intervalos de tiempo
constantes para construir una curva se utilizó un espectrofotómetro para placas
microtiter de 96 pocillos (Benchmark Plus, BioRad, EEUU), con incubación a 32ºC y
agitación suave antes de cada medida.
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3.3 Electroforesis
Para la detección de nuestras proteínas recombinantes se utilizó la electroforesis
(SDS-page), se usaron geles Acrilamida/Bisacrilamida con tricina y geles de
Acrilamida/Bisacrilamida con glicina; dependiendo del rango de tamaños que
quisiéramos discriminar (el porcentaje utilizado de Acrilamida/Bisacrilamida también
varió debido a este motivo).
Se utilizó el dispositivo MiniProtean de BioRad para realizarlas, a un voltaje constante
de 100 V.
Para las electroforesis de muestras de ADN se usaron geles al 1% de agarosa, se
realizaron también a voltaje constante de 100 V.
3.4 Tinción de las bandas
Para la tinción de las bandas de proteína de los geles se usaron dos métodos: Tinción
Coomassie y PlusOne Silver Staining Kit (GE Healthcare Life Sciences).
Tinción Coomassie: la solución de tinción contiene Azul Brillante Coomassie, ácido
acético, metanol y agua; el gel se deja cubierto por esta disolución unos 20 minutos en
agitación; la solución de desteñido contiene metanol, ácido acético y agua; en esta
última lo dejamos toda la noche sin agitación.
PlusOne Silver Staining Kit: fixing solution (40% etanol, 10% ácido acético) durante 30
minutos, sensitizing solution (30% etanol, 4% tiosulfato de sodio, 6,8% acetato de
sodio y 0.5% glutaraldehído) durante 30 minutos, silver reaction (10% nitrato de plata,
0.04% formaldehído) durante 20 minutos, developing solution (2.5% carbonato de
sodio, 0.08% formaldehído) y stop solution (1.5% EDTA-Na2●2H2O) durante 10
minutos.
Una vez desteñidos, los geles se escanearon con el programa LabScan y el equipo de
Amersham Biosciences.
3.5 Ensayos en placa de actividad antimicrobiana
Se inocula al 2% en profundidad la cepa indicadora (NZ9000) en 100 mL de medio
M17 con 1.2% de agar y se plaquea, se realizan pocillos en las placas y se introducen
20µl del agente antimicrobiano a ensayar, se pone a incubar toda la noche a 32ºC.
3.6 Extractos para obtener la endolisina MG3
Esta endolisina, como se ha comentado en la introducción, necesita de otra proteína
(la holina) para atravesar la membrana plasmática, por tanto, una vez producida por la
inducción del sistema NICE con nisina va a quedar en el citoplasma de la bacteria
huésped (NZ9000).
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Para poder "rescatarla" debemos romper la pared celular de Lactococcus, y para ello
se siguió el protocolo que se detalla a continuación.
Se inoculan 50 mL de M17, con glucosa y cloranfenicol, al 2% con un cultivo overnight
de la cepa MG3. Seguir la OD hasta un valor de 0.5, que será el más apto para la
inducción con nisina (una concentración entre 1-2 ng/mL) y que la cepa empiece a
producir la endolisina. Al cabo de 1 hora anotamos la OD del cultivo.
Centrifugamos en alícuotas de 10 mL a 3000 rpm durante 10 minutos, resuspendemos
cada alícuota en 1 mL de sacarosa al 25%. Mantenemos en hielo.
Se centrifuga 1 minuto a 14000 rpm y se resuspende en una disolución de sacarosa al
25% con una concentración de lisozima de 30 mg/mL; incubar 30 minutos a 37ºC.
Centrifugamos 1 minuto a 10000 rpm, resuspendemos en un volumen de buffer de
carga para la electroforesis atendiendo a este factor 0,025 unidades de O.D/µl LB
(buffer de carga) x 1. Hervimos las muestras a 100ºC durante 10 minutos (SDS-page).
3.7 Zimogramas
Este tipo de ensayo se realizó para poder poner de manifiesto la actividad de la
endolisina, para ello a los geles de acrilamida/bisacrilamida se les añade un 4% de
una suspensión de células de Lactococcus autoclavadas; el gel adquiere un aspecto
turbio debido a la presencia de las células. Una vez realizada la electroforesis se
incuba el gel en una disolución que permita la renaturalización de nuestra endolisina y
así poner de manifiesto su actividad, debemos renaturalizar ya que la electroforesis se
realiza en condiciones desnaturalizantes.
Los zimogramas se renaturalizaron siguiendo el siguiente protocolo: lavar los geles
con agua destilada en agitación durante 30 minutos, para añadirles después el buffer
de renaturalización (50 mM de MES, ácido 2-morfolinoetanosulfónico, 0.1% Tritón X-
100, pH 6), se incuban con la disolución a 37ºC en agitación durante toda la noche
(Jayaswal et al., 1990).
3.8 Extracción del plásmido (MiniPrep)
Para extraer y aislar el plásmido pBL9 de un cultivo en medio líquido, se utilizó High
pure plasmid isolation kit de Roche.
El kit está diseñado para extraer y purificar plásmidos de E.coli, de modo que se tuvo
que realizar un paso previo de digestión de la pared celular incubando con una
disolución 30 mg/ml de lisozima durante 1 hora a 37ºC.
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3.9 Células competentes para la transformación
Ya que el laboratorio no disponía de células competentes de NZ9000-400 y NZ9000-
200 para realizar una transformación (la transformación se realizó por electroporación),
se siguió el protocolo que se detalla a continuación para obtenerlas.
Para este protocolo se necesita medio M17 con glucosa al 0.5% y glicina al 1%, se
inoculan 50 mL de este medio al 10% con cultivos overnight de las cepas. Se dejan
crecer durante 2,5 horas a 32ºC , tras ello se ponen en hielo durante 10 minutos. Se
centrifugan las células a 3000 g durante 10 minutos y se resuspenden en 10 mL de
tampón de lavado (0.5 M sacarosa, 10% glicerol), se repite el mismo paso otras dos
veces, por último se resuspenden en 0,67 mL de tampón de lavado y se hacen
alícuotas de 40 µl. Estas alícuotas las almacenamos a -80ºC en nitrógeno líquido.
3.10 Transformación
Para la transformación de las células competentes obtenidas con pBL9 se realizó una
electroporación, este método tiene una alta mortalidad pero una gran eficiencia. El
electroporador usado es el Gene Pulser XCell de BioRad, los parámetros de la
electroporación fueron: 2000 Voltios, 25 Faradios, 200 Ohmios.
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4. Resultados y discusión
4.1 Estudio del efecto de la Nisina en las cepas
Lo primero que se hizo fue estudiar el efecto de distintas concentraciones de Nisina
sobre las cepas de trabajo. Se ensayaron distintas concentraciones que se detallan a
continuación.
Figura 3. Curvas de crecimiento de las cepas en presencia de Nisina, estudio del efecto de
distintas concentraciones de Nisina en NZ9000, e inducción a distintas concentraciones de
nisina de pMG3, pBL54 y pBL9.
En NZ9000 solo apreciamos un notable descenso en la curva de crecimiento a la
concentración más alta de nisina (5ng/mL). Respecto a la inducción de pBL9 vemos
una fuerte caída del crecimiento a todas las concentraciones de nisina, esto quiere
decir que el producto de pBL9 le está resultando tóxico a la célula o que la forma de
producirlo le resulta perjudicial para su crecimiento. Para pMG3 ocurre algo similar a
pBL9, y por último en el caso de pBL54 también vemos un efecto negativo en el
crecimiento al inducir la síntesis de la Lactococina 972, este efecto no debería ser tan
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acusado ya que en esta cepa se encuentran presentes los genes de resistencia a la
Lactococina 972.
4.2 Ensayos de producción y actividad de la proteína de S.
pneumoniae homóloga a la Lactococina 972
Los productos de pBL54 (Lactococina 972) y de pBL9 (proteína homóloga a la
Lactococina 972), se secretan al medio extracelular, por tanto podemos ver si tienen o
no actividad ensayando la actividad de los sobrenadantes de los cultivos inducidos a
diferentes concentraciones de nisina (sobrenadantes procedentes de los cultivos
utilizados para las curvas de crecimiento de la Figura 3).
Figura 4. Para este bioensayo se usó como cepa indicadora NZ9000, los números hacen
referencia a las concentraciones de nisina empleadas en la inducción de pBL54 y pBL9
respectivamente, también se usaron los sobrenadantes de NZ9000 con las mismas
concentraciones de nisina como control negativo del ensayo.
Solo se aprecian halos de inhibición para los sobrenadantes del cultivo de pBL54
donde se está expresando la Lactococina 972, que es fuertemente activa frente a
Lactococcus. La actividad del producto de pBL9 no se puede demostrar con este tipo
de experimentos.
Al no poder demostrar la actividad del producto de pBL9 en este tipo de ensayos en
medio sólido, se realizaron ensayos de actividad de los sobrenadantes en medio
líquido, es decir, añadiendo a cultivos de la cepa indicadora NZ9000 en fase
exponencial (O.D=0.5) los sobrenadantes de las inducciones de las cepas pBL9 y
pBL54, usando los sobrenadantes de NZ9000 como control.
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Figura 5. Ensayo de actividad de los sobrenadantes de pBL9 y pBL54 (control positivo), usando
como cepa indicadora NZ9000, se usa como control negativo los sobrenadantes de los cultivos
de NZ9000 con las mismas concentraciones de nisina empleadas en la inducción de pBL9 y
pBL54.
Se observa que en los sobrenadantes de NZ9000 (control negativo) solo afecta al
crecimiento el que tiene una concentración mayor de nisina (5 ng/mL), aspecto que ya
quedó demostrado en las curvas de crecimiento de la figura 3. La actividad de la
lactococina 972 se aprecia claramente comparando la bajada de los cultivos con
sobrenadante obtenido tras la inducción de pBL54 con nisina frente al cultivo con
sobrenadante de un cultivo no inducido de pBL54. Por otra parte, vemos que la
actividad del producto de pBL9 tampoco se detectó en este tipo de ensayo, vemos que
solo afecta al crecimiento de NZ9000 los sobrenadantes de la inducción con 5 ng/mL
de Nisina, y es debido a ella misma. Los principales motivos por los que no se puede
poner de manifiesto la actividad de la proteína homóloga son los siguientes: no está
siendo secretada, no se produce en suficiente cantidad para apreciar su actividad en
este tipo de ensayo, no se produce de forma activa, L. lactis no es diana de su acción.
No pudiendo demostrar la actividad del producto de pBL9 sobre Lactococcus, se
procedió a demostrar que efectivamente se estaba produciendo aunque no
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pudiéramos ver su actividad, la proteína de S. pnemoniae homóloga de la Lactococina
972 tiene un tamaño esperado de unos 8.8 KDa.
Figura 6. Gel de Acrilamida /Bisacrilamida con tricina y teñido con nitrato de plata de las
muestras de sobrenadantes. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: P54 (pBL54),
P9 (pBL9), NZ (NZ9000); y los números se refieren a la concentración de nisina (ng/mL) con
que han sido inducidos los cultivos. Las muestras de sobrenadante de pBL9 han sido
concentrados 10 veces con acetona.
Se ha utilizado en el gel un marcador, cuyos tamaños se detallan en la imagen, y
además una muestra de sobrenadante de un cultivo de pBL54 inducido con 0.3 ng/mL
de nisina, nos servirá de referencia también porque el tamaño de su proteína
homóloga no difiere mucho.
En este gel no se puede observar la producción de nuestra proteína ya que el intenso
bandeo de las calles indica que se produjo lisis celular desde las concentraciones más
bajas de nisina empleadas (0.15 ng/mL), esto nos impediría ver la banda de nuestra
proteína, en caso de que se estuviera produciendo.
Debido a estos resultados, se probó a inducir pBL9 con concentraciones más bajas de
nisina y ver si se podía evitar la lisis celular para poder obtener sobrenadantes limpios
y demostrar que nuestra proteína es producida y secretada al medio extracelular.
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Una vez realizado este ensayo de inducción a concentraciones más bajas de 0.15
ng/mL de nisina se corrieron en un gel las muestras de sobrenadantes
correspondientes (Figuras 7 y 8).
Figura 7. Curvas de crecimiento de los cultivos de pBL9 inducidos a concentraciones de nisina
desde 0.0024 ng/mL , se crecen cultivos de NZ9000 con las mismas concentraciones de nisina
como control.
Figura 8. Gel de Acrilamida /Bisacrilamida con tricina y teñido con nitrato de plata de las
muestras de sobrenadantes. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: P9 (pBL9), NZ
(NZ9000); y los números se refieren a la concentración de nisina (ng/mL) con que han sido
inducidos los cultivos.
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Respecto a las curvas de crecimiento vemos que la inducción/producción de la
proteína homóloga no resulta ser tan tóxica; en el gel en las calles 5, 7 y 9 podemos
ver una banda entorno a los 9 KDa que además se va intensificando según aumenta la
concentración de nisina, en las calles 4, 6 y 8 vemos ausencia de esa banda; lo que
significa que tiene que ser el producto de la inducción de pBL9, por tanto, nuestra
proteína homóloga si está siendo producida; por tanto, hemos podido demostrar que la
proteína de S. pnemoniae homóloga a la Lactococina 972 está siendo producida
cuando las concentraciones de nisina empleadas en la inducción son de: 0.039 ng/mL,
0.078 ng/mL y 0.15 ng/mL.
4.3 Ensayos de producción y actividad de la endolisina del fago
MG-3
Para producir la endolisina, además de inducir el cultivo de pMG3 con nisina debemos
realizar extractos celulares (Apartado 3.6), ya que la endolisina por sí misma, como se
explicó en la introducción, no puede secretarse al medio.
En el apartado 4.1 ya hemos visto como le afecta la inducción con nisina al cultivo de
pMG3, y vemos que la bajada de las curvas de crecimiento es bastante notable a
todas las concentraciones de nisina salvo a la más baja que es de 0.15 ng/mL, ya que
para una producción eficiente nos interesa que haya la suficiente cantidad de células
produciendo nuestra endolisina, para que obtengamos unas concentraciones de
proteína que podamos verificar en un gel, de este modo, la inducción se realizó a 0.15
ng/mL de nisina, se indujo el cultivo de pMG3 en fase exponencial (O.D=0.5) a esa
concentración de nisina, se recogieron muestras a la hora y a las dos horas de la
inducción; el mismo protocolo se le aplicó a un cultivo de NZ9000 para disponer de un
control negativo. El tamaño de nuestra endolisina es de unos 31,8 KDa.
Para demostrar la actividad de nuestra endolisina, paralelamente al gel se realizó un
zimograma, en el que vamos a renaturalizar la endolisina con el tampón MES (
Apartado 3.7).
Los resultados de ambos ensayos se exponen a continuación en las figuras 9 y 10.
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Figura 9. Gel de Acrilamida /Bisacrilamida con tricina y teñido con nitrato de plata de las
muestras de extractos de pMG3. Las letras de arriba hacen referencia a lo siguiente: M3
(pMG3), NZ (NZ9000); y los números se refieren al tiempo en horas tras la inducción con 0.15
ng/mL de nisina.
Figura 10. Zimograma con las muestras de los extractos de pMG3 y NZ9000 (control negativo),
tras 1 y 2 horas de inducción con 0.15 ng/mL de nisina. Renaturalizado con el tampón MES. La
autolisina es una proteína de L.lactis que es secretada al medio y es capaz de digerir el
peptidoglicano, la lisozima se encuentra en los extractos porque se usa para digerir la pared de
petidoglicano, debido a esto ambas son controles positivos de los zimogramas.
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Como podemos ver en la Figura 9 tenemos una banda adicional en las muestras de
pMG3 que no tenemos en las de NZ9000, que es nuestro control negativo, por tanto la
endolisina sí se ha producido como demuestra el gel. Sin embargo la actividad de la
endolisina no ha podido demostrarse ya que no se ve nada a la altura del tamaño
esperado de la endolisina en el zimograma, bien porque no sean sus condiciones
óptimas de renaturalización (también se ensayó un tampón de acetato de sodio a pH
5.2, no se revelaron ni los controles positivos) o porque el péptido que se sintetiza
carece de actividad.
4.4 Transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con pBL9
Como se comentó en la introducción, la última parte de este trabajo será la
transformación de NZ9000-400 y NZ9000-200 con el plásmido pBL9 (contiene la
secuencia de la proteína homóloga a la Lactococina 972); con ello queremos ver en
las curvas de crecimiento si la inducción/producción de pBL9 en estas cepas no
resulta tan tóxica para el huésped como ocurría en NZ9000 transformado con pBL9
(pBL9). Al ser proteínas homólogas se podría pensar que comparten alguna de las
rutas del sistema de inmunidad, las cepas que vamos a transformar tienen insertado
en su genoma no solo la secuencia del gen de la Lactococina 972 sino también los del
sistema de inmunidad a la misma. Tras la transformación (Apartado 3.10) de las
células competentes (Apartado 3.9) de ambas cepas, se realizó una MiniPrep
(Apartado 3.8) para correr un gel de agarosa al 1% y asegurarnos que el plásmido
estaba presente en las colonias seleccionadas con cloranfenicol (resistencia de pBL9).
Figura 11. Curvas de crecimiento de las cepas en presencia de Nisina, estudio del efecto de
distintas concentraciones de Nisina en NZ9000 (control), e inducción a distintas
concentraciones de nisina de pBL9, NZ9000-400 y NZ9000-200 transformadas con pBL9.
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A la vista de los resultados de las curvas de crecimiento no podríamos concluir que la
producción de la proteína homóloga fuera mejor en estas cepas transformadas. Ya
que apenas se produce cambio notable en el crecimiento entre unas y otras.
5. Conclusión
Con este trabajo se ha puesto de manifiesto la gran utilidad, presente y futura, que
tiene el uso de microorganismos como "factorías celulares." Se ha conseguido
demostrar que Lactococcus lactis es apto para la producción de las siguientes
proteínas: la proteína de Streptococcus pneumoniae homóloga a la Lactococina 972 y
la endolisina del fago MG-3; ambas han sido detectadas mediante electroforesis; con
los recursos y las técnicas empleadas no se ha podido poner de manifiesto su
actividad. En el caso del producto de pBL9 solo se ha enfrentado con Lactococcus
lactis pudiendo no ser éste su diana de acción específica, y aunque lo fuera tampoco
podemos asegurar que el péptido se produce en suficiente cantidad como para que
sea notable su efecto; tampoco podemos afirmar que el péptido producido tenga la
conformación y el plegamiento adecuado para poder ser funcional.
En el caso de la endolisina de MG-3 tampoco hemos podido poner de manifiesto su
actividad, por motivos similares a los de pBL9, con la diferencia de que aquí sí
sabemos que nuestra proteína actúa contra Lactococcus lactis, en el caso de los
zimogramas se deberían ensayar distintas condiciones de renaturalización, antes de
descartar que esta endolisina no fuera activa.
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6. Bibliografía
Alexandrescu, A., Hinck A., y Markley, L. "Coupling between local structure and global
stability of a protein: mutants of staphylococcal nuclease". Biochemistry. 1990; 29:
4516-4452. 2007.
Altena, K., Guder, A., Cramer, Cy Bierbaum, G. 2000."Biosynthesis of the lantibiotic
mersacidin: organization of a type B lantibiotic gene cluster". Appl. Environ. Micribial.
66:2565-2571.
Bolotin, A., Wincker, P., Mauger, S., Jaillon O., Malarme, K., Weissenbach, J., Ehrlich
SD, y Sorokin, A. "The complete genome sequence of the lactic acid bacterium
Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403". Genome Res. 2001;11:731–53.
Brötz, H., Josten, M., Wiedemann, I., Schneider, U., Gotz, F., Bierbaum, G. y Sahl,
H.G. 1998. "Role of lipid-bound peptidoglycan precursors in the formation of pores by
nisin, epidermin and other lantibiotics". Mol. Microbiol. 30: 317-327.
Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F. y Chikindas, N.L. 2001. "Bacteriocins: safe,
natural antimicrobials for food preservation." Int. J Food Microbiol. 71: 1-20.
Diep, D.B., Harvarstein, L.S., Nissan-Meyer, J. y Nes, I.F. 1994. "The gene encoding
plantaricin, a bacteriocin from Lactobacillus plantarum C11, is located on the same
transcription unit as an arg-like regulatory system". Appl. Envirom. Microbiol. 60:160-
166.
Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M y Entian, K.D. 1992. "Biosyntesis of
the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB
protein." Appl. Environ. Microbiol. 58:3730-3743.
Ennahae. S., Sashihara, T., Sonomoto, K. y Ishizaki, A. 2000. "Class IIa bacteriocins:
byosinthesis, structure ans activity." FEMS Microbiol. Rev. 24:705-716.
Gratia, A. 1925. "Sur un remarquable exemle d´antagonism entre deux souches de
colibacille." C. R. Soc. Biol. Fill. 93: 1040-1041.
Facultad de Biología. Junio 2017
24
Héchard, Y. y Sahl, H.G. 2002. "Mode of action of modified and unmodified
bacteriocins from Gram-positive bacteria." Biochimie. 84: 545-557.
Hernández de Rojas, A. 2005. Tesis Doctoral. Universidad de Oviedo.
Jacob, F., Lwolf, A., Simonovitch, A y Wollman, E.L. 1953. "Definition de quelques
termes relatifs à la lysogénie." Ann. Inst. Pateur. 84: 222-224.
Jayaswal, R. K., Y. Lee, and B. J. Wilkinson. 1990. Cloning and expression of a
Staphylococcus aureus gene encoding a peptidoglycan hydrolase ctivity. J. Bacteriol.
172:5783–5788.
Kuipers, O.P., de Ruyter, P.G.G.A., Kleerebezen, M. y de Vos, W.M. 1998. "Quorum
sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria." J. Biotechnol. 64:15-21.
Martínez, B. 1996. Tesis Doctoral. Universidad de Oviedo.
Martínez, B., Fernández, M., Suárez, J.E. y Rodríguez, A. 1999. "Synthesis of
lactococcin 972, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis IPLA 972, depends on
the expression of a plasmid-encoded bicistronic operon." Microbiology. 145: 3155-
3161.
Martínez, B., Suárez, J.E. y Rodríguez, A. 1996. "Lactococcin 972: a homodimeric
lactococcal bacteriocin whose primary target is not the plasma membrane."
Microbiology. 142:2393-2398.
Moll, G. N., Konings, W. N. y Driessen, A.J.M. 1999. "Bacteriocins: mechanism of
membrane insertion and pore formation." Antonnie van Leeuvenhock. 76: 185-198.
Nes, I.F., Diep, D.B., Harvarstein, L.S., Brurberg, M.B., Eijinsk, V.E. y Holo H. 1996.
"Biosyntehsis of bacteriocins in lactic acid bacteria." Antonie van Leeuwenhoek. 70:
113:128.
Tagg, J.R., Dajani, A.S. y Wannamaker, L. W. 1976. "Bacteriocins of Gram positive
bacteria". Bacteriol. Rev. 40: 772-756.
Facultad de Biología. Junio 2017
25
Ventura, M., Zomer, A., Canchaya, C., O´Connel, M., Kuipers, O., Turroni, F., Ribbera,
A., Foroni, E., Buist, G., Wegmann, U., Shearman, C., Gasson, M., Fitzgerald, G., Kok,
J., y Sinderen, D. "Comparative analyses of prophage-like elements present in two
Lactococcus lactis strains." Applied and Environmental microbiology. 73: 7771-7780.
Yan, L.Z., Gibbs, A.C., Stiles, M.E., Wishart, D.S. y Vederas, L.C. 2000. "Analogues of
bacteriocins: antimicrobial specifity and interactions of leucocin A with its enantiomer,
carbobacteriocin B2, and truncated derivatives".J. Med. Chem. 43:4579-4581.
Facultad de Biología. Junio 2017
26