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72º Congreso Argentino de Bioquímica
Simposio Medición de Hormonas Libres:
Lo que no podemos dejar de saber
![Page 2: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/2.jpg)
Hipótesis de Hormona Libre
• La hormona libre es la que está disponible para los tejidos y puede inducir efectos metabólicos y experimentar degradación
• La hormona fijada a proteínas hace las veces de un reservorio metabólicamente inerte
![Page 3: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/3.jpg)
Transporte de Hormonas en la sangre
TBG
Transtiretina
Albumina
Libre
T4 Testosterona
Cortisol
Hombre Mujer
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Validez de los procedimientos de medición. Requerimientos
• La capacidad de determinar correctamente las concentraciones de hormonas libres séricas
• La capacidad de proveer resultados de las mediciones que sean clínicamente útiles
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Métodos para estimar Tiroxina Libre
• Diálisis de trazador
• Diálisis de equilibrio
• Indices de hormona libre
• Inmunoensayos de Un paso
• Inmunoensayos de Dos pasos
• Diálisis de equilibrio/ LC-MSMS
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Métodos para estimar Testosterona Libre
• Diálisis de trazador
• Indices de cálculos
• Inmunoensayo de Un paso (Análogo)
• Métodos de cálculos de Testosterona libre
• Medición por Cromatografía Gaseosa/MSMS y cálculos
• Medición por LC/MSMS
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Transporte de Testosterona
SHBG Albumina
SHBG
Hombre
Mujer
![Page 8: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/8.jpg)
SHBG Albumina
SHBG
Testosterona Biodisponible
Transporte de Testosterona
Hombre
Mujer
![Page 9: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/9.jpg)
Cálculo de Testosterona Libre y Biodisponible
• Fórmula de Vermeulen
• Fórmula de Sodergard
• Fórmula de Nanjee y Wheeler
• Fórmula de Ly y Handelsman
Testosterona total, SHBG, Albumina
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Métodos utilizados para la medición de Cortisol Libre
Inmunoensayos:
No se encuentran disponibles para medir Cortisol libre
plasmático
Se puede resolver en diferentes matrices:
Cortisol Libre Urinario – Reacciones cruzadas
Cortisol salival - Sensibilidad
Equilibrio de Diálisis- LC/MSMS
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Si todos los
individuos tuviesen
igual contenido de
proteínas
transportadoras, la
utilidad diagnóstica
de medir Hormonas
totales y Libres
sería la misma
![Page 13: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/13.jpg)
TBG Elevada
Esteroides
Sexuales
Drogas
Enfermedad
Congénito
Afinidad:
Albúmina -FDH
TTR
NTI
Desnutr.
TBG Disminuida Albúmina/TTR
Embarazo
Estrógenos
• Embarazo
• Anticonceptivos orales
Andrógenos
Esteroides anabólicos
5 Fluorouracilo
Heroína/Metadona
Clofibrate
Acido Nicotínico
Perfenacina
Glucocorticoides
L- Asparaginasa
Enfermedad grave - NTI
Síndrome Nefrótico
Desnutrición
Acromegalia
Síndrome de Cushing
Hipertirodismo
Exceso Deficiencia
Hepatitis aguda/crónica
Insuficiencia suprarrenal
SIDA
Porfiria intermitente aguda
Hipotiroidismo
Bartelena, Horm Res 45: 142 -7, 1996
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Aumento de Concentración de Proteína
Transportadora
Secuencia de eventos
Estado
basal
Ingreso
Hormona
Egreso
Hormona
Ingreso -
Egreso
[Hormona]
Total
[Hormona
Libre]
Conc.
Hormona
fijada
N N N N N 0
[Proteína
Transporta
dora]
(+) (-)
(-)
(+) (+)
(+) N N
Nuevo estado N N N N (+) (+)
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Diseño de Inmunoensayos Inexactitud de medida
• Incorrecta calibración. Falta de estandarización en el proceso
• Dependencia de las concentraciones de proteínas, capacidades de unión y/o presencia de inhibidores o promotores de unión
![Page 16: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/16.jpg)
Características Requeridas en los
Métodos de Inmunoensayos de
Hormonas Libres
Afinidad
Niveles de Hormona
Unida a proteínas
Fase Sólida
Equilibrio
Termodinámico
Efecto de
Drogas
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![Page 18: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/18.jpg)
Inexactitud de los
métodos de medida de
hormonas libres:
• Interacción de
componentes de reactivos
(análogos) con
componentes de la
muestra
• “Secuestro” de la hormona
de la muestra
• Combinación de los 2
procesos
C45-A Guideline, CLSI 2012
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Anticuerpo
T4 Análogo de T4
Albumina Transtiretina TBG
![Page 20: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/20.jpg)
Distribución “ideal” de análogo marcado entre proteínas séricas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
TBG Transtiretina Albumina
Ekins R, Endocr Rev 1990
T 4 Análogo
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Anticuerpo
T4 Análogo de T4
Albumina Transtiretina TBG
Componentes
de Reactivo
(Albumina) Secuestro
con
componentes
normales
Interferente
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Inexactitud de los
métodos de medida de
hormonas libres:
• Interacción de
componentes de reactivos
(análogos) con
componentes de la
muestra
• “Secuestro” de la hormona
de la muestra
• Combinación de los 2
procesos
C45-A Guideline, CLSI 2012
![Page 23: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/23.jpg)
Chrostpfides ND, The immunoassay handbook, 4th ed. Oxford, 2013
Efecto de secuestro del anticuerpo anti analito
![Page 24: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/24.jpg)
Efecto de la Dilución sobre la capacidad de
unión y resultados de T4L
0
20
40
60
80
100
120
6,25 12,5 25 50 100
T4 L
(p
mo
l/l)
Med
ida
T4 L (pmol/l) Esperada
C45-A Guideline, CLSI 2012
![Page 25: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/25.jpg)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2 3 4 5
0
5
10
15
20
25
30
2 3 4 5
Amino N, Clin Chem 1983;29/2:321-325
Efecto de la adición de Albumina sobre resultados de T4 L
pm
ol/
l
pm
ol/
l
g/dl g/dl
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Cambios en diferentes métodos de medición
de T4L en función de T4 unida a Proteínas
0
1
2
3
4
5
6
7
10 20 50 100 200 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
10 20 50 100 150 200
T4 unida a Proteínas
Nelson J, J Clin Endocrinol Metab 1994; 79:76-9
ng
/dl ng
/dl
![Page 27: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/27.jpg)
Cambios en T4 Libre en función de proteínas
séricas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
25 50 100 200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
25 50 100 200
Flitz K, Clin Chem 2007,53;5:911-915
Porcentaje de Proteína sérica nativa
T4 L
(p
mo
l/l)
T4 T
(n
mo
l/l)
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0
50
100
150
200
250
300
350
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
100 90 80 70 60 50 40 30 20
Testosterona Total
Fritz K, Clin Chem 2008, 54; 3: 512-516
Efecto de Hormona unida a Proteínas en la Medición de
Testosterona Libre
Diálisis
Testosterona Libre Análogo
pm
ol/
l p
mo
l/l
nm
ol/
l
![Page 29: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/29.jpg)
Variabilidad de Testosterona Libre por diferentes métodos
Sartorius G, Annals of Clin Biochem 2009; 46:137-43
![Page 30: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/34.jpg)
Métodos de Medición con Separación física
![Page 35: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/35.jpg)
Métodos de Medición con Separación física
Etapas:
1.- Separación
física de la
hormona libre de
la unida a
proteínas (Diálisis
de Equilibrio)
2.- Medición de
hormona libre por
LC/MSMS
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Métodos de Medición con Separación física
Etapas:
1.- Separación
física de la
hormona libre de
la unida a
proteínas (Diálisis
de Equilibrio)
2.- Medición de
hormona libre por
LC/MSMS
1.- Control de pH
2.- Temperatura
3.- Características
de membrana,
tamaño de poros
4.- Dilución
5.- Buffer de
diálisis
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Interferencia Analítica (IFCC)
Error sistemático de la medición, causado
por un componente de la muestra, que
por sí mismo no produce una señal en el
sistema de medición
![Page 38: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/38.jpg)
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Interferencias en los Inmunoensayos
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Limitaciones e Interferencias en las Mediciones
Hormonas Tiroideas Totales y Libres**
• Anticuerpos Anti Hormonas
Deprés N, Clin Chem 1998;44:440-454
• Anticuerpos Anti reactivos (Anti Rhutenio)
Ohba K, Endocr. J. 2012;59(8): 663-7
• Aumento de Afinidad de Albumina
Ruiz M, N Engl J Med 1982;306:635-639
• Aumento de Afinidad de Transtiretina
Scrimshaw B, Thyroid 1992;2:21-26
** Dependiente de métodos
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¿Cuándo sospechamos Interferencia ?
• Cuando existe discordancia entre resultados
de Laboratorio
• Cuando existe discordancia entre resultados y
datos clínicos de los pacientes
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Estandarización y Armonización de pruebas tiroideas
• En el año 2005 la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) creó el Grupo de Trabajo para la Estandarización de las pruebas de la función tiroidea (WG-STFT)
Misión: Documentar el estado de la estandarización y la calidad intrínseca de los inmunoensayos actuales de hormonas tiroideas, focalizándose en T4L y TSH • En el año 2012 se transformó en un Comité C STFT,
desarrollando sistemas de medición de referencia para la estandarización de T4L y armonización de TSH
![Page 42: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/42.jpg)
Estandarización de Resultados de
T4L
Antes de la re calibración Después de la re calibración
Antes de la re
calibración
Después de la re
calibración
Thienpont L, Clin Chem 2010;56:912-920
![Page 43: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/43.jpg)
Monitoreo de estabilidad analítica a través de
medianas móviles Poblacionales de T4L
![Page 44: Presentación de PowerPoint · Métodos para estimar Tiroxina Libre •Diálisis de trazador •Diálisis de equilibrio •Indices de hormona libre ... •Fórmula de Sodergard](https://reader031.vdocuments.co/reader031/viewer/2022021714/5c0097a009d3f2377a8bf712/html5/thumbnails/44.jpg)
Estandarización de la medición de Testosterona total. Programa de CDC
Objetivo: Mejorar el diagnóstico, tratamiento y la prevención de
enfermedades y desordenes a través de la estandarización de
las mediciones de Testosterona total.
Procedimiento de medida: ID-HPLC/MSMS trazable a método
de mayor jerarquía GC-LC/MSMS (Procedimiento de medida
de referencia)
Material: muestras de suero frescas
Rango: 0.25 – 10 ng/ml - Bias promedio: ± 6,4 %
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Porqué es importante
Estandarizar/Armonizar métodos
• Seguridad del paciente
• Guías Clínicas. Uso de puntos de corte únicos
• Confianza del paciente
• Registros electrónicos de resultados unificados
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Conclusión
• Existen diferentes estrategias metodológícas para estimar y
medir las concentraciones de hormonas libres circulantes en
el laboratorio clínico
• El conocimiento de los fundamentos involucrados en los
métodos es requerido para poder conocer las limitationes
técnicas potenciales que presentan y considerar estrategias
alternativas ante resultados que dificultan el diagnóstico e
interpretación clínicas
• La estandarización de las metodologías impactará en el
mejor cuidado y seguimiento de los pacientes
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Muchas Gracias por su Atención