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Splicing alternativo:
el sastre de nuestras células (o de cómo no se puede curar
enfermedades sin una fuerte investigación básica)
CNEA
12/11/19
Alberto Kornblihtt
IFIBYNE-UBA-CONICET
Depto. Fisiol. Biol. Mol. Cel.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires - Argentina
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Los principales productos de los
genes son proteínas
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¿Cómo se fabrican?
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ADN ARN PROTEÍNA
copiado 1(transcripción)
copiado 2(traducción)
duplicación
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ADN
función
proteína
traducción
Ácido ribonucleico mensajero
(mRNA)
transcripción
gen
célulacromosoma
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intrón intrónexón exónexón ADN
Un gen
ARN mensajero
(sólo exones)
proteína
ARN inmaduro
(exones + intrones)
intrones
splicing
Pol
transcripción
traducción
“SPLICEOSOMA”
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Phil Sharp Rich Roberts
Premios Nobel 1993
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Splicing alternativo
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ARN mensajeros
(2 variantes)
splicing alternativo
ADN
Un gen
proteínas
(2 variantes)
ARN
Pol
intrón intrónexón exónexón
transcripción
traducción
“SPLICEOSOMA”
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Splicing alternativo
1. Es la regla más que una excepción. Se estima que afecta a un
95 % de los genes humanos.
2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a
partir de un número limitado de genes.
3. Mutaciones que alteran las secuencias regulatorias del splicing
alternativo son frecuentes en enfermedades hereditarias.
4. Su regulación no sólo depende de la interacción de factores
proteicos (SR y hNRNPs) con sus secuencias blanco en el pre-
mRNA sino también del acoplamiento con la maquinaria
transcripcional de la RNA polimerasa II.
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“SPLICEOSOMA”
“SPLICING
ALTERNATIVO
”
ARN mensajero
precursor
2 ARN mensajeros
diferentes
2 proteínas diferentes
NÚCLEO
CITOPLASMA
ADN (gen)
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un gen una proteína
un gen muchas proteínas
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El splicing alternativo parece ser la
causa de la gran complejidad de los
vertebrados (nosotros)
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Gusano Caenorhabditis elegans
Invertebrado microscópico de 1 mm de largo formado por 1000 células
19.000 genes en cada célulaFuente: http://www.bio.unc.edu/faculty/goldstein/lab/movies.html
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Homo sapiens sapiens
Vertebrado macroscópico de casi 2 m de largo formado por 1013 células
21.000 genes en cada célula
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No somos más complejos porque
tengamos más genes
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19.000 ~ 21.000
gusano humano
genes
Lo que ocurre es que nuestros genes pueden
generar muchas más proteínas que los del
gusano
25.000 ≠ 100.000proteínas
splicing alternativo
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3'
NH2 COOH
ED A(ED I)
ED B(ED II) IIICS
120 aa
64 aa
95 aa
89 aa
0 aa
90 aa91 aa
5'
RGD
Fibronectina humana
Kornblihtt et al. PNAS 1983
Kornblihtt et al. EMBO J 1984
Vibe Pedersen et al. EMBO J. 1984
Kornblihtt et al. EMBO J. 1985
Gutman et al. FEBS Lett. 1986
Gutman et al. PNAS 1987
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Schmucker et al. Cell 101, 671-684 (2000)
Gene de la mosca DSCAM
38.016 variantes de mRNA
![Page 21: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/21.jpg)
Potencial de acción
Neurona
pre-sináptica
Neurona
post-sináptica
SINAPSIS
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X
![Page 23: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/23.jpg)
X
Auto evitación (self avoidance)
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Desmodus rotundus (vampire bat)
Ganglios de la raíz dorsal
N N
C
C
Ganglios del trigémino
>43 ºC >30 ºC
CALOR NOCIVO SENSADO DE INFRARROJO
DOLOR ALIMENTACIÓN
TRPV1 (CANAL IÓNICO DE
NEURONAS)
Julius group: Gracheva et al. Nature 2011
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El splicing ocurre co-transcripcionalmente
Guigó lab: Tilgner et al. Genome Res. 2012
Beyer and Osheim Genes Dev. 1988
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Beyer and Osheim, Genes Dev. 1988
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EL splicing y el splicing alternativo están
acoplados a la transcripción de los genes
Cramer et al. PNAS 1997
Cramer et al. Molecular Cell 1999
![Page 28: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/28.jpg)
Cambios en la velocidad de
transcripción regulan las
opciones de splicing alternativo
(acoplamiento cinético)
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Velocidad baja, alta inclusión
de exones alternativos en el
ARN mensajero maduro
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Sitio débil Sitio fuerte
Exclusión
Velocidad rápida
pol II
SF1U2AF
65U1
U2AF35
First come, first served (el que llega primero se sirve primero)
U1
U2AF35U2AF
65SF1
U1
U2AF35U2AF
65SF1
pol II
U1
U2AF35U2AF
65SF1
U1
U2AF35U2AF
65SF1
Inclusión
Velocidad lenta
Sitio débil Sitio fuerte
Kadener et al. EMBO J. 2001
Nogués et al. JBC 2002
de la Mata et al. Mol. Cell 2003
Fededa et al. Mol. Cell 2005
Alló et al. NSMB 2009
Muñoz et al. Cell 2009
de la Mata et al. RNA 2010
Dujardin et al. Mol. Cell 2014
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Velocidad lenta, alta inclusión
de exones
80% de los eventos de
splicing alternativo
controlados por la velocidad
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Velocidad lenta, baja inclusión
de exones (son salteados)
20% de los eventos de
splicing alternativo
controlados por la velocidad
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Sitio fuerte
Velocidad rápida
Velocidad lenta
Sitio fuerte
Sitio fuerte
Sitio fuerte
ADN
ADN
Inhibidor
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Sitio fuerte
ADN
Velocidad rápida
Inclusión
pol II
U2AF35U2AF
65SF1
U1U1
U1U1
U2AF35U2AF
65SF1
U2AF35U2AF
65SF1
ETR-3
U2AF35U2AF
65SF1
Velocidad lenta
U2AF35U2AF
65SF1
Sitio fuerte
ADN
U2AF35U2AF
65SF1
U2AF35U2AF
65SF1
Salteado
pol II
U1
U1
ETR-3U1
Sitio fuerte
Sitio fuerte
Dujardin et al. Molecular Cell 2014
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¿Qué puede hacer cambiar la
velocidad de la transcripción en
las células?
Cambios en la cromatina que
dificulten o faciliten el pasaje de la
enzima que transcripbe
(polimerasa)
Cambios intrínsecos en la enzima que
transcribe (polimerasa)
Muñoz et al. Cell 2009
Muñoz, Nieto Moreno, Giono et al.
Cell Reports 2017
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Regulación del splicing alternativo por la
cromatina
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CROMOSOMA
NUCLEOSOMA
CROMATINA
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Figure 4-33a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
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Kadener et al., EMBO J. 2001
Nogués et al., J. Biol. Chem. 2002
Cromatina
compacta
TSA
(droga que abre la
cromatina)
Pol II
Pol II
Cromatina laxa o
abierta
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Histonas acetiladas Histonas metiladas
Neuronas poco diferenciadas Neuronas diferenciadas
Schor et al. EMBO J. 2013Schor et al. PNAS 2009
Pol II Pol II
Cromatina relajadaVelocidad rápida
Cromatina compactaVelocidad lenta
Salteado del exón Inclusión del exón
Cromatina alternativa, splicing alternativo
Fiszbein et al. Cell Reports 2016
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Celula Nave (It happens in the body of time, where truth dances) (Ernesto Neto, 2005)
Fiszbein et al. Cell Reports 2016
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AME = atrofia muscular espinal
SMA = Spinal muscular atrophy
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ATROFIA MUSCULAR ESPINAL (SMA)
NEURONA NORMAL NEURONA ENFERMA
MÚSCULO NORMAL MÚSCULO ATROFIADO
Fibra nerviosa normal Fibra nerviosa afectada
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ADN
gen SMN1
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7ARN
ARN
transcripción
splicing
100%proteína sana
proteína SMN
traducción
splicing alternativo
gen SMN2
inhibidor
traducción
transcripción
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7
20%proteína sana
80%proteína enferma
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Adrian KrainerCSHL, New York
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inhibidor
exon 8
exon 6 exon 8exon 7
ADN
gen SMN1 gen SMN2
ARN
ARN
splicing alternativo
proteína SMN
traducción
transcripción
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7
transcripción
splicing
traducción
100%proteína sana
80%proteína sana
20%proteína enferma
SPINRAZA
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Paciente argentina: Antonella, 5 años, 2 aplicaciones de Spinraza
![Page 48: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/48.jpg)
¿La inclusión del exón 7 del gen SMN2
está regulada por la velocidad de la
transcripción?
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0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
FL
DE7
FL
DE7
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
0 6 24 48
PercentageofFL
HourswithTSA
062448
HourswithTSA
p<0.01
0%
20%
40%
60%
80%
PercentageofFL
0
0.5
1
1.5
2FL
DE7
p<0.01
p<0.01
FL
DE7
WT slow
RNAPII
WT slow
RNAPII
DE7
FL
0
1
2
3
4
5
6
0%
20%
40%
60%
80%
100%
- TSA ASO TSA+ASO
PercentageofFL
FL
DE7
p<0.01
p<0.01
- TSAASOTSA+ASO
A B C
La inclusión del exón 7 (E7) del gen SMN2 está controlada
por la velocidad de la transcripción
Marasco et al., en preparación
VELOCIDADnormal lenta
con E7 (normal)
sin E7 (defectuosa)
normal/defectuosa
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U2AF35U2AF
65SF1
U2AF35U2AF
65SF1
U2AF35U2AF
65SF1
Pol
U1
U1
U1
Dujardin et al., Mol. Cell 2014
ADN
copiado lento
ARN
Pol
U2AF35U2AF
65SF1
U1U1
U1U1
U2AF35U2AF
65SF1
U2AF35U2AF
65SF1U2AF
35U2AF65SF1
copiado rápido
ADN
ARN
Exón incluido
Proteína sana
Exón 7 salteado
Proteína enferma
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Histonas acetiladas Histonas metiladas
Neuronas poco diferenciadas Neuronas diferenciadas
Schor et al. EMBO J. 2013Schor et al. PNAS 2009
Pol II Pol II
Cromatina relajadaVelocidad rápida
Cromatina compactaVelocidad lenta
Salteado del exón Inclusión del exón
Cromatina alternativa, splicing alternativo
Fiszbein et al. Cell Reports 2016
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Probamos tricostatina A (TSA) una
droga que inhibe la desacetilación de
las histonas y que por
consiguiente, abre la cromatina
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0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
FL
DE7
FL
DE7
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
0 6 24 48
PercentageofFL
HourswithTSA
062448
HourswithTSA
p<0.01
0%
20%
40%
60%
80%
PercentageofFL
0
0.5
1
1.5
2FL
DE7
p<0.01
p<0.01
FL
DE7
WT slow
RNAPII
WT slow
RNAPII
DE7
FL
0
1
2
3
4
5
6
0%
20%
40%
60%
80%
100%
- TSA ASO TSA+ASO
PercentageofFL
FL
DE7
p<0.01
p<0.01
- TSAASOTSA+ASO
A B C
PROTEÍNA SANA
Marasco et al., en preparación
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Experimentos con ratones SMA
![Page 55: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/55.jpg)
Alelo paterno
Único gen SMN de ratón
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7Alelo
materno
splicing alternativo
Transgén SMN2 humano
hnRNPA1/A2
exón 6 exón 8exón 7
exón 6 exón 8exón 7
![Page 56: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/56.jpg)
Spinraza solo Spinraza + Tricostatina (TSA)
Día 11 después del nacimiento
El efecto de Spinraza mejora con la apertura de la cromatina
Marasco et al., en preparación
NORMAL
NORMAL
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Marasco et al., en preparación
Día 17 después del nacimiento
El efecto de Spinraza mejora con la apertura de la cromatina
![Page 58: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/58.jpg)
P42
Spinraza-like ASO and HDACs inhibitor act cooperatively in SMA mice model
Spinraza-like ASO
Spinraza-like ASO + TSA
Marasco et al., unpublished
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Marasco et al., en preparación
El efecto de Spinraza mejora con la apertura de la cromatina
Spinraza solo Spinraza + Tricostatina (TSA)
Día 11
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Marasco et al., unpublished
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60
*
AGE (DAYS)
*
**
TSA
Heterozygous (WT)
BO
DY
WEI
GH
T (G
RA
MS)
(mSm
n -
/-; h
Smn
2)
Spinraza-like ASO and HDACs inhibitor act cooperatively in SMA mice model
Spinraza-like ASO (suboptimal dose)
Spinraza-like ASO + TSA
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Nusinersen-like (MOE-ASO) and HDACs act cooperatively in SMA mice model
Marasco et al., unpublished
Spinraza-like ASO + TSA
Spinraza-like ASO (suboptimal dose )
TSASUR
VIV
AL
PR
OB
AB
ILIT
Y
P11
Spinraza-like ASO and TSA act cooperatively in SMA mice model
Spinraza-like ASO + TSASpinraza-like ASO
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1
0 20 40 60
AGE (days)
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Spinraza-like (ASO) and VPA act cooperatively in SMA mice model
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60
BO
DY
WEI
GH
T (G
RA
MS)
AGE (DAYS)
Heterozygous (WT)
Spinraza-like ASO + VPA
VPA
SUR
VIV
AL
PR
OB
AB
ILIT
Y
AGE (DAYS)
Spinraza-like ASO + VPA
VPA0
0,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1
0 10 20 30 40 50
Spinraza-like ASO (suboptimal dose )
Spinraza-like ASO (suboptimal dose )
![Page 63: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/63.jpg)
P11 P11
Spinraza-like ASO and HDAC inhibitors act cooperatively in SMA mice model
Spinraza-like ASO Spinraza-like ASO + HDAC inhibitor
Marasco et al., unpublished
Surface righting
![Page 64: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/64.jpg)
Surface righting
0
10
20
30
40
50
60
70
RIG
HTI
NG
REF
LEX
LAT
ENC
Y (s
ec)
ASOVPA ASO+
VPA
UNTREATEDMUTANT
HET(WT)
P7
Marasco et al., unpublished
n = 10 (3 tests each)
![Page 65: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/65.jpg)
Grip strength
0
20
40
60
80
100
ASOVPA ASO+
VPA
AN
GLE
(D
EGR
EES)
UNTREATEDMUTANT
HET(WT)
P7
Marasco et al., unpublished
n = 10 (3 tests each)
ASO + VPAASO
![Page 66: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/66.jpg)
Conclusiones
La velocidad de la transcripción regula el splicing alternativo
Una transcripción lenta puede provocar tanto aumento de la inclusión como
salteado de exones alternativos delendiendo del gen en particular
La estructura de la cromatina afecta el splicing alternativo
La apertura de la cromatina puede ayudar en la terapia de la atrofia muscular
espinal
La luz regula el splicing alternativo en plantas
![Page 67: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/67.jpg)
Valeria Buggiano
Ezequiel Petrillo
Micaela Godoy Herz
Manuel MuñozLuciana Giono
Nicolás Nieto Moreno
UVLuciano Marasco
Ana Fiszbein
Luciana Gómez AcuñaIgnacio Schor
Mariano Alló
Guillermna Kubaczka
Carmen Cuenca
José Stigliano
![Page 68: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/68.jpg)
IFIBYNE-UBA-CONICET
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires - Argentina
Past
Ana Fiszbein
Celina Lafaille
Luciana Gómez Acuña
Manuel Muñoz
Mariano Alló
Gwendal Dujardin
Ezequiel Petrillo
Ignacio Schor
Manuel de la Mata
Paula Cramer
Guadalupe Nogués
Sebastián Kadener
Demián Cazalla
Juan Pablo Fededa
Nicolás Rascovan
Soledad Pérez Santangelo
Anabella Srebrow
Present
Luciana Giono
Valeria Buggiano
Micaela Godoy Herz
Nicolás Nieto Moreno
Luciano Marasco
Carmen Cuenca
Guillermina Kubaczka
![Page 69: Presentación de PowerPoint95 % de los genes humanos. 2. Explica cómo se genera una vasta diversidad proteómica a partir de un número limitado de genes. 3. Mutaciones que alteran](https://reader030.vdocuments.co/reader030/viewer/2022040821/5e6985c46c42010e7218fd5b/html5/thumbnails/69.jpg)
Colaboraciones
Adrian Krainer (Nueva York)
Ben Blencowe (Toronto)
Carlos Menck (San Pablo)
Financiamiento
HHMI (EEUU) 2002-2017
Cure SMA (EEUU)
FAME (Argentina)
Lounsbery Foundation (EEUU)
ANPCyT (Argentina)
Universidad de Buenos Aires
CONICET (Argentina)
2002-2017
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