Download - Practica Aa 1
PRACTICA: Determinación y caracterización del Acido ascórbico
en naranja
Presentado por:Arce Arbildo LadyHachoque Cristobal EddittHilasaca CarlosSauceda Plasencia Nivia
Docente:Mg Sc. Ing. Indira Betalleluz
Curso:Química de Alimentos Avanzada
ESCUELA DE POST GRADOESPECIALIDAD DE TECNOLOGÍA DE
ALIMENTOS
DICIEMBRE 2007, PERU
I. INTRODUCCIÓN
El ácido ascórbico o vitamina C es un nutriente esencial en la dieta humana. La
vitamina C, funciona como un cofactor redox y un catalizador en una amplia
serie de procesos y reacciones bioquímicas. En humanos, la vitamina C sana y
previene el escorbuto, por ello la designación de ácido ascórbico. El término
"Scurvy" o "scurfy", en el inglés antiguo, probablemente se derivó de los
términos escandinavos, skjoerberg y skorbjugg, queriendo decir piel áspera o
costrosa. En la historia humana, además de la hambruna, el escorbuto ha
causado la mayoría de los padecimientos de origen nutricional (Johnston et al.,
2001).
Esta enfermedad fue descrita por los antiguos griegos, egipcios y romanos,
siendo asociado por mucho tiempo a los ejércitos invasores, marinas de guerra
y exploradores. Aun al final del último siglo, el escorbuto estaba ampliamente
generalizado en medio de los mineros de oro de California y Alaska. En 1747,
el Capitán James Lind, médico de la armada británica, demostró que el
escorbuto, era consecuencia de la falta de ingesta de frutas y verduras frescas.
Lind demostró que la mejor forma de prevenirlo se lograba agregando a la dieta
diaria de la tripulación un poco de jugo de limón (Braverman, 1980; Davey et
al., 2000).
El grupo que desarrolla la nomenclatura para vitaminas había propuesto que el
nuevo factor antiescorbútico sea llamado "factor o vitamina C", ya que la "A" y
"B" habían sido previamente designadas como factores potenciales de salud y
de crecimiento o vitaminas. En 1915, Zilva y sus asociados del Instituto Lister
en Londres habían aislado la actividad antisorbútica de una fracción cruda de
limón. Utilizando ensayos animales demostraron que la actividad se destruye
por oxidación y es protegida por agentes reductores (Braverman, 1980;
Johnston et al., 2001). En 1928, Szent-Gyorgyi y Haworth lograron aislar el
ácido ascórbico en forma de cristales (Davey et al., 2000). Debido a su gran
aporte por el estudio de la vitamina C, ambos recibieron el Premio Nobel en
1937 (Eitenmiller y Landen Jr., 1999).
Debido a su alta sensibilidad a los factores externos, la vitamina C ha sido
utilizada para definir la vida útil durante el almacenamiento de vegetales
frescos y semisecos.
II. OBJETIVOS
Cuantificar el contenido de ácido ascórbico en frutas
Cinética de degradación
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1. Estructura Química
El ácido ascórbico o el ácido L-ascórbico es la designación de la Comisión
IUPAC-IUB para Vitamina C (2-oxo-L-teo-hexono-4-lactona-2,3-enodiol). Las
estructuras químicas del ácido ascórbico y algunos derivados se muestran en
la figura 1. El ácido ascórbico tiene un anillo planar de cinco miembros; los dos
centros quirálicos que están en las posiciones 4 y 5 determinan los cuatro
estereoisómeros. El ácido dehidroascórbico, la forma oxidada del ácido
ascórbico, retiene alguna actividad de la vitamina C y puede existir como un
hemicetal hidratado, o como un dímero (Johnston et al., 2001). Tanto el ácido
L-ascórbico como el ácido dehidroascórbico poseen actividad biológica o
vitamínica. Pero el ácido D-isoascórbico no posee actividad biológica, siendo
este el sustituto comercial del ácido L-ascórbico (Wong, 1995; Gregory, 1996).
Gregory (1996) y Davey et al. (2000) afirman que debido a que el ácido L-
ascórbico posee propiedades ácidas y reductoras debidas al resto 2,3 enodiol,
es un compuesto muy polar. El carácter ácido del ácido L-ascórbico se debe a
la ionización del grupo hidroxilo en el carbono C-3, donde tiene un pKa1 = 4.04
a 25ºC. Una segunda ionización, la disociación del hidroxilo en el carbono C-2,
con pKa2 = 11.4 a 25ºC, es mucho menos favorables.
Fig. 1. El ácido ascórbico y varios productos de oxidación. En solución, el ácido
ascórbico probablemente existe como hemicetal hidratado (Johnston et al., 2001).
1.2. Estabilidad y Formas de Degradación
Braverman (1980) sostiene que pequeñas cantidades de oxígeno, que suelen
haber en los alimentos a consecuencia de las diferentes operaciones
realizadas, son suficientes para iniciar la cadena de reacciones autooxidativas
que degradan el ácido ascórbico. Mientras que Tannenbaun (1976) citado por
Huapaya (1995) menciona que el ácido ascórbico está sujeto a una variedad de
mecanismos de degradación:
Degradación aerobia catalizada, en presencia de oxígeno, metales y
enzimas
Degradación aerobia no catalizada, sólo oxígeno
Degradación anaerobia, flavonoides
Lixiviación
El ácido ascórbico es fácilmente destruido por la oxidación, especialmente a
temperaturas elevadas y/o cuando la reacción es catalizada por iones
metálicos como el Fe+3 y Cu+2, convirtiéndose en la vitamina que se pierde
más fácilmente durante el procesamiento, almacenamiento y cocción de los
alimentos. Su degradación está relacionada con la temperatura, luz, pH,
disponibilidad de oxígeno, metales, actividad de agua, ciertas enzimas y hasta
la presencia de otras vitaminas como la riboflavina. Su estabilidad es mayor a
pH ácidos y en ausencia de oxígeno puede resistir temperaturas de
esterilización (Badui, 1990).
Davey et al. (2000) afirman que las hortalizas de hoja verde y los granos verde
son particularmente vulnerables a los periodos inmediatos a la post-cosecha,
pudiendo perder un 20% de ácido ascórbico. Un proceso de deshidratación
como el que se les da a las papas, puede producir hasta un 75% de pérdidas
de ácido ascórbico. Mientras que para las hortalizas, se puede dar algo de 50%
de pérdidas, en el enlatado. Estas pérdidas son inevitables debido a la
movilización del agua. Tal como se aprecia en la figura 2, en los enlatados y
otros productos, una parte del ácido ascórbico es lixiviado hacia el líquido de
procesado.
Regímenes de Cocción a diferentes proporciones agua: muestra 1. Sancochado, 1:1. 10 min de cocción 2. Sancochado, 2:1. 10 min de cocción 3. Sancochado, 5:1. 10 min de cocción 4. Sancochado y Frito, 2:1. 12 minutos de
cocción 5. Frito en movimiento. 10 min de cocción 6. Cocido a Presión, 2:1. 6 min de cocción 7. Microondas, 30ml de agua. 6 min de
cocción
Fig. 2. Pérdidas de Ácido L-Ascórbico durante el procesamiento y cocción en
casa (Davey et al., 2000)
Davey et al. (2000) concluyen que la oxidación del ácido ascórbico ocurre en
dos pasos. El primero es reversible, mientras que el segundo no lo es. En la
primera etapa, la oxidación no es severa y sólo se pierde dos hidrógenos hasta
llegar a la forma de ácido L-Dehidroascórbico. En la segunda etapa, la vitamina
C generalmente se degrada hasta 2, 3 dicetoglucónico (figura 3). Además
sostienen que esta reacción ocurre a los 6 minutos a 37ºC. En este proceso
térmico, las enzimas catalizadoras, como la fenolasa, citocromos oxidasa,
ácido ascórbico oxidasa y peroxidasas se desnaturalizan.
Fig. 3. Oxidación del ácido L-ascórbico (Davey et al., 2000)
1.3. Cinética del Tratamiento Térmico del Ácido Ascórbico
1.3.1. Cinética de Degradación del Ácido Ascórbico
La estabilidad del ácido ascórbico ha sido descrita por varios modelos
cinéticos. Laing et al. (1978) citado por Huapaya (1995) afirma que a
temperaturas y actividades de agua altas, la cinética de degradación del ácido
ascórbico es de orden cero. Lee y Labuza (1975) y Thompson (1982) citados
por Huapaya (1995) afirman que con variaciones de parámetros como
temperatura, metales, concentración de oxígeno y actividad de agua, la cinética
es de primer orden.
Por si parte, Robertson y Samaniego (1986), Eison-Perchonok y Downes
(1982) y Singh et al. (1976) citados por Mikacatl (2003) concluyen que el
mecanismo de degradación del ácido ascórbico puede seguir cinéticas de
primer o segundo orden. En condiciones abundantes de oxígeno o ambientes
anaeróbicos, la degradación del ácido ascórbico sigue una cinética de primer
orden. Mientras que bajo condiciones limitantes de oxígeno, el mecanismo es
de segundo orden.
A condiciones isotérmicas, la ecuación general de cinética de degradación de
orden n que sigue la ley de la potencia, está dada por la ecuación:
Donde:
C(t): Concentración del nutriente, en este caso vitamina C, en el tiempo t.
k(T): Constante de velocidad de reacción correspondiente a la temperatura T.
(s–1)
n: Número de orden de reacción
Para una reacción de orden cero (n = 0), la ecuación quedaría de la forma:
Y si la reacción fuera de primer orden (n = 1)
Pero si la reacción fuera de segundo orden (n = 2)
Donde C0 es la concentración inicial del ácido ascórbico.
Sin embargo, en la actualidad se están aplicando modelos cinéticos de
degradación en procesos no isotérmicos (Corradini y Peleg, 2006).
1.3.2. Ecuación de Arrhenius y Energía de Activación
Cada una de las reacciones anteriormente mencionadas está dada para una
temperatura determinada. La ecuación de Arrhenius nos ayuda a correlacionar
las constantes de velocidad de reacción.
Donde:
k0 : Coeficiente cinético o factor de frecuencia (s–1)
Ea : Energía de activación (KJ/mol-K, Kcal/mol-K)
R : Constante Universal de los Gases Ideales (8.314 J/mol-K, 1.98 cal/mol-K)
1.3.3. Tiempo de Reducción Decimal o Valor D
El tiempo de reducción decimal se define como el tiempo necesario para
reducir la concentración de nutriente hasta su décima parte a una temperatura
T.
1.3.4. Termorresistencia o Valor Z
La sensibilidad de los nutrientes a la temperatura se mide por medio del valor
Z, que se define como el incremento de temperatura necesario para reducir el
valor D a su décima parte.
1.4. Métodos de Determinación
Existen varios métodos de cuantificación de ácido ascórbico. Eitenmiller y
Landen Jr. (1999) mencionan que las principales son los métodos de titulación,
diclorofenolindofenol, fluorescencia automatizada a de 365 y 440,
espectrofotometría a 500nm o HPLC.
La figura 4 nos ilustra acerca de las reacciones del ácido ascórbico con algunos
tipos de análisis.
Fig. 4. Reacciones importantes del ácido L-ascórbico durante el análisis de la Vitamina C
(Eitenmiller y Landen Jr., 1999).
1.4.1. Titulación con 2, 6 diclorofenolindofenol
En 1930, Tillmans introdujo el método de titulación con 2, 6
diclorofenolindofenol (DCPI). El DCPI, que tiene una coloración azulina, es
reducido por el ácido ascórbico hasta convertirse en una solución incolora. El
ácido L-ascórbico es oxidado a ácido dehidroascórbico. En exceso de DPI
obtiene una coloración ligeramente rosada. Este es el punto final de titulación.
Una alternativa de la determinación visual del punto final de titulación es medir
la absorbancia a 518nm.
Este es un método sencillo y práctico de realizar. Sin embargo, existen
deficiencias importantes. La titulación es limitada a la cuantificación de ácido de
L-Ascórbico. El ácido dehidroascórbico no será medido a menos que sea
reducido a ácido ascórbico. La titulación no distingue entre ácido L-Ascórbico
del ácido isoascórbico. El método no sirve para análisis de vitamina C en
carnes procesadas y curadas que contienen ácido isoascórbico. La titulación
con DCIP puede ser usada para jugos frescos y multivitaminas que no
contienen cantidades excesivas de cobre o hierro. Para comidas procesadas o
cocinadas que contengan cobre, hierro, o estaño, debería utilizarse otros
métodos capaces de medir el ácido dehidroascórbico, además del ácido de L-
ascórbico. Los extractos altamente coloreados de frutas y hortalizas pueden
enmascarar el cambio de color en el punto de final de la titulación.
Además, la reducción de DCIP no se limitada al ácido L-ascórbico. Cualquier
sustancia reductora presente en la muestra puede disminuir el color. Tales
interferencias pueden ocasionar mediciones altamente erróneas, si no
reconocidas de ácido L-ascórbico. Las sustancias que pueden interferir
incluyen iones cuprosos, ferrosos, y estañosos, sulfito, tiosulfato, taninos,
betanina, cisteína, glutatión, y reductones generados por pardeamiento no
enzimático. Distintas modificaciones de este método han sido introducidas para
eliminar o minimizar los efectos de interferencias en la titulación DCIP.
Recientemente, un método de extracción de fase (SPE) sólida fue desarrollado
que expande la titulación DCIP para multivitaminas altamente coloreadas,
bebidas no alcohólicas, y frutas y hortalizas. Por otro lado, el paso de limpieza
remueve cobre, hierro,
sulfito, y otras sustancias, como la cisteína y glutatión, disminuyendo la
interferencia. La Sílica C18 impregnada con 2,2 - bipiridil-2,9-dimetil-1,10-
fenatrolina (neocuproína) y N-etilmaleimida quitan compuestos de Fe (II) y Cu
(I) y sulfidril, respectivamente. El método tiene prevista la determinación de
ácido L-ascórbico y ácido dehidroascórbico por reducción de ácido
dehidroascórbico a ácido L-ascórbico con cisteína antes del paso SPE. Este
método es simple y aumenta la sensibilidad del método DCIP. La incorporación
del paso SPE en los métodos reguladores existentes podría disminuir los
problemas asociados con los métodos existentes de titulación (Eitenmiller y
Landen Jr., 1999).
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Materia Prima
Naranja valencia
4.2. Materiales
Cubetas de espectrofotómetro
Papel Tissue
Fiolas de 1000, 500, 100 y 50 ml
Tubos de ensayo
Pipetas volumétricas de 1, 2, 10 y 20 ml
Beakers de 100 y 50 ml
Embudo
Varilla de vidrio
Balanza analítica, electrónica de 0,1 mg de sensibilidad
Centrifuga
Tablas de picar
Cuchillo
4.3. Reactivos
Acido oxalico al 0,4%: Pesar 4 g y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Solución madre de acido ascórbico 0.1% en solución ácido oxálico:
Pesar 100mg de acido ascórbico y llevar a volumen de 100 ml con una
solución de acido oxalico al 0,4%
Solución de 2,6 Dicloroindofenol: Pesar 12 mg de 2-6 DFIF, disolver y
llevar a 1000 ml de volumen con agua destilada. Emplear agua destilada
hirviente. Almacenar en botella de color oscuro y en refrigeración
4.4. Metodología de desarrollo
4.4.1. Preparación de soluciones estándares y curva de calibración
Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de solución madre de acido ascórbico, llevar a volumen
de 100 ml con la solución de acido oxalico al 0,4%. Estas soluciones
enumeradas del 1 al 5 contendrán 1, 2, 3, 4 y 5 mg de acido ascórbico por 100
ml respectivamente
Tomar 4 tubos de prueba y enumerarlos del I al IV y agregar lo siguiente:
I 10ml de agua destilada
II 1 ml de acido oxalico al 0,4%
III 1 ml de solución estándar + 9 ml de agua
IV 1 ml de solución estándar
Ajustar a cero la absorbancia usando I y una longitud de onda de 515 nm
(Klinmezak, 2007)
Al tubo III añadir 9 ml del colorante y exactamente después de 15 segundos,
leer la absorbancia (L1)
Ajustar a cero la absorbancia con la solución del tubo III
Al tubo IV añadir 9 ml del colorante y exactamente después de 15 segundos,
leer la absorbancia (L2)
Repetir desde 2. Para cada estandar de trabajo y registrar los correspondientes
valores de L1 y L2. Construir la curva estandar con las concentraciones de
acido ascórbico (mg/100ml) en la abcisa y en la ordenada la absorbancia (L1-
L2) para cada estandar de trabajo.
4.4.2. Preparación y determinación del contenido de Vitamina C de la
muestra problema
Extraer 200 ml de jugo de la muestra problema por el método de exprimido y
llevarlo a clarificar con la centrifuga a 4000 rpm por 15 minutos, luego someter
a un filtrado al vacío con papel de filtro.
Tomar 3 ml del filtrado y llevarlo a 100 ml con solución de acido oxálico al 0,4
% en una fiola u otra dilución que permita tener medidas dentro del rango de
medida de la curva estándar.
Proceder como se señaló en el item anterior desde 2 hasta 6. En lugar del
estándar de trabajo trabajar con el jugo de la muestra problema.
Calcular L1-L2 y la concentración de acido ascórbico mediante la curva
estándar.
4.4.3. Tratamiento térmico de la muestra problema
Se toma muestras del jugo filtrado de naranja de 10 ml y se coloca en tubos de
prueba cerrados , para minimizar la variación de masa debido a la perdida de
agua de la muestra por efecto de la temperatura (Acebedo, 2005)
Las muestras serán sometidas a dos temperaturas: T1 = 80ºC y T2 = 90ºC.
Para cada temperatura se tomara tiempos de 15, 25, 45 y 60 minutos de
calentamiento en el baño termostático.
Enfriar en baño con hielo
Realizar una dilución adecuada con la muestra tratada (la lectura debe caer en
el rango de la curva de calibración) en 100 ml de acido oxalico al 0,4%.
Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una λ = 515 nm. Realizar tres
repeticiones
4.4.4. Obtención de la equivalencia gasto de 2,6 dicloroindofenol con
cantidad de ácido ascórbico
Transferir 2 ml de la solución estándar de ácido ascórbico en un erlenmeyer de
50ml conteniendo 5 ml solución de extracción. Titular rápidamente con la
solución estándar de 2,6 dicloroindofenol hasta la aparición de un color rosado
persistente por un tiempo mayor de 5 segundos. Realizar una titulación similar
de 3 blancos compuestos de 7 ml de la solución de extracción más un volumen
de agua equivalente al volumen de la solución estándar de dicloroindofenol
gastado en la titulación directa. Después de sustraer el blanco del gasto en la
solución estándar de ácido ascórbico, cálcular y expresar la concentración de la
solución estándar de 2,6 dicloroindofenol como mg de ácido ascórbico
equivalente a 1 ml de gasto.
V. RESULTADO Y DISCUSIONES
Figura 1 - Curva estándar de Acido ascórbico a 515 nm (mg AA/100 ml solución de
acido oxálico al 0.4%)
y = 0.0532x + 0.0032
R2 = 0.9964
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 1 2 3 4 5 6
CONCENTRACION (mg/100ml)
AB
SO
RB
AN
CIA
Tabla 1 – Concentración mg/100ml de acido ascórbico en naranja
Tiempo (min)
L1 L2 L1 – L2 Absorbancia
Concentración mg/100mlR1 R2 R1 R2 R1 R2
0 0.271 0.272 0.093 0.092 0.178 0.18 0.179 53.127215 0.272 0.273 0.107 0.112 0.165 0.161 0.163 48.292030 0.27 0.271 0.102 0.155 0.168 0.116 0.142 41.945745 0.272 0.27 0.157 0.165 0.115 0.105 0.11 32.275260 0.275 0.273 0.195 0.203 0.08 0.070 0.075 21.6981
Figura 2 - Degradación de acido ascórbico en naranja a 90ºC a diferentes
tiempos
y = -0.5258x + 55.243
R2 = 0.975
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Con
cent
raci
on A
A (
mg/
100
ml)
La concentración inicial de ácido ascórbico es de 53.1272 mg/100ml de jugo de
naranja. Collazos reporta entre 43 y 92 mg/100g de naranja. Mientras que
Braverman (1980) afirma que el contenido de ácido ascórbico varía en función
a la parte de la naranja. La cáscara amarilla tiene entre 175 y 292mg/100g. En
el albedo o cáscara blanca, 86 - 194 mg/100g y en la pulpa, 44.9-73.2
mg/100g. La figura 2 muestra la disminución del ácido ascórbico al aplicarse
los tratamientos térmicos al jugo de naranja en diferentes tiempos.
Como se dijo anteriormente, a condiciones totalmente aerobias o anaerobias, la
cinética de reacción es de orden cero (Robertson y Samaniego, 1986; Eison-
Perchonok y Downes, 1982 y Singh et al., 1976; citados por Mikacatl, 2003).
VI. CONCLUSIONES
El jugo de naranja de variedad valencia tiene 53.1272 mg/100ml de ácido
ascórbico. Y es degradado elevadas temperaturas respecto al tiempo de
tratamiento.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Badui, Salvador. 1990. Química de los Alimentos. 2da Edición. México. Editorial
Alhambra.
Belitz, Hans-Dieter y Grosch, Werner. 1997. Química de los Alimentos. 2da Ed.
Trad. por López Buesa, María Otilia. España. Ed. Acribia. 187p.
Braverman, J.B.S, 1980. Introducción a la Bioquímica de los Alimentos. México.
Editorial El Manual Moderno. 358p.
Corradini, Maria G. y Peleg, Micha. 2006. Prediction of vitamins loss during
non-isothermal heat processes and storage with non-linear kinetic models.
Trends in Food Science & Technology 17: 24–34
Davey, Mark W.; Montagu, Marc Van; Inze´, Dirk; Sanmartin, Maite; Kanellis,
Angelos; Smirnoff, Nicholas; Benzie, Iris J.J.; Strain, John J.; Favell, Derek y
Fletcher, John. 2000. Review: Plant L-ascorbic acid: chemistry, function,
metabolism, bioavailability and effects of processing. J Sci Food Agric 80:825-
860
Huapaya García Monterroso, Erika Corona. 1995. Evaluación de la pérdida de
Vitamina C durante el proceso y almacenamiento de pulpa de camu – camu
(Myrciaria paraensis). Tesis para optar el título de Ingeniero de Industrias
Alimentarias. UNALM. Perú.
Johnston, Carol S.; Steinberg, Francene M. y Rucker, Robert B. 2001. Chapter
15. Ascorbic Acid. In: Rucker, Robert B.; Suttie, John W.; McCormick, Donald
B. y Machlin, Lawrence J. Handbook of Vitamins. 3rd Edition. USA. Marcel
Dekker, Inc.
Matissek, Reinhard; Schnepel, Frank y Steiner Gabriele. 1998. Análisis de los
Alimentos. Fundamentos, Métodos y Aplicaciones. España. Ed. Acribia, S.A.
416p.